Name: Narzędzia do badania roli architektonicznego białka HMGB1 w przetwarzaniu zniekształcających helisę, specyficznych dla miejsca wiązań międzyniciowych DNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Poznaj zmodyfikowane metody ChIP i analizy superzwirowania DNA do badania roli białka HMGB1 w uszkodzeniach DNA w komórkach ludzkich. Technika ta umożliwia identyfikację nowych celów farmakologicznych w terapii nowotworowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować członkom laboratorium Vasquez za pomocne dyskusje. Prace te były wspierane przez National Institutes of Health/National Cancer Institute [CA097175, CA093279 do K.M.V.]; oraz Instytut Profilaktyki i Badań nad Rakiem w Teksasie [RP101501]. Finansowanie opłaty za otwarty dostęp: National Institutes of Health/National Cancer Institute [CA093279 do K.M.V.].

1. Przygotowanie ICL skierowanych TFO na substratach plazmidowych
<ol>
	<li>Inkubować równomolowe ilości plazmidowego DNA pSupFG110,11 (5 μg plazmidowego DNA jest dobrym punktem wyjścia) z TFO AG30 sprzężonym z psoralenem w 8 μl potrójnego buforu wiążącego [50% glicerolu, 10 mM Tris (pH 7,6), 10 mM MgCl2] i dH2O do końcowej objętości 40 μl w bursztynowej probówce. Dokładnie wymieszać, pipetując w górę i w dół. Inkubować reakcję w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 12 godzin.</li>
	<li>Rozgrzej lampę UVA, aby zapewnić pełną moc wyjściową. Umieścić reakcję triplex na folii parafinowej i umieścić folię parafinową na lodzie pod lampą UVA (365 nM). Umieść filtr Mylar między lampą a reakcją.</li>
	<li>Naświetlanie promieniowaniem UVA w dawce całkowitej 1,8 J/cm2. Próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C do dalszego wykorzystania. 
	Ostrzeżenie: Nosić odpowiednie okulary i odzież ochronną z promieniowaniem UVA.</li>
	<li>Linearyzować 200 ng wyżej przygotowanego plazmidu enzymem restrykcyjnym EcoR1 w całkowitej objętości 20 μl, korzystając z dostarczonego przez producenta 10-krotnego buforu. Denaturacja enzymu na gorąco przez 20 minut w temperaturze 65 °C. Próbki należy wirować przez 10 minut w temperaturze 10 000 x g i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotować 50x bufor alkaliczny [1,5 M NaOH, 50 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)]. Dodać 0,5 mg agarozy do 50 ml dH2O. Zagotować do rozpuszczenia agarozy i umieścić ją w łaźni wodnej o temperaturze 50 °C.</li>
	<li>Gdy temperatura rozpuszczonej agarozy spadnie do 50 °C, dodaj 1 ml 50x buforu alkalicznego, wymieszaj, a następnie wlej żel do tacki na żel. Przed użyciem odczekaj czas, aż żel stężeje w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodać 4 μl 0,5 M EDTA do 20 μl zlinearyzowanej próbki DNA i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodać 6x alkaliczny bufor ładujący żel (300 mM NaOH, 6 mM EDTA, 18% (w/v) polisacharydu o wysokiej masie cząsteczkowej, 0,06% zieleni bromokrezolowej w dH2O) do próbek i do drabinki DNA 1 kb. 
	UWAGA: Ważne jest, aby używać 6x bufora ładującego żel alkaliczny, zobacz dyskusję.</li>
	<li>Załaduj próbki do żelu w chłodni i uruchom przez noc w 1x buforze alkalicznym (12-16 godzin) przy napięciu 3,2 V na cm. Gdy próbki dostaną się do żelu, umieść szklaną płytkę na żelu, aby zapobiec jego unoszeniu się na wodzie.</li>
	<li>Zneutralizować próbki, mocząc żel w buforze neutralizacyjnym [1 M Tris-Cl (pH 7,6), 1,5 M NaCl, 3 M octan sodu (pH 5,2)] przez 45 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wybarwić żel do DNA 4 μl 1% bromku etydyny (EtBr) w 50 ml wody przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Odplamić wodą przez 15 min. Wizualizacja DNA za pomocą systemu obrazowania. 
	Uwaga: EtBr jest silnym mutagenem i może być wchłaniany przez skórę. Unikaj bezpośredniego kontaktu z EtBr.</li>
</ol>
2. Transfekcja i immunoprecypitacja plazmidów zawierających ICL kierowanych TFO w komórkach ludzkich
<ol>
	<li>Płytka 400 000 komórek ssaków (np. komórek kostniakomięsaka U2OS) na 60 mm szalka w zmodyfikowanym pożywce Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) bez antybiotyków na 24 godziny przed transfekcją. Inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
	<li>Przed transfekcją ciepłe podłoża wzrostowe i sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) do temperatury 37 °C w łaźni wodnej. Ogrzej odczynnik do transfekcji do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Inkubować 30 μl odczynnika do transfekcji z 500 μl 1x pożywki wzrostowej (mix 1) i 2 μg plazmidów zawierających ICL skierowanych TFO w 500 μl 1x pożywki wzrostowej (mix 2) w oddzielnych probówkach okrągłodennych o pojemności 14 ml przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodaj mieszankę 1 do mieszanki 2, dobrze wymieszaj, pipetując w górę iw dół. Inkubować przez 25-30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyj komórki dwukrotnie ciepłym PBS. Dodaj mieszankę do transfekcji kroplami, równomiernie rozprowadzając na płytce komórek. Dodać 1 ml pożywki wzrostowej do płytki i doprowadzić końcową objętość do 2 ml. Dobrze wymieszaj. Umieścić płytki hodowlane w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 na 4 godziny.</li>
	<li>Zastąp pożywkę 3 ml pożywki wzrostowej uzupełnionej 10% FBS i kontynuuj inkubację przez 16 godzin. Nie należy stosować antybiotyków.</li>
	<li>Potraktuj komórki 80 μl 37% świeżego formaldehydu na płytkę do końcowego stężenia około 1% i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej przy braku światła. 
	Uwaga: Formaldehyd jest toksyczny i należy obchodzić się z nim zgodnie z instrukcjami bezpieczeństwa. Narażenie na formaldehyd może powodować szkody dla skóry, oczu i dróg oddechowych.</li>
	<li>Usieciowanie formaldehydu należy ugasić, dodając 300 μl schłodzonej glicyny (dostarczanej w dostępnych na rynku zestawach) na płytkę i inkubując przez 5 minut. Usunąć pożywkę i przemyć dwukrotnie schłodzonym PBS, a następnie zebrać komórki, zeskrobując 1 ml schłodzonego (4 °C) PBS do probówki mikrowirówkowej. Próbki należy zawsze przechowywać na lodzie.</li>
	<li>Przygotować granulki komórkowe przez odwirowanie w temperaturze 4 °C przez 5 minut przy 13 400 x g przy użyciu wirówki stołowej z chłodzeniem. Odpipetować supernatant i umieścić osad komórkowy na lodzie.</li>
	<li>Jednorodnie zawiesić osad w 1 ml schłodzonego (4 °C) buforu A (dostarczanym w dostępnych na rynku zestawach) i inkubować na lodzie przez 10 minut. Mieszać od czasu do czasu, odwracając probówkę. Ogniwa peletowe jak poprzednio (patrz krok 2.9 powyżej).</li>
	<li>Jednorodnie zawiesić osad w 1 ml schłodzonego (4 °C) buforu B (dostarczanym w dostępnych na rynku zestawach) i inkubować na lodzie przez 10 minut, od czasu do czasu mieszając przez odwrócenie. Osadzanie komórek przez odwirowanie jak poprzednio (patrz krok 2.9 powyżej).</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 200 μl schłodzonego buforu B. Dodać 2 μl nukleazy mikrokokowej (MNazy) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Od czasu do czasu mieszać reakcję, przesuwając probówkę. Zatrzymaj reakcję MNazy, umieszczając probówkę na lodzie i dodając 40 mM EDTA. Ogniwa peletowe jak poprzednio (patrz krok 2.9 powyżej).</li>
	<li>Zawieś komórki w 100 μl 1x buforze buforu immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) (dostarczanym w dostępnych na rynku zestawach) uzupełnionym koktajlem inhibitorów proteazy.</li>
	<li>Umieść zawieszone komórki w cienkościennej probówce do mikrofuge. Sonikować próbki, unosząc je na sonikatorze w łaźni wodnej przez 20 sekund, a następnie inkubując przez 20 sekund na lodzie. Powtórz kroki sonikacji 9 razy, aby wygenerować fragmenty o wartości ~800-1,200 pz.
	<ol>
		<li>Do 20 μl sonizowanych próbek dodać 3 μl 5 M NaCl i 1 μl RNazy A. Dobrze wymieszać przez wirowanie i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 min. Następnie dodać 2 μl proteinazy K i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 65 °C. Oczyścić próbki za pomocą zestawu do oczyszczania PCR. Uruchom próbki na 1% żelu agarozowym i wizualizuj za pomocą EtBr. 
		UWAGA: Maksymalna intensywność otrzymanego DNA powinna wynosić 1,000 pz lub mniej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W trzech oddzielnych probówkach dodaj 30 μl lizatu do wstępnie schłodzonej silikonowanej probówki, a następnie dodaj 70 μl schłodzonego buforu 1x ChIP z dodatkiem inhibitorów proteazy. Dodać 1 μg przeciwciał antyimmunoglobuliny G (IgG), antyhistonu H3 (jako kontrola pozytywna) lub przeciwciał anty-HMGB1 do odpowiednich probówek. Inkubować przez noc w chłodnym pomieszczeniu z ciągłą rotacją.</li>
	<li>Zawiesić kulki białka G równomiernie w chłodni. Dodać 4 μl kulek białka G do probówki i inkubować przez kolejne 2-4 godziny w chłodni z rotacją.</li>
	<li>Za pomocą stojaka magnetycznego obierz kulki i usuń supernatant. Dodać 200 μl 1x bufor ChIP zmieszany z koktajlem inhibitorów proteazy do granulatu i myć przez 5 minut w chłodni z rotacją. Powtórz pranie dwa razy.</li>
	<li>Wykonaj jedno dodatkowe przemycie 1x buforem ChIP o wysokiej zawartości soli (zawierającym 70 mM NaCl).</li>
	<li>Zawiesić osady za pomocą buforu elucyjnego o pojemności 160 μl (dostarczanego w dostępnych na rynku zestawach) i inkubować w temperaturze 37 °C z rotacją przez 30 minut.</li>
	<li>Granuluj kulki i zbierz supernatant do świeżej probówki. Dodać 6 μl 5 M NaCl i 2 μl proteinazy K i inkubować przez noc w temperaturze 65 °C.</li>
	<li>Oczyść DNA za pomocą zestawu do oczyszczania produktu PCR i eluuj DNA za pomocą 50 μl dH2O.</li>
	<li>Przeprowadzić reakcje PCR16 przy użyciu zestawów starterów do obszaru (regionów) zainteresowania i rozpuścić produkty na 1% żelu agarozowym barwionym EtBr.</li>
</ol>
3. Test superzwijania i 2-wymiarowa elektroforeza w żelu agarozowym
<ol>
	<li>Przygotować bufor do syntezy naprawy DNA (45 mM Hepes-KOH, pH 7,8; 70 mM KCl; 7,4 mM MgCl2; 0,9 mM DTT; 0,4 mM EDTA; 2 mM ATP, 20 μM dNTPs, 3,4% glicerolu i 18 μg albuminy surowicy bydlęcej). Przechowywać w temperaturze -80 °C. Rozmrozić na lodzie i przed użyciem dodać 40 mM fosfokreatyny i 2,5 μg fosfokinazy kreatyny.</li>
	<li>Przygotuj 10x bufor supercoiling [500 mM Tris (pH 8,0), 500 mM NaCl, 25 mM MgCl2, 1 mM EDTA] i przechowuj w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Linearyzuj 300 ng superskręconego plazmidowego DNA pSupFG1 całkowicie przy użyciu 1 μl topoizomerazy krowianki I (5-15 U / μl) z 1x buforem superzwijającym w reakcji 10 μl. Inkubować mieszaninę w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Rozmrozić bezkomórkowy ekstraktHeLa 24 na lodzie. Do całkowicie zrelaksowanych plazmidów dodaj 25 μl bezkomórkowego ekstraktu HeLa i bufor syntezy naprawy DNA. Dobrze wymieszaj. Dodać dodatkowo 1 μl topoizomerazy krowianki I do mieszanki i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Zakończ reakcje, dodając dodecylosiarczan sodu (SDS) (1% stężenie końcowe) i proteinazę K (stężenie końcowe 0,25 mg/ml). Inkubować w temperaturze 65 °C przez 2 godziny.</li>
	<li>Odlej 1% żel agarozowy z 1x buforem Tris Borate EDTA (TBE). Dodaj barwnik ładujący DNA i załaduj reakcje bezpośrednio na żel w odległości co najmniej 4 pasów od siebie. Uruchom żel przez 8-10 godzin przy 2 V/cm w 1x TBE (wymiar 1) w temperaturze pokojowej, aby rozpuścić topoizomery. 
	UWAGA: Przygotować 5 x roztwór podstawowy TBE w 1 L dH2O, dodając 54 g zasady Tris. 27,5 g kwasu borowego i 20 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0).</li>
	<li>Przygotować 2 l 1x TBE z 3 μg/ml fosforanu chlorochiny. Namocz żel w 200 ml tego roztworu przez 20 minut. Przykryj tackę na żel folią aluminiową.</li>
	<li>Aby elektroforezować żel w drugim wymiarze, obróć żel o 90° w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara i uruchom go na 4-6 godzin przy 2 V/cm w chlorochinie zawierającej 1x TBE, aby rozdzielić dodatnie i ujemne supercewki.</li>
	<li>Zabarwić żel EtBr przez 1 godzinę na bujaku. Odbarwić żel za pomocądH2O przez 15 minut, a następnie zobrazować rozkład termiczny topoizomerów za pomocą imagera.</li>
</ol>

<ol><li>Moser, H. E., Dervan, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-specific+cleavage+of+double+helical+DNA+by+triple+helix+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sequence-specific cleavage of double helical DNA by triple helix formation.</a> Science. 238, 645-650 (1987).</li>
<li>Cooney, M., Czernuszewicz, G., Postel, E. H., Flint, S. J., Hogan, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+oligonucleotide+binding+represses+transcription+of+the+human+c-myc+gene+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Site-specific oligonucleotide binding represses transcription of the human c-myc gene in vitro.</a> Science. 241, 456-459 (1988).</li>
<li>Beal, P. A., Dervan, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second+structural+motif+for+recognition+of+DNA+by+oligonucleotide-directed+triple-helix+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Second structural motif for recognition of DNA by oligonucleotide-directed triple-helix formation.</a> Science. 251, 1360-1363 (1991).</li>
<li>Vasquez, K. M., Dagle, J. M., Weeks, D. L., Glazer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+targeting+at+short+polypurine+sites+by+cationic+triplex-forming+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Chromosome targeting at short polypurine sites by cationic triplex-forming oligonucleotides.</a> J Biol Chem. 276, 38536-38541 (2001).</li>
<li>Vasquez, K. M., Christensen, J., Li, L., Finch, R. A., Glazer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+XPA+and+RPA+DNA+repair+proteins+participate+in+specific+recognition+of+triplex-induced+helical+distortions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Human XPA and RPA DNA repair proteins participate in specific recognition of triplex-induced helical distortions.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 5848-5853 (2002).</li>
<li>Mukherjee, A., Vasquez, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triplex+technology+in+studies+of+DNA+damage%2C+DNA+repair%2C+and+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Triplex technology in studies of DNA damage, DNA repair, and mutagenesis.</a> Biochimie. 93, 1197-1208 (2011).</li>
<li>Chin, J. Y., Glazer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+DNA+lesions+associated+with+triplex-forming+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Carcinog%22%5BJournal%5D)">Repair of DNA lesions associated with triplex-forming oligonucleotides.</a> Mol Carcinog. 48, 389-399 (2009).</li>
<li>Seidman, M. M., Glazer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+for+gene+repair+via+triple+helix+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">The potential for gene repair via triple helix formation.</a> J Clin Invest. 112, 487-494 (2003).</li>
<li>Vasquez, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+and+processing+of+site-specific+DNA+interstrand+crosslinks%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Mol+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Targeting and processing of site-specific DNA interstrand crosslinks.</a> Environ Mol Mutagen. 51, 527-539 (2010).</li>
<li>Wang, G., Levy, D. D., Seidman, M. M., Glazer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+mutagenesis+in+mammalian+cells+mediated+by+intracellular+triple+helix+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Targeted mutagenesis in mammalian cells mediated by intracellular triple helix formation.</a> Mol Cell Biol. 15, 1759-1768 (1995).</li>
<li>Wang, G., Seidman, M. M., Glazer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenesis+in+mammalian+cells+induced+by+triple+helix+formation+and+transcription-coupled+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mutagenesis in mammalian cells induced by triple helix formation and transcription-coupled repair.</a> Science. 271, 802-805 (1996).</li>
<li>Chen, Z., Xu, X. S., Yang, J., Wang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+function+of+XPC+protein+in+psoralen+and+cisplatin-mediated+DNA+repair+and+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Defining the function of XPC protein in psoralen and cisplatin-mediated DNA repair and mutagenesis.</a> Carcinogenesis. 24, 1111-1121 (2003).</li>
<li>Derheimer, F. A., Hicks, J. K., Paulsen, M. T., Canman, C. E., Ljungman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psoralen-induced+DNA+interstrand+cross-links+block+transcription+and+induce+p53+in+an+ataxia-telangiectasia+and+rad3-related-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Psoralen-induced DNA interstrand cross-links block transcription and induce p53 in an ataxia-telangiectasia and rad3-related-dependent manner.</a> Mol Pharmacol. 75, 599-607 (2009).</li>
<li>Vare, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+interstrand+crosslinks+induce+a+potent+replication+block+followed+by+formation+and+repair+of+double+strand+breaks+in+intact+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+repair%22%5BJournal%5D)">DNA interstrand crosslinks induce a potent replication block followed by formation and repair of double strand breaks in intact mammalian cells.</a> DNA repair. 11, 976-985 (2012).</li>
<li>Huang, Y., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+crosslinking+damage+and+cancer+-+a+tale+of+friend+and+foe%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">DNA crosslinking damage and cancer - a tale of friend and foe.</a> Transl Cancer Res. 2, 144-154 (2013).</li>
<li>Mukherjee, A., Vasquez, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HMGB1+interacts+with+XPA+to+facilitate+the+processing+of+DNA+interstrand+crosslinks+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">HMGB1 interacts with XPA to facilitate the processing of DNA interstrand crosslinks in human cells.</a> Nucleic Acids Res. 44, 1151-1160 (2016).</li>
<li>Bidney, D. L., Reeck, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+from+cultured+hepatoma+cells+of+two+nonhistone+chromatin+proteins+with+preferential+affinity+for+single-stranded+DNA%3A+apparent+analogy+with+calf+thymus+HMG+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Purification from cultured hepatoma cells of two nonhistone chromatin proteins with preferential affinity for single-stranded DNA: apparent analogy with calf thymus HMG proteins.</a> Biochem Biophys Res Commun. 85, 1211-1218 (1978).</li>
<li>Bianchi, M. E., Beltrame, M., Paonessa, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+recognition+of+cruciform+DNA+by+nuclear+protein+HMG1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Specific recognition of cruciform DNA by nuclear protein HMG1.</a> Science. 243, 1056-1059 (1989).</li>
<li>Jung, Y., Lippard, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nature+of+full-length+HMGB1+binding+to+cisplatin-modified+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Nature of full-length HMGB1 binding to cisplatin-modified DNA.</a> Biochemistry. 42, 2664-2671 (2003).</li>
<li>Reddy, M. C., Christensen, J., Vasquez, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+human+high+mobility+group+protein+1+and+replication+protein+A+on+psoralen-cross-linked+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Interplay between human high mobility group protein 1 and replication protein A on psoralen-cross-linked DNA.</a> Biochemistry. 44, 4188-4195 (2005).</li>
<li>Das, D., Scovell, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+binding+interaction+of+HMG-1+with+the+TATA-binding+protein%2FTATA+complex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The binding interaction of HMG-1 with the TATA-binding protein/TATA complex.</a> J Biol Chem. 276, 32597-32605 (2001).</li>
<li>Little, A. J., Corbett, E., Ortega, F., Schatz, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+recruitment+of+HMGB1+during+V%28D%29J+recombination+through+interactions+with+RAG1+and+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Cooperative recruitment of HMGB1 during V(D)J recombination through interactions with RAG1 and DNA.</a> Nucleic Acids Res. 41, 3289-3301 (2013).</li>
<li>Lange, S. S., Mitchell, D. L., Vasquez, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+mobility+group+protein+B1+enhances+DNA+repair+and+chromatin+modification+after+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">High mobility group protein B1 enhances DNA repair and chromatin modification after DNA damage.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 10320-10325 (2008).</li>
<li>Lange, S. S., Reddy, M. C., Vasquez, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+HMGB1+directly+facilitates+interactions+between+nucleotide+excision+repair+proteins+on+triplex-directed+psoralen+interstrand+crosslinks%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+repair%22%5BJournal%5D)">Human HMGB1 directly facilitates interactions between nucleotide excision repair proteins on triplex-directed psoralen interstrand crosslinks.</a> DNA repair. 8, 865-872 (2009).</li>
<li>Park, J. Y., Ahn, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+DNA+topology+on+plasmid+DNA+repair+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letters%22%5BJournal%5D)">Effect of DNA topology on plasmid DNA repair in vivo.</a> FEBS letters. , 174-178 (2000).</li>
<li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-affinity+triplex-forming+oligonucleotide+target+sequences+in+mammalian+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Carcinog%22%5BJournal%5D)">High-affinity triplex-forming oligonucleotide target sequences in mammalian genomes.</a> Mol Carcinog. 46, 15-23 (2007).</li>
<li>Sheflin, L. G., Spaulding, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+mobility+group+protein+1+preferentially+conserves+torsion+in+negatively+supercoiled+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">High mobility group protein 1 preferentially conserves torsion in negatively supercoiled DNA.</a> Biochemistry. 28, 5658-5664 (1989).</li>
<li>Betous, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+TLS+DNA+polymerases+eta+and+kappa+in+processing+naturally+occurring+structured+DNA+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Carcinog%22%5BJournal%5D)">Role of TLS DNA polymerases eta and kappa in processing naturally occurring structured DNA in human cells.</a> Mol Carcinog. 48, 369-378 (2009).</li>
<li>Luo, Z., Macris, M. A., Faruqi, A. F., Glazer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+intrachromosomal+gene+conversion+induced+by+triplex-forming+oligonucleotides+microinjected+into+mouse+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">High-frequency intrachromosomal gene conversion induced by triplex-forming oligonucleotides microinjected into mouse cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 9003-9008 (2000).</li>
<li>Vasquez, K. M., Wang, G., Havre, P. A., Glazer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+mutations+induced+by+triplex-forming+oligonucleotides+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Chromosomal mutations induced by triplex-forming oligonucleotides in mammalian cells.</a> Nucleic Acids Res. 27, 1176-1181 (1999).</li>
<li>Puri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimum+number+of+2%27-O-%282-aminoethyl%29+residues+required+for+gene+knockout+activity+by+triple+helix+forming+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Minimum number of 2'-O-(2-aminoethyl) residues required for gene knockout activity by triple helix forming oligonucleotides.</a> Biochemistry. 41, 7716-7724 (2002).</li>
<li>Christensen, L. A., Finch, R. A., Booker, A. J., Vasquez, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+oncogenes+to+improve+breast+cancer+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Targeting oncogenes to improve breast cancer chemotherapy.</a> Cancer Res. 66, 4089-4094 (2006).</li>
<li>Boulware, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triplex-forming+oligonucleotides+targeting+c-MYC+potentiate+the+anti-tumor+activity+of+gemcitabine+in+a+mouse+model+of+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Carcinog%22%5BJournal%5D)">Triplex-forming oligonucleotides targeting c-MYC potentiate the anti-tumor activity of gemcitabine in a mouse model of human cancer.</a> Mol Carcinog. 53, 744-752 (2014).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Skuteczne tworzenie ICL skierowanych do TFO zależy od dwóch kluczowych czynników: po pierwsze, odpowiednich składników buforowych (np. MgCl2) i czasu inkubacji TFO z docelowym substratem DNA (w zależności od powinowactwa wiązania TFO do docelowego dupleksu i zastosowanych stężeń); a po drugie, odpowiednia dawka promieniowania UVA (365 nm) w celu skutecznego tworzenia wiązań krzyżowych psoralenu. Optymalne tworzenie triplex można osiągnąć za pomocą HPLC lub oczyszczonych żelem TFO. Zanieczyszczenia zan...

Oligonukleotydy tworzące tripleksy (TFO) wiążą DNA dupleksowe w sposób specyficzny dla sekwencji poprzez wiązanie Hoogsteena z wodorem, tworząc struktury potrójnej helisy1-5. Technologia Triplex została wykorzystana do badania różnych mechanizmów biomolekularnych, takich jak transkrypcja, naprawa uszkodzeń DNA i celowanie w geny (omówione w bibliograficznychźródłach 6-8). TFO były szeroko stosowane do indukowania specyficznych dla miejsca uszkodzeń plazmidów reporterowych9,10. Nasze laboratorium i inne wcześniej używały TFO, AG30, połączonego z cząsteczką psoralenu w celu indukowania specyficznych dla miejsca wiązań międzyniciowych DNA (ICL) w genie supF na plazmidzie pSupFG15,10-12. ICL są wysoce cytotoksyczne, ponieważ zmiany te kowalencyjnie sieciują dwie nici DNA, a jeśli nie zostaną naprawione, mogą blokować transkrypcję genów i utrudniać maszynerię replikacji DNA13,14. Ze względu na ich potencjał cytotoksyczny, środki indukujące ICL są stosowane jako leki chemioterapeutyczne w leczeniu raka i innych chorób15. Jednak przetwarzanie i naprawa ICL w komórkach ludzkich nie jest dobrze poznana. W związku z tym lepsze zrozumienie mechanizmów związanych z przetwarzaniem ICL w komórkach ludzkich może pomóc w poprawie skuteczności schematów chemioterapeutycznych opartych na ICL. ICL indukowane przez TFO i ich produkty pośrednie naprawy mogą potencjalnie powodować znaczne zniekształcenia strukturalne helisy DNA. Takie zniekształcenia są prawdopodobnym celem dla białek architektonicznych, które wiążą się ze zniekształconym DNA z większym powinowactwem niż do kanonicznego dupleksowego DNA w formie B16-20. Tutaj badaliśmy związek bardzo obfitego białka architektonicznego, HMGB1 z ICL w komórkach ludzkich za pomocą testów immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) na plazmidach usieciowanych psoralenem i zidentyfikowaliśmy rolę HMGB1 w modulowaniu topologii DNA plazmidu usieciowanego psoralenem w ludzkich lizatach komórek rakowych.
HMGB1 to bardzo obfite i wszechobecne w ekspresji niehistonowe białko architektoniczne, które wiąże się z uszkodzonym DNA i alternatywnie ustrukturyzowanymi substratami DNA o wyższym powinowactwie niż kanoniczne DNA w formie B17-20. HMGB1 bierze udział w kilku procesach metabolicznych DNA, takich jak transkrypcja, replikacja DNA i naprawa DNA16,21-23. Wcześniej wykazaliśmy, że HMGB1 wiąże się z ICL skierowanymi na TFO in vitro z wysokim powinowactwem20. Ponadto wykazaliśmy, że brak HMGB1 zwiększył mutagenne przetwarzanie ICL skierowanych do TFO i zidentyfikowaliśmy HMGB1 jako kofaktor naprawy przez wycinanie nukleotydów (NER)23,24. Ostatnio odkryliśmy, że HMGB1 jest związany z ICL skierowanymi przez TFO w komórkach ludzkich, a jego rekrutacja do takich zmian zależy od białka NER, XPA16. Wykazano, że ujemne superzwijanie DNA sprzyja skutecznemu usuwaniu zmian w DNA przez NER25 i odkryliśmy, że HMGB1 indukuje ujemne superzwijanie preferencyjnie na skierowanych do TFO substratach plazmidowych zawierających ICL (w stosunku do substratów plazmidów nieuszkodzonych)16, zapewniając lepsze zrozumienie potencjalnej roli (ról) HMGB1 jako kofaktora NER. Przetwarzanie ICL w komórkach ludzkich nie jest w pełni zrozumiałe; w związku z tym techniki i testy opracowane w oparciu o narzędzia molekularne opisane w niniejszym dokumencie mogą prowadzić do identyfikacji dodatkowych białek zaangażowanych w naprawę ICL, które z kolei mogą służyć jako cele farmakologiczne, które można wykorzystać do poprawy skuteczności schematów chemioterapii raka.
Tutaj omówiono skuteczne podejście do oceny efektywności formowania ICL kierowanego przez TFO w plazmidowym DNA poprzez denaturację elektroforezy w żelu agarozowym. Ponadto, wykorzystując plazmidy zawierające ICL skierowane przez TFO, opisano techniki określania związku HMGB1 z plazmidami uszkodzonymi przez ICL w kontekście komórkowym przy użyciu zmodyfikowanych testów ChIP. Ponadto ustalono łatwą metodę badania modyfikacji topologicznych wprowadzanych przez białko architektoniczne HMGB1, w szczególności na uszkodzonych przez ICL substratach plazmidowych w lizatach komórek ludzkich, przeprowadzając testy superzwijania za pomocą dwuwymiarowej elektroforezy w żelu agarozowym. Opisane techniki mogą być wykorzystane do pogłębienia wiedzy na temat udziału białek naprawczych i architektonicznych DNA w przetwarzaniu ukierunkowanych uszkodzeń DNA na plazmidach w komórkach ludzkich.
Opisujemy szczegółowe protokoły tworzenia specyficznych dla miejsca PSORALEN ICL na plazmidowym DNA, a następnie plazmidowe testy ChIP i supercoilingu w celu identyfikacji białek, które wiążą się ze zmianami chorobowymi, oraz białek, które zmieniają topologię DNA. Testy te można modyfikować tak, aby działały z innymi czynnikami uszkadzającymi DNA, TFO, substratami plazmidowymi i interesującymi liniami komórkowymi ssaków. W rzeczywistości wykazaliśmy, że istnieje co najmniej jedno potencjalne unikalne i wysoce powinowactwo do wiązania TFO w każdym opisanym genie w ludzkim genomie26. Jednak dla jasności opisaliśmy te techniki użycia specyficznego TFO sprzężonego z psoralenem (pAG30) na specyficznym plazmidzie reporterowym mutacji (pSupFG1) w ludzkich komórkach U2OS, jak zastosowaliśmy w Mukherjee i Vasquez, 201616.

<table><tbody><tr><td>5'HMT Psoralen-AG30</td><td>Midland Certified Reagent Co., Midland, TX</td><td>Na zamówienie HPLC</td><td>(lub żel) oczyszczony</td></tr><tr><td>prosty zestaw chromatyny enzymatycznej ChIP</td> IP <td>Signaling Inc.</td><td>9003</td><td>Sugerowany przez producenta protokół jest zoptymalizowany pod kątem IP chromatyny, a nie dla IP plazmidu. Kontrolne przeciwciała IgG i H3, a także kulki białka G i nukleaza mikrokokkowa są dostarczane przez producenta.</td></tr><tr><td>GoTaq Green</td><td>Promega</td><td>M7122</td><td>PCR master mix</td></tr><tr><td>Przeciwciało HMGB1</td><td>Abcam</td><td>Ab18256</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Gel i zestaw do czyszczenia PCR</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr><tr><td>Sól difosforanowa chlorochiny</td><td>Sigma</td><td>C6628-50G</td><td>Do dwuwymiarowej elektroforezy w żelu agarozowym</td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0101S</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji GenePORTER</td><td>Genlantis</td><td>T201015</td><td></td></tr><tr><td>Vaccinia Topoisomerase I</td><td>Invitrogen</td><td>38042-024</td><td></td></tr><tr><td>Długofalowa lampa ultrafioletowa Blak-Ray</td><td>Upland, CA</td><td>B 100 AP</td><td>Lampa UVA</td></tr><tr><td>EpiSonic Multi-Functional Bioprocessor 1100 Epigentek</td><td></td><td>EQC-1100</td><td>Sonikator do kąpieli wodnej</td></tr><tr><td>Filtr Mylar</td><td>GE Healthcare Nauki przyrodnicze</td><td></td><td></td>80112939</tr><tr><td>Agaroza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6111</td><td></td></tr><tr><td>BIO-RAD Chemidoc</td><td>System BIO-RAD</td><td>XRS+</td><td>System obrazowania DNA</td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-500</td><td></td></tr><tr><td>37% Formaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775-25ML</td><td>Służy do sieciowania&nbsp;</td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>New England Biolabs</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>11965092</td><td>Pożywki do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>70013073</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA</td><td>ThermoFisher</td><td>25200056</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Bromokrazol zielony</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114-359</td><td>Barwnik ładujący DNA</td></tr><tr><td>Rurki silikonowane</td><td>Fisher Naukowy&nbsp;</td><td>02-681-320</td><td>Rurka do mikrofugi o niskiej retencji</td></tr><tr><td>Podstawa Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>Kwas borowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>A74-1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific BP24731</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fotometr</td><td>InternationalLight Technologies</td><td>ILT1400-A</td><td>Pomiar dawki UVA</td></tr><tr><td><silny>Linie komórkowe</silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kostniakomięsak ludzki U2OS</td><td>ATCC</td><td>ATCC HTB-96</td><td>Hodowany według dostawcy rekomendacja</td></tr><tr><td>Ludzki gruczolakorak szyjki macicy HeLa</td><td>ATCC</td><td>ATCC-CCL-2</td><td>Hodowany według dostawcy s rekomendacja</td></tr><tr><td>Proksymalny starter do przodu</td><td>5&prime;-gcc ccc ctg acg agc atc ac</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proksymalny starter odwrotny</td><td>5&prime;-tag tta ccg gat aag gcg cag cgg</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dystalny starter do przodu</td><td>5&prime;-aat acc gcg cca cat agc Ag</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dystalny podkład odwrotny</td><td>5&prime;-agt att caa cat ttc cgt gtc gcc</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

narzędzia do badania roli architektonicznego białka hmgb1 w przetwarzaniu zniekształcających helisę, specyficznych dla miejsca wiązań międzyniciowych dna

Tools to Study the Role of Architectural Protein HMGB1 in the Processing of Helix Distorting, Site-specific DNA Interstrand Crosslinks

Białko HMGB1 o wysokiej mobilności jest białkiem o architekturze niehistonowej, które bierze udział w regulacji wielu ważnych funkcji w genomie, takich jak transkrypcja, replikacja DNA i naprawa DNA. HMGB1 wiąże się ze strukturalnie zniekształconym DNA z większym powinowactwem niż do kanonicznego B-DNA. Na przykład odkryliśmy, że HMGB1 wiąże się z wiązaniami krzyżowymi międzyniciowymi DNA (ICL), które kowalencyjnie łączą dwie nici DNA, powodują zniekształcenie helisy, a jeśli nie zostaną naprawione, mogą spowodować śmierć komórki. Ze względu na ich potencjał cytotoksyczny, kilka środków indukujących ICL jest obecnie stosowanych jako środki chemioterapeutyczne w klinice. Podczas gdy czynniki tworzące ICL wykazują preferencje dla pewnych sekwencji zasad (np. 5'-TA-3' jest preferowanym miejscem sieciowania dla psoralenu), w dużej mierze indukują uszkodzenia DNA w sposób bezkrytyczny. Jednak poprzez kowalencyjne sprzężenie czynnika indukującego ICL z oligonukleotydem tworzącym triplex (TFO), który wiąże się z DNA w sposób specyficzny dla sekwencji, można osiągnąć celowe uszkodzenie DNA. Tutaj używamy TFO kowalencyjnie sprzężonego na końcu 5' z psoralem 4'-hydroksymetylo-4,5',8-trimetylopsoralenu (HMT) do wygenerowania specyficznego dla miejsca ICL na plazmidzie reporterowym mutacji do wykorzystania jako narzędzie do badania modyfikacji architektonicznej, przetwarzania i naprawy złożonych zmian DNA przez HMGB1 w komórkach ludzkich. Opisujemy techniki eksperymentalne do przygotowania ICL skierowanych przez TFO na plazmidach reporterowych oraz do badania związku HMGB1 z ICL skierowanymi na TFO w kontekście komórkowym za pomocą testów immunoprecypitacji chromatyny. Ponadto opisujemy testy superzwijania DNA w celu oceny specyficznej modyfikacji architektonicznej uszkodzonego DNA poprzez pomiar ilości zwojów superhelisów wprowadzonych na plazmid usieciowany psoralenem przez HMGB1. Techniki te mogą być wykorzystane do badania ról innych białek biorących udział w przetwarzaniu i naprawie ICL kierowanych przez TFO lub innych ukierunkowanych uszkodzeń DNA w dowolnej linii komórkowej będącej przedmiotem zainteresowania.

Powstawanie ICL kierowanego przez TFO jest kluczowe dla testów opartych na plazmidach, które są wykorzystywane do badania roli białek architektonicznych w przetwarzaniu ICL w komórkach ludzkich. Denaturująca elektroforeza w żelu agarozowym jest prostym sposobem określenia wydajności tworzenia ICL kierowanego przez TFO. Plazmidy zawierające ICL kierowane przez TFO wykazują wolniejszą mobilność podczas migracji przez macierz żelu agarozowego (Rycina 1A, ścieżka 3) w porówna...

Ukierunkowane uszkodzenie DNA można osiągnąć poprzez przywiązanie czynnika uszkadzającego DNA do oligonukleotydu tworzącego triplex (TFO). Za pomocą zmodyfikowanych TFO, asocjacji białek specyficznych dla uszkodzenia DNA i modyfikacji topologii DNA można badać w komórkach ludzkich poprzez wykorzystanie zmodyfikowanych testów immunoprecypitacji chromatyny i testów superzwijania DNA opisanych w niniejszym dokumencie.

Narzędzia do badania roli architektonicznego białka HMGB1 w przetwarzaniu zniekształcających helisę, specyficznych dla miejsca wiązań międzyniciowych DNA

High mobility group box 1 (HMGB1) protein is a non-histone architectural protein that is involved in regulating many important functions in the genome, ...

Ogólnym celem zmodyfikowanych eksperymentów z immunoprecypitacji chromatyny oraz superzwijania DNA jest zbadanie asocjacji i następujących po niej modyfikacji topologicznych indukowanych przez białka architektoniczne w obrębie specyficznych dla danego miejsca uszkodzeń DNA wywołanych przez czynniki chemioterapeutyczne lub kancerogenne w komórkach ludzkich. Metodologia ta pozwoli nam odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące uszkodzeń i naprawy DNA, co powinno ułatwić odkrycie nowych celów farmakologicznych w terapii nowotworów. Nasza technologia umożliwia ukierunkowane wywołanie specyficznych dla danego miejsca uszkodzeń DNA i ułatwia ocenę krytycznych procesów naprawy DNA istotnych w kontekście nowotworów u ludzi.Na początek, 24 godziny przed transfekcją, wysiej 400 000 komórek ssaczych na szalkę 60 mm w medium DMEM uzupełnionym o 10% FBS bez antybiotyków. Inkubuj komórki w temperaturze 37°C i przy 5% CO2 przez noc. W 14-ml probówce z rundenym dnem połącz 30 µL odczynnika do transfekcji w temperaturze pokojowej z 500 µL medium wzrostowego 1X ogrzanego do 37°C.W drugiej probówce połączyć 2 µg plazmidów zawierających ICL skierowanych przez TFO w 500 µL pożywki wzrostowej 1X. Inkubować probówki w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Połączyć mieszaninę pierwszą z mieszaniną drugą, a następnie kilkukrotnie pipetować w górę i w dół w celu dokładnego wymieszania.Następnie inkubuj roztwór w temperaturze pokojowej przez 25 do 30 minut. Potem dwukrotnie przemyj komórki ciepłym PBS. Następnie dodawaj mieszaninę do transfekcji kroplami, rozprowadzając roztwór równomiernie po całej płytce z komórkami.Dodaj jeden mililitr pożywki wzrostowej do płytki i doprowadź końcową objętość do dwóch mililitrów. Wymieszaj dokładnie, a następnie umieść płytki z kulturą w temperaturze 37°C i 5% CO2. Po czterech godzinach zastąp pożywkę trzema mililitrami pożywki wzrostowej z 10% FBS i inkubuj przez kolejne 16 godzin.Po inkubacji do komórek na każdą płytkę należy dodać 80 µL świeżej 37% formaldehydu i inkubować w temperaturze pokojowej w ciemności przez 10 minut. Przerwać sieciowanie formaldehydem, dodając 300 µL schłodzonej glicyny na płytkę, i inkubować przez pięć minut. Następnie należy usunąć medium i dwukrotnie przemyć płytki schłodzonym PBS.Następnie, po dodaniu 1 mm schłodzonego PBS, zebrać komórki poprzez zeskrobanie ich do probówki do mikrowirówki na lodzie, cały czas utrzymując próbki w niskiej temperaturze. Przygotować osady komórkowe poprzez wirowanie przy 13 400 ×g i 4 °C przez pięć minut. Następnie usunąć nadsącz i umieścić osady na lodzie.Użyj jednego mililitra schłodzonego Buforu A, aby homogenicznie resuspender osady, a następnie inkubuj na lodzie przez 10 minut. Następnie ponownie odwiruj komórki, tworząc osad. Teraz, przy użyciu jednego mililitra schłodzonego Buforu B, homogenicznie resuspender osady i inkubuj na lodzie przez 10 minut, sporadycznie mieszając przez odwracanie probówek.Następnie odwirować komórki w celu uzyskania osadu, tak jak wcześniej. Po ponownym zawieszeniu komórek w 200 µL schłodzonego Buforu B, dodać dwa µL nukleazy mikrokokowej (MNase) i inkubować reakcję w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie przerwać reakcję MNase, umieszczając probówki na lodzie i dodając 40 mM EDTA.Poziom trawienia przez nukleazę mikrokokalną jest krytyczny, ponieważ nadmierne trawienie może prowadzić do utraty sygnału, natomiast niedostateczne trawienie może spowodować powstanie znacznego niespecyficznego tła. Po odwirowaniu komórek, ponownie zawiesić osad w 100 µL buforu do immunoprecypitacji chromatyny (bufor ChIP), uzupełnionego o koktajl inhibitorów proteaz. Następnie przenieść zawiesinę komórkową do cienkościennej probówki do mikrowirowania.Próbki poddaj sonikacji, umieszczając je w sonikatorze z kąpielą wodną na 20 sekund, a następnie przez 20 sekund na lodzie. Powtórz etapy sonikacji dziewięć razy, aby uzyskać fragmenty o długości około 800 do 1 200 par zasad. Do 20 µL sonikowanych próbek dodaj 3 µL 5 M chlorku sodu oraz 1 µL RNazy A. Pomieszaj zawartość probówek w wirówce typu vortex i inkubuj je w temperaturze 37 °C przez 30 minut.Następnie dodać 2 µL proteinazy K i inkubować w temperaturze 65 °C przez dwie godziny. Po oczyszczeniu próbek zgodnie z protokołem tekstowym, poddać je elektroforezie w 1% żelu agarozy i wizualizować przy użyciu bromku etydyny. Do trzech oddzielnych, schłodzonych wcześniej probówek silikonizowanych dodać 30 µL lizatu oraz 70 µL schłodzonego buforu ChIP 1X z dodatkiem inhibitorów proteaz.Do odpowiednich probówek dodać jeden mikrogram przeciwciał anty-IgG, anty-histony H3 lub anty-HMGB1. Inkubować przez noc w pomieszczeniu chłodniczym przy ciągłym obracaniu. W pomieszczeniu chłodniczym, po resuspensji kulek Protein G, dodać cztery mikrolitry kulek do każdej probówki reakcyjnej i inkubować w pomieszczeniu chłodniczym przy obracaniu przez kolejne dwie do czterech godzin.Umieść probówki na statywie magnetycznym, aby odwirować kuleczki, a następnie odlej nadsącz. Do osadu dodaj 200 µL 1X buforu ChIP z koktajlem inhibitorów proteaz i przemyj w niskiej temperaturze podczas rotacji przez pięć minut. Następnie, używając 1X buforu ChIP o wysokim stężeniu soli, wykonaj dodatkowe przemycie.Następnie należy użyć 160 µL buforu eluującego do ponownego zawieszenia osadów i inkubować w temperaturze 37 °C przy jednoczesnym obracaniu przez 30 minut. Następnie należy odwirować kuleczki i zebrać nadsącz do nowej probówki. Należy dodać 6 µL pięciomolarnego chlorku sodu oraz 2 µL proteinazy K i inkubować przez noc w temperaturze 65 °C.Po oczyszczeniu DNA zgodnie z protokołem tekstowym, należy przeprowadzić reakcje PCR z wykorzystaniem zestawów starterów do regionu lub regionów zainteresowania, a następnie rozdzielić produkty w 1% żelu agarozowym barwionym bromkiem etydyny. Przed użyciem należy rozmrozić na lodzie wcześniej przygotowany bufor do syntezy naprawczej DNA, a następnie dodać 40 millimolar phosphocreatine oraz 2,5 micrograms creatine phosphokinase. Po przygotowaniu 10X buforu do superzwijania zgodnie z protokołem tekstowym, należy użyć jednego microliter vaccinia topoisomerase 1 z 1X buforem do superzwijania w reakcji o objętości 10 microliter, aby zlinearyzować 300 nanograms superzwiniętego plazmidu PCA FG1.Do rozluźnionych plazmidów dodać 25 µL świeżo rozmrożonego ekstraktu z komórek HeLa oraz bufor do syntezy DNA. Dobrze wymieszać, następnie dodać do reakcji 1 µL topoizomerazy 1 vaccinia i inkubować w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę. Reakcje przerwać poprzez dodanie 1% SDS oraz 0,25 mg/mL proteinazy K, a następnie inkubować w temperaturze 65 °C przez dwie godziny.Po odlaniu żelu agarozy 1% w buforze TPE 1X, dodać barwnik do ładowania DNA do reakcji i nałożyć próbki bezpośrednio na żel, zachowując co najmniej cztery wolne ścieżki odstępu między nimi. Prowadzić elektroforezę przez osiem do 10 godzin przy napięciu dwóch woltów na centymetr w buforze TBE 1X dla pierwszej wymiaru w temperaturze pokojowej, aby rozdzielić topoizomery. Przygotować dwa litry buforu TBE 1X z dodatkiem trzech mikrogramów na mililitr fosforanu chlorochiny.Namocz żel w 200 mililitrach roztworu, przykrywając go folią aluminiową na 20 minut. Aby przeprowadzić elektroforezę żelu w drugim wymiarze, obróć żel o 90 stopni zgodnie z ruchem wskazówek zegara i prowadź proces od czterech do sześciu godzin przy napięciu dwóch woltów na centymetr w buforze 1X TBE z dodatkiem chlorochiny, aby rozdzielić superpętle dodatnie i ujemne. Ilość chlorochiny w buforze do elektroforezy oraz w żelu jest krytyczna, podobnie jak prowadzenie elektroforezy drugiego wymiaru przy bardzo niskim napięciu w celu oddzielenia superpętek dodatnich od ujemnych.Po zabarwieniu i odbarwieniu żelu zgodnie z protokołem tekstowym, należy użyć obrazownika do wizualizacji termorozkładu topoisomerów. Jak widać na tym żelu, około 79% plazmidów zawierających ICL skierowane do TFO wykazuje wolniejszą mobilność w matrycy żelu agarozowego w porównaniu z kontrolnymi plazmidami bez wiązań krzyżowych. Analizy ChIP przeprowadzone na lizatach ludzkich komórek U2OS przetransfekowanych plazmidem kontrolnym lub plazmidami zawierającymi ICL skierowane do TFO wykazują wzbogacenie HMGB1 w regionie P-ICL w porównaniu z regionem kontrolnym po immunoprecypitacji z użyciem przeciwciała anty-HMGB1.W przypadku usunięcia HMGB1 z komórek poprzez zastosowanie siRNA, wzbogacenie specyficzne dla P-ICL uległo zmniejszeniu. Gdy te same próbki poddano immunoprecypitacji przy użyciu przeciwciała anty-IgG, wykryto minimalną amplifikację PCR. Na koniec, na tej rycinie dwuwymiarowa elektroforeza w żelu agarozowym wykazuje modyfikację architektury plazmidów zawierających ICL kierowane przez TFO w formie ujemnego superzwinięcia wywołanego przez HMGB1 w ekstraktach z komórek HeLa.Po opanowaniu tej techniki można ją przeprowadzić w ciągu około pięciu dni, pod warunkiem prawidłowego wykonania. Podczas realizacji tej procedury bardzo ważne jest pamiętanie, że wszystkie etapy płukania powinny odbywać się w pomieszczeniu chłodniczym, ponieważ płukanie w temperaturze pokojowej może zwiększyć sygnał tła. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak siRNA-zależna deplecja białka, a następnie testy przesiewowe mutacji, aby odpowiedzieć na pytania, na przykład czy analizowane białko bierze udział w naprawie DNA?A może znacząco zmienia ona widma mutacji podczas tego procesu? Technika ta utorowała drogę do badania powiązań między białkami a specyficznymi dla danego miejsca uszkodzeniami DNA. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobre wyobrażenie o tym, jak badać powiązania białek architekturalnych z docelowymi wiązaniami krzyżowymi DNA, a następnie określać wpływ takiego powiązania na topologię DNA.Należy pamiętać, że praca z bromkiem etydynyum może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas przeprowadzania tego eksperymentu należy zawsze nosić odpowiednie środki ochrony osobistej.

tools-to-study-role-architectural-protein-hmgb1-processing-helix

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Metoda Hi-C umożliwia bezstronną, genomową identyfikację oddziaływań chromatyny (1). Hi-C łączy ligację bliskościową z sekwencjonowaniem masowo równoległym. Wynikowe dane mogą być wykorzystane do badania architektury genomowej w wielu skalach: wstępne wyniki pozwoliły zidentyfikować takie cechy jak terytoria chromosomowe, segregacja chromatyny otwartej i zamkniętej oraz struktura chromatyny w skali megabazy.

Hi-C: Metoda badania trójwymiarowej architektury genomów.

Niniejszy protokół opisuje metodę wizualizacji białka sygnałowego pęknięć dwuniciowych DNA, aktywowanego w odpowiedzi na uszkodzenie DNA, a także jego lokalizacji podczas mitozy.

Dwuwymiarowe i trójwymiarowe obrazowanie żywych komórek w celu badania białek odpowiedzi na uszkodzenia DNA

Obrazowanie spektroskopowe elektronów może obrazować i odróżniać kwas nukleinowy od białka z rozdzielczością nanometrów. Można go połączyć z systemem miniSOG, który jest w stanie specyficznie znakować znakowane białka w próbkach z transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Zastosowanie tych technologii ilustrujemy na przykładzie dwuniciowych ognisk naprawy pęknięć.

Wizualizacja białek naprawczych DNA oznaczonych tagami miniSOG w połączeniu z obrazowaniem spektroskopowym elektronów (ESI)

Mikronaświetlanie laserowe jest użytecznym narzędziem do badań nad naprawą DNA w żywych komórkach. Przedstawiono metodologiczne podejście do stosowania laserów UVA do wywoływania różnych zmian w DNA. Zoptymalizowaliśmy metodę miejscowego mikronapromieniowania, która utrzymuje normalny cykl komórkowy; W ten sposób napromieniowane komórki przechodzą przez mitozę.

Zaawansowane techniki mikroskopii konfokalnej do badania interakcji białko-białko i kinetyki zmian w DNA

Badanie kinetyki naprawy uszkodzeń DNA wymaga systemu do wywoływania uszkodzeń w określonych regionach subjądrowych. Opisujemy metodę tworzenia zlokalizowanych dwuniciowych pęknięć za pomocą laserowo-skaningowego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w laser 405 nm i zapewniamy zautomatyzowane procedury ilościowego określania dynamiki czynników naprawczych w tych zmianach.

Badanie rekrutacji białek do zmian DNA za pomocą mikropromieniowania laserowego 405 nm

Po uszkodzeniu DNA, ludzkie komórki aktywują niezbędne szlaki naprawcze, aby przywrócić integralność swojego genomu. W tym miejscu opisujemy metodę immunofluorescencji pośredniej jako sposób na wykrycie białek naprawy DNA, analizę ich przestrzennej i czasowej rekrutacji oraz pomoc w badaniu interakcji białko-białko w miejscach uszkodzenia DNA.

Wizualizacja oddziaływania białek naprawy DNA za pomocą immunofluorescencji

Ten artykuł przedstawia podstawowe etapy immunobarwienia i immunoprecypitacji chromatyny. Protokoły te są powszechnie stosowane do badania procesów komórkowych związanych z uszkodzeniem DNA oraz do wizualizacji i ilościowego określenia rekrutacji białek zaangażowanych w naprawę DNA.

Wizualizacja i ilościowe określanie uszkodzeń DNA specyficznych dla miejsca na podstawie endonukleazy

Obecny protokół podkreśla zmodyfikowaną metodę wykrywania i ilościowego oznaczania wiązań krzyżowych DNA-białko (DPC) oraz ich modyfikacji potranslacyjnych (PTM), w tym ubikwitylacji, SUMOylacji i ADP-rybozylacji indukowanej przez inhibitory topoizomerazy i formaldehyd, umożliwiając tym samym badanie powstawania i naprawy DPC i ich PTM.

Ilościowe wykrywanie wiązań krzyżowych DNA-białko i ich modyfikacji potranslacyjnych

Tutaj prezentujemy prosty i szybki protokół wykrywania oddziaływań białek w miejscach uszkodzenia DNA.

Test ligandów zbliżeniowych do lokalizacji białek w miejscach uszkodzenia DNA

Protokół ten demonstruje wykonanie testu pojedyncząłego w celu wizualizacji na żywo rozwijania DNA za pomocą helikazy CMG. Opisuje (1) przygotowanie substratu DNA, (2) oczyszczanie fluorescencyjnie znakowanej helikazy Drosophila melanogaster CMG, (3) przygotowanie komórki przepływowej mikrofluidycznej do mikroskopii całkowitej fluorescencji odbicia wewnętrznego (TIRF) oraz (4) test odwijania DNA pojedyncząłą.

Wizualizacja rozwijania DNA w czasie rzeczywistym pojedyncząłą cząsteczką przez helikazę CMG

Przedstawiamy szybką i skuteczną metodę wykrywania powszechnych delikatnych pęknięć w miejscu przez natywne γH2A. Immunoprecypitacja chromatyny X (ChIP). Takie podejście znacznie skraca zarówno czas, jak i nakład pracy związany z tradycyjnym γH2A. Testy X ChIP przy zachowaniu wysokiej odtwarzalności i wiarygodności wyników.

Przechwytywanie typowych delikatnych uszkodzeń miejsc za pomocą natywnego γH2A. X ChIP

Poznaj zmodyfikowane metody ChIP i analizy superzwirowania DNA do badania roli białka HMGB1 w uszkodzeniach DNA w komórkach ludzkich. Technika ta umożliwia identyfikację nowych celów farmakologicznych w terapii nowotworowej.

Narzędzia do badania roli architektonicznego białka HMGB1 w przetwarzaniu zniekształcających helisę, specyficznych dla miejsca wiązań międzyniciowych DNA (Wideo) | JoVE Journal

Narzędzia do badania roli architektonicznego białka HMGB1 w przetwarzaniu zniekształcających helisę, specyficznych dla miejsca wiązań międzyniciowych DNA

Przeglądaj więcej filmów