Name: Test fluorescencyjny aktywności scramblazy fosfolipidowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Poznaj fluorescencyjną metodę pomiaru aktywności scramblazy fosfolipidowej w wielowarstwowych liposomach zrekonstruowanych z opsyną. Ta niezawodna technika pozwala badać mechanizmy transportu lipidów międzykomórkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Velux Stiftung (A.K.M.), grant NIH EY024207 (A.K.M.) oraz projekt J3686 (B.P.) Austriackiego Funduszu Naukowego (FWF).

1. Przygotowanie liposomów i proteoliposomów
<ol>
	<li>Tworzenie liposomów
	<ol>
		<li>Za pomocą szklanej strzykawki dodać 1,435 μl POPC (25 mg/ml, w chloroformie) i 160 μl POPG (25 mg/ml w chloroformie) do kolby okrągłodennej, aby uzyskać 52,5 μmol lipidów w stosunku molowym POPC:POPG = 9:1.</li>
		<li>Suszyć lipidy przez 30 minut za pomocą wyparki obrotowej z prędkością obrotową 145 obr./min (dla tej objętości rozpuszczalnika nie jest potrzebna kąpiel wodna), a następnie przenieść kolbę do eksykatora próżniowego na co najmniej 3 godziny lub na noc, w temperaturze pokojowej (RT).</li>
		<li>Uwodnić wysuszony film lipidowy 10 ml 50 mM HEPES pH 7,4, 100 mM NaCl (zwanego dalej buforem A), delikatnie obracając kolbą, aż do uzyskania jednorodnej, mętnej zawiesiny; 
		UWAGA: Oczekuje się, że stężenie lipidów na tym etapie wyniesie 5,25 mM, ponieważ do tej pory nie powinny wystąpić żadne straty.</li>
		<li>Sonikować zawiesinę w łaźni wodnej przez 10 minut w temperaturze pokojowej o częstotliwości 40 kHz. Rozwiązanie będzie wyglądało nieco jaśniej.</li>
		<li>Za pomocą ekstrudera przepuść zawiesinę 10 razy przez membranę o wielkości porów 400 nm, a następnie wykonaj drugi cykl wytłaczania z 4 przejściami przez membranę o wielkości porów 200 nm. 
		UWAGA: Średnia średnica powstałych LUV wynosi ~175 nm. W razie potrzeby rozmiar i jednorodność LUV można sprawdzić za pomocą dynamicznego rozpraszania światła zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Określić ilościowo stężenie fosfolipidów w zawiesinie LUV zgodnie z opisem w sekcji 1.2). 
		UWAGA: Ze względu na straty podczas wytłaczania stężenie wynosi zwykle około 3,6 mM.</li>
		<li>Przechowuj LUV w temperaturze 4 °C przez około 2 tygodnie, jeśli nie zostaną natychmiast użyte.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kwantyfikacja fosfolipidów 
	UWAGA: W celu określenia stężenia fosfolipidów w zawiesinie LUV używanej do rekonstytucji, a także stężenia proteoliposomów, które ostatecznie są generowane, podwielokrotność próbki poddaje się utlenianiu kwasem nadchlorowym. Procedura ta rozkłada fosfolipidy w celu uwolnienia nieorganicznego fosforanu, który jest następnie oznaczany ilościowo za pomocą testu kolorymetrycznego w porównaniu z wzorcami 23.
	<ol>
		<li>Przygotować 40 mM roztwór podstawowy fosforanu sodu (Na2HPO4) w dejonizowanej wodzie destylowanej.</li>
		<li>Rozcieńczyć roztwór podstawowy dejonizowaną wodą destylowaną, aby uzyskać roztwory robocze o stężeniu 4 mM i 0,4 mM, które posłużą jako wzorce kalibracyjne.</li>
		<li>Korzystając z roztworów roboczych, przygotuj wzorce w szklanych probówkach o wymiarach od 13 x 100 mm2 do 0 do 80 nmol fosforanu sodu w końcowej objętości 50 μl.</li>
		<li>Pobrać po 10 μl każdej z próbek LUV i proteoliposomów do ilościowego oznaczenia i rozcieńczyć 40 μl ddH2O w szklanych probówkach o wymiarach 13 x 100 mm2. 
		UWAGA: Ponieważ stężenie lipidów w LUV i proteoliposomach mieści się w zakresie 2,5-5 μM, 10 μl próbki powinno zawierać 25-50 nmol fosforu lipidowego.</li>
		<li>Dodać 300 μl kwasu nadchlorowego do każdego z wzorców i próbek i ogrzewać przez 1 godzinę w temperaturze 145 °C w bloku grzewczym. Połóż kulki na rurkach, aby zapobiec parowaniu.</li>
		<li>Pozwól probówkom ostygnąć do temperatury pokojowej i dodaj 1 ml ddH2O.</li>
		<li>Dodać po 400 μl świeżo przygotowanego 12 g/l molibdenianu amonu i 50 g/l askorbinianu sodu i wymieszać.</li>
		<li>Podgrzewać przez 10 minut w temperaturze 100 °C z kulkami na rurkach. Wyjmij rurki z bloku grzewczego i pozwól im ostygnąć do temperatury pokojowej.</li>
		<li>Zmierzyć absorbancję próbek w stosunku do próby ślepej (próbka wzorcowa zawierająca 0 nmol fosforanu sodu) za pomocą spektrometru o długości fali 797 nm.</li>
		<li>Oznaczyć zawartość fosforanów w próbkach w stosunku do krzywej wzorcowej kalibracji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rekonstrukcja Opsin 
	UWAGA: Konieczne jest określenie optymalnych warunków pęcznienia do rozpuszczenia, ponieważ zależą one od rodzaju detergentu, a także składu lipidowego i stężenia LUV. Ponieważ LUV zmieniają swoje właściwości rozpraszania światła podczas pęcznienia, proces ten można monitorować, mierząc absorbancję (rysunek 2), zgodnie z przeglądem Rigaud i Levy'ego, 24 oraz Geertsma i wsp. 25.
	<ol>
		<li>Pobrać pipetą 800 μl LUV (z sekcji 1.1; ponieważ odzysk lipidów po ekstruzji wynosi 70%, oczekiwane stężenie LUV wynosi 3,6 mM fosfolipidów) do probówki do mikrofuge o pojemności 2 ml.</li>
		<li>Dodać 5,3 μl buforu A i 34,7 μl 10% (w/v) DDM rozpuszczonego w buforze A.</li>
		<li>Inkubować przez 3 godziny w temperaturze pokojowej z mieszaniem koniec po końcu.</li>
		<li>W międzyczasie przygotuj kulki styropianowe:
		<ol>
			<li>Użyć 400 mg kulek na próbkę i odważyć je w szklanej zlewce.</li>
			<li>Umyj je dwukrotnie metanolem, trzy razy wodą i raz buforem A. Na każdy etap mycia użyj 5 ml płynu i powoli mieszaj przez 10 min. 
			UWAGA: Zaleca się przygotowanie kulek styropianowych na kilka próbek jednocześnie, np. odważenie 6 g kulek i umycie 75 ml płynu. Nadmiar koralików można przechowywać w lodówce przez kilka dni.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>W ciągu ostatnich 30 minut destabilizacji pęcherzyków wysuszyć fosfolipid znakowany NBD w szklanej probówce z nakrętką ("szklana probówka do rekonstytucji"): Na próbkę 9,5 μl NBD-PC (1 mg/ml w chloroformie, co daje 0,4 mol% całkowitych fosfolipidów) suszy się pod strumieniem azotu w szklanej probówce, a następnie rozpuszcza się w 45 μl 0,1% (w/v) DDM w buforze A.</li>
		<li>Po 3 godzinach destabilizacji pęcherzyków dodać rozpuszczony fosfolipid znakowany NBD, białko rozpuszczone DDM i bufor A tak, aby końcowa objętość 1 ml zawierała 0,36% (w/v), tj. 7 mM, DDM.
		<ol>
			<li>Tak więc, aby wytworzyć liposomy bezbiałkowe (używane jako próbka kontrolna) dodać 45 μl NBD-PC (rozpuszczonego w 0,1% DDM), 60 μl 0,1% DDM i 55 μl buforu A; dla proteoliposomów dodać np. 40 μl białka (z typowego roztworu podstawowego ~110 ng/μl) w 0,1% DDM, 45 μl NBD-PC (rozpuszczony w 0,1% DDM), 20 μl 0,1% DDM i 55 μl buforu A. 
			UWAGA: Kolejność dodawania powinna być zgodna z podaną na liście.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Mieszać próbkę przez dodatkowe godziny w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Dodać 80 mg przygotowanych kulek polistyrenowych i inkubować próbkę, mieszając od końca do końca przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Następnie dodać dodatkowe 160 mg kulek polistyrenowych i inkubować z mieszaniem od końca do końca przez kolejne 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przenieść próbkę (pozostawiając zużyte kulki polistyrenu) do szklanej rurki z nakrętką zawierającą 160 mg świeżych kulek polistyrenowych i mieszać przez noc w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: Najłatwiejszym sposobem przeniesienia próbki i uniknięcia zasysania kulek jest użycie pipety Pasteura, która jest dociskana do dna szklanej rurki z niewielkim nadciśnieniem. Gdy końcówka pipety mocno przylega do dna probówki, próbkę można łatwo pobrać bez ingerencji w kulki.</li>
		<li>Następnego ranka przenieś próbkę do probówki do mikrofuge bez przenoszenia kulek i umieść na lodzie w ramach przygotowań do testu aktywności scramblase.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Test aktywności Scramblase
UWAGA: Intensywność fluorescencji liposomów lub proteoliposomów rozcieńczonych buforem A jest monitorowana w czasie po dodaniu ditionitu w spektrometrze fluorescencji. Aby uzyskać stabilną intensywność początkową, fluorescencję rejestruje się przez co najmniej 50 sekund (lub do momentu uzyskania stabilnego sygnału) przed dodaniem ditionitu do stale mieszanej próbki, a następnie śledzi się ją przez co najmniej 500 sekund po dodaniu ditionitu.
<ol>
	<li>Dodać 1 950 μl buforu A do plastikowej kuwety zawierającej mini mieszadło.</li>
	<li>Dodać 50 μl przygotowanego proteo(liposomów) i pozostawić próbkę do równowagi w spektrometrze fluorescencyjnym przy ciągłym mieszaniu przez kilka sekund.</li>
	<li>W międzyczasie należy przygotować roztwór 1 M ditionitu w 0,5 M niebuforowanym Tris (np. dla dwóch próbek odważyć 20 mg ditionitu w probówce do mikrodymu i rozpuścić w 114 μl lodowatego 0,5 M Tris bezpośrednio przed użyciem i przechowywać na lodzie do następnej próbki). 
	UWAGA: Roztwór ditionitu musi być przygotowany na świeżo i nie powinien być używany później niż 20 minut po przygotowaniu; Jeśli ma być wykonanych wiele pomiarów, podwielokrotności ditionitu można wcześniej zważyć i rozpuścić tuż przed użyciem.</li>
	<li>Rozpocznij monitorowanie fluorescencji (wzbudzenie 470 nm, emisja 530 nm, szerokość szczeliny 0,5 nm).</li>
	<li>Dodać 40 μl 1 M roztworu ditionitu do kuwety 50 sekund po rozpoczęciu zapisu fluorescencji (jeśli to możliwe, użyć przegrody w pokrywie komory kuwety) i kontynuować rejestrację fluorescencji przez kolejne 400-600 sekund.</li>
	<li>Przeanalizuj dane zgodnie z opisem w sekcji 3.</li>
</ol>
3. Analiza danych
<ol>
	<li>Kinetyka mieszania
	<ol>
		<li>Scharakteryzować ślad fluorescencji każdej próbki otrzymanej za pomocą testu aktywności scramblaza, definiując początkową fluorescencję Fi fluorescencję punktu końcowego F, osiągniętą po >400 sekundach. Fi określa się dla każdej próbki jako średnią wartość fluorescencji w okresie 30 sekund przed dodaniem ditionititu.</li>
		<li>Określić dane punktu końcowego odpowiadające zakresowi redukcji fluorescencji, R = 100•F/Fi. Używamy terminów RL dla liposomów bezbiałkowych i RP dla proteoliposomów zawierających opsynę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oznaczanie masy cząsteczkowej funkcjonalnie odtworzonej scramblazy
	<ol>
		<li>Przelicz dane redukcji fluorescencji zgodnie z następującym równaniem: 
		p(≥1 scramblase) = (RP − RL)/(Rmax − RL) (Równanie 1) 
		UWAGA: Gdzie Rmax jest maksymalną redukcją, którą uzyskuje się, gdy rozpuszczona jest wystarczająca ilość białka w taki sposób, że wszystkie pęcherzyki w próbce posiadają co najmniej jedną funkcjonalną scramblazę, a p jest prawdopodobieństwem, że dany pęcherzyk w odtworzonej próbce jest "aktywny w scramblazie", tj. posiada co najmniej jedną funkcjonalną scramblazę. Wartość RL wynosi zwykle 45% 3 , podczas gdy Rmax wynosi zwykle 82,5% 3 , zamiast oczekiwanych 100% (Rmax można eksperymentalnie określić dla proteoliposomów opsyny o PPR >1 mg / mmol). Ponieważ Rmax <100% zakłada się, że subpopulacja pęcherzyków jest oporna na rekonstytucję. Dla Rmax = 82,5% frakcja pęcherzyków, która nie jest w stanie przyjąć białka, wynosi 0,35.</li>
		<li>Opisz związek między scramblazą p(≥1) a PPR (mg białko/fosfolipid mmol) za pomocą statystyk Poissona w następujący sposób: 
		p(≥1 scramblase) = 1 - e-m = 1 - exp(-PPR/α) (Równanie 2) 
		UWAGA: Gdzie m = liczba scramblasów na pęcherzyk, a α = monowykładnicza stała dopasowania w jednostkach mg białka/fosfolipidu mmol.</li>
		<li>Ponieważ część pęcherzyków nie przyczynia się do mieszania nawet przy wysokim PPR (patrz dyskusja), zmodyfikuj równanie na: 
		p(≥1 scramblase) = 1 - exp(-PPR*/α) (Równanie 3) 
		UWAGA: Gdzie PPR* = PPR/(1-f), gdzie f jest oporną na leczenie populacją pęcherzyków lub, w tym przypadku, PPR* = PPR/0,65 (równanie 4). 
		UWAGA: Stała dopasowania α jest określana przez dopasowanie wykresu scramblase p(≥1) w funkcji PPR* za pomocą funkcji monowykładniczej. Jeśli opsyna (masa cząsteczkowa 41,7 kDa) funkcjonalnie odtwarza się w pęcherzykach o średnicy 175 nm (każdy pęcherzyk ma 280 000 fosfolipidów 26) jako monomer, α = 0,187 mg mmol-1. Jeśli opsyna dimeryzuje przed rozpuszczeniem 3, aby uzyskać pęcherzyki aktywne pod wpływem skramblazy, to α = 0,37 mg mmol−1. Gdyby do analizy użyto PPR, a nie PPR*, wówczas odpowiednie wartości α wynosiłyby 0,122 i 0,244 mg mmol−1. Te przewidywane wartości dla α zakładają, że wszystkie cząsteczki opsyny są funkcjonalnie kompetentne. Jeśli tylko frakcja cząsteczek jest zdolna do mieszania lipidów, odpowiednie wartości α będą większe.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Ernst, O. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+and+animal+rhodopsins%3A+structures%2C+functions%2C+and+molecular+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Microbial and animal rhodopsins: structures, functions, and molecular mechanisms.</a> Chem. Rev. 114, 126-163 (2014).</li>
<li>Menon, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opsin+is+a+phospholipid+flippase%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol.+CB%22%5BJournal%5D)">Opsin is a phospholipid flippase.</a> Curr. Biol. CB. 21, 149-153 (2011).</li>
<li>Goren, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+phospholipid+scramblase+activity+of+a+G+protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Constitutive phospholipid scramblase activity of a G protein-coupled receptor.</a> Nat. Commun. 5, 5115(2014).</li>
<li>Ernst, O. P., Menon, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+scrambling+by+rhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol.+Sci.+Off.+J.+Eur.+Photochem.+Assoc.+Eur.+Soc.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Phospholipid scrambling by rhodopsin.</a> Photochem. Photobiol. Sci. Off. J. Eur. Photochem. Assoc. Eur. Soc. Photobiol. , (2015).</li>
<li>Sanyal, S., Menon, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flipping+lipids%3A+why+an%27+what%27s+the+reason+for%3F%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Flipping lipids: why an' what's the reason for?</a> ACS Chem. Biol. 4, 895-909 (2009).</li>
<li>Bevers, E. M., Williamson, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+scramblase%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Phospholipid scramblase: an update.</a> FEBS Lett. 584, 2724-2730 (2010).</li>
<li>Leventis, P. A., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distribution+and+function+of+phosphatidylserine+in+cellular+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys%22%5BJournal%5D)">The distribution and function of phosphatidylserine in cellular membranes.</a> Annu. Rev. Biophys. 39, 407-427 (2010).</li>
<li>Quazi, F., Lenevich, S., Molday, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABCA4+is+an+N-retinylidene-phosphatidylethanolamine+and+phosphatidylethanolamine+importer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">ABCA4 is an N-retinylidene-phosphatidylethanolamine and phosphatidylethanolamine importer.</a> Nat. Commun. 3, 925(2012).</li>
<li>Quazi, F., Molday, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP-binding+cassette+transporter+ABCA4+and+chemical+isomerization+protect+photoreceptor+cells+from+the+toxic+accumulation+of+excess+11-cis-retinal%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">ATP-binding cassette transporter ABCA4 and chemical isomerization protect photoreceptor cells from the toxic accumulation of excess 11-cis-retinal.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 5024-5029 (2014).</li>
<li>Ben-Shabat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+a+nonaoxirane+from+A2E%2C+a+lipofuscin+fluorophore+related+to+macular+degeneration%2C+and+evidence+of+singlet+oxygen+involvement%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Formation of a nonaoxirane from A2E, a lipofuscin fluorophore related to macular degeneration, and evidence of singlet oxygen involvement.</a> Angew. Chem. Int. Ed Engl. 41, 814-817 (2002).</li>
<li>Sparrow, J. R., Wu, Y., Kim, C. Y., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+meets+all-trans-retinal%3A+the+making+of+RPE+bisretinoids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Phospholipid meets all-trans-retinal: the making of RPE bisretinoids.</a> J. Lipid Res. 51 (2010), 247-261 (2010).</li>
<li>Schütt, F., Davies, S., Kopitz, J., Holz, F. G., Boulton, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodamage+to+human+RPE+cells+by+A2-E%2C+a+retinoid+component+of+lipofuscin%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Photodamage to human RPE cells by A2-E, a retinoid component of lipofuscin.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41, 2303-2308 (2000).</li>
<li>Picollo, A., Malvezzi, M., Accardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TMEM16+proteins%3A+unknown+structure+and+confusing+functions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">TMEM16 proteins: unknown structure and confusing functions.</a> J. Mol. Biol. 427, 94-105 (2015).</li>
<li>Mohammadi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+FtsW+as+a+transporter+of+lipid-linked+cell+wall+precursors+across+the+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Identification of FtsW as a transporter of lipid-linked cell wall precursors across the membrane.</a> EMBO J. 30, 1425-1432 (2011).</li>
<li>Meeske, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MurJ+and+a+novel+lipid+II+flippase+are+required+for+cell+wall+biogenesis+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">MurJ and a novel lipid II flippase are required for cell wall biogenesis in Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 6437-6442 (2015).</li>
<li>Ruiz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+Flippases+for+Bacterial+Peptidoglycan+Biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Lipid+Insights%22%5BJournal%5D)">Lipid Flippases for Bacterial Peptidoglycan Biosynthesis.</a> Lipid Insights. 8, 21-31 (2015).</li>
<li>Rick, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+the+wzxE+gene+of+Escherichia+coli+K-12+encodes+a+protein+involved+in+the+transbilayer+movement+of+a+trisaccharide-lipid+intermediate+in+the+assembly+of+enterobacterial+common+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Evidence that the wzxE gene of Escherichia coli K-12 encodes a protein involved in the transbilayer movement of a trisaccharide-lipid intermediate in the assembly of enterobacterial common antigen.</a> J. Biol. Chem. 278, 16534-16542 (2003).</li>
<li>Suzuki, J., Imanishi, E., Nagata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+of+phosphatidylserine+by+Xk-related+protein+family+members+during+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Exposure of phosphatidylserine by Xk-related protein family members during apoptosis.</a> J. Biol. Chem. 289, 30257-30267 (2014).</li>
<li>Suzuki, J., Nagata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+scrambling+on+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Phospholipid scrambling on the plasma membrane.</a> Methods Enzymol. 544, 381-393 (2014).</li>
<li>Alaimo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+but+interchangeable+mechanisms+for+flipping+of+lipid-linked+oligosaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Two distinct but interchangeable mechanisms for flipping of lipid-linked oligosaccharides.</a> EMBO J. 25, 967-976 (2006).</li>
<li>Ernst, C. M., Peschel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad-spectrum+antimicrobial+peptide+restistance+by+MprF-mediated+aminoacylation+and+flipping+of+phospholipids%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbial%22%5BJournal%5D)">Broad-spectrum antimicrobial peptide restistance by MprF-mediated aminoacylation and flipping of phospholipids.</a> Mol. Microbial. 80 (2), 290-299 (2011).</li>
<li>Vehring, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flip-flop+of+fluorescently+labeled+phospholipids+in+proteoliposomes+reconstituted+with+Saccharomyces+cerevisiae+microsomal+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot.+Cell%22%5BJournal%5D)">Flip-flop of fluorescently labeled phospholipids in proteoliposomes reconstituted with Saccharomyces cerevisiae microsomal proteins.</a> Eukaryot. Cell. 6, 1625-1634 (2007).</li>
<li>Rouser, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+dimensional+then+%5Bsic%5D+layer+chromatographic+separation+of+polar+lipids+and+determination+of+phospholipids+by+phosphorus+analysis+of+spots%5BTitle%5D)+AND+%22Lipids%22%5BJournal%5D)">Two dimensional then [sic] layer chromatographic separation of polar lipids and determination of phospholipids by phosphorus analysis of spots.</a> Lipids. 5, 494-496 (1970).</li>
<li>Rigaud, J. -L., Lévy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of membrane proteins into liposomes.</a> Methods Enzymol. 372, 65-86 (2003).</li>
<li>Geertsma, E. R., Nik Mahmood, N. A. B., Schuurman-Wolters, G. K., Poolman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+reconstitution+of+ABC+transporters+and+assays+of+translocator+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Membrane reconstitution of ABC transporters and assays of translocator function.</a> Nat. Protoc. 3, 256-266 (2008).</li>
<li>Mimms, L. T., Zampighi, G., Nozaki, Y., Tanford, C., Reynolds, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+vesicle+formation+and+transmembrane+protein+incorporation+using+octyl+glucoside%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Phospholipid vesicle formation and transmembrane protein incorporation using octyl glucoside.</a> Biochemistry. 20, 833-840 (1981).</li>
<li>Malvezzi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B-dependent+phospholipid+scrambling+by+a+reconstituted+TMEM16+ion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Ca2+-dependent phospholipid scrambling by a reconstituted TMEM16 ion channel.</a> Nat. Commun. 4, 2367(2013).</li>
<li>Eckford, P. D. W., Sharom, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reconstituted+P-glycoprotein+multidrug+transporter+is+a+flippase+for+glucosylceramide+and+other+simple+glycosphingolipids%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">The reconstituted P-glycoprotein multidrug transporter is a flippase for glucosylceramide and other simple glycosphingolipids.</a> Biochem. J. 389, 517-526 (2005).</li>
<li>Marek, M., Günther-Pomorski, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+of+Flippase+Activity+in+Proteoliposomes+Using+Fluorescent+Lipid+Derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Assay of Flippase Activity in Proteoliposomes Using Fluorescent Lipid Derivatives.</a> Methods Mol. Biol. 1377, 181-191 (2016).</li>
<li>Coleman, J. A., Kwok, M. C. M., Molday, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+purification%2C+and+functional+reconstitution+of+the+P4-ATPase+Atp8a2%2C+a+phosphatidylserine+flippase+in+photoreceptor+disc+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Localization purification, and functional reconstitution of the P4-ATPase Atp8a2, a phosphatidylserine flippase in photoreceptor disc membranes.</a> J. Biol. Chem. 284, 32670-32679 (2009).</li>
<li>Coleman, J. A., Quazi, F., Molday, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+P4-ATPases+and+ABC+transporters+and+their+role+in+phospholipid+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Mammalian P4-ATPases and ABC transporters and their role in phospholipid transport.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1831, 555-574 (2013).</li>
<li>Romsicki, Y., Sharom, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+flippase+activity+of+the+reconstituted+P-glycoprotein+multidrug+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Phospholipid flippase activity of the reconstituted P-glycoprotein multidrug transporter.</a> Biochemistry. 40, 6937-6947 (2001).</li>
<li>Zhou, X., Graham, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+phospholipid+translocase+activity+with+purified+Drs2p%2C+a+type-IV+P-type+ATPase+from+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of phospholipid translocase activity with purified Drs2p, a type-IV P-type ATPase from budding yeast.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 16586-16591 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Test aktywności scramblase pozwolił nam pierwotnie ustalić, że opsyna ma aktywność fosfolipidową 2. Test pozwolił nam również scharakteryzować aktywność skramblazy opsyny poprzez testowanie swoistości (użyliśmy różnych lipidów reporterowych znakowanych NBD, takich jak NBD-fosfatydyloetanoloamina, znakowana NBD na łańcuchu acylowym, jak pokazano dla NBD-PC na rysunku 1A, lub na grupie głównej, NBD-sfingomielina lub NBD-fosfatydyloseryna 2), wpływ składu lipidowego pęcherzyków (np...

Fotoreceptor rhodopsin, prototypowy receptor sprzężony z białkiem G (omówiony na przykład w odniesieniu 1), jest pierwszym zidentyfikowanym i zweryfikowanym biochemicznie skramblasem fosfolipidowym 2,3. Skramblasy są transporterami fosfolipidów, które zwiększają naturalnie powolną szybkość transportu fosfolipidów przez warstwy błony do poziomów fizjologicznie odpowiednich w sposób dwukierunkowy i niezależny od ATP 4-6. Przykłady ich działania można znaleźć w retikulum endoplazmatycznym i bakteryjnej błonie cytoplazmatycznej, gdzie konstytutywny proces skramblowania jest niezbędny dla homeostazy i wzrostu błony, a także dla wielu szlaków glikozylacji 5. Regulowane skramblowanie fosfolipidów jest konieczne do odsłonięcia fosfatydyloseryny (PS) na powierzchni komórek apoptotycznych, gdzie działa ona jako sygnał „zjedz mnie” dla makrofagów 7, oraz do zapewnienia prokoagulacyjnej powierzchni na aktywowanych płytkach krwi w celu katalizy produkcji czynników białkowych niezbędnych do krzepnięcia krwi. W błonach dysków fotoreceptorów zasugerowano, że aktywność skramblująca rhodopsiny przeciwdziała niezrównoważeniu fosfolipidów między dwiema warstwami błony dwuwarstwowej, które jest generowane przez zależną od ATP, jednokierunkową flippingazę lipidową ABCA4 4,8,910-12.
Pomimo fizjologicznego znaczenia scramblaz, ich tożsamość pozostawała nieznana, dopóki nie zgłoszono, że rodopsyna pełni funkcję scramblazy w dyskach fotoreceptorów 2, członkowie rodziny białek TMEM16 zostali zidentyfikowani jako zależne od Ca2+ scramblazy niezbędne do ekspozycji PS w błonie plazmatycznej (przegląd w odniesieniu 13), a bakteryjne białko FtsW zostało zaproponowane jako scramblaza Lipid II wymagana do syntezy peptydoglikanu 14. Odkrycia te opierały się na rekonstytucji oczyszczonych białek w liposomach i wykazaniu aktywności scramblazy w powstałych proteoliposomach przy użyciu opisanej tutaj metodologii. Inne potencjalne scramblazy 15-21 — białka MurJ i AmJ zaangażowane w biosyntezę peptydoglikanu, białka WzxE i białka pokrewne zaangażowane w scrambling prekursorów antygenu O, białko MprF niezbędne do translokacji aminoacylowanego fosfatydyloglicerolu przez bakteryjną błonę cytoplazmatyczną oraz członkowie rodziny Xkr8, którym przypisano rolę w ekspozycji PS na powierzchni komórek apoptotycznych — wciąż wymagają weryfikacji biochemicznej. Podkreśla to znaczenie zastosowania wiarygodnego testu w celu identyfikacji i charakterystyki aktywności scramblazy.
W niniejszej pracy opisujemy rekonstytucję oczyszczonej opsyny, apoproteiny fotoreceptora rodopsyny, w dużych jednowarstwowych pęcherzykach (LUVs) oraz następującą analizę aktywności skramblazy w powstałych proteoliposomach z wykorzystaniem testu fluorescencyjnego. W literaturze dostępnych jest kilka dobrze opisanych protokołów heterologicznej ekspresji i oczyszczania opsyny, dlatego nie będziemy ich tutaj opisywać; stosujemy protokoły opisane przez Goren et al. 3, które pozwalają uzyskać termostabilną opsynę z tagiem FLAG w stężeniu około 100 ng/µl w 0,1% (w/v) dodecylmaltosydzie (DDM).
Rekonstytucję osiąga się poprzez traktowanie LUV odpowiednią ilością detergentu, tak aby spuchły, ale nie uległy rozpuszczeniu. W tych warunkach białko błonowe — dostarczone w formie miceli białko-detergent — wbuduje się w liposomy i zostanie włączone do błony liposomalnej po usunięciu detergentu, co doprowadzi do powstania proteoliposomów. Aby przeprowadzić rekonstytucję opsyny (otrzymanej jako oczyszczone białko w 0,1% (w/v) DDM), LUV przygotowuje się z mieszaniny POPC (1-palmitoil-2-oleoil-sn-glycero-3-fosfocholiny) i POPG (1-palmitoil-2-oleoil-sn-glycero-3-[fosfo-rac-(1-gliceryny)]) i nasyca się je DDM przed dodaniem opsyny i NBD-PC. Następnie detergent jest usuwany poprzez traktowanie próbki kuleczkami polistyrenowymi.
Zasada działania testu fluorescencyjnego przedstawiona jest na Rysunku 1B. LUV są symetrycznie rekonstytuowane z niewielką ilością NBD-PC lub innego znakowanego NBD fluorescencyjnego fosfolipidowego reportera (Rysunek 1A). Po dodaniu ditionianu, dianionu nieprzenikającego przez błonę, cząsteczki NBD-PC w zewnętrznej warstwie LUV przestają fluorescować, ponieważ grupa nitro NBD zostaje zredukowana do niefluorescencyjnej grupy aminowej. Ponieważ ani cząsteczki NBD-PC, ani ditionian nie są w stanie przeniknąć przez błonę w czasie trwania eksperymentu (&lt;10 min), prowadzi to do 50% redukcji sygnału fluorescencyjnego. Jednakże, jeśli liposomy są rekonstytuowane ze scramblazą, cząsteczki NBD-PC z wewnętrznej warstwy mogą szybko przemieścić się na zewnątrz, gdzie zostaną zredukowane. W idealnym przypadku prowadzi to do całkowitej utraty fluorescencji (Rysunek 1C).
<img alt="Proces redukcji barwnika w liposomach; schemat: konwersja NBD-PC; wykres zaniku fluorescencji w obecności ditionianu." src="/files/ftp_upload/54635/54635fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schematyczny przebieg testu aktywności skramblazy. Analiza wykorzystuje fluorescencyjny lipid reporterowy znakowany NBD; przedstawiono NBD-PC (A). Duże jednowarstwowe pęcherzyki (LUV) są rekonstytuowane z niewielką ilością NBD-PC. Rekonstytucja prowadzi do powstania symetrycznych pęcherzyków, w których NBD-PC jest rozmieszczone równomiernie w zewnętrznej i wewnętrznej warstwie lipidowej. Ditionian (S2O42-) chemicznie redukuje grupę nitrową NBD do niefluoryzującej grupy aminowej. Traktowanie liposomów wolnych od białek ditionianem (B, góra) powoduje 50% redukcję fluorescencji, ponieważ zredukowane zostają jedynie cząsteczki NBD-PC w zewnętrznej warstwie: ditionian jest naładowany ujemnie i nie może przenikać przez błonę, aby zareagować z cząsteczkami NBD-PC w warstwie wewnętrznej. Obróbka ditionianem proteoliposomów zawierających opsynę (B, dół), t. j., proteoliposomy z aktywną skramblazą, prowadzi do 10% utraty fluorescencji, ponieważ opsyna ułatwia przemieszczanie się NBD-PC między wewnętrzną a zewnętrzną warstwą błony. (C) przedstawia zidealizowane przebiegi fluorescencji uzyskane po potraktowaniu liposomów wolnych od białek oraz proteoliposomów zawierających opsynę ditionianem. Szybkość utraty fluorescencji jest w obu przypadkach taka sama, co wskazuje, że chemiczna redukcja NBD przez ditionian jest etapem limitującym szybkość reakcji, a przemieszanie (scrambling) zachodzi z szybkością równą lub większą od szybkości reakcji chemicznej. Przebiegi uzyskane w rzeczywistym eksperymencie przedstawiono w Rysunek 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54635/54635fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
Opisane przez nas metody mogą być wykorzystane do rekonstytucji i analizy innych oczyszczonych białek, a także mieszanin białek błonowych otrzymywanych, na przykład, poprzez ekstrakcję mikrosoomów detergentem 2.

<table><tbody><tr><td>1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glycero-3-fosfocholina</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850457C</td><td>POPC</td></tr><tr><td>1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sól sodowa)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840457C</td><td>POPG</td></tr><tr><td>1-palmitoilo-2-{6-[7-nitro-2-1,3-benzoksadiazol-4-ylo)amino]heksanoyl}-sn-glicero-3-fosfocholina</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>810130C</td><td>NBD-PC Kwas</td></tr><tr><td>4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy</td><td>VWR Scientific</td><td>EM-5330</td><td>HEPES</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653-1KG</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Dodecyl-&beta;-D-maltozyd</td><td>Anatrace</td><td>D310 5 GM</td><td>DDM</td></tr><tr><td>Kuwety fluorymetryczne</td><td>sigma</td><td>C0918-100EA</td><td>kuwety</td></tr><tr><td>Spektrofluorometr</td><td>Photon Technology International, Inc.</td><td>fluorymetr</td><td></td></tr><tr><td>Wodorosiarczyn sodu klasy technicznej, 85%</td> <td>Sigma</td><td>157953-5G</td><td>ditionit</td></tr><tr><td></td><td></td><td>Oprogramowanie GraphPad Prism 5</td><td>Prism</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>VWR</td><td>JTX171-3</td><td>Tris</td></tr><tr><td>LIPEX 10 ml extruder&nbsp;</td><td>Północna firma Lipids, Inc.</td><td></td><td>Ekstruder</td></tr><tr><td>Whatman, Tarcza drenażowa, PE, 25 mm</td><td>Sigma</td><td>28156-243</td><td>Wspornik dysku</td></tr><tr><td>Membrany Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes, 0,4 i mikro; m, Średnica 25 mm</td> Membrana <td>Sigma</td><td>WHA110607</td><td>400 nm</td></tr><tr><td>Membrany Whatman Nucleopore Track-Etched Membranes, 0,2 i mikro; m, Średnica 25 mm</td><td>Membrana sodowa Sigma</td><td>WHA110606</td><td>200 nm</td></tr><tr><td>Sigma</td><td></td><td>S3264-500G</td><td></td></tr><tr><td>Probówki hodowlane VWR, jednorazowe, ze szkła borokrzemianowego, 13 x 100 mm</td><td>Rurki szklane</td><td>VWR Scientific</td><td>47729-572</td></tr><tr><td>Kwas nadchlorowy</td><td>Sigma</td><td>30755-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Tetrahydrat molibdenianu amonu</td><td>Sigma</td><td>A-7302</td><td>molibdenian amonu</td></tr><tr><td>(+)-L-askorbinian sodu</td><td>Sigma</td><td>A7631-25G</td><td>askorbinian sodu</td></tr><tr><td>Bio-Beads SM2 adsorbenty</td><td>Bio Rad</td><td>1523920</td><td>polistyrenu</td></tr><tr><td>&nbsp; Mikroprobówki 2,0 ml przezroczyste</td><td>VWR Scientific</td><td>10011-742</td><td>Probówki</td></tr> do <tr><td>rekonstytucji Szklana probówka do rekonstytucji</td><td>VWR Scientific</td><td>53283-800</td><td>Probówki szklane do rekonstytucji</td></tr><tr><td>Zetasizer&nbsp;</td><td>Malvern&nbsp;</td><td></td><td>Dls</td></tr></tbody></table>

test fluorescencyjny aktywności scramblazy fosfolipidowej

A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

Scramblases translokują fosfolipidy przez dwuwarstwę błony dwukierunkowo w sposób niezależny od ATP. Pierwszym scramblazem, który został zidentyfikowany i zweryfikowany biochemicznie, była opsyna, apoproteina fotoreceptora rodopsyny. Rodopsyna jest receptorem sprzężonym z białkiem G zlokalizowanym w błonach dyskowych fotoreceptorów pręcików siatkówki, gdzie jest odpowiedzialna za percepcję światła. Aktywność śramblazy rodopsyny nie zależy od jej liganda 11-cis-retinalu, tj. opsyna apoproteinowa jest również aktywna jako scramblaza. Chociaż konstytutywne i regulowane mieszanie fosfolipidów odgrywa ważną rolę w fizjologii komórki, do tej pory zidentyfikowano tylko kilka scramblazów fosfolipidowych oprócz opsyny. Tutaj opisujemy oparty na fluorescencji test aktywności szyfrującej opsyny. Opsyna jest odtwarzana w dużych liposomach jednowarstwowych złożonych z fosfatydylocholiny, fosfatydyloglicerolu i śladowej ilości fluorescencyjnego PC znakowanego NBD (1-palmitoilo-2-{6-[7-nitro-2-1,3-benzoksadiazolo-4-ylo)amino]heksanoilo}-sn-glicero-3-fosfocholiny). Aktywność scramblazy określa się, mierząc stopień, w jakim cząsteczki NBD-PC znajdujące się w wewnętrznej płatku pęcherzyka są w stanie uzyskać dostęp do płatka zewnętrznego, gdzie ich fluorescencja jest chemicznie eliminowana przez środek redukujący, który nie może przejść przez błonę. Metody, które opisujemy, mają ogólne zastosowanie i mogą być wykorzystywane do identyfikacji i charakterystyki aktywności scramblazowej innych białek błonowych.

Opisujemy rekonstytucję opsyny w LUV w celu scharakteryzowania jej aktywności scramblazy przy użyciu testu fluorescencyjnego. Analizujemy wyniki, aby określić dolną granicę szybkości pośredniej przez opsynę wymiany fosfolipidów (scrambling) oraz ustalić stan oligomeryczny, w którym opsyna funkcjonalnie rekonstytuuje się w pęcherzykach.
Aby zidentyfikować optymalne warunki rekonstytucji, konieczne jest empiryczne określenie ilośc...

Opisujemy test oparty na fluorescencji do pomiaru mieszania fosfolipidów w dużych liposomach jednowarstwowych odtworzonych za pomocą opsyny.

Test fluorescencyjny aktywności scramblazy fosfolipidowej

Scramblases translocate phospholipids across the membrane bilayer bidirectionally in an ATP-independent manner. The first scramblase to be identified and ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest rekonstytucja typowego receptora sprzężonego z białkiem G w dużych pęcherzykach jednowarstwowych oraz pomiar jego zdolności do przeprowadzania niezależnego transportu fosfolipidów przez dwuwarstwę lipidową przy użyciu testu opartego na fluorescencji. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie międzykomórkowego transportu lipidów, takie jak: jaka jest tożsamość molekularna białek zdolnych do przemieszczania lipidów i jaki jest ich mechanizm. Główną zaletą tej techniki jest jej wysoka niezawodność i stabilność.Po ustaleniu procedury rekonstytucji dla danego składu lipidów i preferowanego detergentu, należy rozpocząć tę procedurę, używając szklanej strzykawki do dodania 1435 µL roztworu POPC w chloroformie o stężeniu 25 mg/mL do kolby okrągłodنnej. Następnie należy dodać 160 µL roztworu POPG w chloroformie o stężeniu 25 mg/mL, aby uzyskać 52,5 µmol lipidów w stosunku molowym POPC do POPG wynoszącym dziewięć do jednego.Następnie wysusz lipidy przez 30 minut, korzystając z wirówki rotacyjnej ustawionej na 145 RPM. Po zakończeniu suszenia przenieś kolbę do eksykatora próżniowego na trzy godziny w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj 10 mililitrów buforu A, aby nawodnić wysuszony film lipidowy.Delikatnie zakręć kolbą, aż powstanie jednorodna, mętna zawiesina. Poddaj zawiesinę sonikacji z częstotliwością 40 kHz w łaźni wodnej o temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie, używając ekstrudera, przepuść próbkę 10 razy przez membranę o rozmiarze porów 400 nm.Następnie przeprowadź drugi cykl ekstruzji, przepuszczając próbkę cztery razy przez membranę o rozmiarze porów 200 nanometrów. Odstaw otrzymaną, wyraźnie bardziej klarowną zawiesinę, która zawiera duże jednowarstwowe pęcherzyki fosfolipidowe o średnicy około 175 nanometrów. Po zakończeniu ekstruzji przygotuj standardy w szklanych probówkach o wymiarach 13 na 100 milimetrów, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Następnie do osobnych probówek szklanych należy dodać po 10 µL każdej próbki LUV oraz proteoliposomów i rozcieńczyć je 40 µL dejonizowanej wody destylowanej. Do każdej probówki należy dodać 300 µL kwasu nadchlorowego, a następnie inkubować przez jedną godzinę w temperaturze 145 °C w bloku grzewczym. Na każdej probówce należy umieścić kulkę szklaną, aby zapobiec odparowywaniu.Następnie pozostawić probówki do ochłodzenia do temperatury pokojowej i dodać do każdej 1 ml dejonizowanej wody destylowanej. Do każdej probówki dodać 400 µL świeżo przygotowanego roztworu zawierającego 12 g/L molibdanu amonu i 50 g/L askorbinianu sodu, a następnie wymieszać w wstrząsarze typu vortex. Ogrzewać probówki przez 10 minut w temperaturze 100 °C, stosując kulki szklane w celu zapobieżenia parowaniu.Następnie wyjmij probówki z bloku grzejnego i pozostaw je do ostygnięcia do temperatury pokojowej. Używając spektrometru ustawionego na 797 nanometrów, wyznacz krzywą kalibracyjną przy użyciu standardów. Następnie zmierz absorbancję próbek względem próbki ślepej i określ zawartość fosforanów.Należy rozpocząć od pipetowania 800 µL każdej zawiesiny ekstrudowanych LUV do osobnej probówki typu microfuse o pojemności 2 mL. Do każdej probówki należy dodać 5,3 µL buforu A oraz 34,7 µL 10% m/v DDM rozpuszczonego w buforze A. Następnie próbki należy inkubować przez trzy godziny w temperaturze pokojowej, stosując mieszanie w systemie end-over-end.Podczas inkubacji próbek odważ do szklanego zlewki 400 mg kulek na każdą próbkę. Przemyj kulki 5 ml metanolu na próbkę, mieszając powoli przez 10 minut. Powtórz to płukanie raz dla metanolu, trzy razy wodą i raz buforem A. W ciągu ostatnich 30 minut inkubacji próbek wysusz 9,5 µl fosfolipidu znakowanego NBD na próbkę w szklanej probówce z nakrętką, kierując na nie strumień azotu.Następnie, aby rozpuścić wysuszone fosfolipidy, dodaj 45 µL na próbkę 0,1% (m/v) DDM w buforze A. Po zakończeniu inkubacji dodaj rozpuszczony roztwór fosfolipidów znakowanych MBD do każdej próbki. Następnie dodaj 0,1% DDM, bufor A oraz odpowiednią ilość opsyny solubilizowanej w DDM w tej kolejności, aby uzyskać objętość końcową 1 mL przy stężeniu 7 mM DDM.Rekonstytucję białka błonowego osiąga się poprzez traktowanie pęcherzyków odpowiednią ilością detergentu, tak aby pęcznienie nie doprowadziło do ich rozpuszczenia. W tych warunkach, które muszą zostać dobrane empirycznie dla każdego składu lipidów i detergentu, białko wbuduje się w liposomy. Mieszaj próbki przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.Następnie do każdej probówki należy dodać 80 mg przygotowanych kuleczek polistyrenowych i ponownie inkubować przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, stosując mieszanie obrotowe (end-over-end). Do każdej próbki należy dodać kolejne 160 mg kuleczek polistyrenowych i inkubować przez dwie godziny w temperaturze pokojowej przy mieszaniu obrotowym. Po zakończeniu inkubacji próbki należy przenieść, pozostawiając kuleczki, do czystych probówek szklanych, z których każda zawiera 160 mg świeżych kuleczek.Mieszać metodą end-over-end przez noc w temperaturze four degrees Celsius, chroniąc przed światłem. Następnie przenieść próbki, bez kulek, do osobnych probówek typu microfuse. Umieścić probówki na lodzie w celu przygotowania do testu aktywności skramblazy.Zacznij od dodania 1950 µL buforu A do plastikowej kuwety zawierającej plastikowy mieszadełko magnetyczne. Następnie dodaj 50 µL przygotowanej próbki protealiposomów. Pozostaw próbkę w spektrometrze fluorescencyjnym w celu wyrównania stanu równowagi przy stałym mieszaniu przez pięć sekund.Podczas równoważenia próbki należy przygotować roztwór 1 M dithionitu w 0,5 M niebuforowanym TRIS. Rozpocznij monitorowanie fluorescencji przy wzbudzeniu 470 nm, emisji 530 nm i szerokości szczeliny 0,5 nm. Rejestruj sygnał przez 50 sekund, aby uzyskać stabilny odczyt.Następnie do kuwety należy dodać 40 µL jednomolowego roztworu ditionianu. Pomiar fluorescencji należy prowadzić przez co najmniej 500 sekund. Na koniec dane należy przeanalizować zgodnie z opisem w protokole tekstowym.W celu przeprowadzenia pełnej analizy danych fluorescencji, służącej do określenia frakcji pęcherzyków, których nie można zrekonstytuować, wyznaczono odzysk białek i lipidów w zrekonstytuowanych pęcherzykach oraz rozkład wielkości pęcherzyków. W niniejszym badaniu opsynę zrekonstytuowano w dużych pęcherzykach jednowarstwowych, aby scharakteryzować jej aktywność skramblazy za pomocą testu opartego na fluorescencji.Pęcherzyki są rekonstruowane z NBD-PC, który rozkłada się równomiernie między zewnętrzną i wewnętrzną warstwą dwuwarstwy lipidowej. Ditionian redukuje grupę nitro NBD znajdującą się na zewnątrz pęcherzyka do niefluorescencyjnej grupy aminowej, co skutkuje 50% spadkiem fluorescencji w liposomach pozbawionych białek. Jednakże, gdy opsyna ułatwia przemieszczanie się NBD między warstwą wewnętrzną a zewnętrzną, następuje całkowita utrata fluorescencji.Reprezentatywne wyniki tego podejścia przy różnych stosunkach białka do fosfolipidów przedstawiono tutaj. Stopień redukcji fluorescencji wzrasta wraz z ilością opsyny rekonstruowanej w pęcherzykach, która wynosi od 0 do 4,95 µg. Ditionit dodano w wskazanym czasie, a fluorescencję NBD monitorowano przez 400 s.Redukcja fluorescencji jest bardziej znacząca przy wyższych stosunkach białka do fosfolipidów, przy czym największa redukcja wynosi 85%. Końcowa redukcja fluorescencji jest następnie wykorzystywana do określenia prawdopodobieństwa aktywności skramblazy, czyli prawdopodobieństwa, że pęcherzyki zawierają co najmniej jedną skramblazę, przy użyciu statystyki Polsona. Czerwona krzywa reprezentuje dopasowanie mono-wykładnicze dla opsyny. Z kolei szare linie przerywane reprezentują dopasowania mono-wykładnicze dla rekonstytucji opsyny w pęcherzykach jako monomerów, wcześniej utworzonych dimerów lub wcześniej utworzonych tetramerów.Opisana przez nas metoda może zostać łatwo dostosowana do różnych potrzeb. Procedury są wszechstronne i mogą być wykorzystane w przyszłości do identyfikacji oraz charakterystyki aktywności fosfolipidowej scramblazy innych białek błonowych. Procedurę rekonstytucji można zastosować do dowolnego białka błonowego.Technika ta pozwoliła nam zidentyfikować opsynę jako pierwszą biochemicznie zweryfikowaną skramblazę fosfolipidów, a następnie scharakteryzować aktywność różnych stanów konformacyjnych tego białka oraz jego zdolność do transportu różnych lipidów.

a-fluorescence-based-assay-of-phospholipid-scramblase-activity

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Przedstawiamy szybki test oparty na fluorescencji, który monitoruje szybkość gaszenia fluorescencji jako miarę aktywności kanałów gramicydynowych. Kanały gramicydynowe są wykorzystywane jako molekularne przetworniki siły do monitorowania zmian w właściwościach dwuwarstwy lipidowej wyczuwanych przez białka przebiegające przez dwuwarstwę.

Test fluorescencyjny oparty na gramicydynie; do oznaczania potencjału małych cząsteczek w modyfikowaniu właściwości dwuwarstwy lipidowej

Aby przetestować interakcję białka z jego docelowym lipidem, zastosowano system MACS oraz kule magnetyczne skoniugowane z Aneksyną V oraz pęcherzyki lipidowe zsyntetyzowane z lipidu docelowego i fosfatydyloseryny wiążącej Aneksynę V. Białka związane z lipidem docelowym są współoczyszczane i analizowane po elucji z kulek.

Chromatografia powinowactwa oparta na pęcherzykach lipidowych z wykorzystaniem magnetycznego sortowania komórek (LIMACS): nowatorska metoda analizy oddziaływań białko-lipid

Ten film omawia test wycieku fluorescencji w celu zbadania interakcji peptydów penetrujących komórki z błonami komórkowymi za pomocą mimiki błony komórkowej - dużych pęcherzyków jednopłytkowych lub LUV, otoczonych barwnikiem fluorescencyjnym i gaszącym.

Test nieszczelności fluorescencji w celu zbadania interakcji peptydu przenikającego przez komórkę z błoną

W tym filmie demonstrujemy interakcje białko-fosfoinozytyd we wzorcu mikroprzepływowym za pomocą testu modulacji pH, używając wrażliwego na pH barwnika fluorescencyjnego oznaczonego lipidem fosfatydyloetanoloaminy w dwuwarstwie lipidowej, zwanej platformą mikroprzepływową. Modulacje pH po związaniu białka z fosfolipidem powodują wygaszanie fluorescencji.

Test modulacji pH na podpartych dwuwarstwach lipidowych w celu wykrycia interakcji białko-fosfoinozytyd

Prezentujemy nową technikę pomiaru bocznej dyfuzji gatunków powierzchniowo czynnych na granicy płyn-płyn poprzez połączenie monowarstwy kropelki z płaską monowarstwą.

Odzyskiwanie fluorescencji po połączeniu kropli w celu zmierzenia dwuwymiarowej dyfuzji monowarstwy fosfolipidowej

PI(4,5)P2 reguluje różne funkcje komórkowe, ale jego nanoskalowa organizacja w błonie komórkowej jest słabo poznana. Znakując PI(4,5)P2 dwukolorową sondą fluorescencyjną połączoną z domeną homologii Pleckstrin, opisujemy nowatorskie podejście do badania rozkładu przestrzennego PI(4,5)P2 w błonie plazmatycznej w skali nanometrowej.

Obrazowanie pojedynczej cząsteczki w superrozdzielczości 4,5-bisfosforanu fosfatydyloinozytolu w błonie plazmatycznej za pomocą nowatorskich sond fluorescencyjnych

Tutaj prezentujemy wspieraną dwuwarstwę lipidową w kontekście platformy mikroprzepływowej do badania interakcji białko-fosfoinozytyd przy użyciu metody bezznacznikowej opartej na modulacji pH.

-on-a-chip: bezznacznikowe badanie interakcji białko-fosfoinozytyd

Ten protokół opisuje wytwarzanie liposomów oraz sposób, w jaki można je unieruchomić na powierzchni i zobrazować indywidualnie w masowy równoległy sposób za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Pozwala to na ilościowe określenie wielkości i niejednorodności składu między pojedynczymi liposomami populacji.

Ilościowy test pojedynczego liposomu oparty na mikroskopii fluorescencyjnej do wykrywania niejednorodności składu między poszczególnymi liposomami

Test wycieku fluorescencji to prosta metoda, która umożliwia badanie interakcji peptyd/błona, aby zrozumieć ich udział w kilku procesach biologicznych, a zwłaszcza zdolność peptydów penetrujących komórki do zakłócania dwuwarstwowych fosfolipidów podczas bezpośredniego procesu translokacji komórkowej.

Test przecieku fluorescencyjnego w celu zbadania destabilizacji błony przez peptyd penetrujący komórkę

Tutaj opisujemy protokoły wykorzystujące fluorescencyjne czujniki lipidowe i liposomy do określenia, czy białko ekstrahuje i transportuje fosfatydyloserynę czy fosfatydyloinozytol 4-fosforan in vitro.

Oparte na fluorescencji pomiary wymiany fosfatydyloseryny/4-fosforanu fosfatydyloinozytolu między błonami

Przedstawiamy opłacalną metodę oceny przepuszczalności błony liposomalnej, z wyższą czułością i rozdzielczością w porównaniu do tradycyjnych technik. Stosując nowatorską reakcję podstawiania ligandów w kapsule, technika ta wykrywa zmiany w błonach modelowych wywołane fosfolipaząA2. Łatwo zintegrowane ze standardowymi analizami, to dostępne podejście zwiększa rozdzielczość w badaniu biofizyki błon i interakcji toksyn.

Badanie przepuszczalności błony liposomowej do badania wpływu grup fosforanu fosfatydylinozytolu na działanie membranotropowe jadu PLA2

Poznaj fluorescencyjną metodę pomiaru aktywności scramblazy fosfolipidowej w wielowarstwowych liposomach zrekonstruowanych z opsyną. Ta niezawodna technika pozwala badać mechanizmy transportu lipidów międzykomórkowych.

Test fluorescencyjny aktywności scramblazy fosfolipidowej

Przeglądaj więcej filmów