Name: Prosta mechaniczna procedura powodująca niedobór rąbkowych komórek macierzystych u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 55 s
Description: Poznaj technikę indukcji niedoboru rąbkowych komórek macierzystych u myszy bez dodatkowych uszkodzeń oka. Model ten umożliwia długoterminowe badania procesów chorobowych i testowanie nowych terapii w okulistyce.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Ruth Zelkha, MS, za jej hojną pomoc w obrazowaniu. Badania te były wspierane przez Clinical Scientist Development Program Award K12EY021475 dla M.E., grant R01 EY024349-01A1 dla A.R.D., grant podstawowy EY01792 z National Eye Institute, NIH oraz nieograniczony grant z Research to Prevent Blindness. A.R.D. jest laureatem nagrody Career Development Award przyznawanej przez Research to Prevent Blindness.

Wszystkie procedury wykonywane na zwierzętach są zgodne z oświadczeniami Stowarzyszenia Badań nad Widzeniem i Okulistyką dotyczącą wykorzystania zwierząt w badaniach nad widzeniem. Wykorzystano czternaście cztero- do sześciomiesięcznych samców/samic myszy typu dzikiego C57BL/6J: dziesięć myszy do modelu urazowego i cztery jako zwierzęta kontrolne (nieuszkodzone rogówki).
1. Przygotowanie zwierząt
<ol>
	<li>Znieczulić mysz wstrzyknięciem dootrzewnowym mieszaniny 100 mg/kg ketaminy i 5 mg/kg ksylazyny. Po zadziałaniu znieczulenia uszczypnij palec u nogi, aby potwierdzić głębokość znieczulenia; Zwierzę nie powinno reagować.</li>
	<li>Przed przeprowadzeniem eksperymentów należy sprawdzić oko pod lampą szczelinową, aby sprawdzić, czy nie doszło do wcześniejszego uszkodzenia rogówki.</li>
	<li>Wkroplić kroplę 1% chlorowodorku tetrakainy do oka. Po 60 - 90 sekundach przetestuj odruch rogówkowy, aby potwierdzić brak czucia. Zamiast tego można zastosować chlorowodorek proparakainy 0,5%.</li>
	<li>Gdy utrata czucia rogówki jest pewna, delikatnie nanieś kroplę 5% jodu powidonu na oko i na włosy wokół oka. Zetrzyj kroplę po 1 minucie lub rozprowadź ją na włosach wokół oka, aby włosy nie kolidowały z końcówką narzędzia.</li>
</ol>
2. Ścieranie nabłonka rogówki
<ol>
	<li>Nosić rękawice chirurgiczne i fartuch. Przygotuj wymagane narzędzia: sterylny zadzior obrotowy i parę sterylnych pęset. Aby uzyskać lepszą kontrolę, użyj wygiętej pęsety. Podczas zabiegu umieść narzędzia na sterylnym arkuszu.</li>
	<li>Za pomocą zgiętej pęsety ustabilizuj oko, chwytając powieki od strony nosa i delikatnie przesuwając oko. Unikaj używania zbyt dużego nacisku.</li>
	<li>Pod mikroskopem chirurgicznym dwukrotnie ogol się o 360° wokół obszaru rąbka za pomocą sterylnego zadzioru obrotowego. Obejdź rąbek z prędkością 5 - 6 sekund na rundę. 
	UWAGA: Frez ma jedną stałą prędkość. Jednak, aby obracał się z ustaloną prędkością, "nakrętka końcowa" powinna być całkowicie dokręcona.</li>
	<li>Usuń cały nabłonek rogówki od rąbka do rąbka za pomocą obracającego się zadzioru. Aby uzyskać lepsze wyniki, przesuwaj narzędzie po okrężnych stronach i trzymaj je nieco równolegle do powierzchni rogówki, aby pracować z boczną stroną jego końcówki. Uważaj, aby nie uszkodzić zrębu, nie szczotkując ponownie obszarów, w których nabłonek został już usunięty. Nie uciskaj oka. Wyczyść końcówkę szczoteczki zgodnie z wymaganiami.</li>
	<li>Wlej kroplę sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami na rogówkę i zetrzyj wszelkie oderwane arkusze nabłonka miękką chusteczką czyszczącą.</li>
	<li>Ogol pozostały nabłonek, jeśli występuje.</li>
	<li>Zwróć uwagę na ogon myszy podczas zabiegu. 
	UWAGA: Jeśli wystąpi jakikolwiek ruch, głębokość znieczulenia zmniejszyła się i wymagane jest dalsze wstrzyknięcie. Jedna trzecia do dwóch trzecich objętości wstrzykniętej pierwotnie powinna być wystarczająca. Nie należy przedawkować zwierzęcia lekiem znieczulającym.</li>
	<li>Wysterylizuj wszystkie narzędzia przed użyciem ich na innym oku.</li>
</ol>
3. Potwierdź całkowite usunięcie nabłonka
<ol>
	<li>Nanieś kroplę 1 mg/ml fluoresceiny sodowej na rogówkę. Oczyść rogówkę po 30 sekundach i zbadaj ją pod mikroskopem z filtrem kobaltowo-niebieskim, aby sprawdzić, czy nabłonek został całkowicie usunięty. 
	UWAGA: Obszary rogówki z ubytkami nabłonka są uwidocznione na zielono.</li>
</ol>
4. Opieka pooperacyjna
<ol>
	<li>Połóż zwierzę na kocu grzewczym i trzymaj je w bezpiecznym miejscu (np. w klatce) podczas rekonwalescencji. Nie trzymaj nieprzytomnego zwierzęcia w towarzystwie tych przytomnych.</li>
	<li>Zastosuj 1% maść okulistyczną z erytromycyną. Zapobiegnie to również wysuszeniu oczu. Kontynuuj stosowanie antybiotyku codziennie przez tydzień.</li>
	<li>Wstrzyknąć 0,1 mg/kg buprenorfiny podskórnie po zabiegu i ponownie po 12 godzinach. Kontynuować wstrzyknięcie dwa razy dziennie przez dwa dni.</li>
	<li>Obserwuj zwierzę przez 30 - 45 minut, aż do całkowitego wyzdrowienia ze znieczulenia. 
	UWAGA: Łagodny ruch mięśni oddechowych na powierzchni brzusznej wskazuje na dobre samopoczucie zwierzęcia w okresie rekonwalescencji.</li>
</ol>

<ol><li>Afsharkhamseh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+of+limbal+stem+cell+deficiency+after+mechanical+and+thermal+injuries+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Stability of limbal stem cell deficiency after mechanical and thermal injuries in mice.</a> Exp. Eye Res. 145, 88-92 (2015).</li>
<li>Dorà, N. J., Hill, R. E., Collinson, J. M., West, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+tracing+in+the+adult+mouse+corneal+epithelium+supports+the+limbal+epithelial+stem+cell+hypothesis+with+intermittent+periods+of+stem+cell+quiescence%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Lineage tracing in the adult mouse corneal epithelium supports the limbal epithelial stem cell hypothesis with intermittent periods of stem cell quiescence.</a> Stem Cell Res. 15 (3), 665-677 (2015).</li>
<li>Ahmad, S., Osei-Bempong, C., Dana, R., Jurkunas, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+culture+and+transplantation+of+human+limbal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">The culture and transplantation of human limbal stem cells.</a> J. Cell Physiol. 225 (1), 15-19 (2010).</li>
<li>Kolli, S., Ahmad, S., Lako, M., Figueiredo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+clinical+implementation+of+corneal+epithelial+stem+cell+therapy+for+treatment+of+unilateral+limbal+stem+cell+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Successful clinical implementation of corneal epithelial stem cell therapy for treatment of unilateral limbal stem cell deficiency.</a> Stem Cells. 28 (3), 597-610 (2010).</li>
<li>Ahmad, S., Figueiredo, F., Lako, M. Corneal epithelial stem cells: characterization, culture and transplantation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAhmad%2C+S+%22Regen.+Med%22">Regen. Med</a>. 1 (1), 29-44 (2006).</li>
<li>He, H., Yiu, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell-based+therapy+for+treating+limbal+stem+cells+deficiency%3A+A+review+of+different+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Saudi+J.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Stem cell-based therapy for treating limbal stem cells deficiency: A review of different strategies.</a> Saudi J. Ophthalmol. 28 (3), 188-194 (2014).</li>
<li>Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+the+basement+membrane+enhances+corneal+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Removal of the basement membrane enhances corneal wound healing.</a> Exp Eye Res. 93 (6), 927-936 (2011).</li>
<li>Stepp, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wounding+the+cornea+to+learn+how+it+heals%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Wounding the cornea to learn how it heals.</a> Exp. Eye Res. 121, 178-193 (2014).</li>
<li>Amirjamshidi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limbal+fibroblast+conditioned+media%3A+a+non-invasive+treatment+for+limbal+stem+cell+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Vis%22%5BJournal%5D)">Limbal fibroblast conditioned media: a non-invasive treatment for limbal stem cell deficiency.</a> Mol. Vis. 17, 658-666 (2011).</li>
<li>Li, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+AlgerBrush+II+rotating+burr+as+a+tool+for+inducing+ocular+surface+failure+in+the+New+Zealand+White+rabbit%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the AlgerBrush II rotating burr as a tool for inducing ocular surface failure in the New Zealand White rabbit.</a> Exp. Eye Res. 147, 1-11 (2016).</li>
<li>Ti, S. E., Anderson, D., Touhami, A., Kim, C., Tseng, S. C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+outcome+following+transplantation+of+ex+vivo+expanded+limbal+epithelium+on+amniotic+membrane+for+total+limbal+deficiency+in+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Factors affecting outcome following transplantation of ex vivo expanded limbal epithelium on amniotic membrane for total limbal deficiency in rabbits.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 43 (8), 2584-2592 (2002).</li>
<li>Ma, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+chemically+burned+rat+corneal+surface+by+bone+marrow-derived+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of chemically burned rat corneal surface by bone marrow-derived human mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells. 24 (2), 315-321 (2006).</li>
<li>Bu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+activated+omental+cells+on+rat+limbal+corneal+alkali+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of activated omental cells on rat limbal corneal alkali injury.</a> Exp. Eye Res. 121, 143-146 (2014).</li>
<li>Luengo Gimeno, F., Lavigne, V., Gatto, S., Croxatto, J. O., Correa, L., Gallo, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+corneal+stem-cell+transplantation+in+rabbits+with+severe+ocular+alkali+burns%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cataract+Refract.+Surg%22%5BJournal%5D)">Advances in corneal stem-cell transplantation in rabbits with severe ocular alkali burns.</a> J. Cataract Refract. Surg. 33 (11), 1958-1965 (2007).</li>
<li>Lin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+of+limbal+stem+cell+deficiency+induced+by+topical+medication+with+the+preservative+benzalkonium+chloride%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">A mouse model of limbal stem cell deficiency induced by topical medication with the preservative benzalkonium chloride.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (9), 6314-6325 (2013).</li>
<li>Huang, A. J., Tseng, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+epithelial+wound+healing+in+the+absence+of+limbal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Corneal epithelial wound healing in the absence of limbal epithelium.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 32 (1), 96-105 (1991).</li>
<li>Liu, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cornea-specific+expression+of+K12+keratin+during+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Cornea-specific expression of K12 keratin during mouse development.</a> Curr. Eye Res. 12 (11), 963-974 (1993).</li>
<li>Nakatsu, M. N., González, S., Mei, H., Deng, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+limbal+mesenchymal+cells+support+the+growth+of+human+corneal+epithelial+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Human limbal mesenchymal cells support the growth of human corneal epithelial stem/progenitor cells.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 55 (10), 6953-6959 (2014).</li>
<li>Pajoohesh-Ganji, A., Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+goblet+cells+and+their+niche%3A+implications+for+corneal+stem+cell+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Corneal goblet cells and their niche: implications for corneal stem cell deficiency.</a> Stem Cells. 30 (9), 2032-2043 (2012).</li>
<li>McCloy, R. A., Rogers, S., Caldon, C. E., Lorca, T., Castro, A., Burgess, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+inhibition+of+Cdk1+in+G+2+phase+overrides+the+SAC+and+decouples+mitotic+events%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Partial inhibition of Cdk1 in G 2 phase overrides the SAC and decouples mitotic events.</a> Cell Cycle. 13, 1400-1412 (2014).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają nic do ujawnienia.

W tym artykule opisano powtarzalną i stosunkowo prostą technikę tworzenia mysiego modelu LSCD. Jest kilka ważnych aspektów tego modelu, na które warto zwrócić uwagę. Po pierwsze, w przeciwieństwie do modeli, które wykorzystują substancje chemiczne11, 12, uraz obejmuje przede wszystkim nabłonek powierzchniowy (i błonę podstawną), z minimalnym uszkodzeniem leżącego poniżej zrębu rogówki lub innych struktur wewnątrzgałkowych. W związku z tym stan zapalny i bliznowacenie są ograniczone, co może skomplikować proced...

Nabłonek rogówki jest niezbędny do zachowania czystości i integralności rogówki. Jest ona stale odnawiana przez całe życie przez nabłonkowe komórki macierzyste znajdujące się w rąbku - wąskiej strefie na styku rogówki i spojówki. Te samoodnawiające się rąbkowe komórki macierzyste odgrywają kluczową rolę w regeneracji nabłonka rogówki, zarówno normalnie, jak i po urazie. Częściowe lub całkowite wyczerpanie tych komórek macierzystych spowoduje nawracające nadżerki rogówki, ból, bliznowacenie rogówki i neowaskularyzację, pojawienie się komórek kubkowych, a jeśli nie jest leczone, ślepotę rogówki. Ten stan jest znany jako niedobór rąbkowych komórek macierzystych (LSCD) i może być idiopatyczny; dziedziczny; lub nabyte w wyniku urazów chemicznych lub termicznych, długotrwałego noszenia soczewek kontaktowych i przewlekłego stanu zapalnego1-6.
Badania nad LSCD wymagają odpowiedniego modelu zwierzęcego, który nie tylko naśladuje chorobę u ludzi, ale jest powtarzalny i trwały, z najmniejszym uszkodzeniem innych struktur rogówki i oka. Model ten jest niezbędny do oceny leczenia i wyjaśnienia mechanizmów chorobowych na poziomie molekularnym i komórkowym. Jak opisano wcześniejw punkcie 1, za pomocą obrotowego zadzioru można łatwo opracować mysi model LSCD, który charakteryzuje się wyżej wymienionymi zaletami i utrzymuje się przez co najmniej trzy miesiące. Celem tego badania jest przedstawienie prostego, powtarzalnego i zrównoważonego mysiego modelu LSCD.
Obrotowy zadzior jest poręcznym narzędziem, które równomiernie usuwa nabłonek bez uszkadzania leżącego pod nim zrębu1. Był stosowany do wywoływania centralnej erozji rogówki7, 8 w badaniach gojenia się ran. Przedstawiona w niniejszym tekście technika tworzenia LSCD u myszy nie została wcześniej opisana. Wcześniej wprowadzone metody skrobania nabłonka szpatułką skutkują mniej równomiernym uszkodzeniem - szczególnie na rąbku - i bardziej zmiennym fenotypem1, 9, z większym przywróceniem prawidłowego nabłonka rogówki1. W przeciwieństwie do skrobaka, obrotowy zadzior usuwa również błonę podstawną nabłonka7, 8, 10. Inne zgłoszone metody odcinania komórek macierzystych obejmują stosowanie substancji chemicznych, takich jak wodorotlenek sodu, n-heptanol i chlorek benzalkoniowy, które nie tylko mogą wywołać niepożądane uszkodzenie leżących poniżej struktur oka, ale także mogą prowadzić do znacznego stanu zapalnego, a następnie zmętnienia rogówki lub metaplazji płaskonabłonkowejnabłonka 11-15. Obracający się zadzior nie jest związany z tymi poważnymi powikłaniami. Chirurgiczne usunięcie nabłonka rąbka, samodzielnie lub przy użyciu środków chemicznych10, 11, 16, jest trudniejsze do wykonania i nie jest najlepszą opcją u zwierząt o małych oczach i cienkim nabłonku rąbka (takich jak myszy). Ponadto, co zaskakujące, limbektomia może nadal pozostawiać część nabłonka rąbka10.
Niżej opisana technika spowoduje LSCD z neowaskularyzacją i koniunktywalizacją, która naśladuje prezentację pełnego LSCD u pacjentów i trwa co najmniej trzy miesiące1. Jest odpowiedni dla tych, którzy chcą badać LSCD lub patofizjologię gojenia się ran, immunologię i potencjalne metody leczenia u myszy. Możliwe, z pewnymi modyfikacjami, procedurę tę można wykonać u szczurów lub królików10. Ponieważ obracający się zadzior skutecznie usuwa nabłonek, może być wykorzystany we wszelkich badaniach dotyczących ścierania/zraniania nabłonka rogówki oraz we wszelkich powiązanych badaniach klinicznych lub biologii molekularnej.

<table><tbody><tr><td>Frez obrotowy: Środek do usuwania pierścieni rdzy AlgerBrush II&nbsp;</td><td>Rumex International Co, Clearwater, FL</td><td>16-141</td><td>Frez 0,5 mm. Dostępne również w innych firmach.</td></tr><tr><td>Mikroskop chirurgiczny</td><td>Wild Heerbrugg, Szwajcaria</td><td>Wild M691</td><td></td></tr><tr><td>Aparat cyfrowy</td><td>Nikon, Tajlandia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lampa szczelinowa Nikon FS-2</td><td>Nikon, Japonia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poliklonalne przeciwciało anty-CK12</td><td>Santa Cruz Blotechnology, CA,</td> <td>SC-17101</td><td>stężenie 1:100</td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne anty-CK8</td><td>TROMA-I-s, Iowa City, IA</td><td>AB_531826</td><td>Koncentracja 1:50</td></tr></tbody></table>

prosta mechaniczna procedura powodująca niedobór rąbkowych komórek macierzystych u myszy

A Simple Mechanical Procedure to Create Limbal Stem Cell Deficiency in Mouse

Niedobór komórek macierzystych rąbka (LSCD) to stan nieprawidłowego działania lub utraty komórek macierzystych nabłonka rąbka, po którym nabłonek rogówki zostaje zastąpiony spojówką. Pacjenci cierpią z powodu nawracających wad rogówki, bólu, stanów zapalnych i utraty wzroku.
Poprzednio, mysi model LSCD został opisany i porównany z dwoma innymi modelami. Celem było stworzenie spójnego mysiego modelu LSCD, który zarówno naśladuje fenotyp u ludzi, jak i utrzymuje się wystarczająco długo, aby umożliwić badanie patofizjologii choroby i ocenę nowych metod leczenia. Tutaj technika jest opisana bardziej szczegółowo.
Zmotoryzowane narzędzie z obracającym się zadziorem zostało zaprojektowane do usuwania rdzawych pierścieni z powierzchni rogówki lub do wygładzania łożyska skrzydlika u pacjentów. Jest to odpowiednie urządzenie do stworzenia pożądanego modelu LSCD. Jest to łatwo dostępne, łatwe w użyciu narzędzie z cienką końcówką, dzięki czemu nadaje się do pracy z małymi oczami, takimi jak myszy. Jego zastosowanie zapobiega niepotrzebnym urazom oka i nie powoduje niechcianych urazów, jak to często ma miejsce w przypadku modeli urazów chemicznych. W przeciwieństwie do skrobaka usuwa nabłonek wraz z błoną podstawną. W tym protokole obszar rąbka został dwukrotnie przetarty, a następnie cały nabłonek rogówki został ogolony od rąbka do rąbka. Aby uniknąć uszkodzenia zrębu, uważano, aby nie szczotkować powierzchni rogówki, gdy nabłonek został już usunięty.

W ciągu miesiąca od zastosowania tej techniki w 100% rogówek rozwinęła się powierzchowna neowaskularyzacja (Rycina 1A. Zdjęcia wykonano aparatem podłączonym do lampy szczelinowej w polu jasnym i przy użyciu filtra kobaltowego). W 18/20 (90%) oczu neowaskularyzacja objęła całą powierzchnię rogówki (Rycina 1A). W 2/20 (10%) neowaskularyzację zaobserwowano w trzech z czterech kwadrantów rogówki, jednak nadal docierała ona do centrum rogówki.
<p class="jo...

Poniższy artykuł przedstawia łatwą, powtarzalną technikę skutecznego tworzenia trwałego mysiego modelu niedoboru rąbków komórek macierzystych (LSCD). Ten model zwierzęcy jest przydatny w testowaniu i porównywaniu skuteczności leczenia chorób rąbkowych komórek macierzystych.

Prosta mechaniczna procedura powodująca niedobór rąbkowych komórek macierzystych u myszy

Limbal stem cell deficiency (LSCD) is a state of malfunction or loss of limbal epithelial stem cells, after which the corneal epithelium is replaced with ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest stworzenie powtarzalnego, stabilnego i trwałego modelu mysiego niedoboru komórek macierzystych limbusa. Ta prosta technika zapewnia spójny model zwierzęcy niedoboru komórek macierzystych limbusa, bez wywoływania niepożądanych obrażeń oka, co jest trudne do osiągnięcia w standardowych modelach uszkodzeń chemicznych. Model ten jest użyteczny do długoterminowego badania procesu chorobowego na poziomie komórkowym i molekularnym.A także do testowania lub porównywania skuteczności nowych metod leczenia. Po podaniu myszy środka znieczulającego, uciśnij palec u stopy, aby upewnić się, że głębokość znieczulenia jest odpowiednia. Zbadaj oko pod lampą szczelinową, aby zweryfikować brak wcześniejszych uszkodzeń rogówki.Zakroplić kroplę 1% chlorowodorku tetrakainy do oka i odczekać 60 sekund. Następnie delikatnie nanieść 5% jodopowidonu na oko oraz włosy wokół niego. Po jednej minucie wytrzeć kroplę lub rozprowadzić ją na włosach wokół oka, aby zapobiec ich przeszkadzaniu końcówce narzędzia.Przygotuj sterylny wiertarek rotacyjny oraz parę sterylnych pęset zakrzywionych i pozostaw je na sterylnym polu przez cały czas trwania procedury. Następnie ustabilizuj oko, chwytając powieki od strony nosowej za pomocą pęsety zakrzywionej i delikatnie wysuwając gałkę oczną. Należy uważać, aby nie wywierać zbyt dużego nacisku.Pod mikroskopem chirurgicznym dwukrotnie wykonaj opracowanie wokół obszaru limbalnego za pomocą sterylnego wiertła rotacyjnego. Usuń cały nabłonek rogówki od limbusa do limbusa, posługując się wiertłem rotacyjnym w sposób kolisty i wykorzystując boczną stronę jego końcówki. Aby uniknąć uszkodzenia stromy, nie opracowuj ponownie części rogówki, z których nabłonek został już usunięty.Nie należy wywierać żadnego nacisku na oko. Końcówkę pędzla należy czyścić w razie potrzeby. Nanieść kroplę sterylnego PBS na rogówkę, a następnie usunąć wszelkie oddzielone płaty nabłonka za pomocą miękkiej chusteczki do czyszczenia.Następnie usuń resztę nabłonka, jeśli pozostał. Obserwuj ogon myszy, aby upewnić się, że głębokość znieczulenia podczas operacji jest odpowiednia. Nanieś kroplę fluoresceiny sodowej na rogówkę.Po 30 sekundach oczyść rogówkę, a następnie zbadaj ją pod mikroskopem z filtrem kobaltowoniebieskim, aby zweryfikować całkowite usunięcie nabłonka. Po zakończeniu procedury umieść zwierzę w klatce na kocu grzewczym i obserwuj je przez 30-45 minut do czasu pełnego wybudzenia z narkozy. W międzyczasie nanieś do oka maść okulistyczną Erythromycin 1% i kontynuuj codzienne stosowanie antybiotyku przez tydzień.Dodatkowo, należy natychmiast wstrzyknąć podskórnie 0,1mg/kg Buprenorphine, a następnie powtórzyć dawkę 12 godzin po zabiegu i kontynuować iniekcje dwa razy dziennie przez dwa dni. Przedstawiony obraz ukazuje fenotyp rogówki miesiąc po zabiegu. Widoczna jest rozległa neowaskularyzacja, która jest cechą charakterystyczną dla niedoboru komórek macierzystych obrzeża rogówki.Prawidłowa rogówka wykazuje ekspresję Cytokeratyny 12, lecz jest pozbawiona Cytokeratyny 8 oraz komórek kubkowych. W niedoborze komórek macierzystych limbusa na rogówce pojawiają się Cytokeratyna 8 i komórki kubkowe, natomiast dochodzi do utraty Cytokeratyny 12. Po opanowaniu techniki ta doprowadzi do neowaskularyzacji rogówki, która w ciągu miesiąca obejmie niemal całą powierzchnię rogówki myszy i pozostanie stabilna do trzech miesięcy.Ważne jest, aby unikać ponownego szczotkowania tych obszarów rogówki, z których nabłonek został już usunięty. Może to spowodować niepożądaną zapalenie i zmętnienie stromy. Po wystąpieniu niedoboru komórek macierzystych limbusa można testować i porównywać eksperymentalne metody leczenia.Alternatywnie zabiegi można rozpocząć wkrótce po wystąpieniu urazu. W niniejszym filmie przedstawiono, jak skutecznie usunąć nabłonek limbalny i rogówkowy w celu wywołania niedoboru komórek macierzystych limba u myszy. Po wprowadzeniu pewnych modyfikacji procedurę tę można przeprowadzić również u innych zwierząt.

a-simple-mechanical-procedure-to-create-limbal-stem-cell-deficiency

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Opisano metodę propagacji ludzkich guzów siatkówczaka u myszy. Komórki nowotworowe są wstrzykiwane bezpośrednio do oczu myszy z niedoborem odporności. Guzy wtórne zostały pomyślnie wywołane z wykorzystaniem zarówno komórek pobranych bezpośrednio z ludzkich guzów, jak i hodowanych tumorsfer.

Ustanowienie i propagacja guzów retinoblastomy ludzkiej u myszy z niedoborem odporności

Niniejszy artykuł opisuje zoptymalizowaną sekwencję zdarzeń dla obrazowania multimodalnego przeszczepów komórkowych w mózgu gryzoni z wykorzystaniem: (i) bioluminescencji in vivo i obrazowania rezonansem magnetycznym oraz (ii) pośmiertnej analizy histologicznej. Połączenie tych metod obrazowania u jednego zwierzęcia pozwala na ocenę przeszczepów komórkowych z wysoką rozdzielczością, czułością i swoistością.

Multimodalne obrazowanie implantacji komórek macierzystych w ośrodkowym układzie nerwowym myszy

Wstrzyknięcie podsiatkówkowe to technika chirurgiczna służąca skutecznemu dostarczaniu genów do nabłonka barwnikowego siatkówki w oku myszy.  Tutaj opisujemy łatwą i powtarzalną metodę subretinalnego wstrzykiwania wektorów wirusowych do nabłonka barwnikowego siatkówki u myszy eksperymentalnych.

Podejście rąbkowe - podsiatkówkowe wstrzyknięcie wektorów wirusowych do terapii genowej u myszy Nabłonek barwnikowy siatkówki

W tym artykule opisujemy zasady projektowania i przeprowadzania wielokolorowego eksperymentu z wykorzystaniem myszy R26R-Confetti. Zapewniamy specjalny protokół śledzenia komórek nabłonka rogówki, który można modyfikować pod kątem innych interesujących tkanek.

Metoda śledzenia linii komórek rogówki przy użyciu wielokolorowych fluorescencyjnych myszy reporterowych

Ten protokół wprowadza prostą dwuetapową metodę różnicowania komórek macierzystych nabłonka rąbka rogówki od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w warunkach hodowli wolnej od kseno- i komórek karmiących. Przedstawione tu metody hodowli komórkowych umożliwiają opłacalną produkcję na dużą skalę komórek o jakości klinicznej, mających zastosowanie w terapii komórkami rogówki.

Wydajne i skalowalne ukierunkowane różnicowanie klinicznie kompatybilnych komórek macierzystych nabłonka rąbka rogówki od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten protokół przedstawia przezźrenicowe, sterowane widzeniem podejście przeztwardówkowe do bezpiecznego i precyzyjnego dostarczania przeszczepów komórkowych podsiatkówkowych, z niskim wskaźnikiem powikłań chirurgicznych, u myszy, biorców ze zwyrodnieniem siatkówki lub bez.

Przezźrenicowe przeszczepienie przeztwardówkowe przeszczepów podsiatkówkowych w mysim modelu zwyrodnienia siatkówki

Ten protokół opisuje metodę wywoływania dokładnego i powtarzalnego uszkodzenia rogówki i rąbków w modelu mysim. Protokół jest korzystny, ponieważ pozwala na równomierne rozłożenie uszkodzenia silnie zakrzywionej rogówki i rąbka myszy.

Indukcja alkaliów rogówki i rąbka za pomocą techniki stempla i trepanacji w modelu mysim

Tutaj prezentujemy protokół do izolacji i identyfikacji ludzkich komórek niszy rąbkowej.

Izolacja i identyfikacja komórek niszy rąbka ramiennego

Opisujemy szczegółowy protokół przygotowania komórek progenitorowych fotoreceptorów pochodzących z kriokonserwacji hESC oraz dostarczania tych komórek do tkanki podsiatkówkowej u myszy rd10.

Podsiatkówkowe dostarczanie progenitorów fotoreceptorów pochodzących z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych u myszy rd10

Opracowaliśmy szczurzy model ciężkiego zapalenia rogówki poprzez łyżeczkowanie nabłonka rogówki w połączeniu ze szwami rogówkowymi. W badaniu oceniano wzorce zapalenia rogówki, proliferację nabłonka i zmiany w rąbkowych komórkach macierzystych w stanach zapalnych.

Ustalenie modelu ciężkiego zapalenia rogówki u szczurów na podstawie łyżeczkowania nabłonka rogówki w połączeniu ze szwami rogówkowymi

Przedstawiamy tutaj protokół umożliwiający uzyskanie wysokiej jakości zawiesin pojedynczych komórek z całych rogówek myszy poprzez sekwencyjne trawienie kolagenazą A i trypsyną. Metoda ta daje żywotne pojedyncze komórki o wysokiej integralności RNA, co sprawia, że są kompatybilne z dalszymi zastosowaniami, takimi jak sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek czy cytometrprzepływowy y.

Protokół do pobierania zawiesiny jednokomórkowej z rogówek myszy

Poznaj technikę indukcji niedoboru rąbkowych komórek macierzystych u myszy bez dodatkowych uszkodzeń oka. Model ten umożliwia długoterminowe badania procesów chorobowych i testowanie nowych terapii w okulistyce.

Prosta mechaniczna procedura powodująca niedobór rąbkowych komórek macierzystych u myszy

Przeglądaj więcej filmów