Szybka akwizycja obrazów 3D za pomocą mikroskopii episkopowej o wysokiej rozdzielczości

Ogólnym celem tego protokołu jest szybkie uzyskanie cyfrowych obrazów 3D o wysokiej rozdzielczości próbek biologicznych przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego. Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii rozwoju poprzez wizualizację i dynamikę złożonych cech morfologicznych. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że wykorzystuje ona standardowy sprzęt laboratoryjny i wymaga minimalnego wcześniejszego doświadczenia.

Procedurę zademonstruje Jungang Huang, doktorant z mojego laboratorium. Po rozbiorze i utrwaleniu zarodka zgodnie z opisem w protokole tekstowym, zastąp utrwalacz roztworem oczyszczającym i delikatnie obracaj próbkę na kołysce w temperaturze pokojowej przez jeden do dwóch tygodni. Pod koniec inkubacji przenieś próbkę do 10% formaliny i pozostaw na bujaku na kolejne dwa dni.

Trzeciego dnia umyć próbkę w PBS przez trzy pięciominutowe płukania. Następnie odwadniać próbki w rosnącej serii etanolu w temperaturze pokojowej, na delikatnym bujaku przez dwie godziny dla każdego stężenia. Po odwodnieniu 100% etanolu przenieść próbkę do roztworu barwiącego na godzinę, chroniąc ją przed światłem.

Następnie zastąp roztwór świeżym roztworem barwiącym w celu nocnego etykietowania próbki. Następnego ranka zanurzyć próbkę w mieszaninie jeden do jednego objętość świeżo przygotowanych roztworów infiltracyjnych i barwiących na co najmniej trzy godziny na bujaku w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji przenieś zarodek do roztworu naciekowego na kolejną trzygodzinną inkubację kołyszącą.

Następnie zastąp supernatant świeżym roztworem infiltracyjnym na kolejne trzy dni kołysania w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Czwartego dnia zorientuj zarodek w formie do zatapiania i umieść pleśń na lodzie. Wymieszaj roztwór B z roztworem infiltracyjnym, a następnie delikatnie zanurz formę w zimnym roztworze do zatapiania w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po około trzech godzinach za pomocą końcówki potwierdź, że roztwór zastygł i wypchnij próbkę z formy. Przytnij nadmiar materiału do zatapiania, a następnie zmień orientację bloku próbki w nowej formie w orientacji krzyżowej. Następnie umieść cały zestaw na lodzie w dygestorium.

Delikatnie dodaj roztwór do zatapiania do nowej formy, aż forma zostanie zanurzona. Następnie umieść uchwyt blokowy na wierzchu formy. Po trzech do czterech godzinach oderwij formę do zatapiania i umieść blok pod mikroskopem stereoskopowym z ukośnym oświetleniem, aby określić położenie próbki w bloku.

Na powierzchni bloku zaznacz linie siatki wokół próbki i użyj ich jako prowadnic do przycinania nadmiaru materiału do zatapiania. Aby zobrazować próbkę, najpierw przymocuj blok do mikrotomu i uzyskaj świeże cięcie powierzchni próbki. Następnie zamontuj mikroskop stereoskopowy z zoomem poziomo skierowanym w stronę bloku próbki i włącz mikroskop wraz z dołączonym komputerem.

Następnie uruchom oprogramowanie do akwizycji obrazu i użyj trybu podglądu na żywo w oprogramowaniu do obrazowania, aby ustawić ostrość optyki na powierzchni bloku. W razie potrzeby ustaw mikroskop i mikrotom tak, aby powierzchnia bloku znajdowała się na środku wizjera. Jednym z najważniejszych etapów tej procedury jest uzyskanie obrazów w ustalonej pozycji wyjściowej mikrotomu.

Dostosuj powiększenie, aby upewnić się, że cała powierzchnia bloku znajduje się w wizjerze. Następnie wybierz zielony fluorescencyjny filtr białkowy. Kontynuuj wstępne cięcie bloku, aż pojawi się tkanka próbki, i w razie potrzeby ponownie ustaw ostrość obrazu.

Po ręcznym zmierzeniu i ustawieniu czasu naświetlania, uzyskuj i zapisuj obrazy powierzchni bloku po każdym nowym cięciu oraz rejestruj ważne parametry akwizycji obrazu. Pod koniec sesji obrazowania wyeksportuj i przekonwertuj wszystkie pliki obrazów do formatu JPEG, a następnie użyj odpowiedniego oprogramowania do przetwarzania obrazu, aby odwrócić wszystkie oryginalne obrazy, dostosowując w razie potrzeby jasność i kontrast obrazów. Prześlij wszystkie przetworzone obrazy do oprogramowania do wizualizacji 3D, postępując zgodnie z instrukcjami.

Wyrównaj wszystkie obrazy w trybie automatycznym i pokaż wyniki 3D i 2D. Na tym reprezentatywnym zdjęciu całościowego widoku powierzchni embrionalnego dnia 15,5 mysi zarodek przygotowany i zobrazowany tak, jak właśnie pokazano. Można zaobserwować szczegółowe cechy morfologiczne skóry, w tym opuszki wąsów i rozwijające się mieszki włosowe.

Co ważne, rozdzielczość wirtualnego widoku przekroju próbki z dnia embrionalnego 15,5 zobrazowanego tą metodą jest zbliżona do standardowego przekroju histologicznego. Po opanowaniu całej procedury po wstępnym leczeniu roztworem oczyszczającym można zakończyć w ciągu jednego tygodnia, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby roztwór barwiący chronić przed światłem pod kątem czterech stopni podczas etapu infiltracji i zatapiania.

Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak barwienie kamienia, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytanie dotyczące specyficznych wzorców dystrybucji typów komórek. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak korzystać ze sprzętu laboratoryjnego do pozyskiwania obrazów 3D o wysokiej rozdzielczości próbek biologicznych do ich analizy morfometrycznej. Nie zapominaj, że praca z roztworem utrwalającym, barwiącym i infiltracyjnym może być niezwykle niebezpieczna i że podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak praca w dygestorii i noszenie rękawiczek.