Name: Przygotowanie i zastosowanie in vivo sondy aktywności dla amidazy kwasu N-acyloetanoloaminowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Poznaj syntezę i zastosowanie sondy aktywności ARN14686 do wykrywania aktywnej formy amidazy kwasu N-acyloetanoloaminowego (NAAA) w ekstraktach komórkowych i tkankach. Ta metoda pozwala badać aktywację NAAA w stanach zapalnych i neurodegeneracyjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy dziękują Centrum Obrazowania Nikon w Istituto Italiano di Tecnologia, Genua, Włochy (NIC@IIT).

<ol><li>Gygi, S. P., Han, D. K., Gingras, A. C., Sonenberg, N., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+analysis+by+mass+spectrometry+and+sequence+database+searching%3A+tools+for+cancer+research+in+the+post-genomic+era%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Protein analysis by mass spectrometry and sequence database searching: tools for cancer research in the post-genomic era.</a> Electrophoresis. 20, 310-319 (1999).</li>
<li>Washburn, M. P., Wolters, D., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+analysis+of+the+yeast+proteome+by+multidimensional+protein+identification+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Large-scale analysis of the yeast proteome by multidimensional protein identification technology.</a> Nat Biotechnol. 19, 242-247 (2001).</li>
<li>Zhu, H., Bilgin, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Proteomics.</a> Annu Rev Biochem. 72, 783-812 (2003).</li>
<li>Ito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+for+the+two-hybrid+system+in+exploration+of+the+yeast+protein+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Roles for the two-hybrid system in exploration of the yeast protein interactome.</a> Mol Cell Proteomics. 1, 561-566 (2002).</li>
<li>Evans, M. J., Cravatt, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism-based+profiling+of+enzyme+families%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Mechanism-based profiling of enzyme families.</a> Chem Rev. 106, 3279-3301 (2006).</li>
<li>Cravatt, B. F., Wright, A. T., Kozarich, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-based+protein+profiling%3A+from+enzyme+chemistry+to+proteomic+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Activity-based protein profiling: from enzyme chemistry to proteomic chemistry.</a> Annu Rev Biochem. 77, 383-414 (2008).</li>
<li>Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stepwise+huisgen+cycloaddition+process%3A+copper%28I%29-catalyzed+regioselective+%22ligation%22+of+azides+and+terminal+alkynes%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 41, 2596-2599 (2002).</li>
<li>Meldal, M., Tornoe, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cu-catalyzed+azide-alkyne+cycloaddition%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Cu-catalyzed azide-alkyne cycloaddition.</a> Chem Rev. 108, 2952-3015 (2008).</li>
<li>Speers, A. E., Adam, G. C., Cravatt, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-based+protein+profiling+in+vivo+using+a+copper%28i%29-catalyzed+azide-alkyne+%5B3+%2B+2%5D+cycloaddition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Activity-based protein profiling in vivo using a copper(i)-catalyzed azide-alkyne [3 + 2] cycloaddition.</a> J Am Chem Soc. 125, 4686-4687 (2003).</li>
<li>Saxon, E., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+engineering+by+a+modified+Staudinger+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell surface engineering by a modified Staudinger reaction.</a> Science. 287, 2007-2010 (2000).</li>
<li>Kohn, M., Breinbauer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Staudinger+ligation-a+gift+to+chemical+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">The Staudinger ligation-a gift to chemical biology.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 43, 3106-3116 (2004).</li>
<li>Romeo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-Based+Probe+for+N-Acylethanolamine+Acid+Amidase%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Activity-Based Probe for N-Acylethanolamine Acid Amidase.</a> ACS Chem Biol. 10, 2057-2064 (2015).</li>
<li>Ueda, N., Yamanaka, K., Yamamoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+an+acid+amidase+selective+for+N-palmitoylethanolamine%2C+a+putative+endogenous+anti-inflammatory+substance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of an acid amidase selective for N-palmitoylethanolamine, a putative endogenous anti-inflammatory substance.</a> J Biol Chem. 276, 35552-35557 (2001).</li>
<li>Tsuboi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+N-acylethanolamine-hydrolyzing+acid+amidase%2C+a+novel+member+of+the+choloylglycine+hydrolase+family+with+structural+and+functional+similarity+to+acid+ceramidase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase, a novel member of the choloylglycine hydrolase family with structural and functional similarity to acid ceramidase.</a> J Biol Chem. 280, 11082-11092 (2005).</li>
<li>Tsuboi, K., Takezaki, N., Ueda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+N-acylethanolamine-hydrolyzing+acid+amidase+%28NAAA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biodivers%22%5BJournal%5D)">The N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase (NAAA).</a> Chem Biodivers. 4, 1914-1925 (2007).</li>
<li>Ribeiro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Potent+Systemically+Active+N-Acylethanolamine+Acid+Amidase+Inhibitor+that+Suppresses+Inflammation+and+Human+Macrophage+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">A Potent Systemically Active N-Acylethanolamine Acid Amidase Inhibitor that Suppresses Inflammation and Human Macrophage Activation.</a> ACS Chem Biol. 10, 1838-1846 (2015).</li>
<li>Zhao, L. Y., Tsuboi, K., Okamoto, Y., Nagahata, S., Ueda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolytic+activation+and+glycosylation+of+N-acylethanolamine-hydrolyzing+acid+amidase%2C+a+lysosomal+enzyme+involved+in+the+endocannabinoid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Proteolytic activation and glycosylation of N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase, a lysosomal enzyme involved in the endocannabinoid metabolism.</a> Biochim Biophys Acta. 1771, 1397-1405 (2007).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid+residues+crucial+in+pH+regulation+and+proteolytic+activation+of+N-acylethanolamine-hydrolyzing+acid+amidase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Amino acid residues crucial in pH regulation and proteolytic activation of N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase.</a> Biochim Biophys Acta. 1781, 710-717 (2008).</li>
<li>West, J. M., Zvonok, N., Whitten, K. M., Wood, J. T., Makriyannis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometric+characterization+of+human+N-acylethanolamine-hydrolyzing+acid+amidase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometric characterization of human N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase.</a> J Proteome Res. 11, 972-981 (2012).</li>
<li>Bandiera, T., Ponzano, S., Piomelli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+discovery+of+N-acylethanolamine+acid+amidase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Res%22%5BJournal%5D)">Advances in the discovery of N-acylethanolamine acid amidase inhibitors.</a> Pharmacol Res. 86, 11-17 (2014).</li>
<li>Sasso, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antinociceptive+effects+of+the+N-acylethanolamine+acid+amidase+inhibitor+ARN077+in+rodent+pain+models%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Antinociceptive effects of the N-acylethanolamine acid amidase inhibitor ARN077 in rodent pain models.</a> Pain. 154, 350-360 (2013).</li>
<li>Duranti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-%282-oxo-3-oxetanyl%29carbamic+acid+esters+as+N-acylethanolamine+acid+amidase+inhibitors%3A+synthesis+and+structure-activity+and+structure-property+relationships%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">N-(2-oxo-3-oxetanyl)carbamic acid esters as N-acylethanolamine acid amidase inhibitors: synthesis and structure-activity and structure-property relationships.</a> J Med Chem. 55, 4824-4836 (2012).</li>
<li>Ponzano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+structure-activity+relationship+%28SAR%29+of+2-methyl-4-oxo-3-oxetanylcarbamic+acid+esters%2C+a+class+of+potent+N-acylethanolamine+acid+amidase+%28NAAA%29+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Synthesis and structure-activity relationship (SAR) of 2-methyl-4-oxo-3-oxetanylcarbamic acid esters, a class of potent N-acylethanolamine acid amidase (NAAA) inhibitors.</a> J Med Chem. 56, 6917-6934 (2013).</li>
<li>Solorzano, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+structure-activity+relationships+of+N-%282-oxo-3-oxetanyl%29amides+as+N-acylethanolamine-hydrolyzing+acid+amidase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Synthesis and structure-activity relationships of N-(2-oxo-3-oxetanyl)amides as N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase inhibitors.</a> J Med Chem. 53, 5770-5781 (2010).</li>
<li>Vitale, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis%2C+structure-activity%2C+and+structure-stability+relationships+of+2-substituted-N-%284-oxo-3-oxetanyl%29+N-acylethanolamine+acid+amidase+%28NAAA%29+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22ChemMedChem+9%22%5BJournal%5D)">Synthesis, structure-activity, and structure-stability relationships of 2-substituted-N-(4-oxo-3-oxetanyl) N-acylethanolamine acid amidase (NAAA) inhibitors.</a> ChemMedChem 9. 9, 323-336 (2014).</li>
<li>Fiasella, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-Aminoazetidin-2-one+derivatives+as+N-acylethanolamine+acid+amidase+%28NAAA%29+inhibitors+suitable+for+systemic+administration%5BTitle%5D)+AND+%22ChemMedChem+9%22%5BJournal%5D)">3-Aminoazetidin-2-one derivatives as N-acylethanolamine acid amidase (NAAA) inhibitors suitable for systemic administration.</a> ChemMedChem 9. 9, 1602-1614 (2014).</li>
<li>Armirotti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Lactones+Inhibit+N-acylethanolamine+Acid+Amidase+by+S-Acylation+of+the+Catalytic+N-Terminal+Cysteine%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Med+Chem+Lett%22%5BJournal%5D)">beta-Lactones Inhibit N-acylethanolamine Acid Amidase by S-Acylation of the Catalytic N-Terminal Cysteine.</a> ACS Med Chem Lett. 3, 422-426 (2012).</li>
<li>Nuzzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+alpha-amino-beta-lactam+carbamic+acid+ester+as+NAAA+inhibitors.+Synthesis+and+structure-activity+relationship+%28SAR%29+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Potent alpha-amino-beta-lactam carbamic acid ester as NAAA inhibitors. Synthesis and structure-activity relationship (SAR) studies.</a> Eur J Med Chem. 111, 138-159 (2016).</li>
<li>Bonezzi, F. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Important+Role+for+N-Acylethanolamine+Acid+Amidase+in+the+Complete+Freund%27s+Adjuvant+Rat+Model+of+Arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Exp+Ther%22%5BJournal%5D)">An Important Role for N-Acylethanolamine Acid Amidase in the Complete Freund's Adjuvant Rat Model of Arthritis.</a> J Pharmacol Exp Ther. 356, 656-663 (2016).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal Biochem. 150, 76-85 (1985).</li>
<li>Speers, A. E., Cravatt, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-Based+Protein+Profiling+%28ABPP%29+and+Click+Chemistry+%28CC%29-ABPP+by+MudPIT+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Activity-Based Protein Profiling (ABPP) and Click Chemistry (CC)-ABPP by MudPIT Mass Spectrometry.</a> Curr Protoc Chem Biol. 1, 29-41 (2009).</li>
<li>Rybak, J. N., Scheurer, S. B., Neri, D., Elia, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+biotinylated+proteins+on+streptavidin+resin%3A+a+protocol+for+quantitative+elution%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Purification of biotinylated proteins on streptavidin resin: a protocol for quantitative elution.</a> Proteomics. 4, 2296-2299 (2004).</li>
<li>Penna, A., Cahalan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+Blotting+using+the+Invitrogen+NuPage+Novex+Bis+Tris+minigels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Western Blotting using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels.</a> J Vis Exp. (264), (2007).</li>
<li>Giuffrida, A., Piomelli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isotope+dilution+GC%2FMS+determination+of+anandamide+and+other+fatty+acylethanolamides+in+rat+blood+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Isotope dilution GC/MS determination of anandamide and other fatty acylethanolamides in rat blood plasma.</a> FEBS Lett. 422, 373-376 (1998).</li>
<li>Buczynski, M. W., Parsons, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+brain+endocannabinoid+levels%3A+methods%2C+interpretations+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Quantification of brain endocannabinoid levels: methods, interpretations and pitfalls.</a> Br J Pharmacol. 160, 423-442 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Aktywność enzymu jest precyzyjnie regulowana na różnych poziomach, w tym transkrypcji RNA, syntezy białek, translokacji białek, modyfikacji potranslacyjnej i interakcji białko-białko. Często sama ekspresja enzymu nie odpowiada za jego aktywność. ABPP został opracowany w celu badania aktywności białek w ich stanie naturalnym. Wymagane są dwie funkcje: sonda chemiczna, która kowalencyjnie wiąże się z miejscem aktywnym enzymu będącego przedmiotem zainteresowania oraz znacznik reporterowy do wykrywania enzymu znakowanego son...

Powszechnie stosowane metody badania wzorców ekspresji, interakcji i funkcji białek, w tym platformy chromatografii cieczowej i spektrometrii mas do analizy shotgun1,2, metody dwuhybrydowe drożdży3,4 oraz testy in vitro, są ograniczone, ponieważ nie są w stanie ocenić aktywności białek w ich naturalnym stanie. Do wypełnienia tej luki można wykorzystać profilowanie białek oparte na aktywności (ABPP). W tym podejściu sondy małocząsteczkowe zdolne do kowalencyjnego wiązania się z miejscem aktywnym enzymu będącego przedmiotem zainteresowania są sprzężone z grupą reporterową, która pozwala na wykrycie celu. Korzystając z chemii kliknięć (CC), reporter może być zintegrowany z sondą lub może być wprowadzony po zazębieniu się celu5,6. Ta ostatnia procedura wymaga użycia sond zawierających odpowiednie grupy chemiczne, takie jak końcowy alkin lub azydek, które mogą być modyfikowane za pomocą szeregu odczynników reporterowych poprzez reakcje bioortogonalne, takie jak katalizowana Cu(I) cykloaddycja Huisgen [3+2]7-9 lub ligacja Staudingera10,11.
Niedawno ujawniliśmy, że związek ten ARN14686 jako pierwszy ABP do wykrywania hydrolazy cysteinowej in vitro i in vivo, NAAA12. NAAA katalizuje hydrolityczną dezaktywację nasyconych i jednonienasyconych FAE, w tym oleoiloetanoloamidu (OEA) i palmitoiloetanoloamidu (PEA), które są endogennymi agonistami przeciwzapalnego receptora jądrowego PPAR-alfa13-15. NAAA ulega ekspresji głównie w makrofagach i innych komórkach pochodzących z monocytów, a także w limfocytach B14,16, co sugeruje rolę w regulacji wrodzonej odpowiedzi immunologicznej. Enzym jest syntetyzowany w szorstkiej retikulum endoplazmatycznym w postaci nieaktywnej i jest aktywowany w kwaśnych przedziałach komórki przez mechanizm autoproteolityczny17. Rozszczepienie autoproteolityczne generuje nową N-końcową cysteinę (C131 u myszy i szczurów, C126 u ludzi), która jest nukleofilem odpowiedzialnym za hydrolizę FAE18,19. Farmakologiczne hamowanie aktywności NAAA zmienia równowagę syntezy/degradacji FAE na korzyść zwiększonych poziomów komórkowych FAE16,20,21. Wykazano, że kilka pochodnych β-laktonu i β-laktamu hamuje aktywność NAAA z dużą siłą działania i selektywnością16,22-26. Inhibitory te działają poprzez S-acylowanie katalitycznej cysteiny16,27,28.
Związek ARN14686 został zaprojektowany w oparciu o strukturę chemiczną ogólnoustrojowo aktywnego, pochodzącego z seryny inhibitora NAAA β-laktamu, ARN726 (4-cykloheksylobutyl-N-[(S)-2-oksoazetydyno-3-ylo]karbaminianu)16. Grupa 4-butylocykloheksylowa ARN726 została zastąpiona nasyconym łańcuchem alifatycznym C9 z końcowym znacznikiem alkinowym do późniejszej koniugacji CC ze znacznikiem reporterowym zawierającym azydek. Zdecydowaliśmy się zaprojektować dwuetapowy ABP, aby minimalnie zmienić strukturę oryginalnego rusztowania, zachowując w ten sposób powinowactwo sondy do NAAA. Co więcej, unikając wprowadzania nieporęcznych znaczników, taka sonda może być bardziej odpowiednia do leczenia in vivo niż bezpośrednia ABP. ARN14686 hamuje NAAA z dużą siłą działania (hNAAA IC50 = 6 nM, rNAAA IC50 = 13 nM) poprzez tworzenie kowalencyjnego adduktu z katalityczną cysteiną enzymu12. Eksperymenty na żywych szczurach wykazały, że sonda jest selektywna w wychwytywaniu NAAA wyrażonego w płucach. Kwaśna ceramidaza, inna amidaza cysteinowa, która ma 33-34% identyczności z NAAA, została również zidentyfikowana jako cel o niskim powinowactwie przy użyciu wysokich stężeń sondy (10 μM in vitro, 10 mg / ml dożylnie, dożylnie)12. Wykorzystaliśmy również ARN14686 do zbadania obecności aktywnego NAAA w tkankach szczura objętych stanem zapalnym po podaniu pełnego adiuwanta Freunda (CFA)29.
Tutaj przedstawiamy protokół przygotowania ARN14686 (Rysunek 1) i jego zastosowania do badania aktywacji NAAA ex vivo. Jako przykład opisujemy eksperymentalną procedurę wizualizacji NAAA w łapach szczurów po podaniu CFA. W tym eksperymencie białka są ekstrahowane z tkanki łapy po wstrzyknięciu dożylnym sondy, a proteom znakowany ABP jest poddawany CC z azydkiem biotyny. Próbki biotynylowane są wzbogacane za pomocą kulek streptawidyny i wykonywane są bloty białkowe. W innym zastosowaniu opisujemy lokalizację aktywnego NAAA za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w płucach myszy od myszy leczonych sondą. W tym przypadku tkanka jest cięta, a skrawki są poddawane CC w celu dodania rodaminy. Schemat przepływu pracy przedstawiono na rysunku 2.

<table><tbody><tr><td>1,1'-sulfonyldiimidazol&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>367818</td><td>Szkodliwy</td></tr><tr><td>węglan 2-dipyrydylu</td><td>Fluorochem</td><td>11331</td><td>Szkodliwy</td></tr><tr><td>2-metylobutan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M32631</td><td>Łatwopalny, toksyczny, niebezpieczny dla środowiska wodnego</td></tr><tr><td>4-(dimetyloamino)pirydyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>107700</td><td>Toksyczny</td></tr><tr><td>kwas octowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>695092</td><td>Łatwopalny,</td></tr><tr><td>Acetonitryl&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34998</td><td>Łatwopalny, toksyczny</td></tr><tr><td>węgiel aktywny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>161551</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek amonu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9434</td><td>Szkodliwy</td></tr><tr><td>Azide-PEG3-Biotyna</td><td>Jena Biosciences</td><td>CLK-AZ104P4</td><td></td></tr><tr><td>Azide-PEG3-Fluor 545</td><td>Jena Biosciences</td><td>CLK-AZ109</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek BCA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Kolumny Bio-spin</td><td>Biorad</td><td>732-6204</td><td></td></tr><tr><td>Biotyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B4501</td><td></td></tr><tr><td>Bufor blokujący</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>927-40000</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-merkaptoetanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6250</td><td>Wysoce toksyczna</td></tr><tr><td>albumina surowicy Bovin (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Błękit bromofenolowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B0126</td><td></td></tr><tr><td>Bruker Avance III 400</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Celite</td><td>Sigma Aldrich</td><td>419931</td><td>Zagrożenie dla zdrowia</td></tr><tr><td>Azotan cerowo-amonowy&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>22249</td><td>Utleniający, szkodliwy</td></tr><tr><td>hydrat chloralu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8383</td><td>Wysoce toksyczny</td></tr><tr><td>CuSO4.5H2O&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>209198</td><td>Toksyczny</td></tr><tr><td>cykloheksadien</td><td>Sigma Aldrich</td><td>125415</td><td>Łatwopalny, Zagrożenie dla zdrowia</td></tr><tr><td>Cykloheksan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34855</td><td>Łatwopalny, Szkodliwy, Zagrożenie dla zdrowia, Zagrożenie dla środowiska</td></tr><tr><td>Dichlorometan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34856</td><td>Szkodliwy, Zagrożenie dla zdrowia</td></tr><tr><td>Eter dietylowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>296082</td><td>Łatwopalny, Szkodliwy</td></tr><tr><td>dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Acros Organics</td><td>348441000</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek d6 (DMSO-d6)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>175943</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>2860</td><td>Łatwopalny, Szkodliwy</td></tr><tr><td>octan etylu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34858</td><td>Łatwopalny, Szkodliwy</td></tr><tr><td>glicerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Irdye 680-LT Streptavidin</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>925-68031</td><td></td></tr><tr><td>IRDye680-LT Streptawidyna&nbsp;</td><td>Licor</td><td>925-68031</td><td>Krótko odwirować przed użyciem w celu wytrącenia kompleksów białkowych</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34966</td><td>Wysoce toksyczny</td></tr><tr><td>metanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34860</td><td>Łatwopalny, toksyczny, zagrożenie dla zdrowia</td></tr><tr><td>N-(3-dimetyloaminopropylo)-N&prime; -etylokarbodiamid chlorowodorek</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7750</td><td>Szkodliwy,</td></tr><tr><td>N,N-diizopropyloetyloamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D125806</td><td>Łatwopalny,, toksyczny</td></tr><tr><td>N,N-dimetyloformamid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>227056</td><td>Łatwopalny, Szkodliwy, Zagrożenie dla zdrowia</td></tr><tr><td>N-Cbz-L-seryna</td><td>Fluorochem</td><td>M03053</td><td>Szkodliwa</td></tr><tr><td>mikroskopia konfokalna Nikon A1</td><td>Nikon</td><td></td><td>Przeczytaj instrukcję obsługi</td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% żel Bis-Tris</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0335BOX</td><td></td></tr><tr><td>Pallad na węglu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>330108</td><td></td></tr><tr><td>p-anizydyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A88255</td><td>Toksyczny, Zagrożenie dla zdrowia, Zagrożenie</td></tr> <tr><td>dla środowiskaParaformaldehyd</td><td>sigma Aldrich</td><td>441244</td><td>Toksyczny, szkodliwy dla dróg oddechowych,, falmowalny</td></tr><tr><td>Poli(glikol etylenowy)&nbsp;</td><td>Mocowanie przeciwblaknięcie Sigma Aldrich</td><td>P3265</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold z DAPI&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36931</td><td>Unikaj tworzenia się pęcherzyków</td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu (SDS)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3771</td><td>Toksyczny,, falmowalny</td></tr><tr><td>Wodorek sodu&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>452912</td><td>Łatwopalny</td></tr><tr><td>siarczan sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>239313</td><td></td></tr><tr><td>Starion FLA-9000 skaner immage</td><td>FUJIFILM</td><td></td><td>Przeczytaj&nbsp; instrukcję obsługi</td></tr><tr><td>Streptawidyna agaroza</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20349</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Tert-butanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>360538</td><td>Toksyczny, łatwopalny</td></tr><tr><td>Tetrahydrofuran</td><td>Sigma Aldrich</td><td>186562</td><td>Łatwopalny, szkodliwy, zagrożenie dla zdrowia</td></tr><tr><td>Tiomocznik</td><td>Acros Organics</td><td>424542500</td><td>Toksyczny, ciepły w 50 & stopni; C do rozpuszczenia</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma Aldrich</td><td>RDD008</td><td></td></tr><tr><td>Tris(2-karboksyetylo)fosfiny (TCEP)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4706</td><td></td></tr><tr><td>Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-ylo)metylo]amina (TBTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>678937</td><td></td></tr><tr><td>Triton-x100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td>Toksyczny</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Tween-80</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1754</td><td></td></tr><tr><td>Ultra turrax IKA T18 podstawowy homogenizator tkankowy</td><td>IKA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Undec-10-yn-1-ol</td><td>Fluorochem</td><td>13739</td><td></td></tr><tr><td>Szkodliwy mocznik</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U5378</td><td>Toksyczny, ciepły w temperaturze 50 &; C, aby rozpuścić</td></tr></tbody></table>

przygotowanie i zastosowanie in vivo sondy aktywności dla amidazy kwasu n-acyloetanoloaminowego

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Profilowanie białek oparte na aktywności (ABPP) to metoda identyfikacji interesującego enzymu w złożonym proteomie za pomocą sondy chemicznej, która celuje w miejsca aktywne enzymu. Znacznik reporterowy wprowadzony do sondy pozwala na wykrycie znakowanego enzymu za pomocą skanowania fluorescencyjnego w żelu, plamy białkowej, mikroskopii fluorescencyjnej lub chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas. W tym miejscu opisujemy przygotowanie i zastosowanie związku ARN14686, sondy opartej na aktywności chemicznej (CC-ABP), która selektywnie rozpoznaje enzym amidazę kwasu N-acyloetanoloaminowego (NAAA). NAAA to hydrolaza cysteiny, która sprzyja stanom zapalnym poprzez dezaktywację endogennych receptorów aktywowanych przez proliferatory peroksysomów (PPAR)-alfa-agonistów, takich jak palmitoiloetanoloamid (PEA) i oleoiloetanoloamid (OEA). NAAA jest syntetyzowany jako nieaktywny proenzym o pełnej długości, który jest aktywowany przez autoproteolizę w kwaśnym pH lizosomu. Badania lokalizacyjne wykazały, że NAAA ulega ekspresji głównie w makrofagach i innych komórkach pochodzących z monocytów, a także w limfocytach B. Podajemy przykłady, w jaki sposób można ARN14686 wykorzystać do wykrywania i ilościowego oznaczania aktywnego NAAA ex vivo w tkankach gryzoni za pomocą mikroskopii białkowej i fluorescencyjnej.

Związek ARN14686 został zaprojektowany w oparciu o strukturę inhibitora NAAA ARN726. Grupę 4-butylocykloheksylową w ARN726 zastąpiono nasyconym łańcuchem alifatycznym C9 z terminalną grupą alkinową (Rysunek 1). Grupę alkinową wprowadzono, aby umożliwić zastosowanie dwuetapowej procedury znakowania w celu przyłączenia fluoroforu lub cząsteczki biotyny poprzez reakcję CC. Ta cecha sprawia, że ARN14686 jest bardzo wszechstronnym narzędziem do badania NAAA in vitro o...

Tutaj opisujemy przygotowanie i użycie sondy opartej na aktywności (ARN14686, undec-10-ynyl-N-[(3S)-2-oksoazetydyno-3-ylo]karbaminianu), która pozwala na wykrycie i ilościowe określenie aktywnej formy prozapalnego enzymu amidazy kwasu N-acyloetanoloaminowego (NAAA), zarówno in vitro, jak i ex vivo.

Przygotowanie i zastosowanie in vivo sondy aktywności dla amidazy kwasu N-acyloetanoloaminowego

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przedstawienie syntezy sondy opartej na aktywności, ARN 14686, specyficznej dla amidazy kwasu N-acyloetanoloaminowego (NAAA) oraz opisanie jej zastosowania w wykrywaniu katalitycznie aktywnego enzymu w ekstraktach komórkowych i skrawkach tkanek. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na pytania dotyczące funkcji NAAA in vivo, dostarczając informacji na temat aktywacji NAAA w różnych warunkach fizjologicznych i patologicznych, takich jak choroby zapalne i neurodegeneracyjne. Jej główną zaletą jest fakt, że po reakcji NAAA z sondą wystarczy prosta manipulacja, co pozwala na uzyskanie wiarygodnych informacji o stanie aktywacji enzymu in vivo.Kolejną zaletą jest to, że w przeciwieństwie do swoistych przeciwciał, nasza sonda wykrywa jedynie aktywną formę enzymu, co jest przydatne w badaniach z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej. Wizualna prezentacja tej metody jest kluczowa, ponieważ łączy ona różne obszary wiedzy, które razem tworzą spójną całość – od prawidłowej syntezy po końcowe zastosowania. W kolbie okrągłobrzusznej o pojemności 50 ml rozpuścić 350 mg undecynenolu i 3,5 ml suchego dichlorometanu.Następnie do roztworu należy do

preparation-vivo-use-an-activity-based-probe-for-n-acylethanolamine

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Przedstawiono protokół wykrywania trichotecenów (mykotoksyn stanowiących zagrożenie dla zdrowia ludzi) z wykorzystaniem nowo opracowanej metody przesiewowej, opartej na konkurencyjnej metodzie immunochemicznej oraz końcowej detekcji elektrochemicznej.

Metoda ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical) do wykrywania mikotoksyn

Niniejszy protokół opisuje przygotowanie syntetycznego substratu tRNA dla homologu metylotransferazy DNA/tRNA 2 (Dnmt2) z Entamoeba histolytica, Ehmeth, oraz pomiar jego aktywności metylotransferazy. To podejście eksperymentalne może być wykorzystane do badania aktywności innych białek Dnmt2.

Analiza metylacji tRNA in vitro z użyciem enzymu DNA i tRNA metylotransferazy Dnmt2 (Ehmeth) z Entamoeba histolytica

Opisano metodę oznaczania aktywności kinazy octanowej. Analiza ta wykorzystuje reakcję bezpośrednią do wyznaczania aktywności enzymatycznej i kinetyki kinazy octanowej w kierunku tworzenia octanu z zastosowaniem różnych akceptorów fosforanowych. Ponadto metodę tę można wykorzystać do analizy innych enzymów wykorzystujących acetylofosforan lub acetylo-CoA.

Bezpośrednie wykrywanie aktywności octanowej enzymu kinazy octanowej

Ten film pokazuje pomiar in vitro aktywności enzymu dla α-galaktozydazy A i kwaśnej α-glukozydazy w próbkach używających syntetycznych substratów 4-metylulumbelliferylu.

Pomiar in vitro aktywności enzymów α-galaktozydazy A i kwaśnej α-glukozydazy

Odwracalne dodawanie palmitynianu do białek jest ważnym regulatorem wewnątrzkomórkowego transportu białek. Jest to szczególnie interesujące w neuronach, w których wiele białek synaptycznych jest palmitoilowanych. Wykorzystujemy prostą metodę biochemiczną do wykrywania białek palmitoilowanych w hodowanych neuronach, które można dostosować do wielu typów komórek i tkanek.

Wykrywanie palmitoylacji białek w hodowanych neuronach hipokampa poprzez immunoprecypitację i wymianę acylo-biotyny (ABE)

Tutaj prezentujemy protokół do analizy interakcji RNA/białko. Test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) opiera się na zróżnicowanej migracji kompleksów RNA/białko i wolnego RNA podczas natywnej elektroforezy żelowej. Za pomocą znakowanej radioaktywnie sondy RNA, kompleksy RNA/białko można uwidocznić za pomocą autoradiografii.

Test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) do badania interakcji RNA-białko: przykład IRE/IRP

Niniejszy raport opisuje test enzymatyczny in vitro do pomiaru aktywności metylotransferazy fosfatydyloetanoloaminy przy użyciu ekstraktów z komórek Leishmania. Test ten opiera się na przeniesieniu radioaktywnej grupy metylowej z S-[metylo-3] H]adenozylo-L-metioniny do endogennej fosfatydyloetanoloaminy.

In vitro Test do pomiaru aktywności metylotransferazy fosfatydyloetanoloaminy

Ta praca przedstawia metodę wysokoprzepustowych badań przesiewowych przy użyciu uniwersalnego systemu badań przesiewowych enzymów genetycznych, który teoretycznie można zastosować do ponad 200 enzymów. W tym przypadku pojedynczy system przesiewowy identyfikuje trzy różne enzymy (lipazę, celulazę i fosfatazę alkaliczną), po prostu zmieniając zastosowany substrat (octan p-nitrofenylu, p-nitrofenylo-β-D-celobiozyd i fosforan fenylu).

Badania przesiewowe wielu enzymów przy użyciu wysokoprzepustowego systemu badań przesiewowych enzymów genetycznych

Tutaj oferujemy łatwy, tani i efektywny czasowo protokół chemicznego utrwalania tkanki mózgowej naczelnych za pomocą utrwalacza akroleiny, co pozwala na długoterminową konserwację, która jest zgodna z immunohistochemią dla transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Przygotowanie tkanki mózgowej naczelnych innych niż ludzie do wstępnego zatopienia immunohistochemii i mikroskopii elektronowej

Seryjna skaningowa mikroskopia elektronowa (SBEM) jest stosowana do obrazowania i analizy kolców dendrytycznych w mysim hipokampie.

Seryjna skaningowa mikroskopia elektronowa typu block-face (SBEM) do badania kolców dendrytycznych

Ten protokół opisuje szczegółowe etapy wstępnego wdrażania mikroskopii immunoelektronowej, skupiając się na badaniu obwodów synaptycznych i lokalizacji białek w siatkówce.

Badanie obwodów siatkówki i lokalizacji molekularnej poprzez wstępne osadzenie mikroskopii immunoelektronowej

Poznaj syntezę i zastosowanie sondy aktywności ARN14686 do wykrywania aktywnej formy amidazy kwasu N-acyloetanoloaminowego (NAAA) w ekstraktach komórkowych i tkankach. Ta metoda pozwala badać aktywację NAAA w stanach zapalnych i neurodegeneracyjnych.

Przygotowanie i zastosowanie in vivo sondy aktywności dla amidazy kwasu N-acyloetanoloaminowego

Przeglądaj więcej filmów