Name: Genotypowanie Staphylococcus aureus metodą Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Poznaj metodę RS-PCR do genotypowania Staphylococcus aureus w kontekście bovine mastitis. Technika ta oferuje szybką, wysokorozdzielczą analizę izolatów zakaźnych z niskimi kosztami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autor dziękuje R. Bossowi, A. Cosandeyowi, C. Fournierowi, I. Ivanoviciowi i J. Naskovej za ich doskonałą pracę.

1. Izoluje Staphylococcus aureus
<ol>
	<li>Rozprowadzić 10 μl kultury podstawowej S. aureus lub jednej kolonii wyhodowanej na selektywnym podłożu na płytkach agarowych Columbia zawierających 5% krwi owczej (BA).</li>
	<li>Inkubować w warunkach tlenowych w temperaturze 37 °C przez 18 godzin do 24 godzin.</li>
</ol>
2. Ekstrakcja DNA
<ol>
	<li>Przygotować bufor TEL zawierający 10 mM Tris-HCl i 10 mM Na2EDTA, pH 8,5. Przygotować podwielokrotności i sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 min.</li>
	<li>Zbierz 1 kolonię z BA za pomocą sterylnej plastikowej pętelki lub sterylnej drewnianej wykałaczki i ponownie zawieś w 100 μl TEL. Użyj probówek o pojemności 1,5 ml z zakrętkami.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 95 °C przez 10 minut. Następnie natychmiast umieścić próbki na mokrym lodzie.</li>
	<li>Rozcieńczyć próbki w stosunku 1:100 wH2Oodpowiednich do PCR (= matryca DNA do PCR). Nierozcieńczone i rozcieńczone próbki można przechowywać w temperaturze -20 °C przez 1 miesiąc.</li>
</ol>
3. RS-PCR
<ol>
	<li>Na każdą próbkę odpipetować do probówki PCR: 1,5 μlH2O, 12,5 μl Taq Master Mix, 2 μl G1 starter 10 μM, 2 μl L1 starter 10 μM i 7 μl matrycowego DNA, co odpowiada około 30 ng czystego DNA 2.</li>
	<li>Uruchom następujący program cykliczny w standardowym cyklerze PCR: 15 min 95 °C, następnie 27 cykli obejmujących 94 °C przez 1 min, a następnie 2-minutowa rampa i wyżarzanie w temperaturze 55 °C przez 7 min. Po kolejnych 2 minutach rozciągnąć w temperaturze 72 °C na 2 minuty. Przerwać PCR przez końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C na 10 minut, a następnie schłodzić do 4 °C. 
	UWAGA: Produkty PCR można przechowywać w temperaturze -20 °C przez 5 dni.</li>
	<li>Dla każdej serii RS-PCR należy uwzględnić kontrolę dodatnią, tj. próbkę o znanym genotypie (zwykle GTB) i kontrolę ujemną (H2O).</li>
</ol>
4. Elektroforeza
<ol>
	<li>Użyj komercyjnego zminiaturyzowanego zestawu do elektroforezy DNA (zestaw MED) wraz z bioanalizatorem podłączonym do komputera i zainstalowanym oprogramowaniem. Uważnie zapoznaj się z odpowiednimi instrukcjami producenta.</li>
	<li>Ustawić stację zasysania wiórów i wyregulować zacisk strzykawki zgodnie z instrukcją producenta.</li>
	<li>Przygotuj mieszankę żelu i barwnika zgodnie z instrukcją producenta.</li>
	<li>Ładowanie mieszanki żelowo-barwnikowej (zgodnie z instrukcją producenta).
	<ol>
		<li>Przed użyciem należy zrównoważyć mieszankę żelu i barwnika do RT przez 30 minut.</li>
		<li>Umieść nowy chip DNA na stacji do zasysania chipów. Odpipetować 9 μl barwnika żelowego w dobrze oznaczonej literze G.</li>
		<li>Upewnij się, że tłok jest umieszczony na poziomie 1 ml, a następnie zamknij stację zasysania wiórów. Nacisnąć tłok, aż zostanie przytrzymany przez zacisk strzykawki. Odczekać dokładnie 30 sekund, a następnie zwolnić zacisk strzykawki.</li>
		<li>Odczekać 5 sekund. Powoli odciągnąć tłok do pozycji 1 ml.</li>
		<li>Otwórz stację zasysania wiórów i odpipetuj 9 μl barwnika żelowego w obu studzienkach oznaczonych literą "G".</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ładowanie znacznika
	<ol>
		<li>Odpipetować 5 μl markera we wszystkich 12 dołkach na próbki i w studzience drabinkowej. Nie zostawiaj żadnej z tych 13 studzienek pustych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Załadunek drabiny i próbek.
	<ol>
		<li>Odpipetować 1 μl drabinki DNA do dobrze oznaczonego znakiem drabinki.</li>
		<li>Odpipetować 1 μl próbki (zużyte studzienki) lub 1 μl wody dejonizowanej (nieużywane studzienki).</li>
		<li>Umieść chip poziomo w adapterze i wiruj przez 1 minutę przy 2,400 obr./min.</li>
		<li>Uruchom chip w bioanalizatorze w ciągu 5 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uruchamianie analizy
	<ol>
		<li>Uruchom bioanalizator i podłączony komputer. Otwórz oprogramowanie.</li>
		<li>Otwórz pokrywę bioanalizatora i umieść chip w uchwycie na wióry (chip pasuje tylko w jeden sposób). Ostrożnie zamknij pokrywę.</li>
		<li>W kontekście urządzenia w oprogramowaniu wybierz "Elektroforeza" > "dsDNA" > "DNA 7500". Zaakceptuj bieżący prefiks pliku oprogramowania lub zmodyfikuj go.</li>
		<li>Kliknij przycisk Start znajdujący się w oprogramowaniu. Wprowadź przykładowe nazwy w oprogramowaniu. Po zakończeniu przebiegu chipa (po około 30 minutach) w oprogramowaniu bioanalizatora pojawia się komunikat o końcu pracy.</li>
		<li>Wyjmij chip i wyczyść elektrody bioanalizatora zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Wnioskowanie o genotypie na podstawie profilu elektroforezy
<ol>
	<li>Załaduj oprogramowanie Mahal (oprogramowanie jest dostępne bezpłatnie u autorów).</li>
	<li>Importuj dane referencyjne do oprogramowania Mahal: "Plik" > "Importuj dane referencyjne"</li>
	<li>Otwórz elektroforezę uruchomioną w kontekście danych oprogramowania bioanalizatora. Wybierz profil elektroforezy dla jednej próbki.</li>
	<li>Sprawdź, czy są odpowiednie szczyty.
	<ol>
		<li>Użyj oprogramowania Mahal, aby sprawdzić odpowiednie piki: "Narzędzia" > "Średnia fluorescencja". Wprowadź w polu "Fluorescencja" wartości fluorescencji wskazane jako jednostki fluorescencji (FU), tak jak można je odczytać z oprogramowania bioanalizatora. Wstaw 4 (3) piki o najwyższej fluorescencji w kolejności rosnącej i oddzielone przecinkiem. Przykład: 126 130 132 137. 
		UWAGA: Jeśli nie wszystkie z tych pików FU są wskazane przez oprogramowanie bioanalizatora, należy je oszacować, odczytując je z wykresu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Naciśnij przycisk "Oblicz". Pik jest istotny, jeśli obserwowana fluorescencja przekracza wartość podaną w rubryce "Minimalna wysokość piku".</li>
	<li>Wywnioskuj genotyp.
	<ol>
		<li>Wstaw do pola tekstowego Mahal "Piki wejściowe (bp)" rozmiary w bp wszystkich odpowiednich pików w kolejności rosnącej i oddzielone przecinkami. Przykład: 440 462 519 579 637. 
		UWAGA: Jeśli nie wszystkie z tych rozmiarów pików są wskazane przez oprogramowanie bioanalizatora, należy je oszacować, odczytując je z wykresu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Naciśnij przycisk "Oblicz".</li>
	<li>W polu listy poszukaj minimalnej kwadratowej odległości Mahalanobisa "d2m". Jeśli odpowiadająca mu wartość P wynosi ≥0,05, to prawdopodobieństwo odrzucenia hipotezy zerowej H0 wynosi ≥5% (H0: profil obserwowany i profil referencyjny są identyczne), co oznacza, że obserwowany profil jest akceptowany jako identyczny z profilem referencyjnym wskazanego genotypu.</li>
	<li>Jeśli d2m jest minimalne, ale pole odpowiadającej mu wartości P jest puste, odrzuć H0 z prawdopodobieństwem <5%. 
	UWAGA: Oznacza to, że profile są nierówne, chociaż d2m jest minimalne. Taki wynik może wynikać z nietypowych warunków elektroforezy.
	<ol>
		<li>Aby skorygować te odchylenia, wstaw w polu tekstowym "Obserwowany szczyt (bp)" wartość 395 i naciśnij przycisk "Oblicz". Sprawdź ponownie, czy wartość d2m jest minimalna i odpowiada jej wartość P ≥0,05. Jeśli to się nie powiedzie, spróbuj użyć wartości 405, 415 i 425, 
		UWAGA: Czasami wskazane są nawet mniejsze kroki. Jeśli nadal się nie powiedzie, obserwowany profil nie jest obecny w danych referencyjnych, może to być nowy genotyp lub wariant.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Różne profile
	<ol>
		<li>Powtórz kroki od 5.6 do 5.9 dla każdego profilu elektroforezy osobno.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Sears, P. M., McCarthy, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+and+treatment+of+staphylococcal+mastitis%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.Clin.North+Am.Food+Anim.Pract%22%5BJournal%5D)">Management and treatment of staphylococcal mastitis.</a> Vet.Clin.North Am.Food Anim.Pract. 19 (1), 171-185 (2003).</li>
<li>Fournier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bovine+Staphylococcus+aureus%3A+association+of+virulence+genes%2C+genotypes+and+clinical+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Res.Vet.Sci%22%5BJournal%5D)">Bovine Staphylococcus aureus: association of virulence genes, genotypes and clinical outcome.</a> Res.Vet.Sci. 85 (3), 439-448 (2008).</li>
<li>Cosandey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+genotype+B+and+other+genotypes+isolated+from+cow+milk+in+European+countries%5BTitle%5D)+AND+%22J.Dairy+Sci%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus genotype B and other genotypes isolated from cow milk in European countries.</a> J.Dairy Sci. 99 (1), 529-540 (2016).</li>
<li>Boss, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bovine+Staphylococcus+aureus%3A+Subtyping%2C+evolution%2C+and+zoonotic+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22J.Dairy+Sci%22%5BJournal%5D)">Bovine Staphylococcus aureus: Subtyping, evolution, and zoonotic transfer.</a> J.Dairy Sci. 99 (1), 515-528 (2016).</li>
<li>Graber, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mastitis-related+subtypes+of+bovine+Staphylococcus+aureus+are+characterized+by+different+clinical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J.Dairy+Sci%22%5BJournal%5D)">Mastitis-related subtypes of bovine Staphylococcus aureus are characterized by different clinical properties.</a> J.Dairy Sci. 92 (4), 1442-1451 (2009).</li>
<li>Heiniger, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kosten-Nutzen-Analyse+einer+Intervention+zur+Verbesserung+der+Eutergesundheit+in+Schweizer+Milchviehbetrieben%5BTitle%5D)+AND+%22Schweiz.Arch.Tierheilkd%22%5BJournal%5D)">Kosten-Nutzen-Analyse einer Intervention zur Verbesserung der Eutergesundheit in Schweizer Milchviehbetrieben.</a> Schweiz.Arch.Tierheilkd. 156 (10), 473-481 (2014).</li>
<li>Hamann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definition+of+the+physiological+cell+count+threshold+based+on+changes+in+milk+composition%5BTitle%5D)+AND+%22IDF+Mastitis+Newsletter%22%5BJournal%5D)">Definition of the physiological cell count threshold based on changes in milk composition.</a> IDF Mastitis Newsletter. 25, 9-12 (2003).</li>
<li>Hwang, S. Y., Park, Y. K., Koo, H. C., Park, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((spa+typing+and+enterotoxin+gene+profile+of+Staphylococcus+aureus+isolated+from+bovine+raw+milk+in+Korea%5BTitle%5D)+AND+%22J.Vet.Sci%22%5BJournal%5D)">spa typing and enterotoxin gene profile of Staphylococcus aureus isolated from bovine raw milk in Korea.</a> J.Vet.Sci. 11 (2), 125-131 (2010).</li>
<li>Sakwinska, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Link+between+genotype+and+antimicrobial+resistance+in+bovine+mastitis-related+Staphylococcus+aureus+strains%2C+determined+by+comparing+Swiss+and+French+isolates+from+the+Rhone+Valley%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.Environ.Microbiol%22%5BJournal%5D)">Link between genotype and antimicrobial resistance in bovine mastitis-related Staphylococcus aureus strains, determined by comparing Swiss and French isolates from the Rhone Valley.</a> Appl.Environ.Microbiol. 77 (10), 3428-3432 (2011).</li>
<li>Rabello, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilocus+sequence+typing+of+Staphylococcus+aureus+isolates+recovered+from+cows+with+mastitis+in+Brazilian+dairy+herds%5BTitle%5D)+AND+%22J.Med.Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multilocus sequence typing of Staphylococcus aureus isolates recovered from cows with mastitis in Brazilian dairy herds.</a> J.Med.Microbiol. 56, 1505-1511 (2007).</li>
<li>Tavakol, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bovine-associated+MRSA+ST398+in+the+Netherlands%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Vet.Scand%22%5BJournal%5D)">Bovine-associated MRSA ST398 in the Netherlands.</a> Acta Vet.Scand. 54, 28(2012).</li>
<li>Harmsen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Typing+of+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+in+a+university+hospital+setting+by+using+novel+software+for+spa+repeat+determination+and+database+management%5BTitle%5D)+AND+%22J.Clin.Microbiol%22%5BJournal%5D)">Typing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in a university hospital setting by using novel software for spa repeat determination and database management.</a> J.Clin.Microbiol. 41 (12), 5442-5448 (2003).</li>
<li>Zadoks, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+pulsed-field+gel+electrophoresis+and+binary+typing+as+tools+in+veterinary+clinical+microbiology+and+molecular+epidemiologic+analysis+of+bovine+and+human+Staphylococcus+aureus+isolates%5BTitle%5D)+AND+%22J.Clin.Microbiol%22%5BJournal%5D)">Application of pulsed-field gel electrophoresis and binary typing as tools in veterinary clinical microbiology and molecular epidemiologic analysis of bovine and human Staphylococcus aureus isolates.</a> J.Clin.Microbiol. 38 (5), 1931-1939 (2000).</li>
<li>Cremonesi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+characteristics+of+Staphylococcus+aureus+strains+associated+with+high+within-herd+prevalence+of+intramammary+infections+in+dairy+cows%5BTitle%5D)+AND+%22J.Dairy+Sci%22%5BJournal%5D)">Genomic characteristics of Staphylococcus aureus strains associated with high within-herd prevalence of intramammary infections in dairy cows.</a> J.Dairy Sci. 98 (10), 6828-6838 (2015).</li>
<li>Enright, M. C., Day, N. P., Davies, C. E., Peacock, S. J., Spratt, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilocus+sequence+typing+for+characterization+of+methicillin-resistant+and+methicillin-susceptible+clones+of+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22J.Clin.Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multilocus sequence typing for characterization of methicillin-resistant and methicillin-susceptible clones of Staphylococcus aureus.</a> J.Clin.Microbiol. 38 (3), 1008-1015 (2000).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Najbardziej krytycznym etapem całej procedury jest nadmiar DNA w RS-PCR (>30 ng czystego DNA/test) 2. Ogólnie rzecz biorąc, rozdzielczość profilu jest optymalna, jeśli wszystkie jego szczyty zaczynają się i kończą na linii bazowej. Jeśli dwa szczyty znajdują się zbyt blisko siebie, rozdzielczość jest niepełna. W takich warunkach oprogramowanie bioanalizatora może prowadzić do niewłaściwej identyfikacji pików, tak że wymagana jest identyfikacja ręczna.
Wszystkie wyraźnie oddzielone i...

Staphylococcus (S. aureus) jest znany jako najważniejszy patogen na świecie odpowiedzialny za infekcję wewnątrzsutkową (IMI) u bydła 1. Badanie przeprowadzone przez Fourniera i wsp.2 przeprowadzone na krowach szwajcarskich oraz badania przeprowadzone przez Cosandeya i wsp. 3 i Boss i wsp. 4 u krów z 12 krajów europejskich, które S. aureus wyizolował z IMI bydła, jest genetycznie niejednorodną grupą. Poprzez amplifikację PCR międzygenowego regionu dystansowego 16S-23S rRNA (RS-PCR) początkowo wykryto łącznie 17 genotypów w 101 epidemiologicznie niezależnych izolatach 2. Genotyp B i genotyp C (GTC) występowały najczęściej (80%), podczas gdy pozostałe 15 genotypów (GT) występowało rzadko, z których każdy stanowił od 1 do 4% wszystkich izolatów. Na poziomie europejskim 3 najważniejszymi genotypami były GTB, GTC, GTF, GTI i GTR stanowiące 76% wszystkich analizowanych szczepów (n = 456). GTB znajdował się w Europie Środkowej, podczas gdy inne genotypy były szeroko rozpowszechnione. Pozostałe 24% szczepów obejmowało 41 genotypów, jednak wiele z nich zaobserwowano tylko raz.
Badania przeprowadzone przez Fourniera i wsp. 2, Cosandey i wsp. 3 oraz Graber i wsp. 5 wykazało ponadto, że genotypy były silnie powiązane z ich wzorcem genów wirulencji, zarówno na poziomie szwajcarskim, jak i europejskim. Badania wykazały ponadto ogromne różnice w rozpowszechnieniu IMI między S. aureus GTB, GTC i innymi genotypami 2,5: biorąc pod uwagę GTB, do 87% krów w stadzie było zakażonych tym genotypem. Jednak w przypadku GTC i innych genotypów IMI stwierdzono tylko u 1 do 2 krów w stadzie.
IMI wywołany przez S. aureus, zwykle powoduje zapalenie odpowiednich gruczołów sutkowych i wzrost komórek zapalnych w mleku. W konsekwencji zwiększa się liczba komórek somatycznych w mleku (SCC), kluczowy wskaźnik jakości mleka w większości krajów, co prowadzi do obniżenia ceny mleka, a nawet wstrzymania dostawy.
Oprócz RS-PCR Fourniera i wsp. 2, opisano inne metody typowania dla podtypów szczepów bydlęcych S. aureus 8-11. Dwa popularne z nich to pisanie w spa 12 i pisanie sekwencyjne w wielu miejscach (MLST) 13. Pierwsza z nich opiera się na sekwencjonowaniu DNA regionu zmiennego odstępu genu gronkowcowego uzdrowiska kodującego białko A, podczas gdy druga wymaga sekwencjonowania 7 genów porządkowych. Oznacza to, że należy wykonać odpowiednio jeden 12 i siedem PCR 13, a następnie oczyścić amplikon, reakcję sekwencjonowania i analizę przy użyciu specjalnego sprzętu. W porównaniu z RS-PCR, metody te wymagają znacznego dodatkowego wysiłku w laboratorium, co skutkuje niską przepustowością próbki i wysokimi kosztami. Przepustowość jest szczególnie niska w przypadku PFGE. Biorąc pod uwagę rozdzielczość tych metod dla bydlęcych szczepów S. aureus, RS-PCR jest co najmniej tak dobry, jak typ uzdrowiskowy 4 i lepszy niż MLST 4 lub PFGE 15.
Wszystkie te metody, w tym binarne typowanie 13, wykazały swoją skuteczność w uzyskiwaniu dalszych informacji na temat patogenezy IMI bydła wywoływanego przez S. aureus, ale z powodu wspomnianych ograniczeń są mniej odpowiednie dla dużych badań klinicznych. Ponadto genotypowanie metodą RS-PCR, jak opisano przez Fourniera i wsp.2, pozwala na wiarygodne przewidywanie potencjału epidemiologicznego i chorobotwórczego S. aureus zaangażowanego w IMI bydła, dwóch kluczowych wartości w klinicznej medycynie weterynaryjnej.

<table><tbody><tr><td>Tris(hydroksymetylo)-aminometan</td><td>Merck</td><td>1,08382,0500</td><td>Mw = 121,14 g/mol</td></tr><tr><td>Titriplex III</td><td>Merck</td><td>1,08418,0250</td><td>Mw = 372,24 g/mol; Substancja jest równoważna Na2EDTA&middot; 2H2O</td></tr><tr><td>Kwas solny 5 mol/L</td><td>Merck</td><td>1.09911.0001</td><td></td></tr><tr><td>Agar Columbia + 5%</td><td>bioM&eaostry we krwi owczej; rieux</td><td>43049</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw DNA7500 Agilent</td><td>Technologies</td><td>5067-1504</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalizator Agilent 2100</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2940CA</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie eksperckie Agilent 2100</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HotStarTaq master mix&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>203445</td><td></td></tr><tr><td>Primer L1</td><td>Mycrosinth</td><td></td><td>5'CAA GGC ATC CAC CGT3'Podkład</td></tr> <tr><td>G1</td><td>Mycrosinth</td><td></td><td>5'GAA GTC GTA ACA AGG3'</td></tr></tbody></table>

genotypowanie staphylococcus aureus metodą ribosomal spacer pcr (rs-pcr)

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

Rybosomalny dystans PCR (RS-PCR) to wysoce rozdzielcza i solidna metoda genotypowania S. aureus, która pozwala na wysoką przepustowość przy umiarkowanych kosztach i dlatego nadaje się do rutynowych celów. Aby uzyskać najlepszą rozdzielczość, ocenę danych i zarządzanie danymi, wymagany jest zminiaturyzowany system elektroforezy. Wraz z takim systemem elektroforezy i opracowanym przez nas oprogramowaniem (dostępnym bezpłatnie tutaj) przypisanie wzoru prążków do genotypu jest ustandaryzowane i proste. Ekstrakcja DNA jest prosta (przygotowanie do wrzenia), ustawienie reakcji jest łatwe i można je uruchomić na dowolnej standardowej maszynie do PCR. Cykle PCR są powszechne, z wyjątkiem wydłużonych czasów narastania i wydłużania. W porównaniu do typowania spa i typowania sekwencyjnego w wielu miejscach (MLST), RS-PCR nie wymaga sekwencjonowania DNA, co znacznie upraszcza analizę i pozwala na wysoką przepustowość. Co więcej, rozdzielczość dla bydlęcych szczepów S. aureus jest co najmniej tak dobra, jak typowanie uzdrowiskowe i lepsza niż MLST lub elektroforeza żelowa w polu pulsacyjnym (PFGE). Baza danych RS-PCR obejmuje obecnie łącznie 141 genotypów i wariantów. Metoda ta jest silnie związana z wzorcem genów zjadliwości, zaraźliwością i patogennością szczepów S. aureus biorących udział w zapaleniu wymienia u bydła. S. aureus genotyp B (GTB) jest zaraźliwy i powoduje problemy w stadach, powodując duże koszty w Szwajcarii i innych krajach europejskich. Wszystkie inne genotypy zaobserwowane w Szwajcarii infekują pojedyncze krowy i ćwiartki. Genotypowanie metodą RS-PCR pozwala na wiarygodne przewidywanie potencjału epidemiologicznego i patogennego S. aureus zaangażowanego w zakażenie śródsutkowe bydła (IMI), dwóch kluczowych czynników dla klinicznej medycyny weterynaryjnej. Ze względu na te korzystne właściwości, w połączeniu z umiarkowanymi kosztami i wysoką przepustowością próbek, celem tej publikacji jest przedstawienie szczegółowego, krok po kroku protokołu łatwego tworzenia i przeprowadzania RS-PCR do genotypowania S. aureus w innych laboratoriach.

Definicja genotypu i jego wariantów
Profil elektroforetyczny różniący się więcej niż jednym prążkiem od wszystkich zidentyfikowanych genotypów jest uznawany za nowy genotyp. Nowe genotypy są nazywane i rozszerzane zgodnie z metodą Fournier et al. 5, co doprowadziło do powstania genotypów od GTA do GTZ, a następnie od GTAA do GTAZ, GTBA do GTBZ oraz obecnie od GTCA do GTCC. Zmienność w obrębie tylko jednego pr...

Tutaj, rybosomalny dystans PCR (RS-PCR) jest używany razem ze zminiaturyzowanym systemem elektroforezy jako szybka i wysokorozdzielcza metoda genotypowania S. aureus przy umiarkowanych kosztach, pozwalająca na wysoką przepustowość.

Genotypowanie Staphylococcus aureus metodą Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...

Ogólnym celem tej procedury jest uzyskanie genotypów Staphylococcus aureus oraz powiązanie ich z przebiegiem choroby u gospodarzy. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie zapalenia wymienia u bydła, w celu ochrony zakaźności i zdolności do pasażowania Staphylococcus aureus oraz jego izolacji od krów z infekcją wewnątrzwymieniową. Procedurę zaprezentuje Ivana Ivanovic, technik z mojego laboratorium.W pierwszej kolejności należy nanieść 10 µL kultury macierzystej Staphylococcus aureus lub jedną kolonię wyhodowaną na podłożu selektywnym na płytki z agarem Columbia zawierającym 5% krwi owczej (BA). Kulturę inkubuje się tlenowo w temperaturze 37 °C przez 18 do 24 godzin. Za pomocą sterylnej plastikowej pętli lub drewnianej wykałaczki należy pobrać jedną kolonię bakterii z płytki z agarem BA i zawiesić ją ponownie w 100 µL TEL w probówce z nakrętką o pojemności 1,5 ml. Próbki inkubuje się w temperaturze 95 °C przez 10 minut, a następnie należy je natychmiast umieścić na wilgotnym lodzie.Następnie rozcieńcz próbki w stosunku 1:100 w wodzie odpowiedniej do PCR. Przygotuj mieszaninę master mix, dodając do probówki wymienione tutaj odczynniki. Następnie rozdziel ją

genotyping-of-staphylococcus-aureus-by-ribosomal-spacer-pcr-rs-pcr

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisujemy metodę multipleksowej reakcji PCR do szybkiego wykrywania serowarów Salmonella enterica Enteritidis, Hadar, Heidelberg i Typhimurium. Konkretne serowary Salmonella można zidentyfikować, kierując multipleksową reakcję PCR na geny i sekwencje unikalne dla klastra biosyntezy antygenu O oraz flagelliny danego serowaru. Następnie izolatowi Salmonella przypisuje się serowar na podstawie pojawienia się specyficznych amplikonów (produktów PCR) o określonej wielkości, odpowiadających...

PCR allelotypowania w celu identyfikacji serowarów Salmonella enterica: Enteritidis, Hadar, Heidelberg i Typhimurium

Opracowano wydajną metodę wprowadzania pojedynczych mutacji genowych w całym genomie, wykorzystując Streptococcus sanguinis jako organizm modelowy. Metoda ta została osiągnięta dzięki zastosowaniu wysokoprzepustowych reakcji PCR rekombinacyjnego oraz transformacji.

Delecje genów w całym genomie Streptococcus sanguinis za pomocą wysokoprzepustowej PCR

Pokazujemy prosty test multipleksowego PCR do szybkiego badania przesiewowego i typowania Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typu I-V dla opornego na metycylinę Staphylococcus aureus, i przedstawiamy niektóre z istotnych kroków i niuansów proceduralnych, które sprawiają, że jest to skuteczne w adaptacji tego testu do indywidualnych laboratoriów.

Test multipleksowy PCR do typowania gronkowcowego chromosomu kasety mec typów od I do V w gronkowca złocistego opornym na metycylinę

Scharakteryzowanie społeczności mikrobiologicznej było od dawna celem w mikrobiologii środowiskowej. Metody sekwencjonowania nowej generacji pozwalają obecnie na scharakteryzowanie społeczności drobnoustrojów na niespotykanej dotąd głębokości przy minimalnych kosztach i nakładzie pracy. Szczegółowo opisujemy tutaj nasze podejście do sekwencjonowania bakteryjnych genów rybosomalnego RNA 16S za pomocą sekwenatora laboratoryjnego.

Sekwencjonowanie nowej generacji amplikonów genu rybosomalnego RNA 16S

Ten protokół opisuje wykrywanie integronów klasy 1 i związanych z nimi kaset genowych w produktach spożywczych.

Badania przesiewowe środków spożywczych na obecność integronów klasy 1 i kaset genowych

Laserowa desorpcja/jonizacja wspomagana matrycą spektrometria mas lotu (MALDI-TOF MS) oraz techniki molekularne (sekwencjonowanie genów 16S rRNA) pozwalają na identyfikację rzadkich patogenów bakteryjnych w rutynowej diagnostyce. Celem tego protokołu jest połączenie obu technik, co prowadzi do dokładniejszych i bardziej wiarygodnych danych.

Identyfikacja rzadkich patogenów bakteryjnych za pomocą sekwencjonowania genu 16S rRNA i MALDI-TOF MS

Opisujemy wydajną, solidną i opłacalną metodę ekstrakcji kwasu nukleinowego z wymazów w celu scharakteryzowania społeczności bakteryjnych za pomocą sekwencjonowania amplikonów genu 16S rRNA. Metoda ta pozwala na zastosowanie wspólnego podejścia do przetwarzania wielu typów próbek i uwzględnia szereg dalszych procesów analitycznych.

Wydajna ekstrakcja kwasów nukleinowych i sekwencjonowanie genu 16S rRNA w celu scharakteryzowania społeczności bakteryjnych

Tutaj prezentujemy protokół śledzenia zanieczyszczenia genomowym DNA (gDNA) w próbkach RNA. W prezentowanej metodzie wykorzystuje się startery specyficzne dla wewnętrznego transkrybowanego regionu dystansowego (ITS) genów rybosomalnego DNA (rDNA). Metoda ta nadaje się do niezawodnego i czułego wykrywania zanieczyszczenia DNA u większości eukariontów i prokariontów.

Ocena zanieczyszczenia DNA w próbkach RNA na podstawie rybosomalnego DNA

Szczegółowo przedstawiono protokoły wykorzystania biofilmów w otwartych systemach przepływowych z zastosowaniem reaktorów z przepływem kropelkowym oraz reaktorów z obracającym się dyskiem.

Wykorzystanie reaktorów przepływowych kropelkowych oraz reaktorów z obracającym się dyskiem do analizy biofilmu Staphylococcus aureus

Model infekcji skóry i tkanek miękkich u myszy jest wykorzystywany do oceny funkcji wirulencji gronkowca złocistego opornego na metycylinę (MRSA) oraz odpowiedzi immunologicznych gospodarza. W niniejszym materiale przedstawiamy model infekcji podskórnej w przebiegu zakażenia skóry i tkanek miękkich.

Podskórna infekcja groncem złocistym opornym na metycylinę (MRSA)

Poznaj metodę RS-PCR do genotypowania Staphylococcus aureus w kontekście bovine mastitis. Technika ta oferuje szybką, wysokorozdzielczą analizę izolatów zakaźnych z niskimi kosztami.

Genotypowanie Staphylococcus aureus metodą Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

Przeglądaj więcej filmów