Name: Wiarygodna metoda oceny kiełkowania, spoczynku i śmiertelności nasion w warunkach polowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Poznaj metodę oceny kiełkowania, spoczynku i śmiertelności nasion w warunkach polowych przy użyciu oznaczonych pasków nasiennych i testu tetrazolowego. Ta technika pozwala ilościowo badać dynamikę nasion w czasie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Program Grantowy Oceny Ryzyka Biotechnologicznego (Biotech Risk Assessment Grant Program) nr 2006-39454-17438 dla A. Snow, K. Mercera i H. Alexandra z Departamentu Rolnictwa Stanów Zjednoczonych, Narodowego Instytutu Żywności i Rolnictwa. Eksperymenty z wykorzystaniem tej metody zostały przeprowadzone i wspierane przez University of Kansas Field Station, jednostkę badawczą Kansas Biological Survey i University of Kansas. Autorzy pragną podziękować P. Jourdanowi i E. Regnierowi za pomocne recenzje wcześniejszych wersji tego manuskryptu. Ponadto praca ta została wsparta wkładem pracowników University of Kansas Field Station, Waterman Farm na Uniwersytecie Stanowym Ohio (OSU), Centrum Plazmy Zarodkowej Roślin Ozdobnych USDA w OSU oraz Laboratorium Biologii Nasion na Wydziale Ogrodnictwa i Nauk o Uprawach w OSU, zwłaszcza E. Renze, S. Stieve, A. Evans, oraz E. Grassbaugh za wsparcie techniczne.

1. Pozyskanie nasion od wielu gatunków lub z kontrolowanych krzyżówek jednego gatunku
Uwaga: W tym przykładzie wykorzystano nasiona z 15 typów krzyżówek w obrębie gatunku Helianthus annuus (słonecznik), stosując typy dzikie, hybrydowe i uprawne jako rodzica żenego (produkującego nasiona).
<ol>
	<li>Pod koniec sezonu wegetacyjnego zebrać dojrzałe główki nasienne do opisanych woreczków. Oczyścić nasiona z plew i umieścić je w kopertach opisanych typem krzyżowania rodziców w standardowym formacie (t.j. mateczny x ojcowiczny).</li>
	<li>Zgrupować nasiona w dużych kopertach, używając równych ilości nasion z tej samej liczby identycznych typów krzyżowania rodziców. Na przykład 10 nasion z 10 typów krzyżowania z tymi samymi rodzicami matecznymi i ojcowicznymi. Opisać koperty informacjami identyfikacyjnymi (typ krzyżowania). Te duże koperty stanowią zapasy nasion (seed masters) służące do wypełniania pasów zasiewu w Sekcji 2.</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="3">Rodzic żeński</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodzic ojciec</td>
			<td>Dziki: WxW</td>
			<td>F1WxC</td>
			<td>Kadrowanie: CxC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dziki: WxW</td>
			<td>0% WxW</td>
			<td>25% F1xW †</td>
			<td>50% CxW †</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BC: WxF1 lub F1xW</td>
			<td>12,5% WxBC</td>
			<td>37,5% F1xBC</td>
			<td>62,5% CxBC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F1WxC</td>
			<td>25% WxF1 †</td>
			<td>50% F1xF1</td>
			<td>75% CxF1 †</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F2F1xF1</td>
			<td>25% WxF2</td>
			<td>50% F1xF2</td>
			<td>75% CxF2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kadrowanie: CxC</td>
			<td>50% WxC †</td>
			<td>75% F1xC †</td>
			<td>10% CxC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Typy krzyżówek rodzicielskich uzyskane poprzez zapylanie ręczne. Typy krzyżówek hybryd uprawno-dzikich słonecznika zostały wytworzone poprzez zapylanie ręczne do wykorzystania w eksperymencie z zakopywaniem nasion. Dla wszystkich typów krzyżówek rodzic żeński wymieniony jest pierwszy, a rodzic męski drugi. Typy krzyżówek oznaczone znakiem † stanowią część recyprokalnych par krzyżówek o tym samym % alleli uprawnych, ale różnych rodzicach żeńskich. Tabela została wcześniej opublikowana w: Pace, B. A. et al. (2015)15.
2. Przygotowanie niestandardowych pasków do zasiewu nasion
UWAGA: W tym przykładzie zastosowano trzy warianty dat usunięcia oraz 15 powtórzeń, co wymagało łącznie 45 pasków. W tym przykładzie zastosowano 15 przegród na pasek, zatem wymagana była odpowiednia ilość drobnooczkowej tkaniny poliestrowej lub moskitiery do wykonania 15 przegród o wymiarach 7 x 10 cm. Patrz Rysunek 1.
<ol>
	<li>Zacznij od wycięcia paska tkaniny o wymiarach 20 x 105 cm dla każdego paska nasion.</li>
	<li>Odlicz i zaznacz przedziały, a następnie złóż tkaninę na pół. Używając pistoletu z klejem na gorąco, zaklej jeden krótki koniec (10 cm). Gdy klej lekko ostygnie, ale nie całkowicie, dociśnij brzegi tkaniny do siebie, aby stworzyć uszczelnienie. 
	UWAGA: Klej o wysokiej temperaturze oraz końcówki pistoletu do klejenia mogą spowodować oparzenia w przypadku przedłużonego kontaktu ze skórą.</li>
	<li>Nanieś linie kleju od złożonej krawędzi do otwartego krótkiego końca na każdym zaznaczonym przedziale. Dociśnij obie strony tkaniny wzdłuż linii kleju, aby zapewnić szczelność bez otworów między przedziałami. Migracja nasion między przedziałami prowadzi do błędów eksperymentalnych. 
	UWAGA: Po utworzeniu przedziałów niezłożona krawędź powinna pozostać otwarta i gotowa do wsypania nasion oraz dodania informacji identyfikacyjnych (nazwy typu krzyżówki).</li>
	<li>Losowo przypisz typy krzyżówek nasion do przedziałów dla każdego paska.
	<ol>
		<li>Wypełnij przedziały jednolitym numerem nasion (w tym przykładzie zastosowano 20 nasion na każdy przedział). Do etykietowania użyj przemysłowych markerów permanentnych na przyciętych do rozmiaru plastikowych palikach ogrodowych, aby były one odporne na zakopanie. 
		UWAGA: Można zastosować alternatywne metody etykietowania.</li>
		<li>Po wypełnieniu każdego przedziału nasionami i umieszczeniu etykiety, niezwłocznie zaklej przedział pistoletem z klejem na gorąco. Kontynuuj, aż cały pasek nasion zostanie całkowicie zaklejony. W pierwszym przedziale oznacz cały pasek informacjami o powtórzeniu, bloku i/lub wariancie badawczym. 
		UWAGA: W naszym badaniu, ze względu na czasowe usuwanie, bloki oraz paski powtórzeń w obrębie bloków, uwzględniliśmy wszystkie te informacje.</li>
		<li>Przed przejściem do następnego paska sprawdź, czy między przedziałami nie ma szczelin i w razie potrzeby uzupełnij klej punktowo.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Schemat krzyżówki genetycznej, metoda kwadratu Punnetta, kolorowy schemat dziedziczenia genów, narzędzie badawcze." src="/files/ftp_upload/54663/54663fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1. Schemat siewu w rzędach zakopanych. Przykład paska siewu przedstawiający identyfikację typów krzyżówek dla poszczególnych komórek. Rodzic żeński wymieniony jest jako pierwszy, a rodzic męski jako drugi. Kolory wskazują różne pochodzenie ze strony matki: żółty dla dzikiego, niebieski dla F11 hybryda, a czerwony dla kadrowania. <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54663/54663fig1large.jpg" target="_blank">Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
3. Zasiewanie pasków nasion w polu
<ol>
	<li>Wykop doły w działkach do określonej głębokości, aby umieścić w nich pasy. Przypisz pasy do poszczególnych bloków, w których pasy są rozmieszczone losowo, aby data usunięcia mogła służyć jako główna działka, a tożsamość przedziału (w tym przykładzie typ krzyżówki) jako poddziałka w analizie.</li>
	<li>Przykryj pasy ziemią. Dotnij metalową siatkę sprzętową tak, aby była o 10 cm większa od działek, i połóż ją nad zakopanymi pasami. Użyj szpilek w kształcie litery U do zabezpieczenia krawędzi i przykryj brzegi siatki ziemią. 
	UWAGA: To przykrycie służy do wykluczenia drapieżników nasion kopiących nory. Jako alternatywę Mercer et al.13 skonstruowali i zakopali skrzynki z siatki sprzętowej otaczające pasy nasion ze względu na silną presję ze strony sutków w ich lokalizacji terenowej.)</li>
	<li>Umieść kolorowe flagi geodezyjne, aby odróżnić lokalizację pasów oraz daty usunięcia, co będzie uzupełnieniem przejrzystych zapisów pisemnych.</li>
</ol>
4. Wykopanie pasów i ocena nasion
<ol>
	<li>Wykop paski nasion przypisane do danej daty usunięcia. Przechowuj paski w chłodnym i wilgotnym środowisku aż do momentu dostarczenia ich do laboratorium, w którym odbędzie się ocena nasion. Można to osiągnąć, owijając paski mokrym papierem gazetowym i umieszczając je w lodówce transportowej na czas transportu lub wysyłki nocnej.</li>
	<li>Płucz paski w wodzie, aby usunąć błoto i glebę, aż będą one wystarczająco czyste, by zanieczyszczenia zewnętrzne nie zasłaniały nasion.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek rozcinaj po jednej przegrodzie na raz. Policz wykiełkowane nasiona i usuń je. Policz nasiona ewidentnie martwe (np. gnijące lub zepsute). Umieść niewykiełkowane nasiona na oznakowanym, mokrym papierze filtracyjnym o rozmiarze płytki Petriego, aby dalej rozróżnić nasiona niewykiełkowane, uśpione i martwe.
	<ol>
		<li>Umieść płytki Petriego z niewykiełkowanymi nasionami w komorze wzrostu ustawionej na standardowe warunki kiełkowania: 25 °C /10 °C 12 godz. dzień/noc. Pozostaw nasiona na tydzień w celu wykiełkowania. Wszelkie nasiona, które wykiełkują, uznaj za żywotne, lecz niewykiełkowane, ponieważ nie wykiełkowały w warunkach polowych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po zabiegu w komorze wzrostu sprawdź żywotność pozostałych niewykiełkowanych nasion, używając chlorku tetrazoliu (TZ)13. Aby to zrobić, przygotuj roztwór TZ o stężeniu procentowym odpowiednim dla badanego gatunku, korzystając z podręcznika AOSA Tetrazolium Testing Handbook14. W niniejszym przykładzie zastosowano roztwór 1%.
	<ol>
		<li>Przeciąć niewykiełkowane nasiona na pół i umieścić jedną połowę, w której widoczny jest embrion i endosperm, w płytce Petriego zawierającej wystarczającą ilość roztworu TZ, aby przykryć nasiono (nasiona mogą pływać, jest to dopuszczalne).</li>
		<li>Umieść płytki Petriego z TZ w inkubatorze ustawionym na 30 °C i odczekaj 3 godz. Uwaga: Wyższe temperatury przyspieszą reakcję, jeśli jest to pożądane, jednak istnieje ryzyko nadmiernego wybarwienia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyjmij płytki Petriego z inkubatora i dokonaj oceny. Nasiona, których embriony wybarwiły się na czerwono, są zdolne do kiełkowania, natomiast nasiona niewybarwione są martwe. Szczegółowe informacje na temat rozróżniania przypadków granicznych i konkretnych gatunków znajdują się w podręczniku AOSA Tetrazolium Testing Handbook.</li>
</ol>

<ol><li>Walck, J. L., Baskin, J. M., Baskin, C. C., Hidayati, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+transient+and+persistent+seed+banks+in+species+with+pronounced+seasonal+dormancy+and+germination+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Seed+Sci+Res%22%5BJournal%5D)">Defining transient and persistent seed banks in species with pronounced seasonal dormancy and germination patterns.</a> Seed Sci Res. 15 (3), 189-196 (2005).</li>
<li>Alexander, H. A., Schrag, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+soil+seed+banks+and+newly+dispersed+seeds+in+population+dynamics+of+the+annual+sunflower.+Helianthus+annuus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ecol%22%5BJournal%5D)">Role of soil seed banks and newly dispersed seeds in population dynamics of the annual sunflower. Helianthus annuus.</a> J Ecol. 91, 987-998 (2003).</li>
<li>Burnside, O. C., Wilson, R. G., Weiseberg, S., Hubbard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seed+longevity+of+41+weed+species+buried+17+years+in+eastern+and+western%5BTitle%5D)+AND+%22Weed+Sci%22%5BJournal%5D)">Seed longevity of 41 weed species buried 17 years in eastern and western.</a> Weed Sci. 44 (1), 74-86 (1996).</li>
<li>Baskin, C. C., Baskin, J. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBaskin%2C+CC+%22Seeds%3A+Ecology%2C+biogeography%2C+and+evolution+of+dormancy+and+Germination%22">Seeds: Ecology, biogeography, and evolution of dormancy and Germination</a>. , Academic Press. San Diego, CA. (2001).</li>
<li>Finch-Savage, W. E., Leubner-Metzger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seed+dormancy+and+the+control+of+germination%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Seed dormancy and the control of germination.</a> New Phytol. 171, 501-523 (2006).</li>
<li>Baskin, J. M., Baskin, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+classification+system+for+seed+dormancy%5BTitle%5D)+AND+%22Seed+Sci+Res%22%5BJournal%5D)">A classification system for seed dormancy.</a> Seed Sci Res. 14 (1), 1-16 (2004).</li>
<li>Donohue, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+and+genetic+influences+on+the+germination+of+Arabidopsis+thaliana+in+the+field%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%22%5BJournal%5D)">Environmental and genetic influences on the germination of Arabidopsis thaliana in the field.</a> Evolution. 54 (4), 740-757 (2005).</li>
<li>Roach, D. A., Wulff, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+effects+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Ecol+Syst%22%5BJournal%5D)">Maternal effects in plants.</a> Ann Rev Ecol Syst. 18, 209-235 (1987).</li>
<li>Pace, B. A., Alexander, H. M., Emry, J. D., Mercer, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seed+fates+in+crop-wild+hybrid+sunflower%3A+crop+allele+and+maternal+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Evol+Appl%22%5BJournal%5D)">Seed fates in crop-wild hybrid sunflower: crop allele and maternal effects.</a> Evol Appl. 8 (2), 121-132 (2015).</li>
<li>Alexander, H. M., Emry, D. J., Pace, B. A., Kost, M. A., Sparks, K. A., Mercer, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+maternal+effects+and+nuclear+genetic+composition+change+across+the+life+cycle+of+crop-wild+hybrids%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Bot%22%5BJournal%5D)">Roles of maternal effects and nuclear genetic composition change across the life cycle of crop-wild hybrids.</a> Am J Bot. 101 (7), 1176-1188 (2014).</li>
<li>Stewart, N. C., Matthew, J., Halfhill, D., Warwick, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgene+introgression+from+genetically+modified+crops+into+their+wild+relatives%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Transgene introgression from genetically modified crops into their wild relatives.</a> Genetics. 4, 806-817 (2003).</li>
<li>Mercer, K. L., Shaw, R. G., Wyse, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+germination+of+diverse+crop-wild+hybrid+sunflower+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Ecol+Appl%22%5BJournal%5D)">Increased germination of diverse crop-wild hybrid sunflower seeds.</a> Ecol Appl. 16, 845-854 (2006).</li>
<li>Delouche, J. C., Still, T. W., Rapset, M., Lienhard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tetrazolium+test+for+seed+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Mississippi+Sta+Uni+Ag+Exp+Sta+Techn+Bull%22%5BJournal%5D)">The tetrazolium test for seed viability.</a> Mississippi Sta Uni Ag Exp Sta Techn Bull. 51, 1-63 (1962).</li>
<li>Association of Official Seed Analysts. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Tetrazolium+Testing+Handbook%22">Tetrazolium Testing Handbook</a>. , 653 Constitution Avenue NE, Washington, DC 20002, USA. (2010).</li>
<li>Alexander, H. M., Emry, D. J., Pace, B. A., Kost, M. A., Sparks, K. A., Mercer, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+maternal+effects+and+nuclear+genetic+composition+change+across+the+life+cycle+of+crop-wild+hybrids%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Bot%22%5BJournal%5D)">Roles of maternal effects and nuclear genetic composition change across the life cycle of crop-wild hybrids.</a> Am J Bot. 10 (7), 1176-1188 (2014).</li>
<li>Weiss, A. N., Primer, S. B., Pace, B. A., Mercer, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+effects+and+embryo+genetics%3A+germination+and+dormancy+of+crop-wild+sunflower+hybrids%5BTitle%5D)+AND+%22Seed+Sci+Res%22%5BJournal%5D)">Maternal effects and embryo genetics: germination and dormancy of crop-wild sunflower hybrids.</a> Seed Sci Res. 23, 241-255 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu przedstawiamy metody wykorzystania pasów do zakopywania nasion do obserwacji kiełkowania, spoczynku i śmiertelności różnych stad nasiennych w wybranych okresach czasu na polu. Zalety stosowania pasków zamiast pojedynczych pakietów polegają na (1) szybkości budowy pasków i przedziałów w porównaniu z tworzeniem pojedynczych pakietów; oraz (2) łatwość i szybkość wyjmowania wielu przegródek jednym ruchem bez niebezpieczeństwa pominięcia pakietu lub niezamierzonego usunięcia jednego. Ponieważ dwie daty usunięcia...

Ogólnym celem tej metody jest wiarygodna ocena przeżywalności nasion w czasie w warunkach polowych.
Banki nasion gleby to rezerwa rozproszonych, żywotnych, ale niekiełkujących nasion rozmieszczonych albo na powierzchni gleby, albo w ściółce powierzchniowej, albo w profilu glebowym, które mogą utrzymywać się przejściowo lub przez wiele lat1,2. Gdy w 17-letnim badaniu z udziałem kilkudziesięciu gatunków zastosowano metody zakopywania nasion podobne do przedstawionych tutaj, wwielu badanych gatunkach znaleziono żywotne nasiona. Spis nasion jest przeszkodą w kiełkowaniu nasion do momentu wystąpienia odpowiedniej kombinacji warunków dla przetrwania siewki4. Pozostawanie w stanie uśpienia może pozwolić nasionom przetrwać trudne warunki, takie jak niskie temperatury zimą, ograniczenie składników odżywczych lub sezonowa susza, dopóki zewnętrzny wyzwalacz uwalniania w stanie spoczynku nie pozwoli na kiełkowanie. Czynniki wywołujące uwolnienie w stanie spoczynku mogą być różne, od ekspozycji na długotrwałe zimno, związków pozostawionych przez ogień lub fizycznego ataku na okrywę nasienną poprzez ścieranie lub kontakt z kwasami żołądkowymi zwierząt5. Ponieważ sygnały kiełkowania mogą być specyficzne dla rodzajów lub gatunków i często wynikają z przeszłej selekcji naturalnej, nieadaptacyjne kiełkowanie nasion to takie, które zachodzi w nieodpowiednim czasie i może skutkować śmiertelnością nasion lub sadzonek lub słabym wzrostem siewek. Podczas gdy spoczynek został podzielony na wiele typów w oparciu o mechanizmy uwalniania spoczynku (np. spoczynek fizyczny, spoczynek fizjologiczny),6 spoczynek nasion pozostaje jednym z najmniej poznanych tematów w biologii roślin. W związku z tym badania terenowe, które pozwalają na ocenę stanu poszczególnych nasion lub grup nasion w odpowiednich warunkach ekologicznych, mają większą moc wyjaśniającą niż te, które opierają się po prostu na standardowych testach kiełkowania w laboratorium.
Wykorzystanie znanych cech nasion może dostarczyć informacji na temat mechanizmów spoczynku. Kontrola spoczynku nasion jest złożona, obejmuje genetyczną kontrolę czynników fizjologicznych i morfologicznych. Chociaż pełne zrozumienie zakresu mechanizmów uśpienia nie zostało jeszcze wyjaśnione, pojawił się ogólny model, obejmujący zależność sprzężenia zwrotnego między dwoma hormonami roślinnymi, kwasem giberelinowym (GA) i kwasem abscysynowym (ABA)7. W tym uogólnionym modelu dla nasion z fizjologicznym komponentem ich spoczynku, GA służy jako sygnał do uwolnienia w stanie spoczynku, podczas gdy ABA służy do utrzymania stanu uśpienia. Genetyczne skutki matki, jak również środowisko wzrostu matki, mogą wpływać na spoczynek i inne cechy nasion, takie jak wielkość, poprzez tkanki generowane przez matkę i sygnały rozwojowe8. Struktury zewnętrzne wytworzone przez matkę (lub okrywy nasienne) mogą utrzymywać stan spoczynku, czasami w połączeniu ze wskazówkami fizjologicznymi. Ponieważ okrywy nasienne pochodzące od matki są kontrolowane przez geny rośliny matecznej, mogą one nie odzwierciedlać rzeczywistego jądrowego składu genetycznego nasion. Użyliśmy niełupek Helianthus annuus z szeregu krzyżówek hybrydowych z dzikimi roślinami uprawnymi, aby wydobyć te genetyczne skutki matki i zarodka na cechy nasion9,10. W związku z tym projekty badań, które obejmują różne gatunki, typy krzyżówek lub genotypy, mogą zbierać informacje na temat ekologii i genetyki spoczynku, kiełkowania i przetrwania nasion.
Ważny przykład tego, jak fenotypy kiełkowania i przeżywalności nasion mogą wpływać na dynamikę populacji, można zobaczyć w strefach hybrydowych roślin uprawnych i dzikich. Selekcja podczas udomowienia roślin uprawnych eliminuje większość spoczynku i zmniejsza zdolność nasion do przetrwania poza sezonem wegetacyjnym. Jednak przepływ genów lub hybrydyzacja między typami uprawnymi i dzikimi w strefach hybrydowych roślin uprawnych i dzikich może ponownie wprowadzić allele roślin uprawnych (lub warianty genetyczne) do dzikiej populacji, co może mieć wpływ na dynamikę banku nasion. Hybrydy między krewnymi hodowlanymi i dzikimi, potencjalnie występujące w strefach hybrydowych roślin uprawnych i dzikich, mogą posiadać różne fenotypy pośredniego spoczynku, przy czym oczekuje się, że tylko kilka fenotypów przetrwa warunki poza uprawą (np. miesiące zimowe)11.
Celem tego manuskryptu jest pokazanie, w jaki sposób, korzystając z metody zakopywania nasion, możemy ocenić kiełkowanie, spoczynek i przeżywalność różnych typów nasion w różnych okresach czasu, aby zbadać ich naturalną zmienność w warunkach polowych. W naszym przykładzie zastosowaliśmy nasiona słonecznika z 15 krzyżówek hybrydowych roślin uprawnych i dziko żyjących, ponieważ interesuje nas genetyczny wpływ matki i zarodka na cechy nasion.

<table><tbody><tr><td>Małe koperty na monety</td><td>Dowolne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Duże koperty na monety</td><td>Dowolna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>moskitiera poliestrowa o drobnych oczkach</td><td>Dowolny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pistolet do kleju wysokotemperaturowego</td><td>Wszelkie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>wkłady w sztyfcie kleju wysokotemperaturowego</td><td>Dowolne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trwałe markery przemysłowe</td><td>Dowolna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>plastikowe etykiety ogrodowe</td><td>Dowolne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>nożyczki</td><td>Dowolna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>łopata</td><td>Dowolna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>metalowa siatka twarda tkanina</td><td>Dowolna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>flagi geodezyjne, wiele kolorów</td><td>Dowolna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mokra gazeta</td><td>Dowolna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>chłodnica</td><td>Dowolna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>bibuła bibułkowa</td><td>Dowolne</td> szalki Petriego Dowolna <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>temp. kontrolowana komora wzrostu</td><td>Dowolne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>żyletki</td><td>Dowolne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>szalki Petriego</td><td>Dowolny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>chlorek tetrazolu</td><td>Dowolna woda Dowolne</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ciepło inkubator</td><td>Dowolny</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wiarygodna metoda oceny kiełkowania, spoczynku i śmiertelności nasion w warunkach polowych

Reliable Method for Assessing Seed Germination, Dormancy, and Mortality under Field Conditions

Opisujemy techniki przybliżania dynamiki banku nasion w czasie, używając Helianthus annuus jako przykładowego gatunku badawczego. Paski przepuszczalnej tkaniny poliestrowej i kleju można składać i sklejać, aby utworzyć pasek przegródek, w których znajdują się nasiona i informacje identyfikacyjne, umożliwiając jednocześnie kontakt z odciekami glebowymi, wodą, mikroorganizmami i temperaturą otoczenia. Paski mogą być konstruowane z szerokim zakresem numerów i rozmiarów kompartmentów i pozwalają badaczowi na przechowywanie różnych genotypów w obrębie jednego gatunku, różnych gatunków lub nasion, które zostały poddane różnym zabiegom. W przeciwieństwie do pojedynczych pakietów nasion, paski są łatwiej pobierane jako jednostka. Podczas gdy pakiety replikacji mogą być zawarte w pasku, różne paski mogą działać jako bloki lub mogą być pobierane w różnym czasie w celu obserwacji zachowania nasion w czasie. Użyliśmy pistoletu do klejenia wysokotemperaturowego do wyznaczenia przegródek i uszczelnienia pasków po włożeniu nasion i znaczników identyfikujących blok i czas usuwania. Paski nasienne zostały następnie zakopane na polu na żądanej głębokości, z zaznaczonym miejscem do późniejszego usunięcia. Grzebiące w ziemi drapieżniki zostały skutecznie wyeliminowane dzięki zastosowaniu pokrycia z metalowej siatki na powierzchni gleby. Po wybranym przedziale czasu do pochówku wykopywano paski i oceniano nasiona pod kątem kiełkowania, spoczynku i śmiertelności. Podczas gdy wyraźnie martwe nasiona można często odróżnić od niekiełkujących żywych na oko, uśpione nasiona zostały ostatecznie zidentyfikowane za pomocą standardowego testu kolorymetrycznego chlorku tetrazolu pod kątem żywotności nasion.

Krzyżówki o zróżnicowanym pochodzeniu matczynym i różnym procencie alleli rośliny uprawnej (Tabela 1) wykazywały różnice w zależności od daty usunięcia w odniesieniu do procentu nasion wykiełkowanych, niewykiełkowanych oraz martwych (Rys. 2 i 3). Przeprowadzenie testu TZ niewykiełkowanych nasion pozwoliło stwierdzić obecność nasion rzeczywist게 dormantnych podczas drugiego usunięcia (wczesna wiosna) (Tabela 2), natomiast w...

Tutaj prezentujemy protokół oceny przeżywalności nasion, kiełkowania i spoczynku w warunkach polowych przy użyciu zakopanych, oznakowanych pasków nasion i testowania żywotności chlorku tetrazolu (TZ).

Wiarygodna metoda oceny kiełkowania, spoczynku i śmiertelności nasion w warunkach polowych

We describe techniques for approximating seed bank dynamics over time using Helianthus annuus as an example study species. Strips of permeable polyester ...

Ogólnym celem tej procedury jest bezpośrednia obserwacja i ilościowe określenie kiełkowania nasion, śmiertelności oraz stanu uśpienia w warunkach polowych w czasie. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu ekologii nasion, takie jak wpływ różnych gatunków lub ekotypów gatunków na liczbę siewek wnoszących wkład w populację następnej generacji lub liczbę poszczególnych nasion zasilających trwały bank nasion w glebie.Główną zaletą tej techniki jest możliwość łatwego zastosowania w terenie dowolnej liczby projektów doświadczalnych, gatunków, zabiegów lub dat usuwania, a następnie odzyskania ich jako kompletnych powtórzeń po tygodniach lub miesiącach zakopania. Na początek należy wyciąć pas tkaniny o wymiarach 20 x 105 cm dla każdego paska nasion. Za pomocą miary taśmowej należy wyznaczyć na pasku poszczególne przedziały.Złóż tkaninę na pół i za pomocą pistoletu do kleju na gorąco nałóż klej na jednym z krótszych końców. Pozostaw klej do lekkiego ostygnięcia, a następnie dociśnij obie strony do siebie, aby stworzyć uszczelnienie. Nałóż linie kleju wzdłuż oznaczeń każdej przegrody, od zagiętej krawędzi do otwartego krótkiego końca.Dociśnij dwie tkaninowe strony do siebie wzdłuż linii kleju, aby stworzyć uszczelnienia bez dziur między przegrodami. Przypisz losowo typy krzyżyków nasion do przegród dla każdego paska. Następnie odlicz i umieść jednolita liczba nasion w każdej przegrodzie.Używając plastikowego znacznika ogrodowego, opisz przegródkę typem nasion. Użyj pistoletu z klejem na gorąco, aby szczelnie zamknąć przegródkę. Postępuj wzdłuż paska, wypełniając, opisując i zamykając kolejne kieszonki na nasiona, aż cały pasek zostanie wypełniony i zabezpieczony.Przed kontynuacją należy sprawdzić, czy między przedziałami nie ma szczelin i w razie potrzeby nanieść klej. Aby przeprowadzić próby pochówku, najpierw należy wykopać doły o określonej głębokości, aby umieścić w nich paski zgodnie z planem doświadczalnym. Umieść paski z nasionami w ziemi i przykryj je glebą.Następnie należy wyciąć z metalnej siatki sprzętowej panel, który będzie o 10 cm większy z każdej strony niż zakopane działki z nasionami. Brzeg siatki należy uszczelnić glebą. Przykrycie to ma na celu wykluczenie drapieżników żerujących w glebie na nasionach.Na koniec w miejscu prób umieść kolorowe plastikowe etykiety, oznaczone datą usunięcia i zakodowane kolorami tak, aby uzupełniały zapisy pisemne. W wyznaczonym terminie usunięcia wykop nasiona badanego gatunku. Owiń paski mokrym papierem gazetowym, aby zachować ich wilgotność, a następnie umieść je w chłodziarce przeznaczonej do transportu.Po dotarciu do laboratorium opłucz paski wodą, aby usunąć zanieczyszczenia i resztki, aż nasiona staną się widoczne w komorach. Za pomocą nożyczek rozcinaj po jednej komorze na raz. Policz wszystkie wykiełkowane nasiona i wyjmij je.Policz i usuń wszystkie ewidentnie martwe nasiona. Na koniec zbierz wszystkie pozostałe nasiona, które nie wykiełkowały, i umieść je na oznakowanym, zwilżonym kawałku papieru filtracyjnego w szalce Petriego. Umieść szalki w komorze wzrostowej na jeden tydzień, aby umożliwić kiełkowanie.Zbadaj nasiona, a następnie zidentyfikuj i policz wszystkie, które wykiełkowały. Zapisz je jako żywotne, lecz niewykiełkowane, ponieważ nasiona te nie wykiełkowały w warunkach polowych. Pozostałe nasiona przetnij na pół, aby sprawdzić ich żywotność za pomocą chlorku tetrazolu.Umieść jedną połowę w czarce Petriego w taki sposób, aby zarodek i endosperm były widoczne. Dodaj odpowiednią ilość chlorku tetrazolium, aby przykryć połowy nasion. Wstaw czarkę do inkubatora ustawionego na 30 °C na trzy godziny.Na koniec należy ocenić połówki nasion. Nasiona wykazujące czerwone barwienie zarodka są zdolne do kiełkowania, natomiast nasiona niezbarwione są martwe. Wykres ten przedstawia kiełkowanie dzikich krzyżówek upraw słonecznika w pierwszej dacie usuwania po zakopaniu późną jesienią.Typy krzyżówek zostały uporządkowane według rosnącego procentowego udziału alleli rośliny uprawnej, a dla każdego krzyżowania wskazano rodzica żeńskiego. Generalnie niższy procent alleli rośliny uprawnej ograniczał nieadaptacyjne kiełkowanie pod koniec jesieni. W momencie usuwania nasion wczesną wiosną wszystkie genotypy wykazały wysoki stopień kiełkowania, jednak znacząco różniły się liczbą nasion niewykiełkowanych lub martwych.W szczególności krzyżówki z rodzicielstwem macierzystym rośliny uprawnej wykazywały wyższą śmiertelność, podczas gdy krzyżówki z rodzicielstwem macierzystym dzikim częściej pozostawały niewykiełkowane. Do wiosny odnotowano spadek kiełkowania dla niektórych typów krzyżówek. Prawdopodobnie wynika to ze śmiertelności nasion w pasach zakopania w przypadku krzyżówek kiełkujących wcześniej.W związku z tym śmiertelność była wyższa w przypadku krzyżówek bardziej przypominających rośliny uprawne, otrzymanych z matek będących roślinami uprawnymi. Po opanowaniu ta technika może zostać przygotowana w ciągu kilku godzin, w zależności od projektu. Ocena pasków zazwyczaj zajmuje zaledwie kilka minut na jedną partię, plus czas przebywania w komorze wzrostowej i inkubacja w teście TZ. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że jedynie nasiona, które przeszły przez komorę wzrostową i w których następnie stwierdzono żywotność za pomocą testu TZ, można uznać za prawdziwie uśpione.Nasiona, które wykiełkowały w komorze wzrostu, uznaje się za niewykiełkowane. Po przeprowadzeniu tej procedury można równolegle zastosować inne metody, takie jak badania siewek, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład czy przeżywalność nasion przekłada się na ich wschody i ukończenie cyklu życiowego. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dokładną wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić ocenę terenową kiełkowania, śmiertelności i stanu spoczynku nasion.Należy pamiętać, że chlorek tetrazolium jest substancją drażniącą, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy zachować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek.

reliable-method-for-assessing-seed-germination-dormancy-mortality

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Szkodliwość grzybów infekujących nasiona w uprawach zbóż skłoniła do licznych wysiłków badawczych mających na celu lepsze zrozumienie interakcji między rośliną a patogenem. Aby badać interakcje nasion z grzybami w warunkach laboratoryjnych, opracowaliśmy niezawodną metodę ilościowego określania reprodukcji grzybów, biomasy oraz skażenia mikotoksynami przy użyciu bioassayów na ziarnach.

Ilościowe określanie kolonizacji grzybowej, sporogenezy i produkcji mikotoksyn z wykorzystaniem biotestów na ziarnach kukurydzy

Ten film demonstruje test hamowania wzrostu siewek w roślinie Arabidopsis thaliana. Określa się wpływ zwiększonego stężenia elicytora peptydów immunologicznych na wzrost siewek.

Pomiar indukowanego przez układ odpornościowy zahamowania wzrostu siewek

Przedstawiamy procedurę składania testu na ściółkę nasienną (SCBA) z nasion Arabidopsis thaliana. Wykazano, że aparat oddechowy jest potężnym narzędziem do genetycznego i in vitro, w jaki sposób bielmo kontroluje kiełkowanie nasion w uśpionych nasionach i w odpowiedzi na sygnały świetlne. Aparat oddechowy ma zasadniczo zastosowanie w każdej sytuacji, w której podejrzewa się, że bielmo wpływa na wzrost zarodka.

Test ściółki nasiennej do genetycznego zbadania in vitro, w jaki sposób bielmo kontroluje kiełkowanie nasion u Arabidopsis thaliana

Przedstawiono solidne i elastyczne podejście do potwierdzania odporności na herbicydy w populacjach chwastów. Protokół ten pozwala na określenie poziomów odporności na herbicydy i zastosowanie ich do szerokiej gamy gatunków chwastów i herbicydów z niewielkimi dostosowaniami.

Protokoły solidnych testów odporności na herbicydy u różnych gatunków chwastów

Celem tego badania było określenie wpływu sterylizacji wybielaczem i chlorem gazowym na kiełkowanie nasion szeregu genotypów Arabidopsis uprawianych na sterylnych podłożach. Opracowano zoptymalizowane protokoły sterylizacji, aby zapobiec rozwojowi zanieczyszczeń mikrobiologicznych, zapewniając jednocześnie zadowalającą przeżywalność nasion.

Standaryzowana metoda wysokoprzepustowej sterylizacji nasion rzodkiewnika

Grzyby smutku powodują wiele niszczycielskich chorób rolniczych. Są rozproszone jako uśpione teliospory, które kiełkują w odpowiedzi na sygnały środowiskowe. Przedstawiamy dwie metody badania zmian molekularnych podczas kiełkowania: pomiar wzrostu oddychania w celu wykrycia aktywacji metabolicznej i ocenę zmieniających się zdarzeń molekularnych poprzez izolację teliospory na różnych etapach morfologicznych.

Badanie kiełkowania teliosporu za pomocą analizy mikrooddychania i mikrodysekcji

Udostępniamy metodę identyfikacji modulatorów transpiracji dolistnej poprzez zakrojone na szeroką skalę badania przesiewowe biblioteki złożonej.

Identyfikacja nowych regulatorów transpiracji roślin za pomocą wielkoskalowych badań termowizyjnych u Helianthus annuus

To badanie przedstawia metodologie badania patomorfologicznych i molekularnych mechanizmów leżących u podstaw interakcji ciecierzyca – Rhizoctonia bataticola. Metoda bibuły jest przydatna do szybkiego badania reakcji genotypu ciecierzycy, podczas gdy metoda oparta na chorej doniczce może być stosowana do jednoczesnego nakładania suszy i infekcji R. bataticola oraz badania przesiewowego pod kątem tolerancyjnych genotypów.

Testy suchej zgnilizny korzeni ciecierzycy: szczegółowa metodologia

Dostępny jest protokół o wysokiej przepustowości do powierzchniowej sterylizacji nasion Arabidopsisthaliana (Arabidopsis), optymalizujący etapy obsługi cieczy za pomocą prostego urządzenia ssącego zbudowanego z pompą próżniową. Setki próbek nasion można wysterylizować powierzchniowo w ciągu jednego dnia.

Wysokowydajna, wytrzymała i bardzo elastyczna w czasie metoda powierzchniowej sterylizacji nasion rzodkiewnika

Ten protokół ma na celu dostarczenie szczegółowych procedur zbierania, utrwalania i utrzymywania próbek roślin mykoheterotroficznych, stosując różne techniki mikroskopowe, takie jak skaningowa i transmisyjna mikroskopia elektronowa, mikroskopia świetlna, konfokalna i fluorescencyjna do badania kolonizacji grzybów w tkankach roślinnych i nasionach kiełkujących z grzybami mikoryzowymi.

Techniki mikroskopowe interpretacji kolonizacji grzybów w tkankach roślin mykoheterotroficznych i symbiotycznego kiełkowania nasion

Poznaj metodę oceny kiełkowania, spoczynku i śmiertelności nasion w warunkach polowych przy użyciu oznaczonych pasków nasiennych i testu tetrazolowego. Ta technika pozwala ilościowo badać dynamikę nasion w czasie.

Wiarygodna metoda oceny kiełkowania, spoczynku i śmiertelności nasion w warunkach polowych

Przeglądaj więcej filmów