Name: Zanurzona kanapka z bibuły filtracyjnej do długoterminowego obrazowania poklatkowego ex ovo wczesnych zarodków piskląt (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Poznaj metodę zanurzonej kanapki z bibuły filtracyjnej do długoterminowego obrazowania poklatkowego zarodków piskląt ex ovo. Technika umożliwia obserwację morfogenezy bez komory klimatycznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują za wsparcie finansowe z grantu ZonMW-VICI 918.11.635 (Holandia). Autorzy pragną podziękować narzędziowni Vrije Universiteit Amsterdam za praktyczne sugestie i produkcję elementów konfiguracyjnych oraz Jarno Voortmanowi z Carl Zeiss Holandia za pomocne porady dotyczące mikroskopii. Marjolein Blaauboer była wielkim wsparciem w krytycznym komentowaniu kilku szkiców rękopisu.

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone zgodnie z holenderską ustawą o eksperymentach na zwierzętach (Netherlands Experiments on Animals Act).
UWAGA: Metoda „kanapki” z zanurzonym papierem filtracyjnym została zmodyfikowana na podstawie 1.
1. Przygotowanie kanapki z papieru filtracyjnego w zanurzeniu
<ol>
	<li>Sól fizjologiczna Pannetta-Comptona (PC-saline)27,28
	<ol>
		<li>W czystych butelkach o pojemności 1 L przygotować roztwory zapasowe A (1 L ultraczystej H2O, 121 g NaCl, 15,5 g KCl, 10,42 g CaCl2·H2O oraz 12,7 g MgCl2·6H2O) i B (1 L ultraczystej H2O, 2,365 g Na2HPO4·2H2O oraz 0,18 g NaH2PO4·2H2O). Przechowywać je w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przygotować 1 L soli PC, mieszając 90 ml ultraczystej H2O z 40 ml roztworu zapasowego A i 60 ml roztworu zapasowego B (w tej kolejności, aby uniknąć wytrącenia osadu). Roztwór soli PC należy przygotowywać na świeżo z roztworów zapasowych A i B raz w tygodniu. 
		UWAGA: Roztwory zapasowe mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy. Autoklawowanie i/lub dodawanie antybiotyków lub środków przeciwgrzybiczych nie jest konieczne.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubacja zapłodnionych jaj kurzych
	<ol>
		<li>W inkubatorze z nawilżaczem ułożyć jaja na boku i inkubować w temperaturze 37,5 °C do osiągnięcia pożądanego wieku. 
		UWAGA: Jaja należy przechowywać nie dłużej niż dwa tygodnie (najlepiej w temperaturze 12–15 °C) przed eksperymentem, ponieważ w przeciwnym razie ich wylęgalność znacznie spadnie</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nośniki z papieru filtracyjnego (adaptacja z 1)
	<ol>
		<li>Jeśli jest dostępna, należy użyć wycinarki laserowej do wycięcia z grubego papieru filtracyjnego nośników w kształcie klepsydry (28 mm x 2 mm). Zwęzić szerokość w środkowej części z 2 mm do 10,4 mm. Wyciąć centralny otwór eliptyczny (10,6 mm x 5,5 mm), tak aby dłuższa oś elipsy była zorientowana równolegle do dłuższego boku nośnika z papieru filtracyjnego (Rycina 1-M).
		<ol>
			<li>Opcjonalnie można przygotować tekturowy szablon o odpowiednich wymiarach, a następnie przenieść jego kontur oraz obrys centralnego otworu na gruby papier filtracyjny za pomocą ołówka. Nośnik z papieru filtracyjnego należy wyciąć za pomocą precyzyjnych nożyczek.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wyciąć dwa identyczne nośniki z papieru filtracyjnego dla każdego embrionu przeznaczonego do eksplantacji. Przygotować dodatkowe nośniki zapasowe na wypadek utraty embrionu podczas eksplantacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kąpiel olejowa z kontrolą temperatury (w dniu eksperymentu)
	<ol>
		<li>Umieścić zlew z kontrolą temperatury w centrum zmotoryzowanego stolika x-y mikroskopu stereoskopowego i podłączyć zlew do kontrolera temperatury.</li>
		<li>Włożyć cztery duże stalowe pierścienie (średnica zewnętrzna 30 mm, wysokość 4 mm, grubość ścianki 1,5 mm) do szalki Petriego o średnicy 6 cm, aby służyły jako obciążniki, a następnie umieścić szalkę na środku zlewu z kontrolą temperatury. 
		UWAGA: Szalka Petriego służy jedynie jako wypełniacz do regulacji poziomu oleju.</li>
		<li>Napełnić zlew z kontrolą temperatury 130 ml lekkiego oleju mineralnego. W razie potrzeby wyregulować poziom oleju tak, aby znajdował się około 3 mm poniżej górnej krawędzi szalki Petriego o średnicy 6 cm.</li>
		<li>Wyjąć szalkę Petriego z zlewu z kontrolą temperatury i ustawić temperaturę na 40 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie warstwowej struktury z papieru filtracyjnego w zanurzeniu
<ol>
	<li>Pożywka hodowlana (w dniu eksperymentu)
	<ol>
		<li>Wlać 30 ml soli fizjologicznej PC (przygotowanej zgodnie z krokami 1.1.1 do 1.1.2) do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Przygotować jedną probówkę wirówkową 50 ml wypełnioną 30 ml soli fizjologicznej PC na każde dwa zarodki przeznaczone do eksplantacji.</li>
		<li>Ostrożnie rozbić nieinkubowane jajo do szalki Petriego o średnicy 10 cm.</li>
		<li> zebrać rzadkie białko jaja, przesuwając plastikową pipetę transferową wzdłuż ścianek szalki Petriego i zasysając rzadkie białko. Zebrać 30 ml rzadkiego białka do probówki wirówkowej 50 ml na każde dwa zarodki przeznaczone do eksplantacji. Należy upewnić się, że pobrano wyłącznie rzadkie białko. 
		UWAGA: Zazwyczaj 3–4 jaja pozwalają na zebranie około 30 ml rzadkiego białka.</li>
		<li>Wlać 20 ml rzadkiego białka do każdej probówki wirówkowej 50 ml wypełnionej solą fizjologiczną PC (zgodnie z krokiem 2.1.1).</li>
		<li>Wymieszać sól fizjologiczną PC z rzadkim białkiem, delikatnie odwracając probówki kilka razy. Odstawić na kilka minut i sprawdzić, czy mieszanina, zwana od tej pory pożywką hodowlaną, jest przejrzysta. Jeśli pożywka nie jest przejrzysta, należy przygotować świeżą sól fizjologiczną PC z roztworu zapasu i zebrać świeże rzadkie białko.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieścić dwa małe pierścienie ze stali nierdzewnej (średnica zewnętrzna 20 mm, wysokość 4 mm, grubość ścianki 1,5 mm, przerwa w pierścieniu 6,5 mm) w jak największej odległości od siebie w nowej plastikowej szalce Petriego o średnicy 6 cm i wypełnić ją 2 ml pożywki hodowlanej (przygotowanej w krokach 1.4.1 do 1.4.4) za pomocą plastikowej pipety 25 ml (Rycina 1-H). Należy upewnić się, że zanieczyszczenia zgromadzone na powierzchni pożywki pozostały w probówce wirówkowej.</li>
	<li>Usunąć wszelkie zanieczyszczenia lub pęcherzyki powietrza z pożywki za pomocą plastikowej pipety transferowej.</li>
	<li>Wypełnić szalkę Petriego o średnicy 10 cm 75 ml soli fizjologicznej PC (do użycia w kroku 2.15).</li>
	<li>Wyjąć jajo z inkubatora i pozostawić je na blacie na boku przez 1 min, aby zarodek przemieścił się na górę żółtka.</li>
	<li>Ostrożnie rozbić jajo do szalki Petriego (Rycina 1-A). Namoczyć krawędź kawałka cienkiej papierowej chusteczki w gęstym białku i w razie potrzeby wycentrować blastodermę, delikatnie ją przesuwając.</li>
	<li>Usunąć większość rzadkiego i gęstego białka z szalki Petriego za pomocą plastikowej pipety transferowej (z odciętą końcówką, aby ułatwić pobieranie gęstego białka).</li>
	<li>Utworzyć otwór w gęstym białku wokół zarodka, delikatnie wycierając gęste białko kawałkiem chusteczki papierowej, przesuwając ją od środka na zewnątrz (Rycina 1-B). Należy zapobiec przyklejeniu się chusteczki do błony witelinowej.</li>
	<li>Za pomocą pęsety ostrożnie umieścić nośnik z papieru filtracyjnego na błonie witelinowej wokół zarodka, tak aby dłuższa oś eliptycznego otworu była równoległa do osi przednio-tylnej zarodka (Rycina 1-C).</li>
	<li>Przebić jedną końcówką nożyczek do paznokci błonę witelinową blisko nośnika z papieru filtracyjnego i szybko wyciąć obszar wokół całego nośnika (Rycina 1-D).</li>
	<li>Za pomocą pęsety podnieść nośnik z papieru filtracyjnego z żółtka pod kątem, równolegle do osi przednio-tylnej zarodka (Rycina 1-E).</li>
	<li>Obrócić nośnik z papieru filtracyjnego tak, aby strona brzuszna zarodka znajdowała się na górze, i zanurzyć go w soli fizjologicznej PC. Zanurzać nośnik wzdłuż osi przednio-tylnej zarodka pod kątem.</li>
	<li>Usunąć całe pozostałe żółtko przylegające do błony witelinowej i blastodermy, delikatnie przepłukując je solą fizjologiczną PC z plastikowej pipety transferowej. Należy przez cały czas utrzymywać cały nośnik z papieru filtracyjnego w zanurzeniu (Rycina 1-F).</li>
	<li>Wyjąć nośnik z papieru filtracyjnego z soli fizjologicznej PC wzdłuż osi przednio-tylnej zarodka pod kątem i usunąć nadmiar cieczy, przykładając krawędź nośnika do chusteczki papierowej.</li>
	<li>Trzymać papier filtracyjny poziomo, stroną brzuszną zarodka do góry, i za pomocą drugiej pęsety położyć drugi nośnik z papieru filtracyjnego na pierwszym. Ich otwory powinny dokładnie się pokrywać, tworząc „kanapkę” z zarodkiem pomiędzy dwiema warstwami papieru filtracyjnego (Rycina 1-G).</li>
	<li>Natychmiast zanurzyć „kanapkę” z papieru filtracyjnego w pożywce hodowlanej pod kątem wzdłuż osi przednio-tylnej zarodka. Umieścić ją w obszarze obejmującym przestrzeń między dwoma stalowymi pierścieniami (Rycina 1-H).</li>
	<li>Zafiksować kanapkę z papieru filtracyjnego, kładąc dwa kolejne pierścienie stalowe na dwóch poprzednich, upewniając się, że otwór z zarodkiem pozostaje całkowicie odsłonięty (Rycina 1-I).</li>
	<li>Sprawdzić poziom pożywki i upewnić się, że górny dystans jest całkowicie zanurzony w pożywce. W razie potrzeby dodać lub usunąć niewielkie ilości pożywki.</li>
	<li>Ostrożnie umieścić szalkę Petriego w centrum kąpieli olejowej z kontrolą temperatury i ustabilizować szalkę bocznie, umieszczając trzy duże pierścienie ze stali nierdzewnej (średnica zewnętrzna 30 mm, wysokość 4 mm, grubość ścianki 1,5 mm) obok szalki w oleju. Należy upewnić się, że pierścienie stalowe dotykają ścianek szalki (Rycina 1-J).</li>
	<li>Powoli nanieść za pomocą plastikowej pipety transferowej około 6 ml lekkiego oleju mineralnego na powierzchnię pożywki, tak aby pożywka została przykryta ciągłą warstwą oleju mineralnego (Rycina 1-K).</li>
	<li>Ustawić akwizycję time-lapse. 
	UWAGA: Obrazowanie zarodków w formie poziomych panoram składających się z pięciu nachodzących na siebie podobrazów (kafelków) umożliwia szczegółowe obrazowanie (obiektyw 5X) przy jednoczesnym uzyskaniu ogólnego przeglądu morfologii29-30. Przedziały obrazowania od 3 do 10 min pozwalają na szczegółowe śledzenie zmian morfologicznych31, a akwizycja małych stosów z-stack (od pięciu do siedmiu różnych płaszczyzn w odległości 30 µm) kompensuje w znacznym stopniu pogrubianie się i obracanie zarodka30. Przed dalszym przetwarzaniem pojedynczych klatek w filmy time-lapse32 można wybrać płaszczyzny Z o najwyższym kontraście (szczegółowe informacje na temat akwizycji obrazów znajdują się w sekcji Wyniki reprezentatywne).</li>
</ol>
<img alt="Przeszczep blastodysku jaja; schemat i kroki przygotowania; papier filtracyjny, szalka Petriego, warstwa oleju, stalowy pierścień." src="/files/ftp_upload/54636/54636fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Przygotowanie warstwowej struktury („sandwich”) z zanurzonych papierów filtracyjnych. (A) Jajko zostaje rozbite do szalki Petriego. (B) Większość białka gęstego i rzadkiego usuwa się z szalki Petriego za pomocą plastikowej pipety transferowej (niewidoczna na obrazie). Następnie, poprzez delikatne przetarcie białka gęstego ręcznikiem papierowym, tworzy się w nim obszar odsłaniający embrion.C) Nośnik z papieru filtracyjnego umieszcza się wokół blastodermy na szczycie żółtka. (D) Nośnik z papieru filtrującego zostaje oddzielony od otaczającej go błony witelinowej i (E) usunięto z górnej części żółtka. (F) Pozostałości żółtka należy ostrożnie wypłukać w kąpieli z soli fizjologicznej z PC. (G) Zarodek zostaje zamknięty pomiędzy drugim, identycznym nośnikiem z papieru filtracyjnego. (H) Kanapkę z papieru filtracyjnego zanurza się w medium i umieszcza na dwóch pierścieniach ze stali nierdzewnej (embrion skierowany stroną grzbietową lub brzuszną do góry). (I) Dwa pierścienie stabilizują kanapkę od góry. (J) Szalka Petri zawierająca zarodek zostaje przeniesiona do łaźni olejowej z kontrolą temperatury. Pierścienie ze stali nierdzewnej stabilizują szalkę Petri w płaszczyźnie bocznej. (K) Pożywka hodowlana jest przykryta warstwą oleju mineralnego. (L) Schemat kanapkowego filtra zanurzeniowego. (M) Wymiary nośników z papieru filtracyjnego zastosowanych do wykonania kanapki z zanurzonego papieru filtracyjnego. <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54636/54636fig1large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

<ol><li>Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+method+for+chick+whole-embryo+culture+using+a+filter+paper+carrier%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier.</a> Dev. Dyn. 220 (3), 284-289 (2001).</li>
<li>Rozbicki, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin-II-mediated+cell+shape+changes+and+cell+intercalation+contribute+to+primitive+streak+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Myosin-II-mediated cell shape changes and cell intercalation contribute to primitive streak formation.</a> Nat. Cell Biol. 17 (4), 397-408 (2015).</li>
<li>Smith, J. L., Schoenwolf, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurulation%3A+Coming+to+closure%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurulation: Coming to closure.</a> Trends Neurosci. 20 (97), 510-517 (1997).</li>
<li>Schoenwolf, G. C., Sheard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaping+and+bending+of+the+avian+neural+plate+as+analysed+with+a+fluorescent-histochemical+marker%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Shaping and bending of the avian neural plate as analysed with a fluorescent-histochemical marker.</a> Development. 105 (1), 17-25 (1989).</li>
<li>Colas, J. F., Schoenwolf, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+cellular+and+molecular+understanding+of+neurulation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Towards a cellular and molecular understanding of neurulation.</a> Dev. Dyn. 221 (2), 117-145 (2001).</li>
<li>Pourquié, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chick+embryo%3A+a+leading+model+in+somitogenesis+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">The chick embryo: a leading model in somitogenesis studies.</a> Mech. Dev. 121 (9), 1069-1079 (2004).</li>
<li>Maenner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+looping+in+the+chick+embryo%3A+A+morphological+review+with+special+reference+to+terminological+and+biomechanical+aspects+of+the+looping+process%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec%22%5BJournal%5D)">Cardiac looping in the chick embryo: A morphological review with special reference to terminological and biomechanical aspects of the looping process.</a> Anat. Rec. 259 (3), 248-262 (2000).</li>
<li>Wittig, J. G., Münsterberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Early+Stages+of+Heart+Development+Insights+from+Chicken+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cardiovasc.+Dev.+Dis%22%5BJournal%5D)">The Early Stages of Heart Development Insights from Chicken Embryos.</a> J. Cardiovasc. Dev. Dis. 3 (2), (2016).</li>
<li>Layer, P. G., Alber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+of+chick+brain+vesicles+as+revealed+by+peanut+agglutinin+and+cholinesterases%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Patterning of chick brain vesicles as revealed by peanut agglutinin and cholinesterases.</a> Development. 109 (3), 613-624 (1990).</li>
<li>Nakamura, H., Nakano, K. E., Igawa, H. H., Takagi, S., Fujisawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+and+rigidity+of+differentiation+of+brain+vesicles+studied+in+quail-chick+chimeras%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Differ%22%5BJournal%5D)">Plasticity and rigidity of differentiation of brain vesicles studied in quail-chick chimeras.</a> Cell Differ. 19 (3), 187-193 (1986).</li>
<li>Garcia-Lopez, R., Pombero, A., Martinez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+map+of+the+chick+embryo+neural+tube%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Fate map of the chick embryo neural tube.</a> Dev. Growth Differ. 51 (3), 145-165 (2009).</li>
<li>Andermatt, I., Stoeckli, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi-based+gene+silencing+in+chicken+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">RNAi-based gene silencing in chicken brain development.</a> Methods Mol. Biol. 1082, 253-266 (2014).</li>
<li>Tufan, A. C., Akdogan, I., Adiguzel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shell-less+culture+of+the+chick+embryo+as+a+model+system+in+the+study+of+developmental+neurobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Shell-less culture of the chick embryo as a model system in the study of developmental neurobiology.</a> Neuroanatomy. 3 (1), 8-11 (2004).</li>
<li>Endo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chick+embryo+culture+and+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Chick embryo culture and electroporation.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. , Unit 19.15(2012).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Morphol%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> J. Morphol. 88 (1), 49-92 (1951).</li>
<li>Kulesa, P. M., Bailey, C. M., Cooper, C., Fraser, S. E. In Ovo Live Imaging of Avian Embryos. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKulesa%2C+PM+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc%22">Cold Spring Harb. Protoc</a>. 2010 (6), (2010).</li>
<li>Borwompinyo, S., Brake, J., Mozdziak, P. E., Petitte, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+chicken+embryos+in+surrogate+eggshells%5BTitle%5D)+AND+%22Poult+Sci%22%5BJournal%5D)">Culture of chicken embryos in surrogate eggshells.</a> Poult Sci. 84 (9), 1477-1482 (2005).</li>
<li>Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ex-ovo+Chicken+Embryo+Culture+System+Suitable+for+Imaging+and+Microsurgery+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications.</a> J. Vis. Exp. (44), e2154(2010).</li>
<li>Auerbach, R., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+procedure+for+the+long-term+cultivation+of+chicken+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos.</a> Dev. Biol. 41 (2), 391-394 (1974).</li>
<li>New, D. A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+New+Technique+for+the+Cultivation+of+the+Chick+Embryo+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Embryol.+Exp.+Morphol%22%5BJournal%5D)">A New Technique for the Cultivation of the Chick Embryo in vitro.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 3 (4), 320-331 (1955).</li>
<li>Stern, C. D., Bachvarova, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+chick+embryos+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Early chick embryos in vitro.</a> Int. J. Dev. Biol. 41 (2), 379-387 (1997).</li>
<li>Nagai, H., Lin, M. C., Sheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+cornish+pasty+method+for+ex+ovo+culture+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A modified cornish pasty method for ex ovo culture of the chick embryo.</a> Genesis. 49 (1), 46-52 (2011).</li>
<li>Connolly, D., McNaugbton, L. A., Krumlauf, R., Cooke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+in+vitro+development+of+the+chick+embryo+using+roller-tube+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Improved in vitro development of the chick embryo using roller-tube culture.</a> Trends Genet. 11 (7), 259-260 (1995).</li>
<li>Rupp, P. A., Rongish, B. J., Czirok, A., Little, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+of+avian+embryos+for+time-lapse+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Culturing of avian embryos for time-lapse imaging.</a> Biotechniques. 34 (2), 274-278 (2003).</li>
<li>Martins, G. G., Rifes, P., Amaândio, R., Rodrigues, G., Palmeirim, I., Thorsteinsdóttir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+3D+cell+rearrangements+guided+by+a+fibronectin+matrix+underlie+somitogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Dynamic 3D cell rearrangements guided by a fibronectin matrix underlie somitogenesis.</a> PLoS One. 4 (10), e7429(2009).</li>
<li>Nagai, H., Sezaki, M., Nakamura, H., Sheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extending+the+limits+of+avian+embryo+culture+with+the+modified+Cornish+pasty+and+whole-embryo+transplantation+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Extending the limits of avian embryo culture with the modified Cornish pasty and whole-embryo transplantation methods.</a> Methods. 66 (3), 441-446 (2014).</li>
<li>Pannett, C., Compton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cultivation+of+Tissues+in+Saline+Embryonic+Juice%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">The Cultivation of Tissues in Saline Embryonic Juice.</a> Lancet. 203 (5243), 381-384 (1924).</li>
<li>Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+and+temporally+controlled+electroporation+of+early+chick+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos.</a> Nat. Protoc. 3 (3), 419-426 (2008).</li>
<li>Carl Zeiss Microscopy. GmbH Software Guide ZEN 2 - The Tiles & Positions Module. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://applications.zeiss.com/C125792900358A3F/0/9943124DA6FFBA5DC1257E9300412F8B/$FILE/ZEN2_Tiles_and_Positions_Module_Software_Guide.pdf">http://applications.zeiss.com/C125792900358A3F/0/9943124DA6FFBA5DC1257E9300412F8B/$FILE/ZEN2_Tiles_and_Positions_Module_Software_Guide.pdf</a> (2015).</li>
<li>Carl Zeiss Microscopy. GmbH ZEN 2 - (blue edition) - Software Guide. , V1.0 en, Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.unige.ch/medecine/bioimaging/files/3914/3765/2064/ZEN_2_blue_edition_-_Software_Guide.pdf">https://www.unige.ch/medecine/bioimaging/files/3914/3765/2064/ZEN_2_blue_edition_-_Software_Guide.pdf</a> (2014).</li>
<li>Carl Zeiss Microscopy. GmbH Quick Guide ZEN 2 - Acquiring multidimensional images. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://applications.zeiss.com/C125792900358A3F/0/5D9162DBD5AF85DDC1257E35005A68A6/$FILE/ZEN_2-Acquiring_multidimensional_images.pdf">http://applications.zeiss.com/C125792900358A3F/0/5D9162DBD5AF85DDC1257E35005A68A6/$FILE/ZEN_2-Acquiring_multidimensional_images.pdf</a> (2014).</li>
<li>Carl Zeiss Microscopy. GmbH Quick Guide ZEN 2 - Importing and exporting images. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://applications.zeiss.com/C125792900358A3F/0/CF6F8A3FE82E5870C1257E35005AF3E9/$FILE/ZEN_2-Importing_and_exporting_images.pdf">http://applications.zeiss.com/C125792900358A3F/0/CF6F8A3FE82E5870C1257E35005AF3E9/$FILE/ZEN_2-Importing_and_exporting_images.pdf</a> (2014).</li>
<li>Darnell, D. K., Schoenwolf, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+Avian+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol.+Protoc.+Vol.+I%22%5BJournal%5D)">Culture of Avian Embryos.</a> Dev. Biol. Protoc. Vol. I. 135, 31-38 (2000).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Jako nowy wariant dobrze ugruntowanej kultury EC1, zanurzona kanapka z bibułą filtracyjną ułatwia pozyskiwanie długoterminowych filmów poklatkowych w jasnym i ciemnym polu wczesnych zarodków piskląt ex ovo, sprawiając, że inkubator z kontrolowaną temperaturą i wilgotnością wokół mikroskopu staje się zbędny. Zamiast być hodowane na półstałym dnie agaru i białka, zarodki są utrzymywane całkowicie zanurzone w prostym pożywce hodowlanej składającej się z soli fizjologicznej PC i cienkiego białka. Parowanie i utrata ciepła są zminimalizowane przez warstwę oleju mineralnego unoszącą się na pożywce hodowlanej. Zarodki można łatwo hodować, grzbietową lub brzuszną stroną do góry, bez widocznych różnic w jakości. Jak pokazano tutaj, zarodki w zanurzonej kanapce z bibuły filtracyjnej są dostępne dla interwencji mikrochirurgicznych, takich jak nakładanie kulek nasączonych morfogenem. Przyszłe zastosowania obejmują obrazowanie fluorescencyjne na żywo, mikroiniekcje i elektroporację oraz wyciszanie genów w celu manipulowania i badania szerokiego zakresu zdarzeń morfogenetycznych podczas rozwoju brzusznego (np. wczesna serco-somitogeneza) i grzbietowego (np . późna gastrulacja, zamknięcie cewy nerwowej i wczesna faza mózgu). Leczenie farmakologiczne zależne od czasu jest wykonalne, jeśli szalka Petriego zawierająca kanapkę z bibuły filtracyjnej zostanie zastąpiona komorą perfuzyjną, umożliwiającą wymianę pożywki hodowlanej poniżej warstwy oleju mineralnego. Zanurzona warstwa z bibuły filtracyjnej rozwinie swój pełny potencjał obrazowania w połączeniu z obrazowaniem laserowym (w tym mikroskopią świetlną) i obiektywami immersyjnymi.
Niektóre trudności z przygotowaniem zanurzonej kanapki z bibuły filtracyjnej zostaną omówione w poniższych akapitach. Chociaż przeniesienie zarodka z żółtka do kanapki z bibuły filtracyjnej wymaga jedynie umiarkowanego treningu, kilka etapów może znacząco wpłynąć na jakość zarodka w hodowli. Zanim nośnik z bibuły filtracyjnej zostanie umieszczony na żółtku, błona witelinowa wokół zarodka powinna zostać oczyszczona z gęstego białka. Tylko wtedy połączenie między bibułą filtracyjną a membraną witelinową będzie wystarczająco mocne, aby wytrzymać mycie w soli fizjologicznej PC. Bibuła filtracyjna przenosząca zarodek powinna jak najrzadziej przekraczać granicę faz ciecz/powietrze, aby zminimalizować napięcie błon. Po wprowadzeniu do soli fizjologicznej PC w celu umycia, cały nośnik bibuły filtracyjnej musi pozostać całkowicie zanurzony przez cały czas. Czas w kąpieli soli PC-solankowej musi być ograniczony do około 30 - 60 sekund, ponieważ membrana witelinowa zacznie się uwalniać z bibuły filtracyjnej. Mimo to oczyszczanie zarodka powinno być wykonane bardzo dokładnie, ponieważ resztki żółtka będą później zasłaniać widok zarodka. Podczas mycia nigdy nie kieruj strumienia z pipety transferowej bezpośrednio na zarodek, ale zawsze promieniście od niego. Po wyjęciu zarodka z soli fizjologicznej należy trzymać bibułę filtracyjną poziomo, aby zminimalizować napięcie błon zarodkowych. Następnie ustabilizuj zarodek za pomocą drugiego nośnika z bibuły filtracyjnej. Po umieszczeniu drugiego nośnika bibuły filtracyjnej należy unikać tworzenia naprężeń bocznych, które mogłyby przesunąć nośniki bibuły filtracyjnej względem siebie i rozerwać błony embrionalne. Gdy kanapka z bibuły filtracyjnej jest wprowadzana do pożywki hodowlanej, powinna również przekroczyć granicę faz powietrze/ciecz tylko raz, aby zminimalizować naprężenia membran. Drugą parę pierścieni ze stali nierdzewnej służących do stabilizacji kanapki z bibuły filtracyjnej od góry należy umieszczać bardzo powoli i bez żadnego nacisku, aby zminimalizować ściskanie błon zarodkowych. Małe pęknięcia obszaru opaca zarodka zwykle goją się w ciągu pierwszej godziny hodowli, ale uszkodzony zarodek może i zawsze powinien być zastąpiony nową próbką przed pipetowaniem warstwy oleju na pożywkę.
Aby zobrazować cały zarodek lub wiele próbek do filmów poklatkowych o wysokiej rozdzielczości, mikroskop musi być wyposażony w zmotoryzowany stolik x-y, sterowany przez oprogramowanie mikroskopu. Niezwykle ważne jest, aby stolik x-y poruszał się z minimalną prędkością, aby uniknąć uszkodzenia zarodków i turbulencji w pożywce hodowlanej i oleju, co obniży jakość obrazu. Na potrzeby prezentowanych tu filmów poklatkowych zmotoryzowany stolik x-y poruszał się z prędkością około 1,75 mm/s. W przyszłości obrazowanie można jeszcze bardziej ulepszyć, przesuwając stolik do żądanej pozycji i uzyskując obraz po krótkim okresie odpoczynku, aby wibracje i turbulencje zniknęły.
Jako ograniczenie, potencjalni użytkownicy powinni zdawać sobie sprawę ze stosunkowo dużej odległości roboczej (około 1 cm) niezbędnej dla tej metody hodowli, jeśli używany jest mikroskop pionowy bez obiektywów zanurzeniowych. Ta odległość robocza wynika z warstwy pożywki i oleju mineralnego na wierzchu zarodka. Na 6 cm szalce Petriego warstwa oleju ma grubość około 1 - 1,5 mm, a zarodek jest zanurzony na głębokość około 4 mm w pożywce hodowlanej. W zależności od średnicy obiektywu, górna krawędź 6-centymetrowej szalki Petriego może również ograniczać dostęp do zarodka. Można to obejść, używając większego naczynia.
Odległość roboczą od góry można nieznacznie zmniejszyć, minimalizując grubość warstw cieczy. Ponadto odległość roboczą od dołu można zminimalizować, schodząc zarodek głębiej na dno szalki Petriego i zmniejszając grubość szklanego okienka podgrzewanej zlewki. Chociaż protokół został zoptymalizowany do pracy z pionowym mikroskopem zmiennoogniskowym o dużej odległości roboczej, można go również zamontować w mikroskopie odwróconym. Przyszli użytkownicy powinni pamiętać, że zbyt głębokie zanurzenie zarodka w pożywce hodowlanej może prowadzić do problemów z dyfuzjąO2, chociaż wstępne eksperymenty sugerują, że ograniczona dyfuzja nie wydaje się być problemem, o ile zarodek jest otoczony wystarczająco dużym zbiornikiem pożywki hodowlanej, a ułożona bibuła filtracyjna nie jest dociśnięta do dna szalki Petriego.
Kolejnym ograniczeniem jest kontrola temperatury. Poprzez dostosowanie temperatury regulatora podgrzewanej zlewki do 40 °C, temperatura w pożywce równoważy się do 37,5 °C wokół zarodków, gdy podłoże jest pokryte olejem mineralnym. Pokazuje to, że część energii jest tracona między dnem zlewki, gdzie znajdują się elementy grzejne i czujnik temperatury, a lokalizacją zarodków. Regulację temperatury można zoptymalizować poprzez przeniesienie czujnika i redystrybucję elementów grzejnych.

Embriogeneza fascynowała człowieka od początku historii. W jaki sposób struktura i morfologia zarodka rozwijają się w tak dobrze zdefiniowany sposób czasowy i przestrzenny? Zarodek pisklęcia stał się jednym z klasycznych zwierzęcych modeli kręgowców do embriogenezy z kilku powodów: jest łatwo dostępny, niedrogi, przezroczysty we wczesnych stadiach i dostępny do eksperymentalnych manipulacji, gdy rozwija się poza matką. Co więcej, ma prawie płaską geometrię podczas wczesnych wydarzeń morfogenetycznych, takich jak tworzenie się serca i mózgu, gastrulacja, neurulacja i somitogeneza15.
Procesy morfogenetyczne mogą być najlepiej zrozumiane, jeśli są badane dynamicznie, na przykład poprzez pozyskiwanie obrazów poklatkowych. Zarodek pisklęcia można uwidocznić in ovo16, ale ze słabą dostępnością do manipulacji eksperymentalnych i ograniczoną widocznością dla obrazowania mikroskopią światła transmisyjnego. W związku z tym zaproponowano kilka technik hodowli zarodków piskląt ex ovo, albo w systemach hodowli całego żółtka13,17-19, albo jako kultury eksplantatywne1,20-23. W systemach hodowli całego żółtka zarodek pozostaje na nienaruszonym żółtku, a cała zawartość jaja jest przenoszona do innego pojemnika w celu inkubacji. Pojemnik ten może być zastępczą skorupką jajka17, szalką Petriego19 lub hamakiem wykonanym z plastikowej folii spożywczej13,18. Zarodki w całych kulturach żółtka mogą być w idealnym przypadku hodowane aż do wyklucia i są dostępne do mikromanipulacji. Techniki te są szczególnie przydatne do badania rozwoju zarodków po zainicjowaniu krążenia krwi (co zwiększa kontrast), podczas gdy młodsze zarodki pozostają trudne do wizualizacji. Te wczesne zarodki można najlepiej zobrazować, jeśli zostaną wycięte z żółtka i hodowane jako eksplantaty in vitro. Eksplantaty są łatwo dostępne do manipulacji eksperymentalnych i wymagają mniej miejsca do hodowli. Przez wiele lat technika zapoczątkowana przez Denisa Newa w 1955 roku i jej odmiany były złotymi standardami metod hodowli eksplantatów dla zarodków piskląt, dzięki czemu zarodek stał się dostępny do mikroskopii poklatkowej i interwencji mikrochirurgicznych20,21. Pomimo dużego sukcesu, technika Newa jest stosunkowo wymagająca i czasochłonna. Blastoderma często odrywa się, gdy błona witelinowa, przenosząca blastodermę, jest rozciągnięta wokół szklanego pierścienia, aby osiągnąć odpowiednie napięcie1. Co więcej, zarodek może być hodowany tylko brzuszną stroną do góry. Hodowla EC (Early Chick), nowsza technika opracowana przez Chapmana i Collignona1, omija rozciąganie błony witelinowej za pomocą nośnika z bibuły filtracyjnej z centralnym otworem. Bibuła filtracyjna przyczepia się do błony witelinowej, utrzymując w ten sposób jej naturalne napięcie, i otacza zarodek jak rama obrazu1. Zarodki są następnie hodowane na dnie agarowo-białkowym, zwykle brzuszną stroną do góry. Hodowla grzbietową stroną do góry wydaje się możliwa tylko dla zarodków w wieku15 lat HH8 i starszych. Wiele grup dostosowało nośnik bibuły filtracyjnej do swoich potrzeb, na przykład zastępując dno agarowo-białkowe podporą wykonaną z włókien szwów chirurgicznych24 lub membraną pokrytą kolagenem25. Często zarodki hodowane techniką Newa lub kulturą EC są wystawiane na działanie powietrza od strony grzbietowej lub brzusznej w celu ułatwienia dyfuzji tlenu1,20. Te kultury eksplantatów muszą być przechowywane w wilgotnej atmosferze, aby uniknąć parowania pożywki i zapobiec wysychaniu zarodka. Osiąga się to poprzez inkubację szalki z kulturą eksplantatów na większej szalce Petriego zawierającej zwilżoną bibułę1. Akwizycja zdjęć poklatkowych tych zarodków wymaga użycia inkubatora z kontrolowaną temperaturą wokół całego mikroskopu lub pojemnika o kontrolowanej temperaturze z podgrzewaną pokrywą, aby zapobiec kondensacji na ścieżce światła14. Jednak zarodki piskląt mogą również rozwijać się ex ovo całkowicie zanurzone w pożywce hodowlanej jako kultury bibuły filtracyjnej25, umieszczone między warstwą ciężkiego oleju mineralnego i białka w adaptacji techniki Newa2,21 lub jako złożone eksplantaty blastodermy w "kulturze kornwalijskiej pasztecika"23,26, bez bezpośredniego kontaktu z powietrzem.
Zanurzona kanapka z bibuły filtracyjnej to nowy wariant techniki nośnika bibuły filtracyjnej. Łącząc wcześniejszą wiedzę na temat hodowli zarodków piskląt ex ovo, rezygnuje się z inkubatora z kontrolowaną temperaturą i podgrzewanej pokrywy. Zarodek umieszcza się między dwoma identycznymi (wycinanymi laserowo) nośnikami z bibuły filtracyjnej24 i hoduje się go całkowicie zanurzonego w prostym pożywce hodowlanej (sól fizjologiczna Pannetta-Comptona27,28 i cienkie białko w stosunku 3:2) w pojemniku o kontrolowanej temperaturze. Warstwa lekkiego oleju mineralnego unosząca się na wierzchu podłoża zapobiega parowaniu2,21 i minimalizuje straty ciepła do otoczenia. Dno pojemnika posiada szklane okienko, a cała konfiguracja odbywa się na pionowym mikroskopie zmiennoogniskowym o dużej odległości roboczej. Taka konfiguracja pozwala na pozyskiwanie filmów poklatkowych w jasnym i ciemnym polu o wysokiej rozdzielczości, przedstawiających około 30 godzin rozwoju embrionalnego, od wczesnego etapu prymitywnej smugi do etapu 28 somitów (odpowiednik etapów Hamburger Hamilton od 5 do 16, HH5-16)15. Zarodki można hodować równie dobrze brzuszną, jak i grzbietową stroną do góry. W związku z tym zarodki są dostępne do obserwacji i manipulacji rozwojem brzusznym (np. wczesne serce7,8 i somitogeneza6) i grzbietowym (np. późne gastrulacja2, zamknięcie cewy nerwowej 3-5 i wczesna mózg 9-13). Zanurzona kanapka z bibuły filtracyjnej zapewnia proste i stabilne środowisko do mikrochirurgii, implantacji kulek, mikroiniekcji, wyciszania genów i badań elektroporacji. Jego potencjał obrazowania można znacznie zwiększyć dzięki zastosowaniu obrazowania laserowego (w tym mikroskopii z użyciem arkuszy świetlnych) i obiektywów immersyjnych.

<table><tbody><tr><td>Mili-Q&nbsp; Referencyjny system oczyszczania wody</td><td>Millipore</td><td>Z00QSV0WW&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Duran&nbsp; butelki laboratoryjne, z nakrętkami, 1 L</td><td>Sigma-Aldrich/Duran</td><td>Z305200-10EA&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa<</td><td>strong>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Solution A</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck Millipore</td><td>1064041000</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck Millipore</td><td>1049361000</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&#183; H2O</td><td>Merck Millipore</td><td>1023821000</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&#183; 6H2O</td><td>Merck/Sigma-Aldrich</td><td>13152-1KG-D&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td><silny>Nazwa</silny><</td><td>silny>Firma</silny></td><td><silny>Numer katalogowy</silny></td><td><silny>Komentarze</td></tr><tr><td><silny>Roztwór B</silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4&#183; 2H2O</td><td>Merck</td><td>1065801000</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4&#183; 2H2O</td><td>Merck</td><td>1063420250</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Company<</td><td>strong>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Whatman, klasa 595</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10311611</td><td></td></tr><tr><td>Wycinarka laserowa MLS-90120-C130, laser CO2, 130&nbsp; W, długość fali 10,6&nbsp; &mikro; m</td><td>Micro Lasersystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tork Extra Miękkie chusteczki twarzowe</td><td>Tork</td><td>140280</td><td></td></tr><tr><td>Rękawice lateksowe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z645613</td><td></td></tr><tr><td></td><td>EMDAMED</td><td>EMDA 300.131</td><td></td></tr><tr><td>Pipety transferowe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z350613</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>WITG5.480.003</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Accu-jet pro Kontroler</td><td>BrandTech Scientific</td><td>26332</td><td></td></tr><tr><td>Pipety serologiczne plastikowe, 25&nbsp; ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS4251</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowe rękawy</td><td></td><td></td><td></td>na dokumenty</tr><tr><td>Inkubator do jaj - Inkubator mod. 40</td><td>Fiem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zapłodnione jaja kurze (Gallus gallus)</td><td>Drost BV (Loosdrecht, NL)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 cm Szalki do hodowli tkankowych</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5731</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Greiner Bio-one</td><td>664160</td><td></td></tr> 6 <tr><td>cm szalki Petriego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5481</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Probówki wirówkowe, probówki wirówkowe Greinera lub probówki Cellstar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2318</td><td></td></tr><tr><td></td><td>greiner bio-one</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Pierścienie ze stali nierdzewnej, wykonane na zamówienie</mocne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Duże pierścienie, średnica zewnętrzna 30 mm, Wysokość 4 mm, grubość</td><td></td><td></td><td></td>ścianki 1,5 mm</tr><tr><td>Małe pierścienie, średnica zewnętrzna 20 mm, wysokość 4 mm, grubość ścianki 1,5 mm, szczelina w pierścieniu</td><td></td><td></td><td></td>6,5 mm</tr><tr><td>Nożyczki</td><td></td><td></td><td></td>do paznokci</tr><tr><td>Kleszcze, Dumont #5, Inox</td><td>Fine Science Tools , FST</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Cienkie, bardzo ostre nożyczki do cięcia bibuły filtracyjnej</td><td>VWR</td><td>21-102</td><td></td></tr><tr><td>M3516&nbsp; Olej mineralny Sigma-Aldrich</td> Numer CAS <td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; 8042-47-5</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Agar do hodowli EC</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539&nbsp; SIGMA</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653&nbsp; SIGMA-ALDRICH</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Implantacja mikrokulek</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polybead Sampler Kit III (45 &mikro; Użyto koralików)</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>16905-1</td><td></td></tr><tr><td>Igły do ćwiczeń: typ J, nr 02, 0,12x30&nbsp; mm</td><td>SEIRIN</td><td>&nbsp; typ J, nr 02, 0,12x30mm</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Zlewka z kontrolowaną temperaturą</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RTD Czujnik temperatury z gwintowaną obudową M4 RTD-850M</td><td>Omega</td><td>RTD-850M</td><td></td></tr><tr><td>Hermetycznie zamknięty RTD Czujniki HSRTD-3-100-A-3M</td><td>Omega</td><td>HSRTD-3-100-A-1M</td><td></td></tr><tr><td>Przedłużacz termistora i RTD EXTT-3CU-26S-50</td><td>Omega</td><td>EXTT-3CU-26S-50</td><td></td></tr><tr><td>3-pinowe mini złącza do termopar, 3-przewodowych czujników RTD i termistorów MTP-U-M</td><td>Omega</td><td>MTP-U-M</td><td></td></tr><tr><td>Kapton (folia poliamidowa) Izolowane elastyczne grzejniki KHLV-103/(10)-P</td><td>Omega</td><td>KHLV-103/(10)-P</td><td></td></tr><tr><td>Regulator temperatury/procesu CNi16D24-C4EIT-DC</td><td>Omega</td><td>CNi16D24-C4EIT-DC</td><td></td></tr><tr><td>Zlewek aluminiowy wykonany na zamówienie, izolowany poliacetalem (rysunki patrz karta 2)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><silny>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Konfiguracja mikroskopu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axio Zoom.V16 z ApoTome.2 ZEN</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>495010-0009-000</td><td></td></tr><tr><td>Obiektyw PlanNeoFluar Z 1.0X/0.25 FWD 56&nbsp; mm</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>435281-9100-000</td><td></td></tr><tr><td>Ręczne sterowanie obrotowe MARC</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>435604-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>Oświetlacz transilitacyjny górny 450 mot</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>435500-9000-000</td><td></td></tr><tr><td>Zmotoryzowany stolik pomiarowy S 150x100 mot; CAN (D)</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>435465-9020-000</td><td></td></tr><tr><td>Płyta wkładana S, szkło 237x157x3&nbsp; mm (D)</td> <td>Carl Zeiss AG</td><td>435465-9053-000</td><td></td></tr><tr><td>Kontroler EMS 3</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>435610-9010-000</td><td></td></tr><tr><td>Panel sterowania systemu SYCOP 3</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>435611-9010-000</td><td></td></tr><tr><td>Kamera Hamamatsu ORCA Flash 4.0</td><td>Hamamatsu</td><td>C11440-22CU</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopia High-End Workstation Xeon Quad-Core wielojęzyczny</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>490004-0025-000</td><td></td></tr><tr><td>Pakiet językowy Windows 7 x64 Ultimate English US</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410373-0200-000</td><td></td></tr><tr><td>Monitor LCD TFT HP ZR2440w 24"</td> <td>Carl Zeiss AG</td><td>410350-2403-000</td><td>nie jest już dostępny</td></tr><tr><td>ZEN pro 2012 Hardware Klucz licencyjny</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410135-1002-120</td><td>nie jest już dostępny</td></tr><tr><td>Sterownik oprogramowania ZEN Hamamatsu Cameras Hardware Klucz licencyjny</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410136-1045-110</td><td></td></tr><tr><td>Moduł ZEN Stos Z</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410136-0030-110</td><td></td></tr><tr><td>Płytki modułu ZEN / pozycje</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410136-1025-110</td><td></td></tr><tr><td>Moduł ZEN Upływ czasu</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410136-1031-110</td><td></td></tr><tr><td>Projektant eksperymentów modułu ZEN</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410136-1022-110</td><td></td></tr><tr><td>Klucz licencyjny sprzętu ZEN Desk 2012</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>410135-1004-120</td><td>nie jest już dostępny</td></tr></tbody></table>

zanurzona kanapka z bibuły filtracyjnej do długoterminowego obrazowania poklatkowego ex ovo wczesnych zarodków piskląt

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Ze względu na swoją dostępność, niski koszt, płaską geometrię i przezroczystość, zarodek pisklęcia ex ovo stał się głównym modelem zwierzęcym kręgowców do badania zdarzeń morfogenetycznych, takich jak gastrulacja2, neurulacja 3-5, somitogeneza6, zginanie serca7,8 i tworzenie mózgu 9-13, we wczesnej embriogenezie. Kluczem do zrozumienia procesów morfogenetycznych jest ich dynamiczne śledzenie za pomocą obrazowania poklatkowego. Pozyskiwanie filmów poklatkowych przedstawiających embriogenezę piskląt ex ovo zostało ograniczone albo do krótkich okien czasowych, albo do potrzeby stosowania inkubatora w celu kontrolowania temperatury i wilgotności wokół zarodka14. W tym miejscu prezentujemy nową technikę hodowli zarodków piskląt ex ovo w celu obrazowania poklatkowego o wysokiej rozdzielczości przy użyciu mikroskopii światła przechodzącego. Zanurzona warstwa z bibuły filtracyjnej jest wariantem dobrze znanej techniki nośnika bibuły filtracyjnej (hodowla EC)1 i umożliwia hodowlę zarodków piskląt bez konieczności stosowania komory klimatycznej. Zarodek jest umieszczony między dwoma identycznymi nośnikami z bibuły filtracyjnej i jest całkowicie zanurzony w prostym podłożu o kontrolowanej temperaturze, pokrytym warstwą lekkiego oleju mineralnego. Począwszy od stadium prymitywnej smugi (stadium 5 Hamburgera-Hamiltona, HH5)15 aż do co najmniej stadium 28-somitowego (HH16)15, zarodki mogą być hodowane zarówno brzuszną, jak i grzbietową stroną do góry. Pozwala to na pozyskanie filmów poklatkowych obejmujących około 30 godzin rozwoju embrionalnego. Wyświetlane są reprezentatywne klatki poklatkowe i filmy. Zarodki są porównywane morfologicznie z zarodkami hodowanymi w standardowej hodowli EC.
Zanurzona kanapka z bibuły filtracyjnej zapewnia stabilne środowisko do badania wczesnych procesów morfogenetycznych grzbietowych i brzusznych. Pozwala również na obrazowanie fluorescencyjne na żywo i mikromanipulacje, takie jak mikrochirurgia, implantacja kulek, mikroiniekcja, wyciszanie genów i elektroporacja, a także ma duży potencjał do łączenia z obiektywami zanurzeniowymi do obrazowania laserowego (w tym mikroskopii arkuszowej).

Tutaj prezentujemy nową technikę hodowli zarodków piskląt ex ovo do obrazowania poklatkowego przy użyciu światła przechodzącego i mikroskopii fluorescencyjnej. Kanapka z zanurzoną bibułą filtracyjną jest wariantem dobrze znanej techniki nośnika bibuły filtracyjnej1, która pozwala na hodowlę zarodków piskląt całkowicie zanurzonych w płynnej pożywce hodowlanej.

Zanurzona kanapka z bibuły filtracyjnej do długoterminowego obrazowania poklatkowego ex ovo wczesnych zarodków piskląt

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

a-submerged-filter-paper-sandwich-for-long-term-ex-ovo-time-lapse

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Łatwy dostęp do zarodka umożliwił przeprowadzenie eksperymentów mapujących losy komórek przy użyciu kilku podejść, w tym chimer kurczaka i przepiórki oraz ogniskowego znakowania barwnikiem. W niniejszym artykule przedstawiamy metodę przygotowania jaja, która została zoptymalizowana pod kątem długiego czasu przeżycia.

Wycinanie okienka w jajach kurzych do badań nad rozwojem

W niniejszym artykule przedstawiamy prostą metodologię umożliwiającą długotrwałą hodowlę embrionów ptaków ex-ovo. Technika ta jest idealna do eksperymentów podłużnych, które wymagają pełnej dostępności optycznej i/lub sterylnego transportu embrionów ptaków.

System hodowli embrionów kurzych ex-ovo odpowiedni do obrazowania i zastosowań mikrochirurgicznych

Niniejszy artykuł opisuje znakowanie powierzchniowe oraz hodowlę tkanek ex ovo we wczesnym embrionie kurczaka. Przedstawiono techniki umożliwiające obrazowanie w jasnym polu, fluorescencyjne oraz z wykorzystaniem tomografii optycznej koherencyjnej w trybie time-lapse. Śledzenie znaczników powierzchniowych z wysoką rozdzielczością czasowo-przestrzenną pozwala na obliczenie wielkości kinematycznych, takich jak odkształcenia morfogenetyczne, zarówno w dwóch, jak i w trzech wymiarach.

Śledzenie deformacji tkankowych w procesach morfogenetycznych we wczesnym zarodku kurczaka

Ten artykuł opisuje przygotowanie próbki do mikroskopii fluorescencyjnej za pomocą arkuszy świetlnych. Zademonstrowano również metodę montowania żywych zarodków danio pręgowanego w celu długoterminowego obrazowania, co pozwala na nagrywanie długich filmów poklatkowych żywych zarodków w warunkach zbliżonych do fizjologicznych.

Przygotowanie próbki do mikroskopii świetlnej: montaż żywych zarodków danio pręgowanego do długoterminowego obrazowania

Oglądanie i dostęp do zarodka kurczaka podczas rozwoju może być wyzwaniem. Opracowaliśmy metodę ex ovo, która jest prosta, opłacalna i może być łatwo stosowana w klasie lub w środowisku badawczym. Metoda ta zapewnia dostęp do zarodka w późnych stadiach rozwoju zarodkowego (HH 40).

Zoptymalizowana hodowla ex-ovo zarodków piskląt do zaawansowanych etapów rozwoju

Opisana tutaj metoda pozwala na analizę poklatkową rozwoju narządów w zarodkach danio pręgowanego za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu preparacyjnego, zdolnego do wykonywania sekcji optycznych i prostych strategii dostosowania w celu skorygowania dryfu ogniskowego i płaskiego.

Analiza rozwoju nerek danio pręgowanego z obrazowaniem poklatkowym przy użyciu mikroskopu preparacyjnego wyposażonego w sekcję optyczną

Ten artykuł wideo szczegółowo opisuje prostą metodologię in vivo, która może być używana do systematycznego i efektywnego charakteryzowania składników złożonych szlaków sygnałowych i sieci regulacyjnych w wielu zarodkach bezkręgowców.

Siła prostoty: zarodki jeżowców jako modele rozwojowe in vivo do badania złożonych interakcji sieci sygnalizacyjnych między komórkami

Tutaj prezentujemy protokół hodowli organotypowej do hodowli embrionalnych organów kurczaka in vitro. Za pomocą tej metody można badać rozwój zarodkowej tkanki kurczaka, przy zachowaniu wysokiego stopnia kontroli nad środowiskiem hodowli.

Metoda hodowli organotypowej do badania rozwoju zarodkowych tkanek kurczaka

Ten protokół opisuje trzy metody pozyskiwania i wykorzystywania zarodków kurczaków w wieku od 5 do 8 dni oraz ich błony kosmówkowo-omoczniowej (CAM) jako modelu in vivo do badania obrazowania ultrasonograficznego z kontrastem i dostarczania leków za pośrednictwem mikropęcherzyków.

Przygotowanie zarodków ex ovo kurczaków i naczyń błony moczowo-omoczniowej jako modelu in vivo do obrazowania ultrasonograficznego ze wzmocnieniem kontrastowym i badań nad dostarczaniem leków za pośrednictwem mikropęcherzyków

Ten wszechstronny protokół opisuje izolację premigrujących komórek grzebienia nerwowego (NCC) poprzez wycięcie fałdów nerwowych czaszki z zarodków piskląt. Po posiewie i inkubacji migrujące NCC wyłaniają się z eksplantatów fałdów nerwowych, co pozwala na ocenę morfologii i migracji komórek w uproszczonym środowisku 2D.

Przygotowanie i analiza morfologiczna kultur komórek grzebienia nerwowego czaszki piskląt

Ten protokół został opracowany do podłużnego monitorowania właściwości mechanicznych tkanki płytki nerwowej podczas neurulacji zarodka pisklęcia. Opiera się on na integracji mikroskopu Brillouin i systemu inkubacji na etapie, umożliwiającego mechaniczne obrazowanie na żywo tkanki płytki nerwowej w zarodkach piskląt hodowanych ex ovo.

Monitorowanie mechanicznej ewolucji tkanki podczas zamykania cewy nerwowej zarodka pisklęcia

Poznaj metodę zanurzonej kanapki z bibuły filtracyjnej do długoterminowego obrazowania poklatkowego zarodków piskląt ex ovo. Technika umożliwia obserwację morfogenezy bez komory klimatycznej.

Zanurzona kanapka z bibuły filtracyjnej do długoterminowego obrazowania poklatkowego ex ovo wczesnych zarodków piskląt

Przeglądaj więcej filmów