Wizualizacja testu resazuryny agarowej z węglem drzewnym do półilościowego, średnioprzepustowego oznaczania liczby prątków

Ogólnym celem projektu CARA jest zapewnienie średnioprzepustowej, półilościowej oceny aktywności związków przeciwko replikującym się i niereplikującym prątkom. Główną zaletą tej techniki jest to, że jako substytut CFU, CARA pozwala na szybkie przetestowanie zależności od dawki i czasu związku. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie odkrywania leków na gruźlicę, takie jak określenie, czy związek jest bakteriostatyczny lub bakteriobójczy wobec replikujących się bakterii i czy jest bakteriobójczy wobec bakterii niereplikujących.

Metodę zademonstruje Julia Roberts, współpracowniczka w naszym laboratorium. Dodać 450 mililitrów wody do jednolitrowej szklanej zlewki lub 900 mililitrów wody do dwulitrowej kolby Erlenmeyera. Umieścić mieszadło nadające się do sterylizacji w autoklawie w zlewce lub kolbie.

Następnie dodaj proszek Middlebrook 7H11, węgiel aktywny do 0,4% końcowego stężenia i 50% roztwór glicerolu, aby uzyskać 0,2% końcowego stężenia. Przykryj otwór kolby lub zlewki folią aluminiową i przymocuj do szkła taśmą do autoklawu. Po autoklawowaniu pożywki schłodzić ją do około 55 do 65 stopni Celsjusza na magnetycznej płycie mieszającej ustawionej na niską prędkość, aby utrzymać węgiel drzewny w zawiesinie.

Podczas pracy w warunkach aseptycznych w okapie bezpieczeństwa biologicznego wyposażonym w magnetyczną płytkę mieszającą, należy zdjąć folię z podłoża i dodać 100 lub 50 mililitrów suplementu OADC odpowiednio do dwulitrowej kolby lub jednolitrowej zlewki i kontynuować mieszanie. Za pomocą pipety wielokanałowej z ośmioma lub 12 końcówkami filtrującymi napełnij 96-dołkową mikropłytkę 200 mikrolitrami węgla drzewnego 7H11-OADC ze zbiornika odczynnika lub zlewki, pracując szybko, aby uniknąć zestalenia agaru i tworzenia się pęcherzyków. Umieść stosy mikropłytek CARA w zamykanych plastikowych torebkach, aby uniknąć wyschnięcia i przechowuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Zaszczepić polipropylenowe okrągłodenne lub stożkowe probówki wirówkowe zawierające odpowiednio cztery lub 20 mililitrów Middlebrook 7H9-ADN lub 7H9-OADC M.smegmatis przy OD580 od 0,01 do 0,1. Inkubować kultury M.smegmatis w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 20% O2 z wytrząsaniem, rozszerzając kultury do połowy fazy logarytmicznej lub przybliżonego OD580 wynoszącego 0,5. Aby przeprowadzić eksperyment z minimalnym stężeniem hamującym w warunkach replikacji i bez replikacji, rozprowadź 200 mikrolitrów komórek w 7H9-ADN przy OD580 0,01 do wszystkich studzienek 96-dołkowej płytki z czystym dnem, poddanej hodowli tkankowej.

W teście niereplikującym należy użyć PBS zawierającego 0,02% tyloksapolu, aby dwukrotnie przemyć komórki. I użyj niereplikującego się podłoża, aby ponownie zawiesić komórki. Użyj pożywki niereplikującej, aby rozcieńczyć komórki do OD580 0,1 i dodać azotan sodu do końcowego stężenia 0,5 do 5 milimolów ze świeżo przygotowanego jednomolowego zapasu.

Rozprowadzić 200 mikrolitrów komórek przy OD580 0,1 do wszystkich studzienek 96-dołkowej płytki z czystym dnem poddanej hodowli tkankowej. Po przygotowaniu czynników testowych zgodnie z protokołem tekstowym, dodać dwa mikrolitry czynnika testowego, jeden do rzędów od A do E i dwa mikrolitry agenta testowego, dwa do rzędów od E do H, i dokładnie wymieszać. W przypadku testów replikacyjnych inkubuj mikropłytki M.smegmatis w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 20% O2 i 5% CO2 przez jedną do 48 godzin.

W punktach czasowych, w których CARA będzie używana jako odczyt, należy użyć pipety wielokanałowej p200 o pojemności od 50 do 75 mikrolitrów, aby ostrożnie ponownie zawiesić zawartość studzienki na płytce testowej typu MIC90, pipetując w górę i w dół od pięciu do 10 razy. Następnie za pomocą końcówek pipet delikatnie zawiruj zawartość studzienek okrężnymi ruchami. Przenieść 10 mikrolitrów zawartości nierozcieńczonej studzienki testowej do odpowiednich studzienek mikropłytki CARA, unikając rozpryskiwania podczas przenoszenia, upewniając się, że w momencie 10 mikrolitrów podwielokrotność zostanie zauważona w środku studzienek mikropłytki CARA.

Za pomocą taśmy klejącej zwiąż stosy mikropłytek CARA, a następnie umieść je w zamykanej plastikowej torbie. Inkubować mikropłytki M.smegmatis CARA w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 20% O2 przez jeden do dwóch dni w przypadku replikacji płytek i przez dwa do trzech dni w przypadku płytek niereplikujących. Gdy w studzienkach kontroli ujemnej widoczny jest film wzrostu bakterii lub większe makroskopowe kolonie, należy użyć pojedynczego zestawu 12 końcówek p200 z pipetą wielokanałową, aby dozować 40 mikrolitrów sterylnego PBS wzdłuż boku studzienek i pozwolić PBS rozprowadzić się po górnej części mikrokolonii agarowych/bakteryjnych.

Przygotuj odczynnik wywołujący CARA, mieszając pięć miligramów resazuryny i 50 mililitrów 5%Tween80 w PBS. Dodać 50 mikrolitrów świeżo przygotowanego odczynnika wywołującego CARA do każdego dołka mikropłytki CARA. Następnie kilkakrotnie kołysz płytkami w przód iw tył, aby pomóc rozprowadzić odczynnik po agarze i macie bakteryjnej w każdym dołku.

Umieść płytki w zamykanej plastikowej torbie i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej 30 minut w przypadku M.smegmatis. Przed odczytem fluorescencji należy umieścić mikropłytki CARA w okapie bezpieczeństwa biologicznego na 15 minut w temperaturze pokojowej ze zdjętymi pokrywkami. W przypadku korzystania ze spektrofotometrów BSL3 poza szafą bezpieczeństwa biologicznego, przyklej naklejkę PCR o jakości optycznej na płytce i użyj miękkiego ręcznika papierowego, aby szczelnie uszczelnić, delikatnie naciskając na powierzchnię naklejki.

Określ fluorescencję za pomocą odczytu od góry ze wzbudzeniem na 530 nanometrach i emisją na 590 nanometrach. Nie ma potrzeby zaślepiania płyty. Aby przeanalizować dane, należy wykreślić stężenie inhibitora na osi X w skali log10 i fluorescencję na osi Y w skali liniowej.

Zapoznaj się z protokołem tekstowym, aby uzyskać dodatkowe informacje. Stężenie badanego czynnika, które powoduje, że fluorescencja CARA nie wznosi się powyżej poziomów tła, to CARA-MBC większe niż równe 99, co pokazano tutaj. Indeks dolny wielki niż równy 99 wskazuje, że CARA-MBC zapewnia szacunkowe stężenie czynnika testowego, które powoduje śmierć bakterii większą niż równą dwóm log10.

Podejrzewa się, że związki wywierają efekt postantybiotykowy, jeśli wykazują okno statyczne, zdefiniowane jako ponad czterokrotne przesunięcie w prawo między krzywymi MIC i CARA. Okno statyczne wskazuje, że cząsteczka aktywna przeciwko replikacji M. tuberculosis może być bakteriostatyczna, a nie bakteriobójcza. W przypadku cząsteczek o silnym działaniu postantybiotykowym, okna statyczne mogą być trudne do zaobserwowania i są widoczne dopiero po zbadaniu rozszerzonej osi Y dla fluorescencji CARA, jak pokazano tutaj.

Replikujące i niereplikujące się cząsteczki aktywne testowane przez MIC90 i CARA są pokazane tutaj. Podczas gdy izoniazyd i linezolid wydają się wykazywać aktywność przeciwko bakteriom niereplikującym się w teście MIC90, CARA sugeruje, że są one nieaktywne w badanych warunkach niereplikacji. W tym eksperymencie CARA wystawienie M.smegmatis na rosnące stężenie ryfampicyny ujawniło wpływ w ciągu zaledwie jednej godziny i wykazało rosnącą aktywność bakteriobójczą między trzema a 24 godzinami, zabijając więcej niż równe dwóm do trzech log10 przy około 10 mikrogramach na mililitr przez 24 godziny.

Po opanowaniu technikę tę można wykonać w ciągu około dwóch godzin w celu przygotowania płytek, w ciągu godziny w celu przeniesienia komórek na płytki CARA i około jednej do dwóch godzin w celu wywołania i zmierzenia fluorescencji płytek CARA, jeśli zostanie to wykonane prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby użyć CARA jako testu predykcyjnego w celu określenia, czy związek ma działanie bakteriobójcze lub bakteriostatyczne wobec prątków, które replikują się lub nie. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skonfigurować CARA i analizować dane w sposób, który pomaga przewidzieć rodzaj aktywności związku.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.