Name: Szybka akwizycja obrazów 3D za pomocą mikroskopii episkopowej o wysokiej rozdzielczości (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Poznaj metodę szybkiej akwizycji obrazów 3D mysich zarodków za pomocą mikroskopii episkopowej o wysokiej rozdzielczości. Technika ta umożliwia szczegółową analizę morfometryczną struktur embriogenicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy doktorom Yichen Huang, Chunming Guo i Zhenfang Zhou za ich wsparcie techniczne. Badania te zostały sfinansowane przez NIH/NIDDK (1R01DK091645-01A1, XL) i American Heart Association (AHA, 13GRNT16950006, XL).

Wszystkie zastosowania zwierząt są zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Szpitalu Dziecięcym w Bostonie.
1. Przygotowanie próbki
<ol>
	<li>Krycie czasowe
	<ol>
		<li>Umieść samca i samicę C57Bl6 typu dzikiego razem w tej samej klatce.</li>
		<li>Sprawdź, czy nie tworzy się korek współpracujący wcześnie następnego ranka. Zatyczka współpracująca (inaczej czop dopochwowy lub kopulacyjny) to stwardniałe galaretowate osadzanie, które blokuje pochwę.</li>
		<li>Ustaw datę zatyczenia na dzień embrionalny 0,5 (e0,5).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja zarodków myszy
	<ol>
		<li>Eutanazja ciężarnych samic przez uduszenie CO2 .</li>
		<li>Połóż myszy na wznak na podkładce chłonnej i spryskaj okolice brzucha 70% etanolem.</li>
		<li>Podnieś skórę i wykonaj początkowe nacięcie 5 mm w ogonowej okolicy brzucha za pomocą nożyczek chirurgicznych. Wytnij i usuń skórę brzucha, aby w pełni odsłonić narządy wewnętrzne</li>
		<li>Wytnij w pobliżu pochwy, aby usunąć całą macicę.</li>
		<li>Przeciąć między miejscami implantacji wzdłuż rogu macicy. Każdy segment lub zarodek powinien mieć w środku tylko jeden zarodek.</li>
		<li>Przechowuj segmenty macicy w 1x lodowato zimnym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozwarstwienie zarodków
	<ol>
		<li>Umieść każdą koncepcję w osobnym naczyniu z lodowatym PBS pod stereoskopem.</li>
		<li>Usuń kolejno tkanki macicy, łożysko, a następnie błony płodowe za pomocą cienkich kleszczy preparacyjnych.</li>
		<li>Przenieś wypreparowany zarodek do probówki o pojemności 50 ml z 1x lodowatym PBS za pomocą dużej pipety transferowej. Unikaj pobierania zarodka bezpośrednio kleszczami, aby zminimalizować uszkodzenie tkanek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utrwalenie
	<ol>
		<li>Utrwalić wypreparowane zarodki w 10% obojętnym buforowym roztworze formaliny w temperaturze 4 °C przez ponad 24 godziny z co najmniej 10 objętościami utrwalacza.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wstępnej obróbki
	<ol>
		<li>Przygotuj roztwór czyszczący: 4 M mocznik, 10% glicerol, 4% dodecylosiarczan sodu (SDS) w wodzie podwójnie destylowanej.</li>
		<li>Zastąp utrwalacz roztworem czyszczącym.</li>
		<li>Delikatnie obracaj próbkę na bujaku w temperaturze pokojowej przez 1 - 2 tygodnie. Wymień Rozwiązanie Rozliczeniowe raz drugiego i trzeciego dnia. Próbka powoli staje się przezroczysta i półprzezroczysta.</li>
		<li>Zastąp roztwór czyszczący 10% formaliną i pozostaw na bujaku na 2 dni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>odwodnienie
	<ol>
		<li>Próbki poddane wstępnej obróbce należy przemyć 1x PBS 3 razy przez 5 minut każda.</li>
		<li>Odwodnić próbki w rosnącej serii etanolu w temperaturze pokojowej na delikatnym bujaku. W przypadku zarodków E15,5 należy użyć rosnącej serii etanolu obejmującej 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% i 100% etanolu, 2 godziny każdy krok. W przypadku starszych zarodków należy wydłużyć czas inkubacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienia
	<ol>
		<li>Przygotuj roztwór barwiący: dodaj 0,1375 grama soli disodowej eozyny i 0,0275 grama soli hemi (chlorek) w kolorze pomarańczy akrydynowej do 50 ml 100% etanolu. Mieszaj przez 2 godziny. Przefiltruj bibułą filtracyjną. Przechowywać w temperaturze pokojowej i unikać światła, przykrywając folią aluminiową.</li>
		<li>Przenieś próbkę do roztworu barwiącego na 1 godzinę.</li>
		<li>Zastąp świeżym roztworem barwiącym i bejcuj przez noc.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>naciek
	<ol>
		<li>Przygotuj roztwór infiltracyjny: połącz 100 ml roztworu A z zestawu do osadzania JB-4, 1,25 g katalizatora C, 0,275 g soli disodowej eozyny i 0,055 g soli hemi (chlorku) w kolorze pomarańczy akrydynowej. Mieszaj do wymieszania (200 obr./min) w wiaderku z lodem przez 2 godziny, a następnie przefiltruj bibułą filtracyjną.</li>
		<li>Roztwór rozsączający należy przechowywać w temperaturze 4 °C i unikać światła, przykrywając folią aluminiową.</li>
		<li>Przenieść zarodki do roztworu naciekającego: roztworu barwiącego (1:1) i inkubować przez co najmniej 3 godziny na kołysce w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przenieś zarodki do roztworu infiltracyjnego i inkubuj przez 3 godziny na kołysce w chłodnym pomieszczeniu.</li>
		<li>Roztwór rozsączający należy wymieniać raz dziennie i pozostawić w chłodnym pomieszczeniu na delikatnym bujaku na kolejne trzy dni.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Osadzanie
<ol>
	<li>Roztwór B i roztwór infiltracyjny należy przechowywać na lodzie.</li>
	<li>Przygotuj roztwór do zatapiania (1:25 roztworu B i roztwór infiltracyjny) bezpośrednio przed osadzeniem.</li>
	<li>Zorientuj próbkę w formie do zatapiania, a następnie delikatnie wlej zimny roztwór do zatapiania do formy do zatapiania. W razie potrzeby zmień orientację za pomocą szpilki.</li>
	<li>Użyj szpilki, aby sprawdzić, czy roztwór do osadzania jest zestalony. Wypchnij blok próbki i przytnij go w razie potrzeby.</li>
	<li>Zmień orientację bloku próbki za pomocą oddzielnej formy, aby uzyskać orientację krzyżową.</li>
	<li>Umieść uchwyt blokowy na wierzchu formy do zatapiania. Delikatnie wlej roztwór do zatapiania do formy, aż forma i uchwyt bloku zostaną zanurzone w roztworze do zatapiania.</li>
	<li>Próbkę należy przechowywać w pojemniku wtórnym i pozostawić na lodzie na 3-4 godziny w dygestorium.</li>
	<li>Zestalone próbki przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Oderwij formę do zatapiania. Umieść blok pod mikroskopem stereoskopowym z ukośnym oświetleniem, aby sprawdzić położenie próbki w bloku. Na powierzchni bloku zaznacz linie siatki wokół próbki.</li>
	<li>Przytnij blok, aby usunąć ilość materiału do osadzania, używając zaznaczonych linii siatki jako odniesień.</li>
</ol>
3. Akwizycja obrazu
<ol>
	<li>Zacisnąć blok próbki na mikrotomie i uzyskać świeżą powierzchnię cięcia. Ustaw grubość przekroju (np. e9,5-10,5, 1,5 μm; e11,5-12,5, 2,0 μm; e13,5-15,5, 2,5 μm; e16,5-starsze, 3 μm). Utrzymuj próbkę/blok w pozycji wyjściowej mikrotomu.</li>
	<li>Zamontuj mikroskop stereoskopowy z zoomem poziomo skierowany w stronę powierzchni bloku próbki.</li>
	<li>Włącz komputer i mikroskop, a następnie uruchom oprogramowanie do akwizycji obrazu.</li>
	<li>Wizualizuj i ustawiaj ostrość optyki na powierzchni bloku w trybie "podglądu na żywo" w oprogramowaniu do obrazowania.</li>
	<li>W razie potrzeby ustaw mikroskop i mikrotom tak, aby blok znajdował się na środku wizjera.</li>
	<li>Dostosuj powiększenie tak, aby cała powierzchnia bloku znajdowała się w wizjerze.</li>
	<li>Wybierz filtr białka zielonej fluorescencji (GFP) (wzbudzenie 470 ± 20 nm, dichroiczne 495 nm, emisja 525 ± 25 nm) i w razie potrzeby ponownie ustaw ostrość.</li>
	<li>Zmierz i ustaw czas ekspozycji ręcznie (np. 80 - 400 mini sec).</li>
	<li>Pobieraj obrazy powierzchni bloku po każdym nowym cięciu i zapisuj obrazy automatycznie, jeśli to możliwe.</li>
	<li>Rejestruj ważne parametry, takie jak rozdzielczość, grubość przekroju i powiększenie.</li>
	<li>Po wykończeniu całej próbki wyeksportuj i w razie potrzeby przekonwertuj wszystkie pliki graficzne do formatu JPEG.</li>
	<li>Odwróć wszystkie oryginalne obrazy za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu i dostosuj jasność i kontrast.</li>
	<li>Zapisz wszystkie przetworzone obrazy w osobnym folderze.</li>
</ol>
4. 3D Wizualizacja
<ol>
	<li>Prześlij wszystkie przetworzone obrazy do oprogramowania do wizualizacji 3D, postępując zgodnie z instrukcjami.</li>
	<li>Wprowadź rozdzielczość i grubość przekroju, aby przekonwertować wszystkie obrazy na dane wolumetryczne (tj. rozmiar woksela) i zapisać plik 3D.</li>
	<li>Wyrównaj wszystkie obrazy w trybie automatycznym. W razie potrzeby dostosuj poszczególne obrazy ręcznie.</li>
	<li>Zapisz wyrównany obraz pod nową nazwą pliku.</li>
	<li>Analizuj cechy morfometryczne próbki za pomocą oprogramowania do wizualizacji 3D.</li>
</ol>

<ol><li>Gregg, C. L., Butcher, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+in+vivo+imaging+of+embryonic+development%3A+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Quantitative in vivo imaging of embryonic development: opportunities and challenges.</a> Differentiation. 84, 149-162 (2012).</li>
<li>Liu, X., Tobita, K., Francis, R. J., Lo, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+techniques+for+visualizing+and+phenotyping+congenital+heart+defects+in+murine+models%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+defects+Res+C%22%5BJournal%5D)">Imaging techniques for visualizing and phenotyping congenital heart defects in murine models.</a> Birth defects Res C. 99, 93-105 (2013).</li>
<li>Norris, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+coming+of+age%3A+advanced+imaging+technologies+for+characterising+the+developing+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">A coming of age: advanced imaging technologies for characterising the developing mouse.</a> Trends Genet. 29, 700-711 (2013).</li>
<li>Weninger, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotyping+structural+abnormalities+in+mouse+embryos+using+high-resolution+episcopic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+model+mech%22%5BJournal%5D)">Phenotyping structural abnormalities in mouse embryos using high-resolution episcopic microscopy.</a> Dis model mech. 7, 1143-1152 (2014).</li>
<li>Mohun, T. J., Weninger, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Episcopic+three-dimensional+imaging+of+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+protoc%22%5BJournal%5D)">Episcopic three-dimensional imaging of embryos.</a> Cold Spring Harb protoc. , 641-646 (2012).</li>
<li>Sizarov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+and+molecular+analysis+of+the+arterial+pole+of+the+developing+human+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional and molecular analysis of the arterial pole of the developing human heart.</a> J Anat. 220, 336-349 (2012).</li>
<li>Anderson, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+and+abnormal+development+of+the+intrapericardial+arterial+trunks+in+humans+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Normal and abnormal development of the intrapericardial arterial trunks in humans and mice.</a> Cardiovasc Res. 95, 108-115 (2012).</li>
<li>Huang, Y. C., Chen, F., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clarification+of+mammalian+cloacal+morphogenesis+using+high-resolution+episcopic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Clarification of mammalian cloacal morphogenesis using high-resolution episcopic microscopy.</a> Dev Biol. 409, 106-113 (2016).</li>
<li>Mohun, T. J., Weninger, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embedding+embryos+for+episcopic+fluorescence+image+capturing+%28EFIC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+protoc%22%5BJournal%5D)">Embedding embryos for episcopic fluorescence image capturing (EFIC).</a> Cold Spring Harb protoc. , 675-677 (2012).</li>
<li>Weninger, W. J., Mohun, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+analysis+of+molecular+signals+with+episcopic+imaging+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+mol+biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional analysis of molecular signals with episcopic imaging techniques.</a> Methods mol biol. 411, 35-46 (2007).</li>
<li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clarifying+Tissue+Clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162, 246-257 (2015).</li>
<li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scale%3A+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157, 726-739 (2014).</li>
<li>Mohun, T. J., Weninger, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+volume+data+by+episcopic+three-dimensional+imaging+of+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of volume data by episcopic three-dimensional imaging of embryos.</a> Cold Spring Harb protoc. , 681-682 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu przedstawiamy zmodyfikowany protokół wykorzystujący rutynowy sprzęt laboratoryjny do pozyskiwania seryjnych obrazów HREM, które są kompatybilne z szybką wizualizacją 3D i analizą morfometryczną złożonych struktur. Ponieważ obrazy o wysokiej rozdzielczości są wykonywane bezpośrednio z powierzchni bloku, a nie z pojedynczych sekcji, drobne cechy morfologiczne są zachowywane i szybko rekonstruowane cyfrowo w programie do wizualizacji 3D.
Obrazowanie 3D oferuje znaczące korzyści w wi...

Pojawienie się technologii obrazowania 3D otworzyło możliwość systemowej analizy szczegółowych cech morfologicznych podczas rozwoju płodu. Obecnie dostępnych jest wiele metod obrazowania 3D, w tym obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (mikrorezonans magnetyczny), mikrotomografia komputerowa, ultradźwięki wysokiej częstotliwości, optyczna tomografia koherentna, optyczna tomografia projektowa i mikroskopia episkopowa1-4. Każda modalność ma swoje unikalne cechy w zakresie rozdzielczości, kontrastu, szybkości, kosztów, możliwości in utero i dostępności.
Episkopowe przechwytywanie obrazów fluorescencyjnych (EFIC) i mikroskopia episkopowa o wysokiej rozdzielczości (HREM) są metodami obrazowania mikroskopii episkopowej4. W tym przypadku obrazy seryjne o wysokiej rozdzielczości są rejestrowane w sposób ciągły z powierzchni bloku, a nie z odcinków tkanki. Uzyskane obrazy wiernie odwzorowują szczegółowe cechy morfologiczne przy minimalnych lub zerowych zniekształceniach tkanek. Pozyskane dane wolumetryczne można łatwo przekształcić w obrazy 3D o wysokiej rozdzielczości, które nadają się do dokładnej analizy morfometrycznej. Ze względu na stosunkowo niski koszt i wysoką rozdzielczość, HREM i EPIC stały się lepszą alternatywą dla systemowej oceny mysich modeli wad wrodzonych u ludzi2,4-8.
Zarówno metody EFIC, jak i HREM wymagają osadzenia próbek w odpowiednim podłożu. EFIC wykrywa autofluorescencję emitowaną przez osadzoną tkankę. Z tego powodu jest ograniczony do próbek emitujących wysoki poziom autofluorescencji, ale nie do tych o stosunkowo słabej autofluorescencji, takich jak zarodki we wczesnym stadium9. Aby przezwyciężyć zależność od autofluorescencji, próbki barwi się barwnikiem fluorescencyjnym, takim jak eozyna, do obrazowania HREM. Wybór barwników i metod barwienia sprawia również, że HREM jest bardziej kompatybilny z wykrywaniem sygnałów molekularnych w kontekście architektury i morfologii tkanek4,10.
W tym artykule prezentujemy ulepszony protokół HREM, odpowiedni do oceny całego ciała zarodków myszy w późnym stadium rozwoju. Aby ułatwić barwienie, dołączamy etap obróbki wstępnej w celu zwiększenia penetracji tkanek, umożliwiając w ten sposób obrazowanie HREM starszych zarodków myszy.

<table><tbody><tr><td>Myszy</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>C57BL6</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol etylowy</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>111000200</td><td>200 Proof, absolutny, ACS / USP / koszerny</td></tr><tr><td>formalin</td><td>Sigma</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Sigma</td><td>U5128</td><td>Roztwór czyszczący</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher scientific</td><td>G33-4</td><td>Roztwór</td></tr> <tr><td>czyszczącyDodecylosiarczan sodu</td><td>Invitrogen</td><td>15525-017</td><td>Roztwór oczyszczający</td></tr><tr><td>Sól disodowa eozyny Y</td><td>Fisher scientific</td><td>BP241925</td><td>Roztwór infiltracyjny</td></tr><tr><td>Sól pomarańczy akrydynowej hemi (chlorek)</td><td>Sigma</td><td>A6014</td><td>Roztwór infiltracyjny</td></tr><tr><td>Papier Whatman</td><td>GE</td><td>3030-153</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do osadzania JB-4 - Solution A</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>0226A-800</td><td>Roztwór infiltracyjny</td></tr><tr><td>JB-4 Zestaw do osadzania - Rozwiązanie B</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>0226B-30</td><td>Rozwiązanie do zatapiania</td></tr><tr><td>JB-4&nbsp; Zestaw do osadzania - Catalyst</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>02618-12</td><td>Roztwór infiltracyjny</td></tr><tr><td>do osadzania form</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>23185-1</td><td>16 x 8 mm</td></tr><tr><td>Odklejana ostra forma do osadzania</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>18986-1</td><td>Kwadrat 22 mm x 22 mm, ścięty do 12 mm x 12 mm</td></tr><tr><td>JB-4&nbsp; Plastikowe uchwyty</td><td>blokowe Polysciences, Inc.</td><td>15899</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe rury transferowe z podziałką</td><td>VWR</td><td>414004-014</td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petrla</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td>Kleszcze do preparowania zarodków</td></tr><tr><td>Końcówka Inox</td><td>&nbsp; ROBOZ</td><td>RS-5015</td><td>Sekcja zarodków</td></tr><tr><td>Graefe Kleszczyk do tkanek</td><td>&nbsp; ROBOZ</td><td>RS-5153</td> Delikatna nożyczki operacyjne do <td>rozwarstwiania zarodków</td></tr><tr><td></td><td>&nbsp; ROBOZ</td><td>RS-6700</td><td>Dyssekcja zarodków</td></tr><tr><td>14 ml Polipropylenowe probówki z okrągłym dnem</td><td>Falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Polipropylenowe probówki stożkowe</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Wiadro na lód</td><td>Magic Touch Iceware International Corp.</td><td>R19-343</td><td></td></tr><tr><td>100 ml (3.4 uncji) Antystatyczne łodzie wagowe z polistyrenu</td><td>VWR</td><td>89106-766</td><td></td></tr><tr><td>330 ml (11.2 uncji) Antystatyczne łodzie wagowe z polistyrenu</td><td>VWR</td><td>89106-770</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>MP Biomedicals</td><td>102892</td><td>Roztwór PBS</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma</td><td>P0662</td><td>Roztwór PBS</td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Roztwór fosforanu sodu dwuzasadowego siedmiowodnego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9390</td><td>PBS Solution</td></tr><tr><td>Aparat cyfrowy</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>C11440-10C</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom</td><td>Leica</td><td>RM2265</td><td></td></tr><tr><td>Oświetlacz</td><td>Carl Zeiss</td><td>HXP 200C</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescencyjny mikroskop stereo zmiennoogniskowy</td><td>Carl Zeiss</td><td>Axio Zoom.V16</td><td></td></tr> Mikroskop <tr><td>stereoskopowy</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td></td></tr><tr><td>Światłowodowe źródło światła</td><td>Leica</td><td>KL 1500 LCD</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe ostrze mikrotomowe</td><td>VWR</td><td>95057-832</td><td></td></tr><tr><td>Dozownik jednokrawędziowy</td><td>Personna</td><td>62-0330-0000</td><td></td></tr><tr><td>ZEN</td><td>Carl Zeiss</td><td>pro 2012</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop</td><td>Adobe</td><td>CS6 v13.0</td><td></td></tr><tr><td>Amira 3D Software</td><td>Visage Imaging</td><td>5.4</td><td></td></tr><tr><td>Komputer</td><td>Dell T7600, dysk twardy SAS 2x900 GB i 64 GB pamięci</td><td></td><td></td>DDR3 RDIMM</tr><tr><td>Wytrząsarki z platformą kołyszącą</td><td>VWR</td><td>40000-304</td><td></td></tr><tr><td>Standardowe mieszadło z płytą grzejną</td><td>VWR</td><td>12365-382</td><td></td></tr><tr><td>Waga analityczna</td><td>Mettler Toledo</td><td>AB54-S</td><td></td></tr></tbody></table>

szybka akwizycja obrazów 3d za pomocą mikroskopii episkopowej o wysokiej rozdzielczości

Rapid Acquisition of 3D Images Using High-resolution Episcopic Microscopy

Technologia mikroskopii episkopowej o wysokiej rozdzielczości (HREM) umożliwia szybkie pozyskiwanie cyfrowych danych wolumetrycznych i trójwymiarowych (3D) o wysokiej rozdzielczości. Tutaj opisujemy szczegółowy protokół obrazowania całego zarodka myszy. Protokół składa się z czterech głównych sekcji: przygotowanie próbki, osadzanie, akwizycja obrazu i wreszcie wizualizacja 3D. Technologia wymaga, aby próbki były barwione barwnikiem fluorescencyjnym, co może być problematyczne w przypadku dużych lub gęstych próbek. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, ulepszyliśmy istniejący protokół, aby zwiększyć penetrację tkanki barwnika poprzez wstępne potraktowanie próbki roztworem zawierającym mocznik i dodecylosiarczan sodu. W protokole wykorzystuje się wyłącznie rutynowy sprzęt laboratoryjny i odczynniki, co ułatwia adaptację w standardowych warunkach laboratoryjnych. Pokazujemy, że uzyskane obrazy 3D o wysokiej rozdzielczości wiernie odwzorowują szczegółowe cechy morfologiczne narządów wewnętrznych zarodków myszy, umożliwiając w ten sposób analizy morfometryczne. Wspólnie prezentujemy szczegółowy i ulepszony protokół wykorzystujący standardowy sprzęt laboratoryjny do pozyskiwania obrazów 3D o wysokiej rozdzielczości małych i dużych próbek.

Opisaliśmy wysokiej jakości obrazy HREM zarodków myszy między e9.5 a e13.58. Jakość obrazowania zarodków w późniejszych stadiach jest jednak znacznie gorsza ze względu na ograniczoną penetrację tkanek przez fluorescencyjny barwnik eozynę. Aby zwiększyć efektywność barwienia, przetestowaliśmy kilka metod wstępnego przygotowania, które są kompatybilne z obrazowaniem fluorescencyjnym1. W szczególności zarodki myszy w stadium e15.5 poddano działaniu Sca/e A212...

Opisujemy szczegółowy protokół wykorzystujący mikroskopię episkopową o wysokiej rozdzielczości do pozyskiwania trójwymiarowych (3D) obrazów embrionów myszy. Ten ulepszony protokół wykorzystuje zmodyfikowaną metodę przygotowania tkanek w celu zwiększenia penetracji barwnika fluorescencyjnego, umożliwiając w ten sposób analizę morfometryczną zarówno małych, jak i dużych próbek.

Szybka akwizycja obrazów 3D za pomocą mikroskopii episkopowej o wysokiej rozdzielczości

High-resolution episcopic microscopic (HREM) technology enables rapid acquisition of high-resolution digital volumetric and three-dimensional (3D) ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest szybkie pozyskiwanie wysokorozdzielczych cyfrowych obrazów 3D próbek biologicznych przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego. Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii rozwoju poprzez wizualizację i analizę dynamiki złożonych cech morfologicznych. Głównymi zaletami tej techniki są wykorzystanie standardowego wyposażenia laboratorium oraz minimalne wymagania dotyczące wcześniejszego doświadczenia.Procedurę zaprezentuje Jungang Huang, doktorant z mojego laboratorium. Po przeprowadzeniu sekcji i utrwaleniu zarodka zgodnie z opisanym w protokole tekstem, należy zastąpić utrwalacz roztworem przejaśniającym, a następnie delikatnie rotować preparat na wytrząsacie w temperaturze pokojowej przez jeden do dwóch tygodni. Po zakończeniu inkubacji należy przenieść preparat do 10% formaliny i pozostawić na wytrząsacie przez kolejne dwa dni.Trzeciego dnia przemyj próbkę w PBS, wykonując trzy pięciominutowe płukania. Następnie odwodnij próbki w szeregu rosnących stężeń etanolu w temperaturze pokojowej, na łagodnym wytrząsalniku, przez dwie godziny dla każdego stężenia. Po odwodnieniu w 100% etanolu przenieś preparat do roztworu barwiącego na jedną godzinę, chroniąc go przed światłem.Następnie należy wymienić roztwór na świeży roztwór barwiący w celu labellingu preparatu przez noc. Następnego ranka próbkę zanurzono w mieszaninie świeżo przygotowanych roztworów infiltracyjnych i barwiących w stosunku objętościowym jeden do jednego, inkubując przez co najmniej trzy godziny na wytrząsarce przy temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po zakończeniu inkubacji zarodek przeniesiono do roztworu infiltracyjnego na kolejną trzystజిgodzinną inkubację na wytrząsarce.Następnie zastąp nadsącz świeżym roztworem infiltracyjnym i inkubuj przez kolejne trzy dni w wytrząsarce w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Czwartego dnia ustaw zarodek w formie do zatapiania i umieść formę na lodzie. Wymieszaj roztwór B z roztworem infiltracyjnym, a następnie ostrożnie zanurz formę w zimnym roztworze do zatapiania w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Po około trzech godzinach, za pomocą końcówki sprawdzić, czy roztwór stężał, a następnie wypchnąć preparat z formy. Odciąć nadmiar materiału zatopiającego, a następnie ponownie zorientować blok z preparatem w nowej formie, stosując orientację krzyżową. Następnie umieścić cały układ na lodzie w dygestorium.Ostrożnie dolej roztwór do zatapiania do nowej formy, aż zostanie ona całkowicie wypełniona. Następnie umieść uchwyt do bloczków na górze formy. Po trzech lub czterech godzinach zdejmij formę do zatapiania i umieść bloczek pod stereomikroskopem z oświetleniem skośnym, aby określić położenie preparatu wewnątrz bloczka.Na powierzchni kostki narysuj linie siatki wokół preparatu i wykorzystaj te linie jako wskazówki do odcięcia nadmiaru materiału zatopiającego. Aby obrazować preparat, najpierw zamocuj kostkę w mikrotomie i wykonaj cięcie, aby uzyskać świeżą powierzchnię preparatu. Następnie ustaw stereomikroskop z zoomem poziomo, skierowany w stronę powierzchni kostki z preparatem, a następnie włącz mikroskop oraz podłączony do niego komputer.Następnie uruchom oprogramowanie do akwizycji obrazów i skorzystaj z trybu podglądu na żywo, aby ustawić ostrość optyki na powierzchni bloczka. W razie potrzeby wyrównaj mikroskop i mikrotom tak, aby powierzchnia bloczka znajdowała się w centrum pola widzenia. Jednym z najważniejszych etapów tej procedury jest wykonanie obrazów w stałej pozycji wyjściowej mikrotomu.Dostosuj powiększenie, aby upewnić się, że cała powierzchnia bloku znajduje się w polu widzenia. Następnie wybierz filtr dla zielonego białka fluorescencyjnego. Przejdź do wstępnego przycinania bloku, aż pojawi się tkanka preparatu, a następnie w razie potrzeby ponownie ustaw ostrość obrazu.Po ręcznym zmierzeniu i ustawieniu czasu ekspozycji, wykonaj i zapisz obrazy powierzchni bloku po każdym nowym cięciu oraz zapisz istotne parametry akwizycji obrazu. Na koniec sesji obrazowania wyeksportuj i przekonwertuj wszystkie pliki obrazów do formatu JPEG, a następnie użyj odpowiedniego oprogramowania do przetwarzania obrazów, aby odwrócić wszystkie oryginalne obrazy, dostosowując w razie potrzeby ich jasność i kontrast. Prześlij wszystkie przetworzone obrazy do oprogramowania do wizualizacji 3D, postępując zgodnie z instrukcjami.Wyrównaj wszystkie obrazy w trybie automatycznym, a następnie wyświetl wyniki w 3D i 2D. Na tym reprezentatywnym obrazie widoku powierzchniowego całego preparatu zarodka myszy w 15,5 dniu embrionalnym, przygotowanego i obrazowanego zgodnie z wcześniejszą demonstracją, można zaobserwować szczegółowe cechy morfologiczne skóry, w tym poduszeczki wibrysów i rozwijające się mieszki włosowe.Istotne jest to, że rozdzielczość wirtualnego przekroju preparatu z 15,5 dnia embrionalnego obrazowanego tą metodą jest zbliżona do standardowego przekroju histologicznego. Po opanowaniu techniki cała procedura po wstępnym przygotowaniu z użyciem roztworu klarującego może zostać ukończona w ciągu jednego tygodnia, pod warunkiem prawidłowego jej wykonania. Podczas realizacji tej procedury należy pamiętać, aby roztwór barwiący przechowywać w ciemności w temperaturze 4°C podczas etapów infiltracji i odlewania.Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak barwienie skalaryczne, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące specyficznych wzorców rozmieszczenia poszczególnych typów komórek. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wiedzę na temat wykorzystania sprzętu laboratoryjnego do pozyskiwania wysokorozdzielczych obrazów 3D preparatów biologicznych w celu ich analizy morfometrycznej. Należy pamiętać, że praca z roztworami do fiksacji, barwienia i infiltracji może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak praca w dygestorium i noszenie rękawiczek.

rapid-acquisition-3d-images-using-high-resolution-episcopic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Nieniszcząca wizualizacja objętościowa jest możliwa do uzyskania jedynie za pomocą technik tomograficznych, z których najefektywniejszą jest mikrotomografia komputerowa (CT) promieniami rentgenowskimi.

Wysokorozdzielcze obrazowanie 3D Ex-vivo Próbki biologiczne w mikro-tomografii komputerowej (mikro-CT)

Autofagia to wszechobecny proces, który umożliwia komórkom degradację i recykling białek i organelli. Stosujemy zaawansowaną mikroskopię fluorescencyjną do wizualizacji i ilościowego określenia niewielkich, ale istotnych zmian fizycznych związanych z indukcją autofagii, w tym powstawania i dystrybucji autofagosomów i lizosomów oraz ich fuzji w autolizosomy.

Ilościowa analiza autofagii przy użyciu zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej 3D

Czasoprzestrzenne informacje o dynamicznych białkach wewnątrz żywych komórek są kluczowe dla zrozumienia biologii. Rodzaj mikroskopii superrozdzielczej, zwany szybką mikroskopią oświetlenia strukturalnego 3D (f3D-SIM), ujawnia unikalne informacje na temat cytokinetycznego pierścienia Z u bakterii: zarówno jego wygląd podobny do koralików, jak i szybką dynamikę FtsZ w pierścieniu.

Obrazowanie cytokinetycznego pierścienia Z w superrozdzielczości u żywych bakterii przy użyciu szybkiej mikroskopii oświetlenia strukturalnego 3D (f3D-SIM)

Czterowymiarowe (4D) obrazowanie jest wykorzystywane do badania zachowania i interakcji między dwoma typami endosomów w zakończonych nerwach żywych kręgowców.  Ruch tych małych struktur jest scharakteryzowany w trzech wymiarach, co pozwala na potwierdzenie zdarzeń takich jak fuzja endosomów i egzocytoza.

Wizualizacja dynamiki endosomów w żywych zakończeniach nerwowych za pomocą czterowymiarowego obrazowania fluorescencyjnego

Przedstawiamy protokół zastosowania interferometrycznej mikroskopii lokalizacji fotoaktywowanej (iPALM), 3-wymiarowej metody mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek w super rozdzielczości, do obrazowania cytoszkieletu aktynowego w przylegających komórkach ssaków. Takie podejście umożliwia opartą na świetle wizualizację cech strukturalnych w nanoskali, które w przeciwnym razie pozostałyby nierozwiązane przez konwencjonalną mikroskopię optyczną z ograniczoną dyfrakcją.

Trójwymiarowa mikroskopia superrozdzielcza włókien F-aktyny za pomocą interferometrycznej mikroskopii lokalizacji aktywowanej światłem (iPALM)

Udostępniamy proste i solidne protokoły przetwarzania materiału biopsyjnego różnych gatunków, zarodków organizmów modelowych biomedycznych i próbek innych tkanek organicznych, aby umożliwić cyfrowe generowanie danych objętościowych za pomocą metody mikroskopii episkopowej o wysokiej rozdzielczości.

Mikroskopia episkopowa o wysokiej rozdzielczości (HREM) - proste i niezawodne protokoły przetwarzania i wizualizacji materiałów organicznych

Ostatnio zmapowaliśmy trójwymiarowe (3D) przestrzenne lokalizacje tras transportowych dla różnych białek przemieszczających się wewnątrz rzęsek pierwotnych w żywych komórkach. W tym artykule szczegółowo opisano konfigurację eksperymentalną, proces pobierania próbek biologicznych i analizy danych dla podejścia do obrazowania fluorescencji 3D o wysokiej rozdzielczości, nowo zastosowanego w żywych rzęskach pierwotnych.

Zastosowanie szybkiej mikroskopii superrozdzielczej SPEED w żywej rzęsce pierwotnej

Ten protokół wyjaśnia, jak przygotować i zamontować próbki bakterii do trójwymiarowego obrazowania na żywo oraz jak zrekonstruować trójwymiarowy kształt E. coli na podstawie tych obrazów.

Trójwymiarowe obrazowanie komórek bakteryjnych w celu dokładnego odwzorowania komórek i precyzyjnej lokalizacji białek

Tutaj opisujemy narzędzia i metody obliczeniowe, które umożliwiają wizualizację i analizę trzy- i czterowymiarowych danych obrazowych zarodków myszy w kontekście osiowego wydłużania i segmentacji, uzyskanych przez optyczną tomografię projekcyjną in toto oraz przez obrazowanie na żywo i barwienie immunofluorescencyjne w całości za pomocą mikroskopii wielofotonowej.

Trój- i czterowymiarowe podejścia do wizualizacji i analizy w celu badania wydłużenia osiowego i segmentacji kręgowców

Po zintegrowaniu z płytą czołową i konstrukcją optyczną kompatybilną zarówno z mikroskopami jedno-, jak i dwufotonowymi, soczewka mikropryzmatyczna daje znaczącą przewagę w pomiarze odpowiedzi neuronalnych w pionowej kolumnie w różnych warunkach, w tym w dobrze kontrolowanych eksperymentach w stanach skupienia na głowie lub naturalnych zadaniach behawioralnych u swobodnie poruszających się zwierząt.

Długoterminowe obrazowanie zidentyfikowanych populacji neuronów za pomocą mikropryzmatów u zwierząt swobodnie poruszających się i z unieruchomioną głową

Protokół ten opisuje zaawansowane zastosowania obrazowania oraz zarządzanie współzasobami systemu mikroskopu konfokalnego z laserowym skanowaniem zintegrowanym z multipleksowanym detektorem matrycowym do obrazowania komórkowego i subkomórkowego o wysokiej rozdzielczości. Workflow umożliwia obrazowanie multimodalne od konfokalnej do superrozdzielczości (~120 nm) na jednej platformie, czyniąc wizualizację w skali nanoskalowej bardziej dostępną.

Obrazowanie superrozdzielcze i zarządzanie współdzielone: Protokół do mikroskopii konfokalnej z detekcją multipleksową

Poznaj metodę szybkiej akwizycji obrazów 3D mysich zarodków za pomocą mikroskopii episkopowej o wysokiej rozdzielczości. Technika ta umożliwia szczegółową analizę morfometryczną struktur embriogenicznych.

Szybka akwizycja obrazów 3D za pomocą mikroskopii episkopowej o wysokiej rozdzielczości

Przeglądaj więcej filmów