Narzędzia do badania roli architektonicznego białka HMGB1 w przetwarzaniu zniekształcających helisę, specyficznych dla miejsca wiązań międzyniciowych DNA

Ogólnym celem eksperymentów ze zmodyfikowaną immunoprecypitacją chromatyny i superzwijaniem DNA jest zbadanie związku i późniejszych modyfikacji topologicznych indukowanych przez białka architektoniczne na specyficzne dla miejsca uszkodzenie DNA wywołane przez chemioterapeutyk lub czynniki rakotwórcze w komórkach ludzkich. Metodologia ta pozwoli nam odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące uszkodzeń i naprawy DNA, co powinno ułatwić odkrycie nowych celów farmakologicznych w terapii nowotworów. Nasza technologia pozwala nam kierować specyficznymi uszkodzeniami DNA i ułatwia ocenę krytycznych procesów naprawy DNA istotnych dla ludzkiego raka.

Na początek, 24 godziny przed transfekcją, połóż 400 000 komórek ssaków na 60-milimetrowej szalce w DMEM uzupełnionym 10% FBS bez antybiotyków. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez noc. W 14-mililitrowej probówce z okrągłym dnem połącz 30 mikrolitrów środka transfekcyjnego o temperaturze pokojowej z 500 mikrolitrami pożywki wzrostowej 1X, która została podgrzana do 37 stopni Celsjusza.

W drugiej probówce połącz dwa mikrogramy plazmidów zawierających ICL skierowanych do TFO w 500 mikrolitrach pożywki wzrostowej 1X. Inkubować probówki w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Połącz mieszankę jedną z mieszanką drugą i pipetuj w górę iw dół, aby dokładnie wymieszać.

Następnie inkubuj roztwór w temperaturze pokojowej przez 25 do 30 minut. Następnie użyj ciepłego PBS, aby dwukrotnie umyć komórki. Następnie dodaj mieszankę transfekcyjną kroplami, rozprowadzając roztwór równomiernie na płytce komórek.

Dodaj jeden mililitr pożywki wzrostowej do płytki i doprowadź końcową objętość do dwóch mililitrów. Dobrze wymieszaj i umieść płytki hodowlane w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Cztery godziny później zastąp pożywkę trzema mililitrami pożywki wzrostowej z 10% FBS i inkubuj przez dodatkowe 16 godzin.

Po inkubacji dodaj do komórek 80 mikrolitrów świeżego 37% formaldehydu na płytkę i inkubuj w temperaturze pokojowej w ciemności przez 10 minut. Ugasić sieciowanie formaldehydu, dodając 300 mikrolitrów schłodzonej glicyny na płytkę i inkubować przez pięć minut. Następnie usuń pożywkę i użyj schłodzonego PBS, aby dwukrotnie umyć płytki.

Następnie, po dodaniu jednego milimetra schłodzonego PBS, zbierz komórki, zeskrobując je do probówki mikrowirówki na lodzie, utrzymując próbki na lodzie przez cały czas. Przygotuj granulki komórkowe, wirując w temperaturze 13, 400 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Następnie usuń supernatant i umieść granulki na lodzie.

Użyj jednego mililitra schłodzonego buforu A, aby jednorodnie ponownie zawiesić granulki i inkubować na lodzie przez 10 minut. Następnie opluj komórki jak poprzednio. Teraz, z jednym mililitrem schłodzonego buforu B, jednorodnie ponownie zawiesić granulki i inkubować na lodzie przez 10 minut, od czasu do czasu mieszając przez odwrócenie.

Następnie peletki komórek jak poprzednio. Po ponownym zawieszeniu komórek, w 200 mikrolitrach schłodzonego buforu B, dodaj dwa mikrolitry nukleazy mikrokokowej lub MNazy i inkubuj reakcję w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie zatrzymaj reakcję MNazy, umieszczając probówki na lodzie i dodając 40 milimolowy EDTA.

Poziom trawienia przez nukleazę mikrokokową jest bardzo krytyczny, ponieważ nadmierne trawienie może powodować utratę sygnału, podczas gdy niedożywienie może powodować dużo niespecyficznego tła. Po zagnieżdżeniu komórek ponownie zawiesić granulki w 100 mikrolitrach immunoprecypitacji chromatyny lub buforu ChIP, uzupełnionego koktajlem inhibitorów proteazy. Następnie przenieś zawiesinę komórkową do cienkościennej probówki mikrowirówkowej.

Próbki należy poddać sonifikacji, unosząc je na sonikatorze łaźni wodnej przez 20 sekund, a następnie 20 sekund na lodzie. Powtórz kroki sonikacji dziewięć razy, aby wygenerować około 800 do 1 200 fragmentów par zasad. Do 20 mikrolitrów sonikowanych próbek dodaj trzy mikrolitry pięciomolowego chlorku sodu i jeden mikrolitr RNazy A. Odwiruj probówki i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut.

Następnie dodaj dwa mikrolitry proteinazy K i inkubuj w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Po oczyszczeniu próbek, zgodnie z protokołem tekstowym, uruchom je na 1% żelu agarozowym i uwidocznij bromkiem etydyny. W trzech oddzielnych, wstępnie schłodzonych silikonowanych probówkach dodaj 30 mikrolitrów lizatu i 70 mikrolitrów schłodzonego buforu 1X ChIP z dodatkiem inhibitorów proteazy.

Dodaj jeden mikrogram przeciwciał anty-IgG, antyhistonowych H3 lub anty-HMGB1 do odpowiednich probówek. Inkubować przez noc w chłodnym pomieszczeniu z ciągłą rotacją. W chłodni, po ponownym zawieszeniu kulek białka G, dodaj cztery mikrolitry kulek do każdej probówki reakcyjnej i inkubuj w zimnym pomieszczeniu z rotacją przez kolejne dwie do czterech godzin.

Umieść probówki na stojaku magnetycznym, aby granulować kulki i usuń supernatant. Dodaj 200 mikrolitrów buforu 1X ChIP z koktajlem inhibitorów proteazy do granulek i umyj na zimno z rotacją przez pięć minut. Następnie, z buforem 1X ChIP o wysokiej zawartości soli, wykonaj dodatkowe płukanie.

Następnie użyj 160 mikrolitrów buforu elucyjnego, aby ponownie zawiesić osady i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z rotacją przez 30 minut. Zwiń kulki i zbierz supernatant do świeżej probówki. Dodaj sześć mikrolitrów pięciomolowego chlorku sodu i dwa mikrolitry proteinazy K i inkubuj przez noc w temperaturze 65 stopni Celsjusza.

Po oczyszczeniu DNA, zgodnie z protokołem tekstowym, należy przeprowadzić reakcje PCR przy użyciu zestawów starterów do regionu lub regionów zainteresowania i rozpuścić produkty na 1% żelu agarozowym, barwionym bromkiem etydyny. Przed użyciem rozmrozić wcześniej przygotowany bufor syntezy naprawy DNA na lodzie i dodać 40 milimolowych fosfokreatyn oraz 2,5 mikrograma fosfokinazy kreatyny. Po przygotowaniu 10-krotnego buforu superzwijającego, zgodnie z protokołem tekstowym, użyj jednego mikrolitra topoizomerazy krowianki 1 z buforem superzwijającym 1X w reakcji 10 mikrolitrów, aby zlinearyzować 300 nanogramów superskręconego plazmidu, PCA FG1.

Do zrelaksowanych plazmidów dodaj 25 mikrolitrów świeżo rozmrożonego ekstraktu z komórek HeLa i bufor syntezy DNA. Dobrze wymieszaj, a następnie dodaj jeden mikrolitr topoizomerazy krowianki 1 do reakcji i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Zakończ reakcje, dodając 1% SDS i 0,25 miligrama na mililitr proteinazy K i inkubuj w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez dwie godziny.

Po odlaniu 1% żelu agarozowego z buforem 1X TPE, dodaj barwnik obciążający DNA do reakcji i załaduj próbki bezpośrednio na żel w odległości co najmniej czterech pasów od siebie. Uruchom żel przez osiem do 10 godzin przy dwóch woltach na centymetr w 1X TBE dla pierwszego wymiaru w temperaturze pokojowej, aby rozpuścić topoizomery. Przygotuj dwa litry 1X TBE z trzema mikrogramami na mililitr fosforanu chlorochiny.

Namocz żel w 200 mililitrach roztworu, przykryty folią aluminiową na 20 minut. Aby poddać żel elektroforezie w drugim wymiarze, obróć żel o 90 stopni w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara i uruchom go na cztery do sześciu godzin przy napięciu dwóch woltów na centymetr w chlorochinie zawierającej 1X TBE, aby rozdzielić dodatnie i ujemne supercewki. Ilość chlorochiny w buforze do elektroforezy i w żelu jest bardzo krytyczna, podobnie jak uruchamianie żelu przy bardzo niskim napięciu dla drugiego wymiaru, co jest bardzo krytyczne dla oddzielenia dodatnich i ujemnych superzwojów.

Po zabarwieniu i odbarwieniu żelu, zgodnie z protokołem tekstowym, należy użyć imagera, aby zobrazować termodystrybucję topoizomerów. Jak widać w tym żelu, około 79% plazmidów zawierających ICL skierowane do TFO migruje z wolniejszą ruchliwością przez matrycę żelu agarozowego w porównaniu z nieusieciowanymi plazmidami kontrolnymi. Testy ChIP przeprowadzone na lizatach z ludzkich komórek U2OS transfekowanych plazmidem kontrolnym lub plazmidami zawierającymi ICL skierowane do TFO wykazują wzbogacenie HMGB1 w regionie P-ICL w porównaniu z regionem kontrolnym, gdy immunoprecypitacja przeciwciałem anty-HMGB1.

Kiedy HMGB1 został usunięty z komórek poprzez leczenie siRNA, wzbogacenie specyficzne dla P-ICL zostało zmniejszone. Gdy te same próbki poddano immunoprecypitacji przy użyciu przeciwciała anty-IgG, wykryto minimalną amplifikację PCR. Wreszcie, na tym rysunku, dwuwymiarowa elektroforeza w żelu agarozowym demonstruje modyfikację architektoniczną plazmidów zawierających ICL skierowanych do TFO jako ujemne superzwijanie przez HMGB1 w ekstraktach komórek HeLa.

Po opanowaniu tę technikę można wykonać w ciągu około pięciu dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, bardzo ważne jest, aby pamiętać, że wszystkie prania powinny być wykonywane w chłodni, ponieważ pranie w temperaturze pokojowej może zwiększyć sygnał tła. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak zubożenie białka za pośrednictwem siRNA, a następnie testy przesiewowe mutacji, aby odpowiedzieć na pytania, takie jak: czy białko będące przedmiotem zainteresowania bierze udział w naprawie DNA?

A może znacząco zmienia widma mutacji podczas tego procesu? Technika ta utorowała drogę do badania związku między białkami a uszkodzeniami DNA specyficznymi dla danego miejsca. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobry pomysł na to, jak badać asocjację białek architektonicznych w celu celowania w wiązania krzyżowe DNA, a następnie określić wpływ takiej asocjacji na topologię DNA.

Nie zapominaj, że praca z bromkiem etydyny może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tego eksperymentu należy zawsze nosić odpowiedni sprzęt ochronny.