Przygotowanie i zastosowanie in vivo sondy aktywności dla amidazy kwasu N-acyloetanoloaminowego

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przedstawienie syntezy sondy opartej na aktywności, ARN 14686, specyficznej dla amidazy kwasu N-acyloetanoloaminowego (NAAA) oraz opisanie jej zastosowania w wykrywaniu katalitycznie aktywnego enzymu w ekstraktach komórkowych i skrawkach tkanek. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na pytania dotyczące funkcji NAAA in vivo, dostarczając informacji na temat aktywacji NAAA w różnych warunkach fizjologicznych i patologicznych, takich jak choroby zapalne i neurodegeneracyjne. Jej główną zaletą jest fakt, że po reakcji NAAA z sondą wystarczy prosta manipulacja, co pozwala na uzyskanie wiarygodnych informacji o stanie aktywacji enzymu in vivo.

Kolejną zaletą jest to, że w przeciwieństwie do swoistych przeciwciał, nasza sonda wykrywa jedynie aktywną formę enzymu, co jest przydatne w badaniach z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej. Wizualna prezentacja tej metody jest kluczowa, ponieważ łączy ona różne obszary wiedzy, które razem tworzą spójną całość – od prawidłowej syntezy po końcowe zastosowania. W kolbie okrągłobrzusznej o pojemności 50 ml rozpuścić 350 mg undecynenolu i 3,5 ml suchego dichlorometanu.

Następnie do roztworu należy dodać 25 mg DMAP oraz 530 mg DPC. Mieszaninę mieszać w temperaturze pokojowej przez 16 godzin. Po 16 godzinach do roztworu dodać 20 ml dichlorometanu.

Przenieść mieszaninę do rozdzielacza. Dodać 15 mililitrów wody. Wstrząsnąć mieszaniną i odczekać do rozdzielenia się obu faz.

Następnie otwórz kranik, zbierz organiczną fazę znajdującą się na dole, zamknij kranik i przelej fazę organiczną z powrotem do rozdzielacza. Do mieszaniny dodaj 15 mililitrów nasyconego roztworu wodorowęglanu sodu. Wstrząśnij rozdzielaczem i poczekaj, aż obie fazy się rozdzielą.

Po osuszeniu warstwy organicznej siarczanem sodu przefiltruj ją przez watę do kolby okrągłodennej z ciemienkiem. Następnie odparuj warstwę organiczną do suchości pod zmniejszonym ciśnieniem za pomocą wirówki rotacyjnej. Zważ kolbę, aby otrzymać 600 mg oleju, który stanowi mieszaninę węglanu dwa-pirydylo-undekynylu i undecynolu dwa-oksypyrydynokarboksylanu w stosunku 1,7:1.

W okrągłorządkowej kolbie o pojemności 10 ml rozpuścić 60 mg octanu amonu oksoasetydenolu w 2 ml suchego dichlorometanu. Schłodzić roztwór do 0 °C w łaźni lodowej, a następnie dodać kroplami 81 µl diazapropaloetyloaminy. Następnie rozpuścić 350 mg surowej mieszaniny zawierającej undecynol-2-oksypirydynokarboksylan w 2 ml suchego dichlorometanu.

Dodaj rozpuszczoną mieszaninę do roztworu i mieszaj w temperaturze pokojowej przez 15 godzin. Następnie odparuj rozpuszczalnik do suchości pod zmniejszonym ciśnieniem przy użyciu rotacyjnego odparowacza. Oczyść związek za pomocą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym, korzystając z automatycznego aparatu do chromatografii kolumnowej.

Najpierw należy zaabsorbować próbkę na żelu krzemionkowym. Po zrównoważeniu kolumny cykloheksenem, należy wprowadzić próbkę do kartridża. Próbkę eluuje się octanem etylu w cykloheksanie w gradiencie od 0 do 100%, zbierając piki do probówek.

Odparuj rozpuszczalnik z frakcji odpowiadających związkowi do suchości pod zmniejszonym ciśnieniem, używając rotacyjnego odparowacza, aby uzyskać 40 mg białej substancji stałej. Po wstępnym oczyszczeniu próbki zgodnie z opisem w protokole tekstowym, dodaj 11,3 µL stocku 5 mM azydowe poli(etylenglikol)-biotyny i wymieszaj w wirówce typu vortex. Następnie dodaj do próbki 11,3 µL świeżo przygotowanego stocku TCEP o stężeniu 50 mM i wymieszaj w wirówce typu vortex.

Po wymieszaniu 34 µL świeżo przygotowanego roztworu roboczego TBTA o stężeniu 1,7 mM z 11,3 µL roztworu zapasu siarczanu miedzi o stężeniu 50 mM, dodaj 45,3 mL tego roztworu do próbki i wymieszaj w wortexie. Używaj oznakowanych pojemników. Inkubuj reakcję w temperaturze 25 °C przez co najmniej dwie godziny.

Po jednej godzinie inkubacji należy zaobserwować wytrącanie białek i wymieszać mieszaninę reakcyjną. Próbkę wiruj przez cztery minuty przy 6 500 ×g w temperaturze 4 °C. Po usunięciu supernatantu dodaj 750 µL zimnego metanolu i resuspenduj osad za pomocą sonikatora sondowego przez pięć sekund.

Następnie odwiruj próbkę przez cztery minuty przy 6 500 ×g w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Nadpływ usuń za pomocą strzykawki z igłą. Po dwukrotnym przemyciu zimnym metanolem dodaj 325 µL 2,5% SDS w PBS do osadu białkowego.

Próbkę poddaj sonikacji trzy razy po pięć sekund. Następnie podgrzej próbkę przez pięć minut w temperaturze 65 °C. Po sonikacji odwiruj próbkę przez pięć minut przy 6 500 ×g w temperaturze pokojowej.

Następnie przenieś nadsącz do czystej probówki o pojemności 15 ml i dodaj do niego 1,4 ml PBS, aby rozcieńczyć stężenie SDS do 0,5%. W przypadku wzbogacania streptawidyną najpierw doprowadź objętość próbki do 4,2 ml za pomocą PBS. Następnie, używając końcówki z odciętym końcem, dodaj 40 µl 50% zawiesiny wstępnie przemytego agarozy z streptawidyną.

Mieszaninę inkubować przez dwie godziny w temperaturze pokojowej przy stałym obracaniu. Po wirowaniu przez dwie minuty przy 1 400 ×g usunąć nadsącz, nie dopuszczając do wyschnięcia osadu z kulek. Pozostały nadsącz wykorzystać do przeniesienia kulek do kolumny wirówkowej o pojemności 1 mL, a następnie przemyć kolumnę grawitacyjnie 1 mL 1% SDS w PBS.

Kontynuuj płukanie kulek mocznikiem 6 M, a następnie PBS-em, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie użyj 500 µL PBS, aby przenieść wypłukane kulki do probówki o pojemności 1,5 ml. Po odwirowaniu próbki przez 2 minuty przy 1 400 ×g ostrożnie odessij nadsącz za pomocą strzykawki z igłą.

Aby eluować białka związane z żywicą, należy dodać 25 µL buforu elucyjnego do osadu z żywicy i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przez 15 minut w temperaturze 95 °C. Do skrawków tkanki przygotowanych zgodnie z protokołem tekstowym należy dodać około 400 µL mieszaniny do chemii klik (click chemistry mix). Należy zwrócić uwagę, aby wybrana objętość mieszaniny do chemii klik była wystarczająca do całkowitego pokrycia skrawków.

Następnie inkubować skrawki tkanki przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, chroniąc je przed światłem. Po inkubacji przemyć próbki buforem PBS przez pięć minut, a następnie zimnym metanolem przez pięć minut. Następnie przemyć skrawki tkanki trzykrotnie roztworem 1% Tween 20 i 0,5 mM EDTA w PBS przez dwie minuty.

Na koniec wypłucz preparaty jeszcze raz w PBS przez pięć minut. Po wysuszeniu na powietrzu dodaj kroplę medium montażowego przeciwko zanikaniu fluorescencji z DAPI. Przykryj próbki szkiełkami podstawowymi i zabezpiecz lakierem.

W celu syntezy sondy undecynenol jest aktywowany za pomocą węglanu dipirydylowego w obecności katalitycznej ilości 4-dimetyloaminopirydyny, co prowadzi do powstania mieszanego węglanu, który następnie reaguje z aminowym laktamem. Beta-laktam, czyli głowica sondy, reaguje z centrum aktywnym NAAA, podczas gdy terminalny alkino może zostać funkcjonalizowany tagiem reporterowym za pomocą chemii klik. ARN 14686 został wykorzystany do wykrycia aktywacji NAAA w ekstraktach komórkowych z zapalonych łap szczurów za pomocą blokowania białek. U szczurów naiwnych nie wykryto sygnału NAAA.

I odwrotnie, u szczurów traktowanych pełnym adjuwantem Freunda obserwuje się wyraźny prążek odpowiadający aktywnej NAAA. Innym zastosowaniem ARN 14 six eight six jest obrazowanie tkanek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Tutaj czerwone komórki reprezentują makrofagi pęcherzykowe, które są dodatnie pod kątem aktywnej NAAA.

NAAA lokalizuje się w rozproszonych strukturach pęcherzykowych, co jest wyraźnie widoczne przy większym powiększeniu. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat syntezy i wykorzystania ARN 14 686 do wykrywania aktywnego NAAA w tkankach, zarówno za pomocą western blotu, jak i mikroskopii fluorescencyjnej. Ponadto, mimo że niniejszy protokół jest specyficzny dla naszego celu, opisane zastosowania sond można łatwo dostosować do różnych sond opartych na aktywności, specyficznych dla innych celów niż NAAA.