Name: Szybka akwizycja obrazów 3D za pomocą mikroskopii episkopowej o wysokiej rozdzielczości (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Poznaj metodę szybkiej akwizycji obrazów 3D mysich zarodków za pomocą mikroskopii episkopowej o wysokiej rozdzielczości. Technika ta umożliwia szczegółową analizę morfometryczną struktur embriogenicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy doktorom Yichen Huang, Chunming Guo i Zhenfang Zhou za ich wsparcie techniczne. Badania te zostały sfinansowane przez NIH/NIDDK (1R01DK091645-01A1, XL) i American Heart Association (AHA, 13GRNT16950006, XL).

Wszystkie zastosowania zwierząt są zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Szpitalu Dziecięcym w Bostonie.
1. Przygotowanie próbki
<ol>
	<li>Krycie czasowe
	<ol>
		<li>Umieść samca i samicę C57Bl6 typu dzikiego razem w tej samej klatce.</li>
		<li>Sprawdź, czy nie tworzy się korek współpracujący wcześnie następnego ranka. Zatyczka współpracująca (inaczej czop dopochwowy lub kopulacyjny) to stwardniałe galaretowate osadzanie, które blokuje pochwę.</li>
		<li>Ustaw datę zatyczenia na dzień embrionalny 0,5 (e0,5).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja zarodków myszy
	<ol>
		<li>Eutanazja ciężarnych samic przez uduszenie CO2 .</li>
		<li>Połóż myszy na wznak na podkładce chłonnej i spryskaj okolice brzucha 70% etanolem.</li>
		<li>Podnieś skórę i wykonaj początkowe nacięcie 5 mm w ogonowej okolicy brzucha za pomocą nożyczek chirurgicznych. Wytnij i usuń skórę brzucha, aby w pełni odsłonić narządy wewnętrzne</li>
		<li>Wytnij w pobliżu pochwy, aby usunąć całą macicę.</li>
		<li>Przeciąć między miejscami implantacji wzdłuż rogu macicy. Każdy segment lub zarodek powinien mieć w środku tylko jeden zarodek.</li>
		<li>Przechowuj segmenty macicy w 1x lodowato zimnym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozwarstwienie zarodków
	<ol>
		<li>Umieść każdą koncepcję w osobnym naczyniu z lodowatym PBS pod stereoskopem.</li>
		<li>Usuń kolejno tkanki macicy, łożysko, a następnie błony płodowe za pomocą cienkich kleszczy preparacyjnych.</li>
		<li>Przenieś wypreparowany zarodek do probówki o pojemności 50 ml z 1x lodowatym PBS za pomocą dużej pipety transferowej. Unikaj pobierania zarodka bezpośrednio kleszczami, aby zminimalizować uszkodzenie tkanek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utrwalenie
	<ol>
		<li>Utrwalić wypreparowane zarodki w 10% obojętnym buforowym roztworze formaliny w temperaturze 4 °C przez ponad 24 godziny z co najmniej 10 objętościami utrwalacza.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wstępnej obróbki
	<ol>
		<li>Przygotuj roztwór czyszczący: 4 M mocznik, 10% glicerol, 4% dodecylosiarczan sodu (SDS) w wodzie podwójnie destylowanej.</li>
		<li>Zastąp utrwalacz roztworem czyszczącym.</li>
		<li>Delikatnie obracaj próbkę na bujaku w temperaturze pokojowej przez 1 - 2 tygodnie. Wymień Rozwiązanie Rozliczeniowe raz drugiego i trzeciego dnia. Próbka powoli staje się przezroczysta i półprzezroczysta.</li>
		<li>Zastąp roztwór czyszczący 10% formaliną i pozostaw na bujaku na 2 dni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>odwodnienie
	<ol>
		<li>Próbki poddane wstępnej obróbce należy przemyć 1x PBS 3 razy przez 5 minut każda.</li>
		<li>Odwodnić próbki w rosnącej serii etanolu w temperaturze pokojowej na delikatnym bujaku. W przypadku zarodków E15,5 należy użyć rosnącej serii etanolu obejmującej 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% i 100% etanolu, 2 godziny każdy krok. W przypadku starszych zarodków należy wydłużyć czas inkubacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienia
	<ol>
		<li>Przygotuj roztwór barwiący: dodaj 0,1375 grama soli disodowej eozyny i 0,0275 grama soli hemi (chlorek) w kolorze pomarańczy akrydynowej do 50 ml 100% etanolu. Mieszaj przez 2 godziny. Przefiltruj bibułą filtracyjną. Przechowywać w temperaturze pokojowej i unikać światła, przykrywając folią aluminiową.</li>
		<li>Przenieś próbkę do roztworu barwiącego na 1 godzinę.</li>
		<li>Zastąp świeżym roztworem barwiącym i bejcuj przez noc.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>naciek
	<ol>
		<li>Przygotuj roztwór infiltracyjny: połącz 100 ml roztworu A z zestawu do osadzania JB-4, 1,25 g katalizatora C, 0,275 g soli disodowej eozyny i 0,055 g soli hemi (chlorku) w kolorze pomarańczy akrydynowej. Mieszaj do wymieszania (200 obr./min) w wiaderku z lodem przez 2 godziny, a następnie przefiltruj bibułą filtracyjną.</li>
		<li>Roztwór rozsączający należy przechowywać w temperaturze 4 °C i unikać światła, przykrywając folią aluminiową.</li>
		<li>Przenieść zarodki do roztworu naciekającego: roztworu barwiącego (1:1) i inkubować przez co najmniej 3 godziny na kołysce w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przenieś zarodki do roztworu infiltracyjnego i inkubuj przez 3 godziny na kołysce w chłodnym pomieszczeniu.</li>
		<li>Roztwór rozsączający należy wymieniać raz dziennie i pozostawić w chłodnym pomieszczeniu na delikatnym bujaku na kolejne trzy dni.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Osadzanie
<ol>
	<li>Roztwór B i roztwór infiltracyjny należy przechowywać na lodzie.</li>
	<li>Przygotuj roztwór do zatapiania (1:25 roztworu B i roztwór infiltracyjny) bezpośrednio przed osadzeniem.</li>
	<li>Zorientuj próbkę w formie do zatapiania, a następnie delikatnie wlej zimny roztwór do zatapiania do formy do zatapiania. W razie potrzeby zmień orientację za pomocą szpilki.</li>
	<li>Użyj szpilki, aby sprawdzić, czy roztwór do osadzania jest zestalony. Wypchnij blok próbki i przytnij go w razie potrzeby.</li>
	<li>Zmień orientację bloku próbki za pomocą oddzielnej formy, aby uzyskać orientację krzyżową.</li>
	<li>Umieść uchwyt blokowy na wierzchu formy do zatapiania. Delikatnie wlej roztwór do zatapiania do formy, aż forma i uchwyt bloku zostaną zanurzone w roztworze do zatapiania.</li>
	<li>Próbkę należy przechowywać w pojemniku wtórnym i pozostawić na lodzie na 3-4 godziny w dygestorium.</li>
	<li>Zestalone próbki przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Oderwij formę do zatapiania. Umieść blok pod mikroskopem stereoskopowym z ukośnym oświetleniem, aby sprawdzić położenie próbki w bloku. Na powierzchni bloku zaznacz linie siatki wokół próbki.</li>
	<li>Przytnij blok, aby usunąć ilość materiału do osadzania, używając zaznaczonych linii siatki jako odniesień.</li>
</ol>
3. Akwizycja obrazu
<ol>
	<li>Zacisnąć blok próbki na mikrotomie i uzyskać świeżą powierzchnię cięcia. Ustaw grubość przekroju (np. e9,5-10,5, 1,5 μm; e11,5-12,5, 2,0 μm; e13,5-15,5, 2,5 μm; e16,5-starsze, 3 μm). Utrzymuj próbkę/blok w pozycji wyjściowej mikrotomu.</li>
	<li>Zamontuj mikroskop stereoskopowy z zoomem poziomo skierowany w stronę powierzchni bloku próbki.</li>
	<li>Włącz komputer i mikroskop, a następnie uruchom oprogramowanie do akwizycji obrazu.</li>
	<li>Wizualizuj i ustawiaj ostrość optyki na powierzchni bloku w trybie "podglądu na żywo" w oprogramowaniu do obrazowania.</li>
	<li>W razie potrzeby ustaw mikroskop i mikrotom tak, aby blok znajdował się na środku wizjera.</li>
	<li>Dostosuj powiększenie tak, aby cała powierzchnia bloku znajdowała się w wizjerze.</li>
	<li>Wybierz filtr białka zielonej fluorescencji (GFP) (wzbudzenie 470 ± 20 nm, dichroiczne 495 nm, emisja 525 ± 25 nm) i w razie potrzeby ponownie ustaw ostrość.</li>
	<li>Zmierz i ustaw czas ekspozycji ręcznie (np. 80 - 400 mini sec).</li>
	<li>Pobieraj obrazy powierzchni bloku po każdym nowym cięciu i zapisuj obrazy automatycznie, jeśli to możliwe.</li>
	<li>Rejestruj ważne parametry, takie jak rozdzielczość, grubość przekroju i powiększenie.</li>
	<li>Po wykończeniu całej próbki wyeksportuj i w razie potrzeby przekonwertuj wszystkie pliki graficzne do formatu JPEG.</li>
	<li>Odwróć wszystkie oryginalne obrazy za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu i dostosuj jasność i kontrast.</li>
	<li>Zapisz wszystkie przetworzone obrazy w osobnym folderze.</li>
</ol>
4. 3D Wizualizacja
<ol>
	<li>Prześlij wszystkie przetworzone obrazy do oprogramowania do wizualizacji 3D, postępując zgodnie z instrukcjami.</li>
	<li>Wprowadź rozdzielczość i grubość przekroju, aby przekonwertować wszystkie obrazy na dane wolumetryczne (tj. rozmiar woksela) i zapisać plik 3D.</li>
	<li>Wyrównaj wszystkie obrazy w trybie automatycznym. W razie potrzeby dostosuj poszczególne obrazy ręcznie.</li>
	<li>Zapisz wyrównany obraz pod nową nazwą pliku.</li>
	<li>Analizuj cechy morfometryczne próbki za pomocą oprogramowania do wizualizacji 3D.</li>
</ol>

<ol><li>Gregg, C. L., Butcher, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+in+vivo+imaging+of+embryonic+development%3A+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Quantitative in vivo imaging of embryonic development: opportunities and challenges.</a> Differentiation. 84, 149-162 (2012).</li>
<li>Liu, X., Tobita, K., Francis, R. J., Lo, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+techniques+for+visualizing+and+phenotyping+congenital+heart+defects+in+murine+models%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+defects+Res+C%22%5BJournal%5D)">Imaging techniques for visualizing and phenotyping congenital heart defects in murine models.</a> Birth defects Res C. 99, 93-105 (2013).</li>
<li>Norris, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+coming+of+age%3A+advanced+imaging+technologies+for+characterising+the+developing+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">A coming of age: advanced imaging technologies for characterising the developing mouse.</a> Trends Genet. 29, 700-711 (2013).</li>
<li>Weninger, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotyping+structural+abnormalities+in+mouse+embryos+using+high-resolution+episcopic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+model+mech%22%5BJournal%5D)">Phenotyping structural abnormalities in mouse embryos using high-resolution episcopic microscopy.</a> Dis model mech. 7, 1143-1152 (2014).</li>
<li>Mohun, T. J., Weninger, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Episcopic+three-dimensional+imaging+of+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+protoc%22%5BJournal%5D)">Episcopic three-dimensional imaging of embryos.</a> Cold Spring Harb protoc. , 641-646 (2012).</li>
<li>Sizarov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+and+molecular+analysis+of+the+arterial+pole+of+the+developing+human+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional and molecular analysis of the arterial pole of the developing human heart.</a> J Anat. 220, 336-349 (2012).</li>
<li>Anderson, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+and+abnormal+development+of+the+intrapericardial+arterial+trunks+in+humans+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Normal and abnormal development of the intrapericardial arterial trunks in humans and mice.</a> Cardiovasc Res. 95, 108-115 (2012).</li>
<li>Huang, Y. C., Chen, F., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clarification+of+mammalian+cloacal+morphogenesis+using+high-resolution+episcopic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Clarification of mammalian cloacal morphogenesis using high-resolution episcopic microscopy.</a> Dev Biol. 409, 106-113 (2016).</li>
<li>Mohun, T. J., Weninger, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embedding+embryos+for+episcopic+fluorescence+image+capturing+%28EFIC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+protoc%22%5BJournal%5D)">Embedding embryos for episcopic fluorescence image capturing (EFIC).</a> Cold Spring Harb protoc. , 675-677 (2012).</li>
<li>Weninger, W. J., Mohun, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+analysis+of+molecular+signals+with+episcopic+imaging+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+mol+biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional analysis of molecular signals with episcopic imaging techniques.</a> Methods mol biol. 411, 35-46 (2007).</li>
<li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clarifying+Tissue+Clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162, 246-257 (2015).</li>
<li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scale%3A+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157, 726-739 (2014).</li>
<li>Mohun, T. J., Weninger, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+volume+data+by+episcopic+three-dimensional+imaging+of+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of volume data by episcopic three-dimensional imaging of embryos.</a> Cold Spring Harb protoc. , 681-682 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu przedstawiamy zmodyfikowany protokół wykorzystujący rutynowy sprzęt laboratoryjny do pozyskiwania seryjnych obrazów HREM, które są kompatybilne z szybką wizualizacją 3D i analizą morfometryczną złożonych struktur. Ponieważ obrazy o wysokiej rozdzielczości są wykonywane bezpośrednio z powierzchni bloku, a nie z pojedynczych sekcji, drobne cechy morfologiczne są zachowywane i szybko rekonstruowane cyfrowo w programie do wizualizacji 3D.
Obrazowanie 3D oferuje znaczące korzyści w wi...

Pojawienie się technologii obrazowania 3D otworzyło możliwość systemowej analizy szczegółowych cech morfologicznych podczas rozwoju płodu. Obecnie dostępnych jest wiele metod obrazowania 3D, w tym obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (mikrorezonans magnetyczny), mikrotomografia komputerowa, ultradźwięki wysokiej częstotliwości, optyczna tomografia koherentna, optyczna tomografia projektowa i mikroskopia episkopowa1-4. Każda modalność ma swoje unikalne cechy w zakresie rozdzielczości, kontrastu, szybkości, kosztów, możliwości in utero i dostępności.
Episkopowe przechwytywanie obrazów fluorescencyjnych (EFIC) i mikroskopia episkopowa o wysokiej rozdzielczości (HREM) są metodami obrazowania mikroskopii episkopowej4. W tym przypadku obrazy seryjne o wysokiej rozdzielczości są rejestrowane w sposób ciągły z powierzchni bloku, a nie z odcinków tkanki. Uzyskane obrazy wiernie odwzorowują szczegółowe cechy morfologiczne przy minimalnych lub zerowych zniekształceniach tkanek. Pozyskane dane wolumetryczne można łatwo przekształcić w obrazy 3D o wysokiej rozdzielczości, które nadają się do dokładnej analizy morfometrycznej. Ze względu na stosunkowo niski koszt i wysoką rozdzielczość, HREM i EPIC stały się lepszą alternatywą dla systemowej oceny mysich modeli wad wrodzonych u ludzi2,4-8.
Zarówno metody EFIC, jak i HREM wymagają osadzenia próbek w odpowiednim podłożu. EFIC wykrywa autofluorescencję emitowaną przez osadzoną tkankę. Z tego powodu jest ograniczony do próbek emitujących wysoki poziom autofluorescencji, ale nie do tych o stosunkowo słabej autofluorescencji, takich jak zarodki we wczesnym stadium9. Aby przezwyciężyć zależność od autofluorescencji, próbki barwi się barwnikiem fluorescencyjnym, takim jak eozyna, do obrazowania HREM. Wybór barwników i metod barwienia sprawia również, że HREM jest bardziej kompatybilny z wykrywaniem sygnałów molekularnych w kontekście architektury i morfologii tkanek4,10.
W tym artykule prezentujemy ulepszony protokół HREM, odpowiedni do oceny całego ciała zarodków myszy w późnym stadium rozwoju. Aby ułatwić barwienie, dołączamy etap obróbki wstępnej w celu zwiększenia penetracji tkanek, umożliwiając w ten sposób obrazowanie HREM starszych zarodków myszy.

<table><tbody><tr><td>Myszy</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>C57BL6</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol etylowy</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>111000200</td><td>200 Proof, absolutny, ACS / USP / koszerny</td></tr><tr><td>formalin</td><td>Sigma</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Sigma</td><td>U5128</td><td>Roztwór czyszczący</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher scientific</td><td>G33-4</td><td>Roztwór</td></tr> <tr><td>czyszczącyDodecylosiarczan sodu</td><td>Invitrogen</td><td>15525-017</td><td>Roztwór oczyszczający</td></tr><tr><td>Sól disodowa eozyny Y</td><td>Fisher scientific</td><td>BP241925</td><td>Roztwór infiltracyjny</td></tr><tr><td>Sól pomarańczy akrydynowej hemi (chlorek)</td><td>Sigma</td><td>A6014</td><td>Roztwór infiltracyjny</td></tr><tr><td>Papier Whatman</td><td>GE</td><td>3030-153</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do osadzania JB-4 - Solution A</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>0226A-800</td><td>Roztwór infiltracyjny</td></tr><tr><td>JB-4 Zestaw do osadzania - Rozwiązanie B</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>0226B-30</td><td>Rozwiązanie do zatapiania</td></tr><tr><td>JB-4&nbsp; Zestaw do osadzania - Catalyst</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>02618-12</td><td>Roztwór infiltracyjny</td></tr><tr><td>do osadzania form</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>23185-1</td><td>16 x 8 mm</td></tr><tr><td>Odklejana ostra forma do osadzania</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>18986-1</td><td>Kwadrat 22 mm x 22 mm, ścięty do 12 mm x 12 mm</td></tr><tr><td>JB-4&nbsp; Plastikowe uchwyty</td><td>blokowe Polysciences, Inc.</td><td>15899</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe rury transferowe z podziałką</td><td>VWR</td><td>414004-014</td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petrla</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td>Kleszcze do preparowania zarodków</td></tr><tr><td>Końcówka Inox</td><td>&nbsp; ROBOZ</td><td>RS-5015</td><td>Sekcja zarodków</td></tr><tr><td>Graefe Kleszczyk do tkanek</td><td>&nbsp; ROBOZ</td><td>RS-5153</td> Delikatna nożyczki operacyjne do <td>rozwarstwiania zarodków</td></tr><tr><td></td><td>&nbsp; ROBOZ</td><td>RS-6700</td><td>Dyssekcja zarodków</td></tr><tr><td>14 ml Polipropylenowe probówki z okrągłym dnem</td><td>Falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Polipropylenowe probówki stożkowe</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Wiadro na lód</td><td>Magic Touch Iceware International Corp.</td><td>R19-343</td><td></td></tr><tr><td>100 ml (3.4 uncji) Antystatyczne łodzie wagowe z polistyrenu</td><td>VWR</td><td>89106-766</td><td></td></tr><tr><td>330 ml (11.2 uncji) Antystatyczne łodzie wagowe z polistyrenu</td><td>VWR</td><td>89106-770</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>MP Biomedicals</td><td>102892</td><td>Roztwór PBS</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma</td><td>P0662</td><td>Roztwór PBS</td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Roztwór fosforanu sodu dwuzasadowego siedmiowodnego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9390</td><td>PBS Solution</td></tr><tr><td>Aparat cyfrowy</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>C11440-10C</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom</td><td>Leica</td><td>RM2265</td><td></td></tr><tr><td>Oświetlacz</td><td>Carl Zeiss</td><td>HXP 200C</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescencyjny mikroskop stereo zmiennoogniskowy</td><td>Carl Zeiss</td><td>Axio Zoom.V16</td><td></td></tr> Mikroskop <tr><td>stereoskopowy</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td></td></tr><tr><td>Światłowodowe źródło światła</td><td>Leica</td><td>KL 1500 LCD</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe ostrze mikrotomowe</td><td>VWR</td><td>95057-832</td><td></td></tr><tr><td>Dozownik jednokrawędziowy</td><td>Personna</td><td>62-0330-0000</td><td></td></tr><tr><td>ZEN</td><td>Carl Zeiss</td><td>pro 2012</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop</td><td>Adobe</td><td>CS6 v13.0</td><td></td></tr><tr><td>Amira 3D Software</td><td>Visage Imaging</td><td>5.4</td><td></td></tr><tr><td>Komputer</td><td>Dell T7600, dysk twardy SAS 2x900 GB i 64 GB pamięci</td><td></td><td></td>DDR3 RDIMM</tr><tr><td>Wytrząsarki z platformą kołyszącą</td><td>VWR</td><td>40000-304</td><td></td></tr><tr><td>Standardowe mieszadło z płytą grzejną</td><td>VWR</td><td>12365-382</td><td></td></tr><tr><td>Waga analityczna</td><td>Mettler Toledo</td><td>AB54-S</td><td></td></tr></tbody></table>

szybka akwizycja obrazów 3d za pomocą mikroskopii episkopowej o wysokiej rozdzielczości

Rapid Acquisition of 3D Images Using High-resolution Episcopic Microscopy

Technologia mikroskopii episkopowej o wysokiej rozdzielczości (HREM) umożliwia szybkie pozyskiwanie cyfrowych danych wolumetrycznych i trójwymiarowych (3D) o wysokiej rozdzielczości. Tutaj opisujemy szczegółowy protokół obrazowania całego zarodka myszy. Protokół składa się z czterech głównych sekcji: przygotowanie próbki, osadzanie, akwizycja obrazu i wreszcie wizualizacja 3D. Technologia wymaga, aby próbki były barwione barwnikiem fluorescencyjnym, co może być problematyczne w przypadku dużych lub gęstych próbek. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, ulepszyliśmy istniejący protokół, aby zwiększyć penetrację tkanki barwnika poprzez wstępne potraktowanie próbki roztworem zawierającym mocznik i dodecylosiarczan sodu. W protokole wykorzystuje się wyłącznie rutynowy sprzęt laboratoryjny i odczynniki, co ułatwia adaptację w standardowych warunkach laboratoryjnych. Pokazujemy, że uzyskane obrazy 3D o wysokiej rozdzielczości wiernie odwzorowują szczegółowe cechy morfologiczne narządów wewnętrznych zarodków myszy, umożliwiając w ten sposób analizy morfometryczne. Wspólnie prezentujemy szczegółowy i ulepszony protokół wykorzystujący standardowy sprzęt laboratoryjny do pozyskiwania obrazów 3D o wysokiej rozdzielczości małych i dużych próbek.

Opisaliśmy wysokiej jakości obrazy HREM zarodków myszy między e9.5 a e13.58. Jakość obrazowania zarodków w późniejszych stadiach jest jednak znacznie gorsza ze względu na ograniczoną penetrację tkanek przez fluorescencyjny barwnik eozynę. Aby zwiększyć efektywność barwienia, przetestowaliśmy kilka metod wstępnego przygotowania, które są kompatybilne z obrazowaniem fluorescencyjnym1. W szczególności zarodki myszy w stadium e15.5 poddano działaniu Sca/e A212...

Opisujemy szczegółowy protokół wykorzystujący mikroskopię episkopową o wysokiej rozdzielczości do pozyskiwania trójwymiarowych (3D) obrazów embrionów myszy. Ten ulepszony protokół wykorzystuje zmodyfikowaną metodę przygotowania tkanek w celu zwiększenia penetracji barwnika fluorescencyjnego, umożliwiając w ten sposób analizę morfometryczną zarówno małych, jak i dużych próbek.

Szybka akwizycja obrazów 3D za pomocą mikroskopii episkopowej o wysokiej rozdzielczości

High-resolution episcopic microscopic (HREM) technology enables rapid acquisition of high-resolution digital volumetric and three-dimensional (3D) ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest szybkie pozyskiwanie wysokorozdzielczych cyfrowych obrazów 3D próbek biologicznych przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego. Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii rozwoju poprzez wizualizację i analizę dynamiki złożonych cech morfologicznych. Głównymi zaletami tej techniki są wykorzystanie standardowego wyposażenia laboratorium oraz minimalne wymagania dotyczące wcześniejszego doświadczenia.Procedurę zaprezentuje Jungang Huang, doktorant z mojego laboratorium. Po przeprowadzeniu sekcji i utrwaleniu zarodka zgodnie z opisanym w protokole tekstem, należy zastąpić utrwalacz roztworem przejaśniającym, a następnie delikatnie rotować preparat na wytrząsacie w temperaturze pokojowej przez jeden do dwóch tygodni. Po zakończeniu inkubacji należy przenieść preparat do 10% formaliny i pozostawić na wytrząsacie przez kolejne dwa dni.Trzeciego dnia przemyj próbkę w PBS, wykonując trzy pięciominutowe płukania. Następnie odwodnij próbki w szeregu rosnących stężeń etanolu w temperaturze pokojowej, na łagodnym wytrząsalniku, przez dwie godziny dla każdego stężenia. Po odwodnieniu w 100% etanolu przenieś preparat do ro

rapid-acquisition-3d-images-using-high-resolution-episcopic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Nieniszcząca wizualizacja objętościowa jest możliwa do uzyskania jedynie za pomocą technik tomograficznych, z których najefektywniejszą jest mikrotomografia komputerowa (CT) promieniami rentgenowskimi.

Wysokorozdzielcze obrazowanie 3D Ex-vivo Próbki biologiczne w mikro-tomografii komputerowej (mikro-CT)

Autofagia to wszechobecny proces, który umożliwia komórkom degradację i recykling białek i organelli. Stosujemy zaawansowaną mikroskopię fluorescencyjną do wizualizacji i ilościowego określenia niewielkich, ale istotnych zmian fizycznych związanych z indukcją autofagii, w tym powstawania i dystrybucji autofagosomów i lizosomów oraz ich fuzji w autolizosomy.

Ilościowa analiza autofagii przy użyciu zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej 3D

Czasoprzestrzenne informacje o dynamicznych białkach wewnątrz żywych komórek są kluczowe dla zrozumienia biologii. Rodzaj mikroskopii superrozdzielczej, zwany szybką mikroskopią oświetlenia strukturalnego 3D (f3D-SIM), ujawnia unikalne informacje na temat cytokinetycznego pierścienia Z u bakterii: zarówno jego wygląd podobny do koralików, jak i szybką dynamikę FtsZ w pierścieniu.

Obrazowanie cytokinetycznego pierścienia Z w superrozdzielczości u żywych bakterii przy użyciu szybkiej mikroskopii oświetlenia strukturalnego 3D (f3D-SIM)

Czterowymiarowe (4D) obrazowanie jest wykorzystywane do badania zachowania i interakcji między dwoma typami endosomów w zakończonych nerwach żywych kręgowców.  Ruch tych małych struktur jest scharakteryzowany w trzech wymiarach, co pozwala na potwierdzenie zdarzeń takich jak fuzja endosomów i egzocytoza.

Wizualizacja dynamiki endosomów w żywych zakończeniach nerwowych za pomocą czterowymiarowego obrazowania fluorescencyjnego

Przedstawiamy protokół zastosowania interferometrycznej mikroskopii lokalizacji fotoaktywowanej (iPALM), 3-wymiarowej metody mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek w super rozdzielczości, do obrazowania cytoszkieletu aktynowego w przylegających komórkach ssaków. Takie podejście umożliwia opartą na świetle wizualizację cech strukturalnych w nanoskali, które w przeciwnym razie pozostałyby nierozwiązane przez konwencjonalną mikroskopię optyczną z ograniczoną dyfrakcją.

Trójwymiarowa mikroskopia superrozdzielcza włókien F-aktyny za pomocą interferometrycznej mikroskopii lokalizacji aktywowanej światłem (iPALM)

Udostępniamy proste i solidne protokoły przetwarzania materiału biopsyjnego różnych gatunków, zarodków organizmów modelowych biomedycznych i próbek innych tkanek organicznych, aby umożliwić cyfrowe generowanie danych objętościowych za pomocą metody mikroskopii episkopowej o wysokiej rozdzielczości.

Mikroskopia episkopowa o wysokiej rozdzielczości (HREM) - proste i niezawodne protokoły przetwarzania i wizualizacji materiałów organicznych

Ostatnio zmapowaliśmy trójwymiarowe (3D) przestrzenne lokalizacje tras transportowych dla różnych białek przemieszczających się wewnątrz rzęsek pierwotnych w żywych komórkach. W tym artykule szczegółowo opisano konfigurację eksperymentalną, proces pobierania próbek biologicznych i analizy danych dla podejścia do obrazowania fluorescencji 3D o wysokiej rozdzielczości, nowo zastosowanego w żywych rzęskach pierwotnych.

Zastosowanie szybkiej mikroskopii superrozdzielczej SPEED w żywej rzęsce pierwotnej

Ten protokół wyjaśnia, jak przygotować i zamontować próbki bakterii do trójwymiarowego obrazowania na żywo oraz jak zrekonstruować trójwymiarowy kształt E. coli na podstawie tych obrazów.

Trójwymiarowe obrazowanie komórek bakteryjnych w celu dokładnego odwzorowania komórek i precyzyjnej lokalizacji białek

Tutaj opisujemy narzędzia i metody obliczeniowe, które umożliwiają wizualizację i analizę trzy- i czterowymiarowych danych obrazowych zarodków myszy w kontekście osiowego wydłużania i segmentacji, uzyskanych przez optyczną tomografię projekcyjną in toto oraz przez obrazowanie na żywo i barwienie immunofluorescencyjne w całości za pomocą mikroskopii wielofotonowej.

Trój- i czterowymiarowe podejścia do wizualizacji i analizy w celu badania wydłużenia osiowego i segmentacji kręgowców

Po zintegrowaniu z płytą czołową i konstrukcją optyczną kompatybilną zarówno z mikroskopami jedno-, jak i dwufotonowymi, soczewka mikropryzmatyczna daje znaczącą przewagę w pomiarze odpowiedzi neuronalnych w pionowej kolumnie w różnych warunkach, w tym w dobrze kontrolowanych eksperymentach w stanach skupienia na głowie lub naturalnych zadaniach behawioralnych u swobodnie poruszających się zwierząt.

Długoterminowe obrazowanie zidentyfikowanych populacji neuronów za pomocą mikropryzmatów u zwierząt swobodnie poruszających się i z unieruchomioną głową

Protokół ten opisuje zaawansowane zastosowania obrazowania oraz zarządzanie współzasobami systemu mikroskopu konfokalnego z laserowym skanowaniem zintegrowanym z multipleksowanym detektorem matrycowym do obrazowania komórkowego i subkomórkowego o wysokiej rozdzielczości. Workflow umożliwia obrazowanie multimodalne od konfokalnej do superrozdzielczości (~120 nm) na jednej platformie, czyniąc wizualizację w skali nanoskalowej bardziej dostępną.

Obrazowanie superrozdzielcze i zarządzanie współdzielone: Protokół do mikroskopii konfokalnej z detekcją multipleksową

Poznaj metodę szybkiej akwizycji obrazów 3D mysich zarodków za pomocą mikroskopii episkopowej o wysokiej rozdzielczości. Technika ta umożliwia szczegółową analizę morfometryczną struktur embriogenicznych.

Szybka akwizycja obrazów 3D za pomocą mikroskopii episkopowej o wysokiej rozdzielczości

Przeglądaj więcej filmów