Name: Wizualizacja wczesnych stadiów fagocytozy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-03T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Poznaj technikę mikroskopii konfokalnej do wizualizacji wczesnych stadiów fagocytozy z użyciem komórek DC 2.4 i Candida albicans. Ta metoda umożliwia badanie dynamiki interakcji patogen-gospodarz w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Wendy Salmon i Nicki Watson z ośrodka Keck w Instytucie Whiteheada MIT za obrazowanie.

1. Przygotowanie linii komórkowych DC2.4 i RAW 264.7
UWAGA: Makrofagopodobna linia komórkowa RAW 264.7 i linia komórek dendrytycznych DC2.4 są pochodzenia mysiego, a do hodowli komórek zastosowano następujące warunki.
<ol>
	<li>Hoduj komórki RAW 264.7 w DMEM (pożywce Dulbecco's Minimal Eagle's) uzupełnionej 10% inaktywowaną płodową surowicą bydlęcą (FBS) w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze z 5% CO2 .</li>
	<li>Hoduj komórki DC2.4 w podobnych warunkach jak komórki RAW 264.7, z wyjątkiem użycia pożywki RPMI (Roswell Park Memorial Institute) uzupełnionej L-glutaminą zamiast DMEM.</li>
</ol>
2. Przygotowanie fluorescencyjnych cząstek sprzężonych: C. albicans, Zymosan, kulki pokryte IgG
<ol>
	<li>Uprawa Candida albicans
	<ol>
		<li>Inokulować szczep C. albicans SC5314 z zamrożonego glicerolu w 25 ml YPD uzupełnionego Uri (2% baktopeptonu, 1% ekstraktu drożdżowego, 2% glukozy i 80 μg/ml urydyny) przez noc w temperaturze 30 °C. 
		UWAGA: Unikaj uprawy kultury Candida powyżejOD 600 z 12.</li>
		<li>Weź 1 ml C. albicans i odwiruj go w temperaturze 2 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml PBS.</li>
		<li>Zebrać osad przez odwirowanie przy 2,000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Powtórz krok 2.1.4.</li>
		<li>Obliczyć wielokrotność infekcji (MOI) C. albicans w stosunku do liczby fagocytów i przystąpić do testu fagocytozy, jak opisano w sekcji 3. OD600 1 odpowiada 2,5 x 107 Candida albicans na 1 ml. 
		UWAGA: Generowanie Candida-BFP jest opisane w reference13.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie kulek pokrytych Zymosanem i IgG 
	UWAGA: Zymosan jest preparatem w postaci cząstek węglowodanowych grzybów zawierającym β-glukan, który pochodzi z Saccharomyces cerevisiae. Zymosan jest znany z wywoływania sygnałów zapalnych w makrofagach i komórkach dendrytycznych i był szeroko stosowany w badaniach nad fagocytozą 13,14,15.
	<ol>
		Krótko przemieszać <li>probówkę zawierającą cząstki stałe i przelać do probówki o pojemności 1,5 ml ilość wystarczającą do przeprowadzenia eksperymentu. 
		UWAGA: Zazwyczaj używamy proporcji 1:10 (na jedną komórkę dodaj 10 cząsteczek zymosanu lub kulek pokrytych IgG).</li>
		<li>Dodać 1 ml lodowatego PBS i zebrać cząstki, wirując przez 1 minutę przy 10 000 x g.</li>
		<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml lodowatego PBS.</li>
		<li>Powtórz kroki 2.2.2-2.2.3 
		UWAGA: Przejdź do kroku 2.2.5 lub przechowuj probówkę w temperaturze 4 °C do czasu użycia.</li>
		<li>Sonikować cząstki stałe przez 10 sekund w ultradźwiękowym sonikatorze kąpieli (120 V, 50-60 kHz), aby uniknąć agregacji cząstek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Fagocytoza
UWAGA: Fagocytoza to złożony proces, który rozpoczyna się od wiązania cząstek na powierzchni komórek fagocytów poprzez interakcję PRR z ligandami na powierzchni cząstki. Po wiązaniu następuje złożenie aktyny i związanych z nią białek w miejscu kontaktu oraz utworzenie miseczki fagocytarnej. Późniejszy demontaż aktyny zachodzi w fagosomie i powoduje całkowite pochłonięcie cząstek. Poniżej opisujemy różne etapy fagocytozy.
<ol>
	<li>Test wiążący 
	UWAGA: Celem tego eksperymentu jest monitorowanie pierwszego etapu fagocytozy, który obejmuje interakcję między ligandami na cząstkach docelowych a receptorami na fagocytach.
	<ol>
		<li>Zasiej około 5 x 104 komórek w szkiełku komorowym, tak aby w czasie eksperymentu zlewały się w 60-70%. Alternatywnie, płytki na szkiełkach nakrywkowych (w formacie 24- lub 12-dołkowym) lub 96-dołkowych płytkach ze szklanym dnem. Inkubować komórki przez noc w wilgotnym inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2, 
		UWAGA: Komórki można liczyć za pomocą hemocytometru lub podobnej techniki.</li>
		<li>Umieścić szkiełko (lub płytę) komory w temperaturze 10 °C na 10 minut.</li>
		<li>Delikatnie usunąć pożywkę z każdej studzienki za pomocą pipety lub aspiratora. 
		UWAGA: Wykonaj ten krok ostrożnie, ponieważ każda studzienka systemu komorowego szkła nakrywkowego jest mała; Łatwo jest zaburzyć komórki za pomocą końcówki pipety lub silnego przepływu powietrza z aspiratora.</li>
		<li>Zmieszać znakowane fluorescencyjnie cząstki z pożywką do hodowli komórkowych (przygotowaną w sposób opisany powyżej). Dodaj Candida-BFP (przy MOI 10), fluorescencyjnie sprzężony zymosan lub kulki lateksowe IgG-FITC królika (10 cząstek na komórkę) do komórek. Użyj końcowej objętości pożywki 200 μl na jedną komorę, aby upewnić się, że wszystkie komórki są pokryte.</li>
		<li>Wirować szkiełko komory przy 277 x g przez 3 minuty w temperaturze 10 °C. 
		UWAGA: Ten etap wirowania pomaga zwiększyć kontakt między cząstkami stałymi a komórkami i synchronizuje proces wiązania.</li>
		<li>Natychmiast przenieść szkiełko komorowe do inkubatora z wilgotnością 37 °C z 5% CO2 na 5 minut.</li>
		<li>Wyjmij szkiełko komory z inkubatora i zassaj pożywkę.</li>
		<li>Umyj komórki 3x lodowatym PBS. 
		UWAGA: Sprawdź obecność niezwiązanych cząstek pod mikroskopem świetlnym i w razie potrzeby przemyj więcej razy PBS. Konieczne jest usunięcie niezwiązanych cząstek z odwiertu, aby zminimalizować szum tła podczas analizy.</li>
		<li>Utrwal komórki, dodając 500 μl 4% paraformaldehydu (PFA) rozcieńczonego w PBS przez inkubację przez 30 minut w temperaturze pokojowej. 
		UWAGA: Ten krok wymaga użycia 4% PFA, który jest wysoce toksyczny, i potencjalnie rakotwórczy. Należy zachować odpowiednią ostrożność podczas używania tego płynu. Chroń również próbki przed światłem.</li>
		<li>Przemyć komórki, dodając 500 μl PBS do komory i delikatnie odessać roztwór.</li>
		<li>Powtórz krok 3.1.9 dwa razy. 
		UWAGA: Na tym etapie należy ponownie napełnić każdą fiolkę natychmiast po wyjęciu poprzedniego PBS.</li>
		<li>Zatrzymać utrwalanie przez inkubację z 500 μl 50 mM NH4Cl w PBS przez 10 minut.</li>
		<li>Umyć komórki dwukrotnie PBS, jak opisano w kroku 3.1.10.</li>
		<li>Przepuszczalność komórek przez dodanie 250 μl buforu wiążącego (0,1% saponiny, 0,2% BSA w PBS) przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Barwnik F-aktyny przez dodanie fluorescencyjnie sprzężonej falloidyny (rozcieńczonej w stosunku 1:500 w buforze wiążącym). Inkubuj komórki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Umyć komórki trzykrotnie PBS, jak opisano w kroku 3.1.10.</li>
		<li>Rejestruj obrazy za pomocą mikroskopu konfokalnego (obiektyw 63x oraz laser 402 nm i 488 nm) i analizuj obrazy za pomocą ImageJ16. 
		UWAGA: Udane wiązanie cząstek charakteryzuje się obecnością miseczki fagocytarnej w miejscu, w którym cząstki stykają się z komórką fagocytarną (ryc. 1). Patrz krok 3.2.5.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test wychwytu fagocytozy 
	UWAGA: Ten eksperyment ma na celu monitorowanie całkowitej internalizacji fluorescencyjnie znakowanych cząstek przez fagocyty za pomocą mikroskopii konfokalnej (ryc. 2).
	<ol>
		<li>Zasiej około 5 x 104 komórek w szkiełku komorowym, tak aby w czasie eksperymentu zlewały się w 60-70%. Alternatywnie, płytki na szkiełkach nakrywkowych (w formacie 24- lub 12-dołkowym) lub 96-dołkowych płytkach ze szklanym dnem. Inkubować komórki przez noc w wilgotnym inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2, 
		UWAGA: Komórki można liczyć za pomocą hemocytometru lub podobnej techniki.</li>
		<li>Szkiełka komory (lub płytę) należy przechowywać w temperaturze 10 °C przez 10 min. 
		UWAGA: Chłodzenie jest konieczne w celu zablokowania endocytozy, a także niepożądanej fagocytozy, a następnie uzyskania zsynchronizowanej fagocytozy.</li>
		<li>Wykonaj kroki od 3.1.3 do 3.1.5</li>
		<li>Przenieść szkiełko komorowe do inkubatora z wilgotnością 37 °C z 5% CO2 i inkubować w różnych punktach czasowych. Napraw komórki po 30, 60 i 90 minutach po zakażeniu. Obserwuj, jak C. albicans zaczyna tworzyć strzępki po 60 minutach od zakażenia; Fagocyty zaczynają wykazywać śmierć komórkową (piroptozę) po 90 min8. 
		UWAGA: Jest to zalecenie, a optymalizacja jest niezbędna w zależności od typu ogniwa i zastosowanych cząstek stałych.</li>
		<li>Wykonaj kroki od 3.1.7 do 3.1.15. Analizuj obrazy za pomocą ImageJ16. 
		UWAGA: pomyślny wychwyt charakteryzuje się całkowitą internalizacją cząstki wewnątrz cytoplazmy fagocytu (ryc. 2). Barwienie fagocytów markerem powierzchni komórki, takim jak falloidyna, pomaga wytyczyć kontur komórek. Niezbędne jest również wykonanie z-stacków w celu określenia, czy cząstki są związane z powierzchnią komórki, czy całkowicie zinternalizowane.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowanie fagocytozy na żywo 
	UWAGA: W tym protokole opisujemy zastosowanie mikroskopii konfokalnej do uchwycenia różnych etapów fagocytozy przy użyciu fluorescencyjnie sprzężonego zymozanu. Używamy dendrytycznej linii komórkowej DC2.4, która stabilnie wyraża oznaczoną mCherry F-actin8, biosensora, który pokazuje rozkład nitkowatej aktyny w żywych komórkach. Ponieważ fagocytoza jest procesem napędzanym aktyną, obrazowanie na żywo w tej komórce nie tylko pozwala nam uchwycić ruch i dynamikę sieci F-aktyny, ale także uwidocznić różne zdarzenia fagocytarne w żywych komórkach (ryc. 3, film 1).
	<ol>
		<li>Wysiewaj około 5 x 104 komórek w komorze szkiełka w stężeniu tak, aby w czasie eksperymentu zlewały się w 60-70%. Inkubować komórki przez noc w wilgotnym inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2, 
		UWAGA: Komórki można liczyć za pomocą hemocytometru lub podobnej techniki.</li>
		<li>Utrzymuj szkiełka komory na lodzie przez 10 min. 
		UWAGA: Chłodzenie jest konieczne, aby zablokować niepożądane wchłanianie i uzyskać zsynchronizowaną fagocytozę.</li>
		<li>Wykonaj kroki od 3.1.3 do 3.1.5</li>
		<li>Rozgrzej wstępnie stolik mikroskopu do 37 °C i zrównoważ komorę z 5% CO2 . Odczekaj 30-45 minut, aż temperatura i CO2 ustabilizują się przed rozpoczęciem obrazowania. 
		UWAGA: Ponieważ poziomy CO2 i temperatury mają kluczowe znaczenie dla fagocytozy, ważne jest, aby włączyć grzałkę mikroskopu przed eksperymentem, aby zrównoważyć komorę środowiskową.</li>
		<li>Umieścić szkiełko komorowe zawierające komórki w komorze inkubatora mikroskopu w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
		<li>Wykonywanie obrazowania na żywo17,18. 
		UWAGA: Ustawienia mocy lasera (wzmocnienie, otwór itp.) mogą się różnić w zależności od typu używanego mikroskopu i sondy fluorescencyjnej. Dlatego zalecamy zapoznanie się z instrukcją obsługi mikroskopu w celu uzyskania optymalnych warunków do obrazowania na żywo 17,18.
		<ol>
			<li>Użyj konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego (i powiązanego oprogramowania) do obrazowania na żywo. Użyj obiektywu olejowego 63X 1.4NA z otworem 1-1.1 Airy.</li>
			<li>Aby rozpocząć obrazowanie, użyj jasnego pola, aby znaleźć reprezentatywny obszar na szkiełku komory. Następnie wybierz pole, klikając opcję Pozycja w oprogramowaniu. Do wykrycia GFP na ścieżce 1 użyto zestawu filtrów dla lasera 488 nm z rozdzielaczem wiązki przy 582 nm, do wykrywania długości fal od 488 do 582 nm.</li>
			<li>Na ścieżce 2 wybierz zestaw filtrów optymalny dla mCherry (RFP) za pomocą rozdzielacza wiązki o długości fali 578 nm i wykrywającego długości fal od 578 do 600 nm. Używaj laserów 488 nm i 578 nm o 50% mocy lasera i wzmocnieniu wyjściowym 600-700. Uzyskuj obrazy co 30 sekund, łącznie przez 90 minut.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Janeway, C. A. Jr, Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Innate immune recognition.</a> Annu. Rev. Immunol. 20, 197-216 (2002).</li>
<li>Underhill, D. M., Goodridge, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Information+processing+during+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Information processing during phagocytosis.</a> Nat. Rev. Immunol. 12, 492-502 (2012).</li>
<li>Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pathol%22%5BJournal%5D)">The cell biology of phagocytosis.</a> Annu Rev Pathol. 7, 61-98 (2012).</li>
<li>Aderem, A., Underhill, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+phagocytosis+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of phagocytosis in macrophages.</a> Annu Rev. Immunol. 17, 593-623 (1999).</li>
<li>Flannagan, R. S., Harrison, R. E., Yip, C. M., Jaqaman, K., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+macrophage+%26%2334%3Bprobing%26%2334%3B+is+required+for+the+efficient+capture+of+phagocytic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic macrophage &#34;probing&#34; is required for the efficient capture of phagocytic targets.</a> J. Cell Biol. 191, 1205-1218 (2010).</li>
<li>Swanson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaping+cups+into+phagosomes+and+macropinosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Shaping cups into phagosomes and macropinosomes.</a> Nat. Rev. Mol Cell Biol. 9, 639-649 (2008).</li>
<li>Botelho, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+biphasic+changes+in+phosphatidylinositol-4%2C5-bisphosphate+at+sites+of+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Localized biphasic changes in phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate at sites of phagocytosis.</a> J. Cell Biol. 151, 1353-1368 (2000).</li>
<li>Tafesse, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+Sphingolipid+Biosynthesis+Blocks+Phagocytosis+of+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Disruption of Sphingolipid Biosynthesis Blocks Phagocytosis of Candida albicans.</a> PLoS Pathog. 11, e1005188(2015).</li>
<li>Kwik, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+cholesterol%2C+lateral+mobility%2C+and+the+phosphatidylinositol+4%2C5-bisphosphate-dependent+organization+of+cell+actin%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Membrane cholesterol, lateral mobility, and the phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate-dependent organization of cell actin.</a> PNAS. 100, 13964-13969 (2003).</li>
<li>Levin, R., Grinstein, S., Schlam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoinositides+in+phagocytosis+and+macropinocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22BBA%22%5BJournal%5D)">Phosphoinositides in phagocytosis and macropinocytosis.</a> BBA. 1851, 805-823 (2015).</li>
<li>Freeman, S. A., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis%3A+receptors%2C+signal+integration%2C+and+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton.</a> Immunol. Rev. 262, 193-215 (2014).</li>
<li>Jutras, I., Desjardins, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis%3A+at+the+crossroads+of+innate+and+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis: at the crossroads of innate and adaptive immunity.</a> Annu. Rev. Cell. 21, 511-527 (2005).</li>
<li>Strijbis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bruton%27s+Tyrosine+Kinase+%28BTK%29+and+Vav1+contribute+to+Dectin1-dependent+phagocytosis+of+Candida+albicans+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Bruton's Tyrosine Kinase (BTK) and Vav1 contribute to Dectin1-dependent phagocytosis of Candida albicans in macrophages.</a> PLoS Pathog. 9, e1003446(2013).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beta-glucan+receptor+Dectin-1+activates+the+integrin+Mac-1+in+neutrophils+via+Vav+protein+signaling+to+promote+Candida+albicans+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">The beta-glucan receptor Dectin-1 activates the integrin Mac-1 in neutrophils via Vav protein signaling to promote Candida albicans clearance.</a> Cell Host Microbe. 10, 603-615 (2011).</li>
<li>Esteban, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungal+recognition+is+mediated+by+the+association+of+dectin-1+and+galectin-3+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Fungal recognition is mediated by the association of dectin-1 and galectin-3 in macrophages.</a> PNAS. 108, 14270-14275 (2011).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat. Meth. 9, 671-675 (2012).</li>
<li>Ettinger, A., Wittmann, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24974023">Fluorescence live cell imaging.</a> Meth. Cell Biol. 123, 77-94 (2014).</li>
<li>Khodjakov, A., Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+division+process+in+living+tissue+culture+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging the division process in living tissue culture cells.</a> Methods. 38, 2-16 (2006).</li>
<li>Freeman, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+Form+an+Expanding+Diffusional+Barrier+that+Coordinates+Phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Integrins Form an Expanding Diffusional Barrier that Coordinates Phagocytosis.</a> Cell. 164, 128-140 (2016).</li>
<li>Jaumouille, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+cytoskeleton+reorganization+by+Syk+regulates+Fcgamma+receptor+responsiveness+by+increasing+its+lateral+mobility+and+clustering%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Actin cytoskeleton reorganization by Syk regulates Fcgamma receptor responsiveness by increasing its lateral mobility and clustering.</a> Dev. Cell. 29, 534-546 (2014).</li>
<li>Bain, J., Gow, N. A., Erwig, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+insights+into+host-fungal+pathogen+interactions+derived+from+live-cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Sem.+Immunopath%22%5BJournal%5D)">Novel insights into host-fungal pathogen interactions derived from live-cell imaging.</a> Sem. Immunopath. 37, 131-139 (2015).</li>
<li>Forestier, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+host-Leishmania+interactions%3A+significance+in+visceral+leishmaniasis%5BTitle%5D)+AND+%22Para.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Imaging host-Leishmania interactions: significance in visceral leishmaniasis.</a> Para. Immunol. 35, 256-266 (2013).</li>
<li>John, B., Weninger, W., Hunter, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+imaging+the+innate+and+adaptive+immune+response+to+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Advances in imaging the innate and adaptive immune response to Toxoplasma gondii.</a> Future Microbiol. 5, 1321-1328 (2010).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Profesjonalne fagocyty, takie jak makrofagi i komórki dendrytyczne, pochłaniają i eliminują atakujące patogeny, dzięki czemu fagocytoza jest ważnym elementem systemu obronnego gospodarza. Podczas tego procesu fagocyty przechodzą rozległą reorganizację błony i przegrupowanie cytoszkieletu na powierzchni komórki 8,19,20. Aby lepiej zrozumieć ten dynamiczny proces, niezbędna jest wizualizacja różnych etapów fagocytozy. Tutaj opisal...

Pomimo ciągłego narażenia na patogeny, takie jak bakterie, wirusy i grzyby, nasze ciało jest dobrze wyposażone w mechanizmy odpornościowe, które zapewniają ochronę przed infekcjami. Wrodzony układ odpornościowy jest pierwszą linią obrony przed atakującymi patogenami i opiera się głównie na komórkach fagocytarnych, które rozpoznają i internalizują obce cele.
Fagocytoza to ewolucyjnie zachowany proces komórkowy, który obejmuje pochłanianie niechcianych cząstek większych niż 0,5 μm. Komórki fagocytarne wyrażają szeroki zakres receptorów immunologicznych (znanych również jako receptory rozpoznawania wzorców, PRR) na powierzchni komórki, które umożliwiają im rozpoznawanie wzorców molekularnych związanych z patogenami (PAMP) obecnych na patogenach przed pochłonięciem3. Po wiązaniu patogenu następuje grupowanie receptorów na powierzchni komórki i wyzwala tworzenie miseczki fagocytarnej. Powoduje to przebudowę błony sterowanej aktyną, która wystaje wokół celu, ostatecznie otaczając go i ściskając, tworząc dyskretną wakuolę fagosomalną2,5. Fagosom następnie dojrzewa i zakwasza się przez późniejszą fuzję z późnymi endosomami i lizosomami, która tworzy fagolizosom6.
Chociaż fagocytoza jest opisywana jako zdarzenie zależne od receptora i napędzane aktyną, proces ten opiera się również na przestrzenno-czasowej modyfikacji lipidów tworzących błonę plazmatyczną, takich jak fosfoinozytydy (PI) i sfingolipidy7,8. Podczas gdy polimeryzacja aktyny jest podyktowana miejscową akumulacją fosfoinozytolo-4,5-bifosforanu (PI(4,5)P2) u podstawy miseczki fagocytarnej, depolimeryzacja aktyny zależy od konwersji (PI(4,5)P2 do fosfoinozytolu-3,4,5-bifosforanu (PI(3,4,5)P3)3,9. Obie modyfikacje są niezbędne, ponieważ pierwsza prowadzi do pomyślnego rozciągnięcia pseudopodów wokół celu, a druga umożliwia zatopienie cząstek w cytozolu fagocytu10.
Komórki, które mają zdolność do fagocytozy, to albo profesjonalne fagocyty, takie jak makrofagi/monocyty, granulocyty/neutrofile i komórki dendrytyczne (DC), albo nieprofesjonalne fagocyty, takie jak fibroblasty i komórki nabłonkowe11. Fagocytoza wykonywana przez wszystkie fagocyty odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu i przebudowie tkanek, podczas gdy fagocytoza wykonywana przez profesjonalne fagocyty jest odpowiedzialna za koordynację wrodzonej i nabytej odpowiedzi immunologicznej przeciwko patogenom. Profesjonalne fagocyty nie tylko pochłaniają i zabijają patogen, ale także prezentują antygeny komórkom limfoidalnym adaptacyjnego układu odpornościowego. Przyczynia się to do uwalniania cytokin prozapalnych i angażowania komórek limfoidalnych, co prowadzi do skutecznej blokady infekcji12.
Konwencjonalne techniki biochemiczne odegrały kluczową rolę w zdobyciu wiedzy na temat molekularnego mechanizmu różnych procesów komórkowych podczas fagocytozy, takich jak modyfikacje potranslacyjne i różne związki o wysokim powinowactwie między białkami. Trudno jest jednak uzyskać informacje dotyczące przestrzennej i czasowej dynamiki zdarzeń fagocytarnych przy użyciu konwencjonalnych metod biochemicznych. Obrazowanie żywych komórek nie tylko pozwala nam monitorować zdarzenia komórkowe w sposób wrażliwy na czas, ale także umożliwia nam uzyskanie informacji na poziomie pojedynczej komórki. W tym miejscu opisujemy metodę badania różnych etapów fagocytozy, a także analizy całego procesu czasoprzestrzennie za pomocą mikroskopii konfokalnej.

<table><tbody><tr><td>&beta;-Merkaptoetanol</td><td>AppliChem</td><td>A1108</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej&nbsp;</td><td>9998</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamidyn-2-fenyloindol, mleczan)</td><td>ThermoFisher</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>ThermoFisher</td><td>BP-231-1</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco' s Minimalny Orzeł" s medium)</td><td>Gibco</td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 1x (sól fizjologiczna buforowana fosforanami)</td><td>Corning cellgro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Sigma Aldrich</td><td>12003C</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki lateksowe powlekane IgG sprzężone z FITC</td><td>Cayman</td><td>500290</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina 200 mM (100x)</td><td>ThermoFisher</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór paraformaldehydu (4% w PBS)</td><td>Affymetrix</td><td>19943 1 LT</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna (10 000 U/ml)</td><td>ThermoFisher</td><td><a href="https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-penicillin-streptomycin-10-000-u-ml-3/15140122">15-140-122</a></td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin-Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>RAW 264,7 ogniwa</td><td>ATCC</td><td>TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>RPMI (Roswell Park Memorial Institute)</td><td>Gibco</td><td>61870</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7900</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego (0,4% (w/v) w PBS)</td><td>Corning cellgro</td><td>MT25900CI</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (1x) (0,05%)</td><td>ThermoFisher</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20 Surfact-Amps Roztwór detergentu</td><td>ThermoFisher</td><td>&nbsp; 85114</td><td></td></tr><tr><td>Zymosan-Alexa Fluor 594</td><td>ThermoFisher</td><td>Z23374</td><td></td></tr><tr><td>Komorowy 1.0 borokrzemianowy system nakrywkowy (8 komór)</td><td>ThermoFisher</td><td>155361</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko szklane 10 z kratkami</td><td>Hycor</td><td>87144</td><td></td></tr></tbody></table>

wizualizacja wczesnych stadiów fagocytozy

Visualizing the Early Stages of Phagocytosis

Ciało ssaka jest wyposażone w różne warstwy mechanizmów, które pomagają bronić się przed inwazją patogenów. Profesjonalne fagocyty układu odpornościowego - takie jak neutrofile, komórki dendrytyczne i makrofagi - zachowują wrodzoną zdolność do wykrywania i usuwania takich atakujących patogenów poprzez fagocytozę1. Fagocytoza obejmuje choreograficzne zdarzenia reorganizacji błony i przebudowy aktyny na powierzchni komórki2,3. Fagocyty skutecznie internalizują i eliminują obce cząsteczki tylko wtedy, gdy spełnione są wszystkie etapy fagocytozy. Etapy te obejmują rozpoznawanie i wiązanie patogenu przez receptory rozpoznawania wzorców (PRR) znajdujące się na powierzchni komórki, tworzenie miseczki fagocytarnej przez błoniaste wypukłości wzbogacone w aktynę (pseudopody) otaczające cząstki oraz rozszczepienie fagosomu, a następnie dojrzewanie fagolizosomu, które powoduje zabicie patogenu3,4.
Obrazowanie i kwantyfikacja różnych etapów fagocytozy jest kluczowe dla wyjaśnienia molekularnych mechanizmów tego procesu komórkowego. Niniejszy manuskrypt przedstawia metody badania różnych faz fagocytozy. Opisujemy podejście oparte na mikroskopie do wizualizacji i ilościowego określania wiązania, tworzenia miseczek fagocytarnych i internalizacji cząstek stałych przez fagocyty. Ponieważ fagocytoza występuje, gdy wrodzone receptory na komórkach fagocytarnych napotykają ligandy na cząstce docelowej większej niż 0,5 μm, testy, które tutaj przedstawiamy, obejmują użycie chorobotwórczych grzybów Candida albicans i innych cząstek, takich jak zymosan i kulki pokryte IgG.

Przedstawiono metodę mikroskopową do monitorowania różnych etapów fagocytozy. Pokazano poszczególne zdarzenia zachodzące podczas fagocytozy różnych fluorescencyjnych cząsteczek przez komórki DC2.4. Wykorzystując opisane tutaj techniki, zbadaliśmy rolę sfingolipidów we wczesnych etapach fagocytozy. W tym celu użyto komórek dendrytycznych DC2.4 z genetycznym niedoborem Sptlc2, enzymu katalizującego pierwszy i limitujący etap szlaku biosyntezy sfingolipidów. W porównaniu z komórkami typu dzikiego, komórki DC2.4 Sptlc2-...

Tutaj opisujemy technikę opartą na mikroskopie, aby wizualizować i kwantyfikować wczesne kaskady zdarzeń podczas fagocytozy patogenów, takich jak grzyby Candida albicans i cząstki większe niż 0,5 μm, w tym kulki pokryte zymozanem i IgG.

Wizualizacja wczesnych stadiów fagocytozy

The mammalian body is equipped with various layers of mechanisms that help to defend itself from pathogen invasions. Professional phagocytes of the immune ...

Nadrzędnym celem tej techniki jest monitorowanie różnych etapów fagocytozy za pomocą mikroskopu konfokalnego. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie interakcji między patogenami krzyżowymi. Głównie po to, aby zrozumieć, w jaki sposób patogeny dostają się do komórek gospodarza podczas infekcji.Główną zaletą tej techniki jest to, że jest prosta i pozwala nam uzyskać informacje o komórce wirusa naszych zdarzeń, które zachodzą podczas fagocytozy w sposób wrażliwy na czas. Na początek przygotuj fluorescencyjnie sprzężony zymosan zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym. Poprzedniego dnia wysiewaj około pięć razy 10 do czwartej komórki DC 2,4 w szkiełku komorowym, tak aby studzienki były zlewające się w 60 do 70% w czasie eksperymentu.Gdy komórki osiągną odpowiednią gęstość, umieść szkiełko komory w temperaturze 10 stopni Celsjusza na 10 minut. Chłodzenie komórek jest konieczne, aby zablokować endocytozę, a także kiedy przełączać cytozę. A następnie mieć zsynchronizowaną fagocytozę.Następnie delikatnie usuń podłoże z każdej studzienki za pomocą pipety lub aspiratora. Następnie zmieszać fluorescencyjnie sprzężony zymosan z pożywką do hodowli komórkowych w wielokrotności infekcji 10. Następnie dodaj 500 mikrolitrów pożywki do każdej komory, aby upewnić się, że cała komórka jest pokryta.Następnie obrócić suwak komory, aby zarówno zwiększyć kontakty między cząstkami w komórkach, jak i zsynchronizować proces wiązania. Po odwirowaniu przenieś szkiełko komory do inkubatora z wilgotnością 37 stopni Celsjusza z 5 procentami CO2. Po pięciu minutach w temperaturze 37 stopni Celsjusza wyjmij szkiełko z inkubatora i zassaj pożywkę.Następnie umyj komórki trzykrotnie lodowatym PBS. Po ostatnim myciu sprawdź obecność niezwiązanych cząstek pod mikroskopem świetlnym i w razie potrzeby wykonaj dodatkowe płukania. Konieczne jest usunięcie niezwiązanych cząstek ze studzienek, aby zminimalizować szum tła podczas analizy.Następnie utrwal komórki, dodając 500 mikrolitrów czteroprocentowego paraformaldehydu w PBS do studzienek i inkubując je przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po utrwaleniu komórek umyj je, dodając 500 mikrolitrów PBS do każdej komory, a następnie delikatnie zasysając roztwór. Powtórz krok prania jeszcze dwa razy.Po trzeciej rundzie płukania zatrzymaj reakcję, dodając do komórek 500 mikrolitrów 50-milimolowego chlorku amonu w PBS i inkubując je przez 10 minut. Następnie umyj komórki w 500 mikrolitrach PBS o temperaturze pokojowej. Następnie przepuszczaj komórki, dodając 500 mikrolitrów buforu wiążącego do każdej studzienki i inkubując komórki przez 30 minut w temperaturze pokojowej.Następnym krokiem jest barwienie F-aktyny poprzez dodanie fluorescencyjnie sprzężonej falloidyny do komórek i inkubację ich przez godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie umyj komórki trzykrotnie 500 mikrolitrami PBS. Na koniec uchwyć obrazy za pomocą mikroskopu konfokalnego i przeanalizuj obrazy za pomocą ImageJ.W celu zmierzenia wychwytu zymosanu należy przygotować szkiełka komorowe z komórkami, jak pokazano w teście wiązania. Po zakończeniu etapów chłodzenia i etykietowania przenieś szkiełko komory do inkubatora z wilgotnością 37 stopni Celsjusza z pięcioprocentowym CO2. I inkubuj komórki w różnych punktach czasowych.Napraw komórki po 30, 60 i 90 minutach po infekcji. Pamiętaj, aby zoptymalizować te punkty czasowe w oparciu o odpowiedni typ ogniwa i używane cząstki fluorescencyjne. Następnie przeanalizuj obrazy za pomocą ImageJ.Pomyślny wychwyt charakteryzuje się całkowitą internalizacją cząstki wewnątrz cytoplazmy fagocytu. Na początek przygotuj komorę środowiskową na scenie mikroskopu, podgrzewając ją do 37 stopni Celsjusza i równoważąc komorę z 5 procentami CO2. Poczekaj od 30 do 45 minut, aż temperatura i CO2 ustabilizują się przed obrazowaniem.Widzenie poziomu CO2 i temperatury ma kluczowe znaczenie dla fagocytozy, dlatego ważne jest, aby włączyć grzałkę mikroskopu przed eksperymentem, aby zrównoważyć środowisko tej komory. Następnie przygotuj szkiełka komorowe z komórkami DC 2,4, które stabilizują ekspresję mCherry F-aktyny, jak pokazano w teście wiązania. Postępując zgodnie z krokami gruchania i etykietowania, przenieś szkiełko komory z wirówki bezpośrednio na wstępnie podgrzany stolik mikroskopu.Na koniec wykonaj obrazowanie na żywo za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego, jak opisano w dołączonym protokole tekstowym, aby nie tylko uchwycić ruch i dynamikę sieci F-aktyny, ale także uwidocznić różne zdarzenia fagocytarne w żywych komórkach. Komórki pokazane tutaj na zielono to dzikie komórki DC 2.4, które są zainfekowane kanadyjskim BFP, który jest pokazany na czerwono. Obrazowanie poklatkowe służy do wizualizacji wczesnych stadiów fagocytozy i jest tutaj pokazane w 30-sekundowych odstępach.Lokalizacje oznaczone gwiazdką to miejsca, w których zachodzi przebudowa aktyny. Cały proces odbywa się w ciągu kilku minut. Tutaj oceniono rolę sfingolipidów pod kątem ich roli we wczesnych stadiach fagocytozy.Stosując tę technikę, stwierdzono, że sfingolipidy są niezbędne do wiązania Candida albicans z komórkami i zmniejszania ogólnej fagocytozy. To zmniejszenie wiązania fagocytotycznego wykazano również w przypadku wiązania komórek DC 2.4 z zymozanami. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonywać obrazowanie na żywo, aby zbadać wczesne stadium fagocytozy.Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu jednej do dwóch godzin, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Po tej procedurze można przeprowadzić fagocytozę innych patogenów, w tym bakterii i pasożytów, w celu zrozumienia skomplikowanego związku między komórkami odpornościowymi a tymi patogenami. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią komórki, aby zbadać endocytozę za pośrednictwem receptorów, w tym fagocytozę i makropinocytozę w komórkach odpornościowych.

visualizing-the-early-stages-of-phagocytosis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film demonstruje test do monitorowania niezależnych zdarzeń fagocytozy krwinek czerwonych (RBC) za pośrednictwem makrofagów. Mysie immunoglobuliny G (IgG) opsonizowane ludzkie erytrocyty są inkubowane z mysimi makrofagami i obserwowane pod mikroskopem konfokalnym. Erytrocyty są pochłaniane przez makrofagi poprzez tworzenie miseczki fagocytarnej i ukierunkowane na degradację lizosomalną.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym fagocytozy makrofagów krwinek czerwonych z opsonizowanymi IgG

Ten film demonstruje technikę mikroskopii TIRF (total internal reflection fluorescence) o wysokiej rozdzielczości do wizualizacji w czasie rzeczywistym powstawania i zamykania fagosomów podczas fagocytozy za pośrednictwem makrofagów opsonizowanych IgG-opsonizowanych czerwonych krwinek (RBC) przyczepionych do powierzchni naczynia o szklanym dnie. Makrofagi rozciągają pseudopodia wokół erytrocytów i pochłaniają je wewnątrz fagosomów, odrywając je od powierzchni szkła.

Wizualizacja powstawania i zamykania fagosomów oparta na mikroskopii TIRF

Opisujemy metody wideomikroskopii żywych komórek fagocytozy Candida albicans za pomocą makrofagów.  Metody te umożliwiają specyficzną dla danego etapu analizę migracji, rozpoznawania, pochłaniania i dojrzewania fagosomów oraz ujawniają nowe aspekty fagocytozy.

Mikroskopia wideo żywych komórek fagocytozy patogenów grzybowych

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Badanie biogenezy fagolizosomów w żywych makrofagach

Tutaj prezentujemy protokół ilościowego oznaczania fagocytozy cząstek fluorescencyjnych za pomocą przylegającej linii komórkowej makrofagów przy użyciu metody fluorometrycznej. Metoda ta ułatwia wysokoprzepustową kwantyfikację internalizacji cząstek, a także wynikającą z niej polimeryzację aktyny.

Wysokoprzepustowa technika fluorometryczna do oceny fagocytozy makrofagów i polimeryzacji aktyny

Opisujemy eksperymentalny układ do wizualizacji z bezprecedensową wysoką rozdzielczością tworzenia i zamykania fagosomów w trzech wymiarach u żywych makrofagów, przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem. Umożliwia monitorowanie podstawy miseczki fagocytarnej, rozciągających się pseudopodów, a także dokładnego miejsca rozszczepienia fagosomu.

"Test zamykania fagosomu" do wizualizacji powstawania fagosomów w trzech wymiarach przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRFM)

Ten manuskrypt opisuje prostą metodę pomiaru pH i powierzchni fagosomalnej oraz cytoplazmatycznego pH neutrofili ludzkich i mysich za pomocą wskaźnika ratiometrycznego seminaphthorhodafluor (SNARF)-1 lub S-1. Osiąga się to za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek i analizy obrazu.

Obrazowanie fagosomu neutrofili i cytoplazmy za pomocą ratiometrycznego wskaźnika pH

Tutaj opisujemy metody wykorzystujące mikroskopię konfokalną z wirującym dyskiem do obrazowania pojedynczych zdarzeń fagocytarnych przez makrofagi otrzewnowe rezydujące u myszy. Protokoły można rozszerzyć na inne komórki fagocytarne.

Poklatkowe obrazowanie 3D fagocytozy przez makrofagi myszy

Mechanizm związany z fagocytozą w zakażeniu Leishmania pozostaje słabo poznany. W tym miejscu opisujemy metody oceny wczesnych zdarzeń zachodzących podczas interakcji Leishmania z komórkami gospodarza.

Badanie fagocytozy Leishmania za pomocą mikroskopii konfokalnej

Prezentowany tutaj jest protokół do ilościowego określania i tworzenia dynamicznych obrazów regulacji makrofagów (MΦ) za pośrednictwem mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) fagocytozy nieopsonizowanych cząsteczek drożdży (zymosan), które są sprzężone z cząsteczką fluorescencyjną wrażliwą na pH.

Mezenchymalne komórki macierzyste regulują fagocytozę makrofagów; Kwantyfikacja i obrazowanie

Badanie to wyjaśnia przetwarzanie fagocytarne cząstek Godanti Bhasma (GB) w komórkach ssaków, charakteryzując ich wychwyt komórkowy, dynamikę wakuoli, zakwaszenie i degradację. Odkrycia te nie tylko pogłębiają naszą wiedzę na temat podstawowych mechanizmów fagocytozy, ale także sprawiają, że GB jest obiecującym systemem modelowym do opracowywania nowych strategii terapeutycznych.

Badanie sekwencyjnych zdarzeń komórkowych fagocytozy wywołanej przez Godanti Bhasma w komórkach ssaków

Poznaj technikę mikroskopii konfokalnej do wizualizacji wczesnych stadiów fagocytozy z użyciem komórek DC 2.4 i Candida albicans. Ta metoda umożliwia badanie dynamiki interakcji patogen-gospodarz w czasie rzeczywistym.

Wizualizacja wczesnych stadiów fagocytozy

Przeglądaj więcej filmów