Name: Przygotowanie włókien białkowych macierzy zewnątrzkomórkowej do spektroskopii Brillouina (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Poznaj metodę przygotowania włókien kolagenowych i elastynowych z macierzy zewnątrzkomórkowej do spektroskopii Brillouina. Technika ta umożliwia pełną analizę właściwości mikromechanicznych bez znajomości współczynnika załamania.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Radę Badań nad Naukami Inżynieryjnymi i Fizycznymi [numer grantu EP/M028739/1]. RSE otrzymało wsparcie w postaci Santander Postgraduate Research Award 2015.

Uwaga: Przed użyciem zapoznaj się z protokołami bezpieczeństwa biologicznego i wszystkimi odpowiednimi kartami charakterystyki substancji niebezpiecznych (MSDS). Laser użyty w tych eksperymentach to laser klasy 3B; Wymagane jest przestrzeganie lokalnych przepisów w celu bezpiecznego korzystania z systemu. Podczas wykonywania pomiaru spektroskopią laserową należy stosować wszystkie odpowiednie zasady bezpieczeństwa, w tym stosowanie środków ochrony osobistej (okularów ochronnych).
Ścięgna ogonowe zostały pobrane od 7-8 tygodniowych szczurów rasy Wistar, które zostały poddane eutanazji do innych celów, zgodnie z rozporządzeniem UE 1099/2009 i przepisami dotyczącymi dobrostanu zwierząt (ubój lub zabijanie) z 1995 roku. Więzadła karkowe bydła pozyskano z miejscowej rzeźni.
1. Przygotowanie włókien próbki
UWAGA: Włókna białkowe macierzy zewnątrzkomórkowej mogą być ekstrahowane z różnych tkanek, przy użyciu różnych procedur. Protokoły zostały dopracowane w oparciu o powszechnie stosowane procedury.
<ol>
	<li>Ekstrakcja włókien kolagenowych z ogona szczura
	<ol>
		<li>Uśmierc szczura przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 100 mg/kg masy ciała pentobarbitonu sodu. Następnie odetnij ogon bezpośrednio w miejscu styku z ciałem, dociskając jednoostrzową żyletką. Zawiń ogon w folię spożywczą i przechowuj go w stanie zamrożonym w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będzie potrzebny.</li>
		<li>Zebrać ogon z zamrażarki, odciąć segment o długości 20 mm od bliższego końca, gdy jest jeszcze zamrożony, a następnie pozostawić go do rozmrożenia na szalce Petriego wypełnionej roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) (pH 7,4) w temperaturze pokojowej tonacji.</li>
		<li>Po rozmrożeniu ogona wykonaj nacięcie wzdłuż segmentu za pomocą skalpela, aby rozciąć skórę. Następnie odklej się, aby odsłonić cztery osłonięte wiązki ścięgien wokół kręgu ogonowego.</li>
		<li>Używając cienkich kleszczyków i uważając, aby nie zastosować żadnego wstępnego odkształcenia, delikatnie wyciągnij każde włókno z osłonki i umieść je w fiolce zawierającej wodę destylowaną z 0,01% w/v azydkiem sodu (NaN3), aby zapobiec rozwojowi bakterii i przechowywać w lodówce. Pojedynczy ogon daje około trzydziestu włókien ścięgien.</li>
		<li>Aby uzyskać czysty włóknisty kolagen typu I, zastosuj trzyczęściowy proces trawienia enzymatycznego10 do włókien ścięgien w celu usunięcia proteoglikanów i całego innego materiału niekolagenowego.
		<ol>
			<li>Najpierw zanurzyć włókna w 0,125 U/ml chondroitynazy ABC w 0,05 M buforze Tris i 0,06 M octanu sodu (CH3COONa) o pH 8,0 przez 24 godziny w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsaniem przy 200 obr./min.</li>
			<li>Następnie zanurzyć włókna w 1 U/ml hialuronidazy Streptomyces w 0,05 M buforze Tris i 0,15 M chlorku sodu (NaCl) o pH 6,0 i powrócić do inkubatora wytrząsającego na 24 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
			<li>Na koniec zanurzyć włókna w 1 mg/ml trypsyny w 0,05 M fosforanu sodu (NaHPO4) i 0,15 M NaCl o pH 7,2 na 16 godzin w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Oczyszczone włókna należy przechowywać w lodówce w fiolkach zawierających wodę destylowaną o zawartości 0,01%NaN 3 w celu zapobieżenia rozwojowi bakterii, do czasu, gdy będzie to wymagane do pomiaru.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekstrakcja włókien elastyny z więzadła karkowego bydła
	<ol>
		<li>Zaopatrzyć się w więzadło karkowe bydła z rzeźni, zawinąć je w folię spożywczą i przechowywać w stanie zamrożonym w temperaturze -20 °C do momentu użycia.</li>
		<li>Aby wytworzyć czystą elastynę, wyjmij więzadło z zamrażarki, pozwól mu rozmrozić się w temperaturze pokojowej, usuń je za pomocą skalpela i strawij więzadło we wrzącej kąpieli wodnej zgodnie z procedurą Lansinga, w następujący sposób.
		<ol>
			<li>Przygotować 0,1 M roztwór wodorotlenku sodu (NaOH) w wodzie destylowanej i dodać go do odtłuszczonego więzadła w kolbie stożkowej, pokrywając tkankę.</li>
			<li>Gotować kolbę w łaźni wodnej w temperaturze 95 °C przez 45 minut.</li>
			<li>Wyjąć więzadło z kolby wytrawiającej i kilkakrotnie przemyć nierozpuszczalny blok tkanek w wodzie destylowanej, aż do uzyskania pH 7,0 (monitorowanego za pomocą pH-metru).</li>
			<li>Wyjmij chusteczkę z końcowego roztworu do płukania i zanurz ją w wodzie destylowanej (zmieszanej z 0,01% NaN3 w celu zapobieżenia rozwojowi bakterii) w szczelnie zamkniętym pojemniku i przechowuj w lodówce.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wyjmij chusteczkę z lodówki i uważając, aby nie użyć zbyt dużej siły i nie naprężyć wstępnie, za pomocą pęsety delikatnie odciągnij mniejsze segmenty elastyny (o długości od 20 do 50 mm i grubości ok. 2 mm) od większego bloku i umieść je na szalce Petriego z roztworem PBS (pH 7,4).</li>
		<li>Za pomocą cienkich kleszczy delikatnie rozdrobnij małe wiązki włókien o grubości około 1 mm i przytnij je na kilka mm długości za pomocą skalpela.</li>
		<li>Przenieś włókna do fiolek zawierających wodę destylowaną (z 0,01% NaN3 w celu zapobieżenia rozwojowi bakterii) i przechowuj je w lodówce do czasu, gdy będzie to wymagane do pomiaru.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Montaż włókien na podłożu odblaskowym
	<ol>
		<li>Za pomocą frezu diamentowego wytnij kawałek odblaskowego szkiełka silikonowego.</li>
		<li>Aby stworzyć uwodnioną komorę, wytnij pasek Parafilm tak, aby pasował do silikonowego szkiełka z wydrążonym nacięciem pośrodku (wystarczająco dużym, aby zmieścić włókno) i umieść go na silikonowym podłożu. 
		UWAGA: W przypadku pomiarów suchych włókien należy przyciąć parafilm w kształcie litery U, tak aby jeden z czterech boków pozostał otwarty na powietrze po uszczelnieniu w kroku 1.3.4.</li>
		<li>Wyjmij włókna z lodówki, użyj pary cienkich kleszczy, aby zebrać pojedyncze włókno z roztworu do przechowywania i umieść je na małej szalce Petriego wypełnionej czystą wodą o temperaturze pokojowej na 5 minut, aby umyć próbkę. Następnie zbierz włókno i przenieś je do środka wgłębienia parafilmu na podłożu silikonowym. 
		Ostrożnie: Unikaj uszkodzenia włókna poprzez rozciąganie go podczas tej operacji i unikaj zmiany orientacji próbki na podłożu, ponieważ może to spowodować zmianę właściwości mechanicznych.</li>
		<li>Umieść cienkie szklane szkiełko nakrywkowe na włóknie i uszczelnij komorę, delikatnie przesuwając rozgrzaną lutownicę po powierzchni szkła, aby stopić parafilm pod szkłem. 
		Ostrożnie: Unikaj uszkodzenia włókna, nie zbliżając zbyt blisko grotu lutowniczego lub nadmiernie podgrzewając podłoże.</li>
		<li>Umieść zapieczętowaną komorę na płaskiej powierzchni pod niewielką wagą i pozostaw ją na około 12 godzin, aby uzyskać dobry kontakt między próbką a podłożem silikonowym, unikając jednocześnie uszkodzenia próbki.</li>
		<li>Zdejmij ciężar i zabezpiecz komorę na podłożu za pomocą.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie eksperymentu Brillouin i pozyskiwanie widm włókien
<ol>
	<li>Przygotowanie komory na próbkę
	<ol>
		<li>Umieścić próbkę przygotowaną w sposób opisany w części 1.3 na pionowym uchwycie wyposażonym w goniometr umożliwiający obrót próbki w płaszczyźnie przy zachowaniu stałego kąta rozproszenia (2Φ = 90°; patrz rysunek SI-1) i położenia objętości rozpraszania.</li>
		<li>Wykonaj dokładną regulację ostrości światła laserowego na próbce przez soczewkę. 9 
		Ostrożny: Moc wyjściowa lasera może być zbyt wysoka i spowodować oparzenie próbki. Upewnij się, że jest ustawiony wystarczająco wysoko, aby zapewnić dobrą czułość, ale nie za wysoko, aby uniknąć uszkodzenia próbki. W tym przypadku zastosowaliśmy moc ok. 76 mW na próbce. Było to wystarczające, aby uzyskać dobrą czułość bez spalania próbki, biorąc również pod uwagę, że jest ona cienka i styka się z podłożem, które pomaga rozpraszać ciepło generowane przez oświetlenie laserowe.</li>
		<li>Umieść próbkę pod kątem 45° (Φ) do padającej wiązki laserowej za pomocą skali noniusza. Osiągnij optymalne pozycjonowanie, przeprowadzając pomiar i maksymalizując intensywność pików w widmie (patrz poniżej).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustawianie spektrometru
	<ol>
		<li>Otwórz oprogramowanie do pozyskiwania i manipulowania danymi i skonfiguruj akwizycję widma Brillouina próbki12. Opisana tutaj procedura ma zastosowanie do wieloprzebiegowego interferometru tandemowego (rysunek SI-1A).</li>
		<li>Ustawić dwa interferometry Fabry'ego-Perota (FP) niezależnie zmieniając napięcia przyłożone do piezoelektrycznego przez jednostkę sterującą. W tej procedurze wstępnego wyrównania obserwuj światło odbite przez każdy FP. Gdy intensywność odbita przez dwa FP dąży do zera, osiągane jest prawidłowe wyrównanie.</li>
		<li>Kalibracja widma: dostępny zakres częstotliwości lub swobodny zakres widmowy (FSR) zależy od odległości między dwoma zwierciadłami pierwszej wnęki FP, L, przez FSR = c/2L, gdzie c jest prędkością światła, a L jest mierzone za pomocą czujnika zegarowego.</li>
		<li>Zsynchronizuj skany dwóch interferometrów FP i przełącz układ optyczny na tandemową konfigurację wieloprzebiegową. Sterowanie ze sprzężeniem zwrotnym natężenia przesyłanego światła laserowego automatycznie utrzyma wyrównanie dwóch FP podczas pomiaru.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiar widm Brillouina 
	Ostrożność: Widmo Brillouina jest w dużym stopniu zależne od temperatury i uwodnienia próbki, dlatego dokładna kontrola tych parametrów jest kluczem do uzyskania powtarzalnych widm.
	<ol>
		<li>Rozpocznij akwizycję widma Brillouina próbki i uruchamiaj je, aż zostanie osiągnięty dobry stosunek sygnału do szumu. Może to potrwać kilka minut w zależności od przekroju czynnego rozproszenia, stężenia i grubości próbki. 
		UWAGA: Nie ma praktycznej zasady dotyczącej stosunku sygnału do szumu, ale jakość widma jest sprawdzana przez eksperymentatora na podstawie konkretnej analizowanej próbki. Istnieje kompromis między jakością widmową a czasem trwania pomiaru, dlatego parametry eksperymentalne muszą być dobrane zgodnie z konkretnym zastosowaniem.</li>
		<li>W celu dokonania pomiaru suchej próbki należy pobrać kolejne widma – dla każdego z nich, zgodnie z krokiem 2.3.1 – aż do momentu, gdy nie zaobserwuje się żadnych zmian w położeniu pików. Osiąga się to, gdy próbka jest w równowadze z atmosferą pomieszczenia i dalsze suszenie nie wpłynie na widmo.</li>
		<li>Wybierz polaryzację światła (VV lub VH; V oznacza pionowy, a H horyzontalny kierunek polaryzacji światła względem płaszczyzny rozpraszania) i uzyskują widma pod każdym kątem do osi światłowodu (θ ; Rysunek SI-1) poprzez ręczne obracanie próbki w płaszczyźnie.</li>
		<li>Zapisz widma Brillouina do pliku do późniejszego przetwarzania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Analiza widm Brillouina
UWAGA: Analiza dopasowania pików Brillouina może być przeprowadzona za pomocą różnych funkcji. Wybrano funkcję4,13 tłumionego oscylatora harmonicznego (DHO), ponieważ jest to prawidłowy model dla pików pochodzących z tłumionych modów akustycznych w ośrodkach lepkosprężystych.
<ol>
	<li>Analiza dopasowania pików Brillouina
	<ol>
		<li>Wybierz zakres spektralny dla interesującego go piku w widmie Brillouina.</li>
		<li>Włącz linię bazową w dopasowaniu, jeśli widmo tła jest znacznie wyższe od zera. 
		UWAGA: Linia bazowa może się różnić w zależności od widma. Upewnij się, że korekta jest stosowana w sposób systematyczny i powtarzalny</li>.
		<li>Zastosować szczegółowe dopasowanie metodą najmniejszych kwadratów za pomocą funkcji DHO4,13 do interesującego nas piku Brillouina iteracyjnie, aż do osiągnięcia zbieżności i uzyskania najlepszej krzywej dopasowania. Następnie zapisz wyniki dopasowania do pliku.</li>
		<li>Uzyskaj średnie wartości z parametrów dopasowania dwóch pików każdego dubletu Brillouina.</li>
		<li>Obliczyć prędkość fali akustycznej na podstawie częstotliwości szczytowej (korzystając z poniższego wyrażenia).</li>
		<li>Wykreśl wyniki dopasowania za pomocą wykresów, np. prędkość fali akustycznej w funkcji kąta do osi włókna, θ , i zastosuj odpowiednie modele (np. dla akustycznie anizotropowychsystemów 9), aby wyodrębnić wielkości mechaniczne, takie jak współczynniki tensora sprężystości.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Brillouin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+de+la+lumi%C3%A8re+et+des+rayonnes+X+par+un+corps+transparent+homog%C3%A8ne%3B+influence+de+l%27agitation+thermique%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Phys%22%5BJournal%5D)">Diffusion de la lumière et des rayonnes X par un corps transparent homogène; influence de l'agitation thermique.</a> Ann. Phys. 17, 88-122 (1922).</li>
<li>Caponi, S., Corezzi, S., Mattarelli, M., Fioretto, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+effects+on+the+elastic+properties+of+amorphous+polymeric+materials%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">Stress effects on the elastic properties of amorphous polymeric materials.</a> J. Chem. Phys. 141 (21), 214901(2014).</li>
<li>Mattarelli, M., Montagna, M., Still, T., Schneider, D., Fytas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibration+spectroscopy+of+weakly+interacting+mesoscopic+colloids%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Vibration spectroscopy of weakly interacting mesoscopic colloids.</a> Soft Matter. 8 (15), 4235-4243 (2012).</li>
<li>Comez, L., Masciovecchio, C., Monaco, G., Fioretto, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aComez%2C+L+%22Solid+State+Physics%22">Solid State Physics</a>. Robert, E. C., Robert, L. S. 63, Academic Press. 1-77 (2012).</li>
<li>Madami, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+a+propagating+spin+wave+induced+by+spin-transfer+torque%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Direct observation of a propagating spin wave induced by spin-transfer torque.</a> Nat. Nanotechnol. 6 (10), 635-638 (2011).</li>
<li>Harley, R., James, D., Miller, A., White, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phonons+and+the+elastic+moduli+of+collagen+and+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Phonons and the elastic moduli of collagen and muscle.</a> Nature. 267 (5608), 285-287 (1977).</li>
<li>Cusack, S., Miller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+elastic+constants+of+collagen+by+Brillouin+light+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Determination of the elastic constants of collagen by Brillouin light scattering.</a> J. Mol. Biol. 135 (1), 39-51 (1979).</li>
<li>Vaughan, J. M., Randall, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brillouin+scattering%2C+density+and+elastic+properties+of+the+lens+and+cornea+of+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Brillouin scattering, density and elastic properties of the lens and cornea of the eye.</a> Nature. 284 (5755), 489-491 (1980).</li>
<li>Palombo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomechanics+of+fibrous+proteins+of+the+extracellular+matrix+studied+by+Brillouin+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Soc.+Interface%22%5BJournal%5D)">Biomechanics of fibrous proteins of the extracellular matrix studied by Brillouin scattering.</a> J. R. Soc. Interface. 11 (101), (2014).</li>
<li>Sivan, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+accumulation+of+pentosidine+in+aggrecan+and+collagen+from+normal+and+degenerate+human+intervertebral+discs%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Age-related accumulation of pentosidine in aggrecan and collagen from normal and degenerate human intervertebral discs.</a> Biochem. J. 399 (1), 29-35 (2006).</li>
<li>Leon, W. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSoskel%2C+NT+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. 144, Academic Press. 196-214 (1987).</li>
<li>Fioretto, D., Scarponi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+a+glassy+polymer+studied+by+Brillouin+light+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Mater.+Sci.+Eng.+A%22%5BJournal%5D)">Dynamics of a glassy polymer studied by Brillouin light scattering.</a> Mater. Sci. Eng. A. 521-522, 243-246 (2009).</li>
<li>Palombo, F., Madami, M., Stone, N., Fioretto, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+mapping+with+chemical+specificity+by+confocal+Brillouin+and+Raman+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Mechanical mapping with chemical specificity by confocal Brillouin and Raman microscopy.</a> Analyst. 139 (4), 729-733 (2014).</li>
<li>Scarcelli, G., Yun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multistage+VIPA+etalons+for+high-extinction+parallel+Brillouin+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Multistage VIPA etalons for high-extinction parallel Brillouin spectroscopy.</a> Opt. Express. 19 (11), 10913-10922 (2011).</li>
<li>Scarcelli, G., Kim, P., Yun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Measurement+of+Age-Related+Stiffening+in+the+Crystalline+Lens+by+Brillouin+Optical+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">In Vivo Measurement of Age-Related Stiffening in the Crystalline Lens by Brillouin Optical Microscopy.</a> Biophys. J. 101 (6), 1539-1545 (2011).</li>
<li>Scarcelli, G., Yun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+Brillouin+optical+microscopy+of+the+human+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">In vivo Brillouin optical microscopy of the human eye.</a> Opt. Express. 20 (8), 9197-9202 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Spektroskopia rozpraszania Brillouina jest unikalnym narzędziem, za pomocą którego można scharakteryzować poszczególne składowe tensora elastyczności włókna białkowego z niespotykaną dotąd szczegółowością. Co więcej, pomiary mogą być wykonywane w skali mikroskopowej, a tym samym dostarczą nam nowego wglądu w mechanikę struktur biologicznych w mikroskali, pozwalając nam po raz pierwszy zrozumieć mechaniczne i prawdopodobnie funkcjonalne znaczenie złożoności architektury matrycy i biochemii, które ujawniły się w ostatnich latach.
Technika ta mierzy właściwości mechaniczne w zakresie częstotliwości GHz. Dziedzina ta nigdy wcześniej nie była badana w odniesieniu do biopolimerów strukturalnych, a zarówno rodzi, jak i dostarcza środków do udzielenia odpowiedzi na podstawowe pytania dotyczące molekularnych mechanizmów elastyczności.
Opisaliśmy etapy ekstrakcji włókien kolagenu i elastyny z tkanek zwierzęcych oraz pomiaru widm rozpraszania Brillouiny przy użyciu podłoża odblaskowego, aby uzyskać pełny opis biomechaniki włókien. Krytycznymi krokami w protokole są te, które zapewniają uzyskanie oczyszczonych włókien i odpowiednie warunki eksperymentalne dla powtarzalnych pomiarów białek włóknistych. Należy jednak pamiętać, że procedury ekstrakcji mogą modyfikować właściwości mechaniczne włókien.
Modyfikacje tej techniki obejmują sprzężenie z mikroskopią optyczną w celu uzyskania mikroogniskowego rozpraszania Brillouina i metod mapowania13 oraz możliwe połączenie z technikami uzupełniającymi (np. rozpraszanie Ramana). Obecne zastosowania tej techniki koncentrują się głównie na wycinanych materiałach biologicznych, ale ważne osiągnięcia, np. te oparte na wielu etalonach VIPA14, umożliwiają przeniesienie tej techniki z laboratorium na łóżko pacjenta, a szereg zastosowań już wykazano15,16 , w tym potencjał in vivo Aplikacji. Podejście VIPA jest alternatywą dla tego, co opisujemy; Ma szybszy czas akwizycji, ale niekoniecznie jest odpowiedni w przypadku próbek nieprzezroczystych, takich jak te analizowane tutaj. Co więcej, zastosowanie podłoża odblaskowego nie jest praktyczne w konfiguracjach wykorzystujących etalony VIPA, ponieważ ich kontrast nie byłby wystarczający do odrzucenia quasi-elastycznego światła. Ograniczenia związane z szybkością pozyskiwania zestawu danych spektralnych i z natury słabym przekrojem czynnym rozpraszania materiału mogą ograniczać zastosowania do dynamicznych systemów biologicznych i pozyskiwania danych z głębi tkanek, ale udoskonalenia techniczne mogą poprawić obecną wydajność.
BLS może stać się głównym narzędziem w podstawowych badaniach biofizycznych nad macierzą zewnątrzkomórkową, a tym samym dostarczyć nowych informacji na temat ewolucji właściwości mechanicznych podczas wzrostu macierzy i ich utraty w wyniku patologicznej degeneracji. Należy jednak pamiętać, że pomiary są nieinwazyjne i dlatego mogą być wykonywane in vivo. W rzeczywistości udało się to już osiągnąć w przypadku rogówki16 , a takie prace mogą stanowić platformę do opracowania nowych narzędzi diagnostycznych dla szerokiego zakresu zaburzeń tkanki łącznej.
Elastografia ultradźwiękowa i mikroskopia sił atomowych (AFM) są alternatywnymi metodami pomiaru mikromechanicznego, ale technika BLS oferuje lepszą rozdzielczość przestrzenną (w skali subkomórkowej) niż ta pierwsza i, w przeciwieństwie do AFM, nie nakłada żadnych sił mechanicznych na próbkę i nie ogranicza się tylko do analizy cech powierzchni. Moduły Brillouiny kolagenu i elastyny mieszczą się w zakresie GPa, podczas gdy moduły Younga ze szczepów makroskopowych są rzędu MPa (dalsze szczegóły zostaną podane w innym miejscu). Wynik ten wskazuje na różnicowy moduł sprężystości z silną zależnością od częstotliwości wzbudzenia, ze względu na lepkosprężyste zachowanie włókien. BLS może być stosowany do szerokiego zakresu problemów i materiałów w naukach biomedycznych. Może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na pytania dotyczące fizjologii i patologii tkanek biologicznych, a także dostarczyć fizycznego narzędzia do podstawowego zrozumienia materiałów i interakcji na poziomie molekularnym.

Efekt rozpraszania światła Brillouina (BLS) został odkryty przez Léona Brillouina w 1922 roku. 1 Polega na nieelastycznym rozpraszaniu światła widzialnego przez aktywowane termicznie fonony akustyczne w materiale. W fizyce ciała stałego fonony akustyczne to spójne drgania wszystkich atomów w sieci. Jednowymiarowy łańcuch dwóch naprzemiennych typów atomów w sieci jest prostym modelem ilustrującym różnicę między fononami akustycznymi, ujawnianymi przez BLS, a fononami optycznymi, badanymi przez absorpcję w podczerwieni i rozpraszanie Ramana (ryc. 1). Fonony akustyczne to ruchy atomów w łańcuchu w fazie z przemieszczeniem wzdłuż kierunku propagacji (podłużne fonony akustyczne) lub prostopadłe do kierunku propagacji (poprzeczne fonony akustyczne), podczas gdy fonony optyczne to ruchy atomów poza fazą wytwarzające oscylacyjny elektryczny moment dipolowy (mody podłużne lub poprzeczne).
Spektroskopia BLS jest używana w naukach analitycznych od lat 20-tych; jednak dopiero od lat 80-tych możliwe są pomiary wysokiego kontrastu dzięki zastosowaniu tandemowego wieloprzebiegowego spektrometru Fabry'ego-Perota. Od tego czasu nastąpił wzrost postępów w dziedzinie BLS do zastosowań analitycznych w materii skondensowanej (gdzie wykorzystuje się oddziaływanie foton-fonon)2-4 i materiałach magnetycznych (poprzez oddziaływanie foton-magnon)5. Przełomowe prace nad zastosowaniami biomedycznymi6-8 utorowały drogę do opracowania różnych podejść, w tym tego zastosowanego tutaj i opisanego wcześniej9 z wykorzystaniem odblaskowego podłoża w konfiguracji podobnej do płytek krwi w celu uzyskania pełnego opisu tensora elastyczności próbki.
W obecnej pracy stosujemy spektroskopię BLS do podstawowych składników macierzy zewnątrzkomórkowej w tkankach łącznych, białek włóknistych elastyny i kolagenu typu I. Kolagen typu I jest sztywną, potrójną spiralną cząsteczką, która łączy się poprzecznie i wzdłużnie z rozległym sieciowaniem, tworząc zasadniczo sztywne włókna w tkankach, takich jak ścięgna. Sieci kolagenu często współistnieją z sieciami elastyny, białka, które, co niezwykłe, generuje elastyczność dalekiego zasięgu poprzez połączenie entropii i hydrofobowych interakcji z otoczeniem i jest niezbędne do funkcjonowania tkanek takich jak płuca i skóra. Oba włókna są modelowane przy użyciu sześciokątnego modelu kryształu w obecnych badaniach. 9 W części 1 opisujemy protokół ekstrakcji włókien z tkanek zwierzęcych i przygotowania próbki do pomiarów spektroskopowych. W części 2 przedstawiono procedurę zakładania aparatu Brillouina i pozyskiwania widm z włókien. Część 3 zawiera szczegółowe informacje na temat analizy danych zastosowanej do widm Brillouina w celu wyodrębnienia odpowiednich informacji mechanicznych w nich zawartych. Następnie prezentowane i omawiane są reprezentatywne wyniki.

<table><tbody><tr><td>Chondroitynaza ABC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2905</td><td></td></tr><tr><td>Tris Buffer</td><td>Fluka</td><td>93358</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Acetate</td><td>Fisher Scientific</td><td>S608-500</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td> Azek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Streptomyces Hialuronidaza&nbsp; </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1136-1AMP</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Sodium Chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4665</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Phosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide</td><td>Fisher Scientific</td><td>S320-500</td><td></td></tr><tr><td>Pure Water</td><td>Millipore</td><td>ZRQS0P3WW</td><td>Produkowany we własnym zakresie</td></tr><tr><td>Woda destylowana</td><td>Bibby Scientific Limited</td><td>D4000</td><td>Produkowany we własnym zakresie z wody niegazowanej</td></tr><tr><td><silny>Euthatal</td><td>Merial&nbsp;</td><td>J01601A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tandem Interferometer TFP-1</td><td>JRS Scientific Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Freezer</td><td>Lec</td><td>TU55144</td><td></td></tr><tr><td>Lodówka</td><td>Zanussi</td><td>ZBA15021SA</td><td></td></tr><tr><td>Płyta grzewcza</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP88857206</td><td></td></tr><tr><td><mocne>Zaciski</mocne></td><td>VWR</td><td>241-7311 i 241-7201</td><td></td></tr><tr><td><mocne>Stojak zaciskowy</mocny></td><td>VWR&</td><td>nbsp; 241-0093</td><td></td></tr><tr><td><mocny>Termometr</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-201-401</td><td></td></tr><tr><td>Cling Film</td><td>Sainsbury's</td><td>7650540</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793-1EA</td><td></td></tr><tr><td>silikon</td><td>IDB Technologies</td><td>N/A</td><td>Brak katalogu numer. Zamów na życzenie.</td></tr><tr><td><mocny>Szkło nakrywkowe</mocny></td><td>VWR</td><td>631-1571</td><td></td></tr><tr><td><mocny>Kolba stożkowa</mocny></td><td>VWR</td><td>214-1175</td><td></td></tr><tr><td><mocny>zlewka</mocny></td><td>VWR</td><td>213-0469</td><td></td></tr><tr><td><mocny>Cylinder miarowy</mocny></td><td>VWR</td><td>612-3838</td><td></td></tr><tr><td><mocny>fiolka</mocny></td><td>VWR</td><td>548-0051 & 548-0863</td><td></td></tr><tr><td><mocna>szalka Petriego</mocna></td><td>VWR</td><td>391-0441</td><td></td></tr><tr><td><mocny>skalpel</mocny></td><td>Swann Morton Ltd</td><td>&nbsp; 0914 & 0308</td><td></td></tr><tr><td><mocny>Diamentowy skryba</mocny></td><td>RS Instruments</td><td>394-217</td><td></td></tr><tr><td><mocny>Lutownica</mocny></td><td>RS Instruments</td><td>231-5332</td><td></td></tr><tr><td><mocny> kleszczyki</mocny></td><td>VWR</td><td>232-0188</td><td></td></tr><tr><td><mocny>Podwójna mikroszpatułka</mocny></td><td>VWR</td><td>Różne rozmiary</td><td></td></tr><tr><td>pH</td><td>Hanna Instruments</td><td>HI-2210-02</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka orbitalna</td><td>IKA</td><td>&nbsp; </td><td></td>0002819000</tr></tbody></table>

przygotowanie włókien białkowych macierzy zewnątrzkomórkowej do spektroskopii brillouina

Preparation of Extracellular Matrix Protein Fibers for Brillouin Spectroscopy

Spektroskopia Brillouina jest nową techniką w dziedzinie biomedycyny. Bada właściwości mechaniczne próbki poprzez interakcję światła widzialnego z indukowanymi termicznie falami akustycznymi lub fononami rozchodzącymi się z prędkością kilku km/s. Informacje na temat elastyczności i struktury materiału pozyskiwane są w sposób nieniszczący, bezdotykowy, otwierając tym samym drogę do zastosowań in vivo i potencjalnej diagnostyki patologii. W pracy opisano zastosowanie spektroskopii Brillouina do badania biomechaniki we włóknach kolagenowych typu I trawionych elastyną i trypsyną macierzy zewnątrzkomórkowej. Białka włókniste macierzy zewnątrzkomórkowej są budulcem tkanek biologicznych, a badanie ich mechanicznego i fizycznego zachowania jest kluczem do ustalenia zależności struktura-funkcja w prawidłowych tkankach i zmian zachodzących w chorobie. Przedstawiono procedury przygotowania próbki, a następnie pomiaru widm Brillouina przy użyciu podłoża refleksyjnego wraz ze szczegółami układu optycznego i metodami analizy danych spektralnych.

Przedstawiamy protokół zastosowania spektroskopii rozpraszania światła Brillouina do oczyszczonych elastyną i trypsyną włókien kolagenowych typu I macierzy zewnątrzkomórkowej w celu wydobycia ich pełnych właściwości elastycznych.

Przygotowanie włókien białkowych macierzy zewnątrzkomórkowej do spektroskopii Brillouina

Brillouin spectroscopy is an emerging technique in the biomedical field. It probes the mechanical properties of a sample through the interaction of ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przygotowanie próbki włókien białkowych macierzy zewnątrzkomórkowej, kolagenu lub elastyny, w celu ich umieszczenia w komorze pomiarowej do pomiarów spektroskopii Brillouina. Zastosowanie tej metody pozwala na pozyskanie włókien kolagenu i elastyny macierzy zewnątrzkomórkowej z tkanek łącznych pochodzenia zwierzęcego do wykorzystania w pomiarach spektroskopii Brillouina. Główną zaletą tego podejścia jest możliwość całkowitego określenia mikromechanicznych właściwości próbki bez wcześniejszej znajomości współczynnika załamania światła materiału.Gdy ogon jest jeszcze zamrożony, odetnij od końca proksymalnego segment o długości 20 milimetrów i rozmroź tkankę w szalce Petriego wypełnionej PBS o temperaturze pokojowej. Po rozmrożeniu ogona, za pomocą skalpela wykonaj nacięcie wzdłuż próbki, aby rozciąć skórę, a następnie odchyl tkankę, by odsłonić cztery pęczki ścięgien w pochewkach wokół kręgów ogona. Używając precyzyjnej pęsety, delikatnie wyciągnij każde włókno z pochewki i umieść je w fiolce zawierającej wodę destylowaną z dodatkiem 0,01% masowych azydku sodu w celu przechowywania w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Aby uzyskać czysty włóknisty kolagen typu I, należy zanurzyć włókna w chondroitynazie ABC w buforze TRIS i octanie sodu na 24 godziny w temperaturze 37°C w inkubatorze z wytrząsaniem. Następnego dnia włókna przenosi się do hialuronidazy ze Streptomyces w buforze TRIS i chlorku sodu na kolejne 24 godziny w temperaturze 37°C w inkubatorze z wytrząsaniem. Następnie włókna zanurza się w trypsynie w fosforanie sodu i chlorku sodu na 16 godzin w temperaturze 37°C z wytrząsaniem.Oczyszczone włókna można następnie przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsius w probówkach z wodą destylowaną z dodatkiem 0,01% sodium azide do momentu ich użycia. Aby wyekstrahować włókna elastyny z więzadła karkowego bydlęcego, należy najpierw odtłuścić świeżo pobrane więzadło karkowe bydlęce. Po usunięciu całej tkanki tłuszczowej należy umieścić więzadło w kolbie stożkowej i zalać tkankę świeżo przygotowanym roztworem sodium hydroxide w wodzie destylowanej.Gotować więzadło w kąpieli wodnej o temperaturze 95 °C przez 45 minut. Następnie wielokrotnie płukać nierozpuszczalny blok w zlewce wypełnionej wodą destylowaną. Po uzyskaniu pH 7,0 zanurzyć tkankę w wodzie destylowanej z dodatkiem 0,01% sodium azide i szczelnie zamknąć pojemnik, aby przechowywać go w temperaturze czterech °C do momentu użycia.Po przechowywaniu użyj pęsety, aby delikatnie wyciągnąć z większego bloku mniejsze segmenty elastyny o grubości około 2 mm i długości od 20 do 50 mm. Umieść segmenty w szalce Petriego zawierającej PBS i za pomocą precyzyjnej pęsety delikatnie wyizoluj z segmentów pęczki włókien o grubości około 1 mm. Następnie użyj skalpela, aby pociąć pęczki na fragmenty o długości kilku milimetrów i przenieś kawałki włókien do fiolek z wodą destylowaną z dodatkiem 0,01% sodium azide w celu przechowywania w temperaturze 4 °C do czasu użycia.Aby zamocować włókno na podłożu refleksyjnym, należy najpierw użyć przecinaka diamentowego do wycięcia fragmentu refleksyjnego szkiełka krzemowego. Następnie należy wyciąć pasek parafilmu z otworem w centrum, wystarczająco dużym, aby pomieścił fragment włókna, i umieścić parafilm na podłożu krzemowym. Teraz, używając pęsety precyzyjnej, należy przenieść pojedyncze włókno z roztworu przechowującego w temperaturze 4 °C do małej szalki Petriego wypełnionej czystą wodą w temperaturze pokojowej.Po 5 minutach przenieś wypłukane włókno do centrum otworu w parafilmie na podłożu krzemowym. Następnie przykryj włókno cienką szkiełkiem nakrywką i ostrożnie przyłóż rozgrzaną lutownicę do szkła, aby stopić parafilm znajdujący się pod nim. Aby umożliwić obrót próbki w płaszczyźnie przy zachowaniu stałego kąta rozpraszania i pozycji objętościowej, zamocuj próbkę w uchwycie pionowym wyposażonym w goniometr i ustaw pod kątem 45 stopni względem padającej wiązki lasera.W suchych włóknach kolagenowych przy określonym kącie obrotu wynoszącym zero stopni, mody podłużne generują peak objętościowy przy 18.92 gigahertz, podczas gdy mody równoległe do powierzchni dają peak przy 9.85 gigahertz. Peak równoległy do powierzchni przesuwa się w stronę niższych częstotliwości, gdy określony kąt obrotu zbliża się do 90 stopni, natomiast peak objętościowy wykazuje jedynie niewielkie przesunięcie w stronę czerwieni przy zmianie określonego kąta obrotu w tym samym zakresie. W mokrych włóknach kolagenowych oba peaki pozostają w zasadzie niezmienione w trakcie eksperymentu, przy czym peak objętościowy znajduje się przy 10.5 gigahertz, a peak równoległy do powierzchni przy 4.9 gigahertz, co wskazuje na redukcję częstotliwości o 80 do 100% i wynika ze zmniejszonej sztywności uwodnionego materiału.Na tej ilustracji przedstawiono wykres prędkości fali akustycznej w suchym kolagenie, uzyskanej z pików równoległych do powierzchni i poprzecznych, w funkcji konkretnego kąta obrotu. W suchych włóknach elastyny, mierzonych przy konkretnym kącie obrotu wynoszącym zero stopni, pik objętościowy występuje przy 16.8 GHz, a mod równoległy do powierzchni występuje przy 8.2 GHz. Mokre włókna elastyny wykazują jednak pik objętościowy przy częstotliwości o 37% niższej niż pik objętościowy suchej elastyny, co wskazuje na zmniejszenie sztywności włókna.Podobnie jak w przypadku suchego kolagenu, istnieją dowody na anizotropię właściwości mechanicznych suchych włókien elastyny, co potwierdza skuteczność spektroskopii Brillouina w pozyskiwaniu istotnych danych na temat sztywności, składu i aspektów strukturalnych konkretnych badanych materiałów. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat przygotowania próbek włókien kolagenu i elastyny do mikromechanicznych testów opartych na spektroskopii rozproszenia światła Brillouina.

preparation-extracellular-matrix-protein-fibers-for-brillouin

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

W tym filmie prezentujemy techniki eksperymentalne wykorzystywane do wytwarzania elastycznych podłoży powleczonych macierzą zewnątrzkomórkową (ECM), które nadają się do hodowli komórkowej oraz pozwalają na zastosowanie mikroskopii sił trakcyjnych i obserwację wpływu sztywności ECM na zachowanie komórek.

Przygotowanie podatnych macierzy do ilościowego pomiaru skurczu komórkowego

Spektroskopia Ramana jest odpowiednią techniką do bezkontaktowej, bezetykietowej analizy żywych komórek, konstruktów inżynierii tkankowej oraz tkanek natywnych. Specyficzne dla źródła sygnatury spektralne mogą być generowane i analizowane przy użyciu analizy wielowariancyjnej.

Bezkontaktowy i bezetykietowy monitoring komórek oraz macierzy pozakomórkowej z wykorzystaniem spektroskopii Ramanowskiej

Ten system modelowy zaczyna się od wypełnionego miofibroblastami żelu fibrynowego, który może być używany do badania endogennej kolagenu (re)organizacji w czasie rzeczywistym w sposób nieniszczący. System modelowy jest bardzo przestrajalny, ponieważ może być używany z różnymi źródłami komórek, dodatkami do pożywek i może być łatwo dostosowany do konkretnych potrzeb.

Inżynieria konstruktów tkankowych na bazie fibryny z miofibroblastów oraz zastosowanie ograniczeń i szczepów do indukowania reorganizacji komórek i kolagenu

Opisujemy technikę wpisywania identycznych siatek Bragga w każdy rdzeń światłowodu wielordzeniowego. Osiąga się to poprzez wprowadzenie dodatkowej powierzchni do ścieżki optycznej w celu złagodzenia soczewkowania przez zakrzywioną powierzchnię okładziny włókna.

Pisanie siatek Bragga we włóknach wielordzeniowych

Elektroprzędzone nanowłókna mają wysoki stosunek powierzchni do masy, doskonałą integralność mechaniczną oraz wspierają wzrost i proliferację komórek. Te nanowłókna mają szeroki zakres zastosowań biomedycznych. Tutaj wytwarzamy nanowłókna keratynowe/PCL przy użyciu techniki elektroprzędzenia i charakteryzujemy włókna pod kątem możliwych zastosowań w inżynierii tkankowej.

Synteza nanowłókien na bazie keratyny w inżynierii biomedycznej

Tutaj prezentujemy protokół do budowy szybkiego spektrometru Brillouina. Kaskadowe wirtualnie obrazowane etalony z matrycą fazową (VIPA) osiągają prędkość pomiaru ponad 1000 razy większą niż tradycyjne skaningowe spektrometry Fabry'ego-Perota. To ulepszenie zapewnia środki do analizy tkanek i biomateriałów metodą Brillouin przy niskich poziomach mocy in vivo.

Szybki spektrometr sub-GHz do analizy rozpraszania Brillouina

Opisujemy konstrukcję spektrometru CW-SBS do szybkiego rozpraszania Brillouiny stymulowanego falami ciągłymi. Spektrometr wykorzystuje lasery diodowe o pojedynczej częstotliwości i atomowy filtr wycinający do pozyskiwania widm transmisyjnych mętnych/niemętnych próbek o wysokiej rozdzielczości spektralnej przy prędkościach do 100 razy większych niż w przypadku istniejących spektrometrów CW-SBS. To ulepszenie umożliwia szybką analizę materiału Brillouina.<br...

Szybki spektrometr rozpraszania Brillouina stymulowany falami ciągłymi do analizy materiałów

Celem tego protokołu jest produkcja całych włókien macierzy zewnątrzkomórkowej przeznaczonych do gojenia ran, które są odpowiednie do oceny przedklinicznej jako część regeneracyjnego implantu rusztowania. Włókna te są wytwarzane przez hodowlę fibroblastów na membranach z pustych włókien i ekstrahowane przez rozpuszczenie błon.

Produkcja włókien macierzy zewnątrzkomórkowej poprzez protektorową hodowlę komórek z pustych włókien

Naszym ogólnym celem jest zrozumienie, w jaki sposób komórki wyczuwają sygnały zewnątrzkomórkowe, które prowadzą do ukierunkowanego wzrostu aksonów. W tym miejscu opisujemy metodologię indukowanej światłem adsorpcji molekularnej białek, używaną do wytwarzania zdefiniowanych mikrowzorów składników macierzy zewnątrzkomórkowej w celu zbadania określonych zdarzeń, które rządzą wzrostem aksonów i odnajdywaniem ścieżki.

Indukowana światłem adsorpcja molekularna białek z wykorzystaniem systemu PRIMO do mikrowzorcowania w celu zbadania odpowiedzi komórek na białka macierzy zewnątrzkomórkowej

Tutaj prezentujemy protokół koniugacji monomeru białkowego za pomocą enzymów tworzących polimer białkowy o kontrolowanej sekwencji i unieruchamiania go na powierzchni w celu badań spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek.

Synteza enzymatyczna i immobilizacja spolimeryzowanego białka za pośrednictwem OaAEP1 do spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek

Niniejszy artykuł opisuje protokół mechanicznej charakterystyki żywych sferoidów w macierzy 3D za pomocą mikrospektroskopii Brillouina. Ta całkowicie optyczna metoda umożliwia wizualizację sferoidów o rozdzielczości mikroskalowej oraz ilościowych właściwościach mechanicznych. To podejście ma znaczenie dla fenotypowania mechanicznego; na przykład określanie stanów patologicznych kulistych nowotworów w mikrośrodowisku 3D.

Mechaniczne mapowanie sferoidów za pomocą spektroskopii Brillouina

Poznaj metodę przygotowania włókien kolagenowych i elastynowych z macierzy zewnątrzkomórkowej do spektroskopii Brillouina. Technika ta umożliwia pełną analizę właściwości mikromechanicznych bez znajomości współczynnika załamania.

Przygotowanie włókien białkowych macierzy zewnątrzkomórkowej do spektroskopii Brillouina

Przeglądaj więcej filmów