Name: Neurofarmakologiczna manipulacja skrępowanych i swobodnie latających pszczół miodnych, Apis mellifera (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: Poznaj metody podawania leków pszczołom miodnym Apis mellifera w badaniach neuroetologii i socjobiologii. Techniki obejmują podawanie doustne oraz iniekcje do tułowia, ocellusa lub traktu ocellarnego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten projekt został sfinansowany przez DP0986021 grantowe ARC i 585442 grantowe NHMRC. ABB jest wspierana przez ARC Future Fellowship (FT140100452). jest wspierany przez stypendium iMQRES przyznawane przez Macquarie University oraz przez DAAD-Doktorandenstipendium przyznawane przez Niemiecką Centralę Wymiany Akademickiej. JMD jest wspierany przez CNRS i University Paul Sabatier.

1. Drug Administration for Harnessed Bees (Administracja Leków dla Pszczół Okiełznanych)
<ol>
	<li>Leczenie doustne
	<ol>
		<li>Przygotuj 1,5 M roztwór sacharozy, mieszając 257 g sacharozy z 500 ml wody (łatwiej jest rozpuścić tę ilość sacharozy we wrzącej wodzie). Roztwór sacharozy przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia. 
		UWAGA: Roztwór sacharozy stanowi bardzo gościnne środowisko dla niektórych mikroorganizmów, a tym samym łatwo ulega skażeniu i staje się niesmaczny dla pszczół. Roztwór sacharozy luzem może być porcjowany i przechowywany w temperaturze -20 °C do czasu użycia.</li>
		<li>Zdecyduj o odpowiedniej dawce leku (jak ją osiągnąć, omówiono w sekcji dyskusji poniżej) i przygotuj roztwór tak, aby preferowana dawka leku została rozpuszczona w 20 μl roztworu sacharozy (np. aby dostarczyć 20 μg, rozcieńczyć lek w stosunku 1 mg/ml). Uprząż pszczół według Felsenberga i in. (2011)16. Wykonaj ten krok co najmniej 12 godzin przed leczeniem farmakologicznym, aby upewnić się, że pszczoły nie są już zestresowane zaprzęganiem po przedstawieniu roztworu leku. 
		UWAGA: Aby uzyskać bardziej spójne wyniki, najlepiej jest zagłodzić pszczoły (umieszczając pszczoły zaprzężone w inkubatorze w temperaturze 34 °C i wilgotności 70%) O/N.</li>
		<li>Za pomocą mikropipety przyłóż kroplę 1,5 M wody z sacharozą do anteny zaprzęgniętej pszczoły. Gdy trąba jest wysunięta, należy przyłożyć 20 μl kropli 1,5 M sacharozy zawierającej lek bezpośrednio do trąbki pszczoły. Upewnij się, że pszczoła zjada wszystko. Jako kontrolę pojazdu należy użyć 1,5 M roztworu sacharozy bez dodatku leków. 
		UWAGA: Ilość roztworu sacharozy może wymagać dostosowania na podstawie planów eksperymentalnych. Jeśli zamierzone jest warunkowanie apetytywne, karmienie pszczół tuż przed treningiem będzie zakłócać reakcję pszczół.</li>
		<li>Wyrzuć lub odłóż na bok pszczoły, które nie spożywają całej sacharozy. 
		UWAGA: Jeśli duża liczba pszczół nie wypije roztworu sacharozy, może być konieczne dostosowanie harmonogramu karmienia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wstrzyknięcie w klatkę piersiową
	<ol>
		<li>Przygotuj lek w pszczole miodnej Ringer17w następujący sposób:
		<ol>
			<li>Wymieszaj i autoklaw 7,45 g NaCl, 0,448 g KCl, 0,812 g MgCl2, 0,735 g CaCl2, 54,72 g sacharozy, 4,95 g D-glukozy i 2,48 g HEPES w 1,000 ml wody. Zachowaj ostrożność podczas przechowywania Ringera, ponieważ łatwo ulega zanieczyszczeniu. Porcję i przechowywać Ringer w temperaturze -20 °C do czasu użycia.</li>
			<li>Lek rozpuścić w roztworze Ringera, a następnie rozcieńczyć tak, aby pożądana ilość była obecna w 5 μl. Na przykład, jeśli pszczoły mają być leczone 5 μg leku, 1 g można najpierw rozpuścić w 1 ml w Ringer, a następnie rozcieńczyć w stosunku 1:1000 w Ringerze do końcowego roztworu 1 μg/μl. 
			UWAGA: Alternatywnie, zamiast roztworu Ringera można użyć dostępnego w handlu PBS (Phosphate-buffered Salin).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zrób mikroskalpel, odłamując róg obosiecznej żyletki za pomocą uchwytu na ostrze. Przymocuj fragment ostrza do uchwytu ostrza, aby tworzył ładne ostrze z ostrym końcem.</li>
		<li>Pod mikroskopem stereoskopowym ostrożnie użyj mikroskalpela, aby wyciąć 2-milimetrowy otwór tuż nad tarczką, obok wyrostka tylnego skrzydła klatki piersiowej pszczoły. Unikaj zbyt głębokiego cięcia, ponieważ może to zranić mięśnie lotu, i uważaj, aby uniknąć zawiasów skrzydła. Najlepiej przyciąć tylko trzy boki, aby płat naskórka można było później odchylić do tyłu, aby zamknąć miejsce urazu.</li>
		<li>Za pomocą mikropipety umieść 5 μll Ringera (lub PBS) zawierającego lek na górze otworu w klatce piersiowej. Uważnie monitoruj pod mikroskopem, aby upewnić się, że cała kropla została wchłonięta przez hemolimfę. Użyj Ringer (lub PBS) jako kontrolki pojazdu.</li>
		<li>Jeśli to możliwe, przesuń płatek skórki z powrotem nad otwór. Po 5-10 godzinach ponownie się przymocuje i uszczelni. 
		UWAGA: Jako alternatywę dla tej techniki wstrzyknąć 1 μl bezpośrednio w klatkę piersiową za pomocą szklanej strzykawki, po otwarciu małego otworu w środku wędzidełka (linia poprzeczna w tylnej części tarczki) za pomocą igły strzykawkowej (średnica: 0,6 mm, G: 23). Pozwala to uniknąć konieczności uprzedniego przecięcia klatki piersiowej skalpelem, a miejsce wstrzyknięcia jest mniejsze, ale ta metoda pozostawi miejsce wstrzyknięcia odsłonięte.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Iniekcja do celulo<br />
	UWAGA: Jest to metoda odpowiednia do dostarczania cząsteczek przez torebkę główną, do hemolimfy.
	<ol>
		<li>Przygotować leki jak w ppkt 1.2.1, ale dostosować stężenia leku tak, aby pożądana dawka zawierała się w 1 μl Ringera lub PBS (mniejsza objętość może zostać wchłonięta przez otwór w ocellus niż przez klatkę piersiową).</li>
		<li>Przygotować mikroskalpel jak w ppkt 1.2.2. Pod mikroskopem stereoskopowym zablokuj głowę zaprzęgniętej pszczoły na miejscu, wypełniając szczelinę szyi woskiem. Używaj wosku topliwego w niskiej temperaturze (np. wosku dentystycznego), aby uniknąć uszkodzenia receptorów węchowych czułków lub innych komórek, które mogą być ważne dla oceny zachowania (np. uczenia się węchu). Następnie ostrożnie wyjmij soczewkę z środkowego ocellusa, wkładając końcówkę mikroskalpela pod soczewkę i delikatnie oderwij soczewkę od torebki głowy. 
		UWAGA: Możliwe jest również ostrożne nałożenie wosku na anteny, aby zapobiec ruchom.</li>
		<li>Ostrożnie pipetować lek na otwór ocellus. Poczekaj, aż wszystko zostanie wchłonięte do kapsułki na głowę. Usuń woskowinę dentystyczną z czułków i pozwól pszczole odpocząć przez chwilę przed kontynuowaniem procedury eksperymentalnej. Użyj Ringer (lub PBS) jako kontrolki pojazdu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wstrzyknięcie do dróg oddechowych 
	UWAGA: Przewód oczny zawiera duże włókna, łączące się z większością obszarów centralnego mózgu18. Ta metoda leczenia umożliwia stosowanie związków tylko do mózgu, ale nie jest ukierunkowane na określone podregiony mózgu.
	<ol>
		<li>Przygotować pszczołę jak w 1.3.2 i usunąć soczewkę środkowego oka za pomocą końcówki mikroskalpela, jak w 1.3.3. 
		UWAGA: Można to zrobić do 2 godzin przed wstrzyknięciem. Z naszego doświadczenia wynika, że karmione pszczoły lepiej radzą sobie z tą operacją niż pszczoły zagłodzone</li>
		<li>Napełnić szklaną strzykawkę o pojemności 10 μl wyposażoną w igłę o małej wielkości (np. 33, średnica: 210 μm) roztworem leku przygotowanym w sposób opisany w ppkt 1.3.1.</li>
		<li>Za pomocą ręcznego mikromanipulatora wprowadzić końcówkę strzykawki przez siatkówkę oka do kapsułki głowy na głębokość 50 μm i wstrzyknąć 250 nl roztworu.</li>
		<li>Po użyciu strzykawkę należy przepłukać 3 razy wodą destylowaną, a następnie 3 razy 75% etanolem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mikroiniekcja w określone struktury mózgu 
	UWAGA: Oprócz wymienionych powyżej systematycznych zabiegów, możliwe jest wykonywanie mikroiniekcji w poszczególne struktury mózgu. Pozwala to na farmakologiczną manipulację jednym lub kilkoma obszarami mózgu, pozostawiając inne nienaruszone. Działa to najlepiej w przypadku obszarów mózgu, które są łatwe do rozpoznania z przedniej powierzchni mózgu (np. płaty antenowe, kielichy ciała grzyba lub płaty pionowe lub płaty wzrokowe), ale inne regiony zostały ukierunkowane. Należy pamiętać, że orientacja (przednia/tylna, grzbietowa/brzuszna) odnosi się raczej do osi ciała, a nie do neuraxis19.
	<ol>
		<li>Przygotować lek w Ringer lub PBS w taki sam sposób, jak w ppkt 1.2.1, dodając barwnik fluorescencyjny (np. 0,5 mg/ml Dextran, Alexa 546 lub 568 fluor) lub niefluorescencyjny (np. 1 mM błękitu metylenowego). 
		UWAGA: Dodanie barwnika fluorescencyjnego pozwoli na weryfikację miejsca wstrzyknięcia po zakończeniu eksperymentu (przy użyciu mikroskopii konfokalnej, po wypreparowaniu mózgu), podczas gdy barwniki niefluorescencyjne pozwolą na bezpośrednie monitorowanie podczas eksperymentu.</li>
		<li>Aby wykonać szklane pipety do wstrzykiwań, należy włożyć szklane kapilary o odpowiedniej średnicy do zacisków uchwytu ściągacza elektrod (1,0 mm dla standardowego uchwytu dołączonego do mikrowtryskiwacza wymienionego w wykazie materiałów). Dostosuj ustawienia ciągnięcia i podgrzewania, aby uzyskać końcówkę o długości około 0.5 cm (ustawienia będą różne dla każdego ściągacza, nawet jeśli używany jest ten sam model). 
		UWAGA: Idealnie byłoby, gdyby dwie pipety wyciągnięte z jednej szklanki miały tę samą długość i kształt, tak aby można było używać obu.</li>
		<li>Pod mikroskopem stereoskopowym połam końcówki, aby uzyskać średnicę zewnętrzną około 10-15 μm, na podstawie oceny wizualnej za pomocą skali na siatce wprowadzonej do okularu. Kroki na skali są definiowane przez producenta i mogą być korygowane w zależności od zastosowanego powiększenia.</li>
		<li>Następnie napełnić szklane pipety roztworem do wstrzyknięcia. Jeśli używane są szklane kapilary z włóknami, napełnij pipetę, umieszczając tylną stronę w roztworze leku, w przeciwnym razie napełnij końcówkę za pomocą końcówek do mikroładowania.</li>
		<li>Włóż napełnioną szklaną pipetę do uchwytu kapilarnego mikrowtryskiwacza, który jest sterowany przez ręczny lub elektroniczny mikromanipulator.</li>
		<li>Skalibrować mikrowstrzykiwacz, aby wstrzyknąć żądaną objętość (0,5-2 nl, w zależności od wielkości docelowej struktury mózgu). W tym celu należy wstrzyknąć bezpośrednio do małej szalki Petriego zawierającej olej mineralny i zmierzyć średnicę kropli za pomocą siatki. Zmieniaj ustawienia, aż zostanie osiągnięta żądana głośność.</li>
		<li>Umocować głowę zaprzęgniętej pszczoły za pomocą miękkiego wosku dentystycznego, jak w ppkt 1.3.2, przed wycięciem otworu w przedniej części torebki głowy, za pomocą mikroskalpela, z trzema nacięciami: jednym tuż poniżej środkowego ocellusa (brzusznego), jednym na granicy prawego lub lewego oka i jednym powyżej łodyg czułków (grzbietowych). Użyj kawałka wosku dentystycznego, aby przytrzymać otwartą klapkę na miejscu.</li>
		<li>Ostrożnie odepchnij gruczoły i tchawicę leżące na wierzchu mózgu za pomocą cienkich kleszczy, a następnie wykonaj małe pęknięcie w nerwilemie (bardzo cienka błona wokół mózgu) powyżej docelowej struktury mózgu. 
		UWAGA: Jeśli ma być leczonych wiele pszczół jednocześnie, procedurę tę można wykonać wcześniej; Należy jednak uważać, aby nie pozostawiać pszczół w tym stanie zbyt długo (nie dłużej niż 30 minut), ponieważ ich mózgi mogą wyschnąć.</li>
		<li>Włóż końcówkę do żądanego obszaru mózgu i dostosuj głębokość prostopadłą do powierzchni mózgu (np. 60 μm dla kielichów grzybowych). Wstrzyknij zaprogramowaną głośność. W przypadku bocznych obszarów mózgu należy wstrzykiwać obustronnie (tj. wykonać jedno wstrzyknięcie do każdej półkuli). Jeśli używany jest barwnik niefluorescencyjny, upewnij się, że wstrzyknięcie nastąpiło we właściwym obszarze podczas obserwacji podczas wstrzykiwania. Jeśli używany jest barwnik fluorescencyjny, zrób to samo w świetle fluorescencyjnym za pomocą mikroskopu stereoskopowego z fluorescencyjnym systemem view.</li>
		<li>Następnie umieść otwartą klapę z powrotem na głowie pszczoły. Rozpuść kryształ eikozanu o średnicy około 1 mm za pomocą cienkiego drutu owiniętego wokół końcówki mikrolutownicy (temperatura topnienia wynosi 35-37°C) i uszczelnij nacięcia. To znacznie zmniejszy śmiertelność.</li>
		<li>Uwolnij pszczołę z uprzęży w celu analizy behawioralnej (ale patrz dyskusja) lub trzymaj w uprzęży do eksperymentów na skrępowanych pszczołach – np. testów odruchu wyprostu trąbki (PER)20.</li>
		<li>Jeśli użyto barwnika fluorescencyjnego, upewnij się, że wstrzyknięcie uderzyło w obszar zainteresowania po zakończeniu eksperymentu za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego (ryc. 1). 
		UWAGA: Jest to szczególnie przydatne w przypadku celowania w głębsze obszary mózgu (gdzie trudno byłoby zobaczyć barwnik niefluorescencyjny podczas fazy wstrzykiwania).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Metody podawania leków dla pszczół swobodnie latających
<ol>
	<li>Leczenie doustne
	<ol>
		<li>Przygotuj lek w taki sam sposób, jak w krokach 1.1.1-1.1.2. Dodaj roztwór leku do karmnika i umieść w lodówce do przechowywania. 
		UWAGA: Wystarczy dowolny karmnik, taki jak odwrócona do góry nogami nakrętka od butelki lub słoik odwrócony na bibułce.</li>
		<li>Trenuj pszczoły do karmnika grawitacyjnego zawierającego 1 M lub 0,5 M roztworu sacharozy, umieszczając karmnik w pobliżu ula. Gdy pszczoły zaczną żerować przy karmniku, stopniowo odsuwaj go dalej, aż znajdzie się w wygodnej odległości, aby uniknąć użądlenia (minimum 5 m).</li>
		<li>Oznaczaj pszczoły farbą, aby śledzić poszczególne pszczoły miodne. Sporządź listę wszystkich kombinacji kolorów, które zostaną użyte. Kiedy pszczoła wyląduje przy karmniku, ostrożnie zaznacz jej brzuch dwoma kolorami i zanotuj na liście, że kombinacja została pobrana.</li>
		<li>Zamień podajnik grawitacyjny na podajnik zawierający roztwór leku/sacharozy. Zwróć uwagę na oznaczone pszczoły, które odwiedzają karmnik. Złap każdą nieoznakowaną pszczołę odwiedzającą karmnik, ponieważ pszczoły są płodnymi rekruterami, a liczba pszczół odwiedzających karmnik z narkotykami może szybko wymknąć się spod kontroli. Jest to szczególnie problematyczne, jeśli ten sam eksperyment ma być przeprowadzany w kolejnych dniach, ponieważ naiwne pszczoły mogą już nie być naiwne. 
		UWAGA: Jako alternatywę dla szkolenia pojedynczych pszczół do karmnika, poprzedni autorzy z powodzeniem podawali wodę z sacharozą z dodatkiem leków do całego ula21-23.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Leczenie miejscowe 
	UWAGA: Celem jest rozpuszczenie interesującego związku w rozpuszczalniku, który może przeniknąć przez woskowy naskórek owada. W tym celu można stosować różne rozpuszczalniki. Do najczęściej stosowanych należą aceton, dimetyloformamid (DMF) i dimetylosulfotlenek (DMSO).
	<ol>
		<li>Oceń, który rozpuszczalnik najlepiej sprawdza się w przypadku danego związku. Jeśli spodziewany jest silny fenotyp w wyniku przedawkowania (np. paraliżu lub śmierci), należy potraktować pszczoły (krok 2.2.2) wysoką dawką (np. 20 μg kokainy7) rozpuszczoną w każdym z różnych rozpuszczalników i uważnie monitorować czas do paraliżu lub śmierci.</li>
		<li>Za pomocą mikrokapilary o pojemności 1 μl (lub mikrostrzykawki, która może być zamontowana na odpowiednim dozowniku powtarzalnym) i uchwytu mikrokapilarnego, pobrać 1 μl roztworu leku (np. 3 μg/μl kokainy) do kapilary. Wyrzuć kroplę i ostrożnie pomaluj ją na klatce piersiowej oznaczonej pszczoły. Przykryj roztworem jak największy obszar, zamiast pozostawiać stałą kroplę, ponieważ pszczoła prawdopodobnie ją wtedy oczyści. Uważaj, aby związek nie zetknął się z zawiasami skrzydeł, ponieważ może to odciągnąć go od klatki piersiowej i wzdłuż skrzydeł, gdzie wyparuje bez wchłonięcia przez hemolimfę. 
		UWAGA: W zależności od celu badawczego, metoda ta może być również stosowana do podawania leków do brzucha pszczoły. Jednak leki docierają do OUN szybciej i w większych ilościach, gdy są stosowane na klatkę piersiową24. Ta metoda działa równie dobrze w przypadku pszczół zaprzężonych, jak i swobodnie latających.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Leczenie ulatniające się
	<ol>
		<li>Rozpuścić narkotyki (wcześniej metoda ta była stosowana do dostarczania kokainy pszczołom miodnym10) w 100% etanolu. Aby zapewnić rozpuszczalność, nie należy używać chlorowodorku ani innych form soli leku, jeśli to możliwe. Przygotowując rozcieńczenie, przygotuj je tak, aby ilość, która ma być dostarczona pszczole, znajdowała się w 100 μl. Używaj czystego etanolu jako kontroli pojazdu.</li>
		<li>Aby utworzyć filament, użyj tej samej procedury, co McClung i Hirsh25.
		<ol>
			<li>Krótkie wyjaśnienie: owiń drut nichromowy ciasno wokół gwoździa i przymocuj do dwóch przewodów elektrycznych (po jednym na każdym końcu żarnika). Usuń paznokieć. Pozostała cewka nichromowa jest określana jako żarnik.</li>
			<li>Przełóż dwa druty przez starannie wywiercone otwory w pokrywie probówki wirówkowej o pojemności 50 ml, która powinna być odporna na wybraną temperaturę. Przyklej druty płynnym silikonem. 
			UWAGA: Spowoduje to, że rurka będzie szczelna. Jest to niezbędne, aby uniknąć wtórnego kontaktu z eksperymentatorem i zapewnić, że pszczoły są leczone odpowiednią dawką.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Podłącz przewody prowadzące do żarnika do źródła zasilania. Używając termopary do pomiaru temperatury żarnika, eksperymentuj z różnymi kombinacjami napięcia/prądu, aż uzyskasz taki, który zapewni odpowiedni profil temperatury dla danego leku, najlepiej taki, który pozwala na 10 sekund ogrzewania lub mniej. Jest to bardzo ważne, należy zapoznać się z odpowiednią literaturą (np. aby kokaina mogła się ulatniać, musi zostać podgrzana do temperatury co najmniej 200 °C, ale w temperaturach powyżej 350 °C jest rozkładana na związki wtórne26).</li>
		<li>Ostrożnie nanieść pipetą 100 μl roztworu leku zawierającego etanol na filament. Rozprowadź płyn na jak największej powierzchni filamentu, ponieważ zwiększy to wydajność parowania. Pozostaw żarnik wystawiony na działanie promieni słonecznych w temperaturze pokojowej, aż cały etanol wyparuje. 
		UWAGA: Jeśli etanol nie zostanie wystarczająco odparowany, pszczoły będą leczone zarówno wybranym lekiem, jak i etanolem. Pszczoły są niezwykle wrażliwe na etanol, a niektóre leki mają synergistyczne interakcje z etanolem, co wpływa na wyniki eksperymentalne.</li>
		<li>Gdy etanol całkowicie odparuje (osad leku można zwykle zobaczyć na suchym włóknie pod mikroskopem), złap swobodnie latającą pszczołę w probówce o pojemności 50 ml. Ostrożnie zamknij pokrywę zawierającą filament.</li>
		<li>Włącz zasilanie na 10 sekund, wyłącz zasilanie i odczekaj kolejne 50 sekund (aby ulatniający się związek ostygł, a tym samym skroplił się lub osadził). Uwolnij bee. 
		UWAGA: Chociaż ta metoda leczenia działa doskonale w przypadku pszczół swobodnie latających, może być równie skutecznie stosowana w przypadku pszczół zaprzęgniętych. Wystarczy umieścić zaprzężoną pszczołę w tubce o pojemności 50 ml. Załadować żarnik zgodnie z opisem w ppkt 2.3.4 między pszczołami. Aby uzyskać większą przepustowość, można używać kilku filamentów równolegle.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Frisch, K. . von B. ees <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFrisch%2C+K.+von+Bees+%22Their+Vision%2C+Chemical+Senses%2C+and+Language%22">Their Vision, Chemical Senses, and Language</a>. , Cornell University Press. Itacha, NY. (1971).</li>
<li>Giurfa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amazing+mini-brain%3A+lessons+from+a+honey+bee%5BTitle%5D)+AND+%22Bee+World%22%5BJournal%5D)">The amazing mini-brain: lessons from a honey bee.</a> Bee World. 84 (1), 5-18 (2003).</li>
<li>Giurfa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+and+neural+analysis+of+associative+learning+in+the+honeybee%3A+a+taste+from+the+magic+well%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Behavioral and neural analysis of associative learning in the honeybee: a taste from the magic well.</a> J. Comp. Physiol. 193 (8), 801-824 (2007).</li>
<li>Perry, C. J., Barron, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Honey+bees+selectively+avoid+difficult+choices%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Honey bees selectively avoid difficult choices.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (47), 19155-19159 (2013).</li>
<li>Giurfa, M., Sandoz, J. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invertebrate+learning+and+memory%3A+Fifty+years+of+olfactory+conditioning+of+the+proboscis+extension+response+in+honeybees%5BTitle%5D)+AND+%22Learn.+Mem%22%5BJournal%5D)">Invertebrate learning and memory: Fifty years of olfactory conditioning of the proboscis extension response in honeybees.</a> Learn. Mem. 19 (2), 54-66 (2012).</li>
<li>Srinivasan, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Honey+bees+as+a+model+for+vision%2C+perception%2C+and+cognition%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Honey bees as a model for vision, perception, and cognition.</a> Annu. Rev. Entomol. 55, 267-284 (2010).</li>
<li>Søvik, E., Cornish, J. L., Barron, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cocaine+tolerance+in+honey+bees%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cocaine tolerance in honey bees.</a> PLoS One. 8 (5), e64920(2013).</li>
<li>Søvik, E., Barron, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invertebrate+models+in+addiction+research%5BTitle%5D)+AND+%22Brain.+Behav.+Evol%22%5BJournal%5D)">Invertebrate models in addiction research.</a> Brain. Behav. Evol. 82 (3), 153-165 (2013).</li>
<li>Søvik, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Reward+processing+and+responses+to+drugs+of+abuse+in+the+honey+bee%2C+Apis+mellifera%22">Reward processing and responses to drugs of abuse in the honey bee, Apis mellifera</a>. , Macquarie University. Australia. November (2013).</li>
<li>Søvik, E., Even, N., Radford, C. W., Barron, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cocaine+affects+foraging+behaviour+and+biogenic+amine+modulated+behavioural+reflexes+in+honey+bees%5BTitle%5D)+AND+%22Peer+J%22%5BJournal%5D)">Cocaine affects foraging behaviour and biogenic amine modulated behavioural reflexes in honey bees.</a> Peer J. 2, e662(2014).</li>
<li>Abramson, C. I., Stone, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+an+ethanol+model+using+social+insects+I%3A+behavior+studies+of+the+honey+bee+%28Apis+mellifera+L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol.+Clin.+Exp.+Res%22%5BJournal%5D)">The development of an ethanol model using social insects I: behavior studies of the honey bee (Apis mellifera L.).</a> Alcohol. Clin. Exp. Res. 24, 1153-1166 (2000).</li>
<li>Sauer, S., Kinkelin, M., Herrmann, E., Kaiser, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+of+sleep-like+behaviour+in+honey+bees%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+A+Neuroethol.+Sensory%2C+Neural%2C+Behav.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The dynamics of sleep-like behaviour in honey bees.</a> J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sensory, Neural, Behav. Physiol. 189 (8), 599-607 (2003).</li>
<li>Münch, D., Kreibich, C. D., Amdam, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+and+its+modulation+in+a+long-lived+worker+caste+of+the+honey+bee%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Aging and its modulation in a long-lived worker caste of the honey bee.</a> J. Exp. Biol. 216 (Pt 9), 1638-1649 (2013).</li>
<li>Cheeseman, J. F., Winnebeck, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+anesthesia+alters+time+perception+by+phase+shifting+the+circadian+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">General anesthesia alters time perception by phase shifting the circadian clock.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. , (2012).</li>
<li>Schulte, C., Theilenberg, E., Müller-Borg, M., Gempe, T., Beye, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+integration+and+expression+of+piggyBac-derived+cassettes+in+the+honeybee+%28Apis+mellifera%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Highly efficient integration and expression of piggyBac-derived cassettes in the honeybee (Apis mellifera).</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111 (24), 9003-9008 (2014).</li>
<li>Felsenberg, J., Gehring, K. B., Antemann, V., Eisenhardt, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioural+pharmacology+in+classical+conditioning+of+the+proboscis+extension+response+in+honeybees+%28Apis+mellifera%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Behavioural pharmacology in classical conditioning of the proboscis extension response in honeybees (Apis mellifera).</a> J. Vis. Exp. (47), e2282(2011).</li>
<li>Burger, H., Ayasse, M., Dötterl, S., Kreissl, S., Galizia, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perception+of+floral+volatiles+involved+in+host-plant+finding+behaviour%3A+Comparison+of+a+bee+specialist+and+generalist%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+A+Neuroethol.+Sensory%2C+Neural%2C+Behav.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Perception of floral volatiles involved in host-plant finding behaviour: Comparison of a bee specialist and generalist.</a> J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sensory, Neural, Behav. Physiol. 199 (9), 751-761 (2013).</li>
<li>Pan, K. C., Goodman, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocellar+projections+within+the+central+nervous+system+of+the+worker+honey+bee%2C+Apis+mellifera%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Ocellar projections within the central nervous system of the worker honey bee, Apis mellifera.</a> Cell Tissue Res. 176 (4), 505-527 (1977).</li>
<li>Ito, K., Shinomiya, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+nomenclature+for+the+insect+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A systematic nomenclature for the insect brain.</a> Neuron. 81, 755-765 (2014).</li>
<li>Bitterman, M. E., Menzel, R., Fietz, A., Schäfer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classical+conditioning+of+proboscis+extension+in+honeybees+%28Apis+mellifera%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Psychol%22%5BJournal%5D)">Classical conditioning of proboscis extension in honeybees (Apis mellifera).</a> J. Comp. Psychol. 97 (2), 107-119 (1983).</li>
<li>Barron, A. B., Robinson, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+modulation+of+task+performance+by+octopamine+in+honey+bee+%28Apis+mellifera%29+division+of+labour%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+A+Neuroethol.+Sens.+Neural.+Behav.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Selective modulation of task performance by octopamine in honey bee (Apis mellifera) division of labour.</a> J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sens. Neural. Behav. Physiol. 191 (7), 659-668 (2005).</li>
<li>Schulz, D. J., Sullivan, J. P., Robinson, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Juvenile+Hormone+and+Octopamine+in+the+Regulation+of+Division+of+Labor+in+Honey+Bee+Colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Horm.+Behav%22%5BJournal%5D)">Juvenile Hormone and Octopamine in the Regulation of Division of Labor in Honey Bee Colonies.</a> Horm. Behav. 42 (2), 222-231 (2002).</li>
<li>Schulz, D. J., Elekonich, M. M., Robinson, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenic+amines+in+the+antennal+lobes+and+the+initiation+and+maintenance+of+foraging+behavior+in+honey+bees%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Biogenic amines in the antennal lobes and the initiation and maintenance of foraging behavior in honey bees.</a> J. Neurobiol. 54 (2), 406-416 (2003).</li>
<li>Barron, A. B., Vander Meer, R. K., Maleszka, J., Robinson, G. E., Maleszka, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+injection%2C+feeding+and+topical+application+methods+for+treatment+of+honeybees+with+octopamine%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Comparing injection, feeding and topical application methods for treatment of honeybees with octopamine.</a> J. Insect Physiol. 53 (2), 187-194 (2007).</li>
<li>McClung, C., Hirsh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotypic+behavioral+responses+to+free-base+cocaine+and+the+development+of+behavioral+sensitization+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Stereotypic behavioral responses to free-base cocaine and the development of behavioral sensitization in Drosophila.</a> Curr. Biol. 8 (2), 109-112 (1998).</li>
<li>Martin, B. R., Lue, L. P., Boni, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrolysis+and+volatilization+of+cocaine%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anal.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Pyrolysis and volatilization of cocaine.</a> J. Anal. Toxicol. 13 (3), 158-162 (1989).</li>
<li>Lefer, D., Perisse, E., Hourcade, B., Sandoz, J. -C., Devaud, J. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+waves+of+transcription+are+required+for+long-term+memory+in+the+honeybee%5BTitle%5D)+AND+%22Learn.+Mem%22%5BJournal%5D)">Two waves of transcription are required for long-term memory in the honeybee.</a> Learn. Mem. 20 (1), 29-33 (2012).</li>
<li>Urlacher, E., Soustelle, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Honey+Bee+Allatostatins+Target+Galanin%2FSomatostatin-Like+Receptors+and+Modulate+Learning%3A+A+Conserved+Function%3F%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Honey Bee Allatostatins Target Galanin/Somatostatin-Like Receptors and Modulate Learning: A Conserved Function?</a> PLoS One. 11 (1), e0146248(2016).</li>
<li>Stollhoff, N., Menzel, R., Eisenhardt, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+recovery+from+extinction+depends+on+the+reconsolidation+of+the+acquisition+memory+in+an+appetitive+learning+paradigm+in+the+honeybee+%28Apis+mellifera%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spontaneous recovery from extinction depends on the reconsolidation of the acquisition memory in an appetitive learning paradigm in the honeybee (Apis mellifera).</a> J. Neurosci. 25 (18), 4485-4492 (2005).</li>
<li>Barron, A. B., Maleszka, R., Helliwell, P. G., Robinson, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cocaine+on+honey+bee+dance+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Effects of cocaine on honey bee dance behaviour.</a> J. Exp. Biol. 212 (2), 163-168 (2009).</li>
<li>Devaud, J. -M., Papouin, T., Carcaud, J., Sandoz, J. -C., Grünewald, B., Giurfa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+substrate+for+higher-order+learning+in+an+insect%3A+Mushroom+bodies+are+necessary+for+configural+discriminations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Neural substrate for higher-order learning in an insect: Mushroom bodies are necessary for configural discriminations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. , 1-9 (2015).</li>
<li>Vergoz, V., Roussel, E., Sandoz, J. -C., Giurfa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aversive+learning+in+honeybees+revealed+by+the+olfactory+conditioning+of+the+sting+extension+reflex%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Aversive learning in honeybees revealed by the olfactory conditioning of the sting extension reflex.</a> PLoS One. 2 (3), e288(2007).</li>
<li>Henry, M., Béguin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+common+pesticide+decreases+foraging+success+and+survival+in+honey+bees%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A common pesticide decreases foraging success and survival in honey bees.</a> Science. 336 (6079), 348-350 (2012).</li>
<li>Søvik, E., Perry, C. J., LaMora, A., Barron, A. B., Ben-Shahar, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+impact+of+manganese+on+honeybee+foraging%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Negative impact of manganese on honeybee foraging.</a> Biol. Lett. 11 (3), 20140989(2015).</li>
<li>Farooqui, T., Vaessin, H., Smith, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Octopamine+receptors+in+the+honeybee+%28Apis+mellifera%29+brain+and+their+disruption+by+RNA-mediated+interference%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Octopamine receptors in the honeybee (Apis mellifera) brain and their disruption by RNA-mediated interference.</a> J. Insect Physiol. 50 (8), 701-713 (2004).</li>
<li>Guo, X., Su, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recipe+for+a+Busy+Bee%3A+MicroRNAs+in+Honey+Bee+Caste+Determination%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Recipe for a Busy Bee: MicroRNAs in Honey Bee Caste Determination.</a> PLoS One. 8 (12), e81661(2013).</li>
<li>Cristino, A. S., Barchuk, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroligin-associated+microRNA-932+targets+actin+and+regulates+memory+in+the+honeybee%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Neuroligin-associated microRNA-932 targets actin and regulates memory in the honeybee.</a> Nat. Commun. 5, 5529(2014).</li>
<li>Vargaftig, B. B., Coignet, J. L., de Vos, C. J., Grijsen, H., Bonta, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mianserin+hydrochloride%3A+Peripheral+and+central+effects+in+relation+to+antagonism+against+5-hydroxytryptamine+and+tryptamine%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Mianserin hydrochloride: Peripheral and central effects in relation to antagonism against 5-hydroxytryptamine and tryptamine.</a> Eur. J. Pharmacol. 16 (3), 336-346 (1971).</li>
<li>Beggs, K. T., Tyndall, J. D. A., Mercer, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Honey+bee+dopamine+and+octopamine+receptors+linked+to+intracellular+calcium+signaling+have+a+close+phylogenetic+and+pharmacological+relationship%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Honey bee dopamine and octopamine receptors linked to intracellular calcium signaling have a close phylogenetic and pharmacological relationship.</a> PLoS One. 6 (11), (2011).</li>
<li>Matsumoto, Y., Menzel, R., Sandoz, J. -C., Giurfa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+olfactory+classical+conditioning+of+the+proboscis+extension+response+in+honey+bees%3A+a+step+toward+standardized+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Revisiting olfactory classical conditioning of the proboscis extension response in honey bees: a step toward standardized procedures.</a> J. Neurosci. Methods. 211 (1), 159-167 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisane powyżej metody pozwalają na proste, skuteczne i solidne leczenie pszczół miodnych swobodnie latających lub zaprzęgniętych. Metody te są zgodne z wieloma paradygmatami eksperymentalnymi i pytaniami biologicznymi (Tabela 1). Wszystkie metody swobodnego latania można łatwo zastosować do pszczół zaprzęgniętych. Odwrotna sytuacja jest jednak mniej skuteczna, ponieważ tymczasowe ograniczenie i inwazyjne metody leczenia mogą często zagrozić zdolności pszczół do latania.
Metod...

Odkąd Karl von Frisch wyjaśnił ich język tańca1, pszczoły miodne pozostały popularnym gatunkiem badawczym dla badaczy zajmujących się zachowaniem zwierząt i neurobiologią. W ostatnich latach na przecięciu tych dwóch dziedzin pojawiło się mnóstwo nowych dyscyplin, a obok nich powstało kilka innych dyscyplin (np. biologia molekularna, genomika i informatyka). Doprowadziło to do szybkiego rozwoju nowych teorii i modeli pozwalających zrozumieć, w jaki sposób zachowanie wynika z aktywności w obrębie układu nerwowego. Ze względu na unikalny styl życia, bogaty repertuar zachowań oraz łatwość manipulacji eksperymentalnej i farmakologicznej, pszczoły pozostały na czele tej rewolucji.
Pszczoły miodne są wykorzystywane do badania podstawowych zagadnień neurobiologicznych, takich jak te leżące u podstaw uczenia się i pamięci2,3, podejmowania decyzji4, węchu5 lub przetwarzania wzrokowego6. W ostatnich latach pszczoła miodna została nawet wykorzystana jako model do badania tematów zwykle zarezerwowanych dla badań medycznych, takich jak skutki działania uzależniającychleków 7-11, sen12, starzenie się13 lub mechanizmy leżące u podstaw znieczulenia14.
W przeciwieństwie do klasycznych organizmów modelowych (np. D. melanogaster, C. elegans, M. musculus), dostępnych jest bardzo niewiele narzędzi genetycznych do manipulowania funkcjami neuronalnymi u pszczół miodnych, chociaż obecnie to się zmienia15. Zamiast tego badania nad pszczołami miodnymi opierały się przede wszystkim na manipulacjach farmakologicznych. Odniosło to duży sukces; Jednak różnorodność badań nad pszczołami jest tak duża, że potrzebny jest szereg metod podawania farmakologicznego. Badania z udziałem pszczół miodnych dotyczą bardzo zróżnicowanych kwestii, są badane przez naukowców z różnych dyscyplin i środowisk oraz wykorzystują różne podejścia eksperymentalne. Wiele pytań badawczych wymaga, aby pszczoły albo latały swobodnie, swobodnie wchodziły w interakcje ze swoją kolonią, albo jedno i drugie. Może to utrudnić śledzenie poszczególnych zwierząt doświadczalnych i uniemożliwić ograniczenie lub kaniulację.
Aby dostosować się do różnorodności badań nad pszczołami miodnymi, potrzebne są różne metody dostarczania leków, pozwalające na solidne i elastyczne podawanie, jednocześnie zapewniając, że profile farmakokinetyczne i farmakodynamiczne, inwazyjność metody i jej niezawodność, pasują do omawianego paradygmatu. Ze względu na te zróżnicowane potrzeby, większość grup badawczych opracowała własne, unikalne metody podawania leków. Do tej pory była to siła społeczności badawczej zajmującej się pszczołami; Doprowadziło to do opracowania szeregu metod pozwalających na podawanie tego samego leku w różnych okolicznościach. Naszym celem nie jest opracowanie jednej ustandaryzowanej metody farmakologicznych manipulacji pszczołami, ale raczej zwrócenie uwagi na metody, które okazały się szczególnie skuteczne i pomoc naukowcom w ich przyjęciu. Omawiamy podstawowe zasady ich działania, a także ich zalety i wady.

<table><tbody><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8501</td><td>Każdy dostawca zrobi</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu sześciowodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia dwuwodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>Monohydrat dekstrozy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49159</td><td></td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy sól fizjologiczna (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Wosk ochronny</td><td>Dentaurum</td><td>124-305-00</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>dimetyloformamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4551</td><td></td></tr><tr><td>95% etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>493511</td><td></td></tr><tr><td>Szklana kapilara</td><td>WPI</td><td>1B100F-3</td><td></td></tr><tr><td>23 G NanoFil igła</td><td>WPI</td><td>NF33BV-2</td><td></td></tr><tr><td>Bardzo drobna elektroda Forsceps</td><td>Dumont</td><td>0208-55-PO</td><td></td></tr><tr><td> ściągacz</td><td>SRI</td><td>2001</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowtryskiwacz FemtoJet</td><td>Eppendorf</td><td>5247 000.01</td><td></td></tr><tr><td>Eicosane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>219274</td><td></td></tr><tr><td>mikromanipulator ręczny</td><td>Brinkmann Instrumentenbau</td><td>MM-33</td><td></td></tr><tr><td>mikromanipulator elektroniczny</td><td>Luigs & Neumann Feinmechanik + Elektortechnik</td><td>Junior unit XYZ</td><td></td></tr><tr><td>lutownica</td><td>Leica</td><td></td> M80 lutownica Weller WESD51 <td></td></tr><tr><td>Dextran, Alexa Fluor 546, 10 000 MW</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D-22911</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Alexa Fluor 568, 10 000 MW</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D-22912</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> mała szalka Petriego <td></td></tr><tr><td></td>Olej mineralny <td>Sigma-Aldrich</td><td>P5481</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Probówka wirówkowa</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Australijskie Zaopatrzenie</td><td></td><td></td>Entomologiczne</tr><tr><td>Uchwyt i łamacz</td><td>Australijskie Zaopatrzenie Entomologiczne</td><td>E130</td><td></td></tr><tr><td>Pióro obosieczne żyletka</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>50-949-135</td><td></td></tr><tr>Drut <td></td><td></td><td>nichromowy</td><td>Każdy dostawca zrobi</td></tr><tr>Przewody elektryczne <td>Każdy dostawca zrobi</td><td>Farba modelowa</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Tamiya USA</td><td>Zależy od koloru</td><td></td></tr><tr><td>Dozownik powtarzalny</td><td>Firma Hamilton</td><td>PB-600-1</td><td></td></tr><tr><td>Szklana strzykawka</td><td>WPI</td><td>NANOFIL</td><td></td></tr><tr><td>system podglądu fluorescencji</td><td>Siatka Nightsea</td><td>SFR-GR</td><td></td></tr><tr><td></td><td>ProSciTech</td><td>S8014-24</td><td></td></tr><tr><td>mikrokapilara z uchwytem</td><td>Drummond</td><td>1-000-0010</td><td></td></tr><tr><td>Płynny silikon</td><td></td><td></td><td>Każdy dostawca zrobi</td></tr><tr><td>Termopara</td><td>Digitech</td><td>QM-1324</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipeta</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

neurofarmakologiczna manipulacja skrępowanych i swobodnie latających pszczół miodnych, apis mellifera

Neuropharmacological Manipulation of Restrained and Free-flying Honey Bees, Apis mellifera

Pszczoły miodne wykazują zadziwiające zdolności uczenia się oraz zaawansowane zachowania społeczne i komunikację. Ponadto ich mózg jest mały, łatwy do wizualizacji i badania. Dlatego pszczoły od dawna są ulubionym modelem wśród neurobiologów i neuroetologów do badania neuronalnych podstaw zachowań społecznych i naturalnych. Ważne jest jednak, aby techniki eksperymentalne stosowane do badania pszczół nie kolidowały z badanymi zachowaniami. Z tego powodu konieczne było opracowanie szeregu technik farmakologicznej manipulacji pszczołami miodnymi. W artykule przedstawiono metody leczenia pszczół miodnych trzymanych przez uwięzi lub swobodnie latających za pomocą szerokiej gamy środków farmakologicznych. Należą do nich zarówno metody nieinwazyjne, takie jak leczenie doustne i miejscowe, jak i metody bardziej inwazyjne, które pozwalają na precyzyjne dostarczanie leków zarówno w sposób ogólnoustrojowy, jak i miejscowy. Na koniec omawiamy zalety i wady każdej metody oraz opisujemy typowe przeszkody i sposoby ich pokonania. Kończymy dyskusją na temat tego, jak ważne jest dostosowanie metody eksperymentalnej do zagadnień biologicznych, a nie na odwrót.

Przedstawiono wybór reprezentatywnych wyników dla opisanych powyżej metod, przede wszystkim w celu wykazania, że metody te umożliwiają dotarcie czynników farmakologicznych do mózgu i wpływanie na zachowanie pszczoły miodnej.
Specyficzne efekty w procesach mózgowych można łatwo uzyskać po iniekcji w klatkę piersiową.
Ponieważ środki farmakologiczne wstrzykiwane przez klatk...

Ten manuskrypt opisuje kilka protokołów podawania środków farmakologicznych pszczołom miodnym, w tym proste nieinwazyjne metody dla pszczół swobodnie latających, a także bardziej inwazyjne warianty, które pozwalają na precyzyjne, miejscowe leczenie krępowanych pszczół.

Neurofarmakologiczna manipulacja skrępowanych i swobodnie latających pszczół miodnych, Apis mellifera

Honey bees demonstrate astonishing learning abilities and advanced social behavior and communication. In addition, their brain is small, easy to visualize ...

Ogólnym celem opisanych procedur jest niezawodne i stabilne podawanie środków farmakologicznych do ośrodkowego układu nerwowego pszczół miodnych lub podobnych owadów. Metody te mogą pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinach socjobiologii, neuroetologii i pszczelarstwa, takich jak badanie neuromeganizmów zachowań społecznych. Główną zaletą tych technik jest to, że umożliwiają one badanie neurobiologii organizmów niemodelowych, takich jak pszczoła miodna, w przypadku których dostępne narzędzia genetyczne są obecnie ograniczone.Procedurę zaprezentuje Jenny Plath, doktorantka z Laboratorium Neuroetologii na Macquarie University. Leki można podawać doustnie lub poprzez iniekcję. Iniekcje można wykonywać do klatki piersiowej, do ocelli lub do drogi ocellarnej.Iniekcje w ocellus dostarczają leki do całej głowy, natomiast iniekcje w trakt ocellarny są skierowane do konkretnych obszarów mózgu. Przed wykonaniem wszystkich iniekcji należy przygotować mikroskalpel, odłamując róg dwustronnego ostrza brzytwy za pomocą uchwytu do ostrzy. Fragment ostrza należy zamocować w uchwycie tak, aby stworzyć odpowiednie narzędzie o ostrym zakończeniu.W celu wykonania iniekcji w klatkę piersiową należy wyciąć otwór o średnicy dwóch milimetrów tuż nad scutellum, obok tylnego wyrostka skrzydłowego klatki piersiowej pszczoły. Należy unikać zbyt głębokiego cięcia, aby nie uszkodzić mięśni lotnych, oraz zachować ostrożność, by nie przeciąć zawiasów skrzydeł. Najlepiej naciąć tylko trzy boki, tak aby płat kutykuli mógł zostać później odgięty w celu zamknięcia miejsca nacięcia.Następnie wstrzyknij lek do klatki piersiowej. Potem przesuń fałd kutykuli z powrotem nad otwór; po dziesięciu godzinach przywróci on swoją pozycję i zamknie otwór. Aby uzyskać dostęp do mózgu, unieruchom głowę przymocowanej pszczoły, wypełniając szczelinę szyjną rozgrzanym w dłoni woskiem dentystycznym, aby uniknąć uszkodzenia receptorów węchowych czułków lub innych komórek, które mogą być istotne dla zachowania pszczoły.Antenę można również unieruchomić za pomocą wosku dentystycznego. Następnie, używając mikroskalpela, należy ostrożnie usunąć soczewkę oczka pośrodkowego, wsuwając końcówkę skalpela pod soczewkę i delikatnie oddzielając ją od torebki głowy. Aby lek przedostał się do całej torebki głowy, należy ostrożnie nanieść go pipetą w miejsce po soczewce oczka i odczekać do czasu jego wchłonięcia.Alternatywnie, można celować w podregiony mózgu poprzez iniekcję przez trakt ocellarny, na przykład wstrzykując 250 nanolitrów leku na głębokość 50 mikronów, aby dotrzeć do struktur mózgu sąsiadujących z ocelli. Następnie usuwa się wosk dentystyczny i pozwala pszczole odpocząć przez jakiś czas przed kontynuowaniem procedury eksperymentalnej. Aby przygotować igły do iniekcji, należy wyciągnąć szklane rurki o średnicy jednego milimetra, aby uzyskać końcówkę o długości około 0,5 centymetra.Następnie, pod mikroskopem stereoskopowym, odłam końcówki, aby utworzyć otwór o średnicy zewnętrznej około 10 do 15 mikronów. Można to zmierzyć za pomocą skali na okularniku. Teraz napełnij igłę do iniekcji roztworem leku.Następnie w systemie do iniekcji przymocuj załadowaną igłę do mikromanipulatora. Przetestuj system w oleju mineralnym i skalibruj go tak, aby podawał dawkę od 0,5 do 2 nanolitrów, w zależności od wielkości docelowej struktury mózgu. Za pomocą siatki pomiarowej zmierz średnicę kropli, aby obliczyć ich objętość.Aby unieruchomić głowę przymocowanej pszczoły, należy użyć miękkiego wosku dentystycznego, tak jak poprzednio. Następnie, za pomocą mikroskalpela, należy wyciąć otwór w przedniej części torebki głowy, wykonując trzy cięcia: jedno tuż poniżej oczka środkowego, jedno na krawędzi prawego lub lewego oka oraz jedno powyżej nasad czułków. Użyj kawałka wosku dentystycznego, aby utrzymać otwartą klapkę na miejscu.Następnie ostrożnie odsunąć gruczoły i tchawicę za pomocą precyzyjnej pęsety i wykonać niewielkie nacięcie w neurylemmie powyżej docelowej struktury mózgu. Teraz wprowadzić końcówkę szklanej pipety do pożądanego regionu mózgu, idealnie prostopadle do jego powierzchni, na głębokość niezbędną do osiągnięcia docelowej struktury. Następnie wstrzyknąć dawkę leku.W przypadku targetowania sparowanych obszarów mózgu należy wykonać jedną injekcję do każdej półkuli, aby wpłynąć na obie półkule. Jeśli wraz z bolusem wstrzyknięty zostanie barwnik fluorescencyjny, powierzchowne obszary mózgu można oglądać przy użyciu światła fluorescencyjnego. Pozostałe obszary można sprawdzić później za pomocą mikroskopii konfokalnej.Po wstrzyknięciu przywróć na miejsce fragment kutykuli i uszczelnij nacięcie, roztapiając kryształ eikozanu o średnicy około jednego milimetra na kutykuli za pomocą cienkiego drutu przymocowanego do mikrolutownicy. Znacznie ograniczy to śmiertelność. Aby podać lek tak lotny, jak ten z podgrzanego włókna nichromowego, należy przygotować go w roztworze w czystym etanolu.Aby ostrożnie wywiercić otwory w zakrętce probówki o średnicy 50 mm, należy przełożyć przez nie dwa przewody. W celu wykonania włókna należy ciasno nawinąć drut nichromowy na gwóźdź, przyłączyć drut nichromowy do dwóch przewodów elektrycznych, a następnie wyciągnąć gwóźdź. Następnie należy zamocować przewody i uszczelnić otwory silikonem.Następnie podłącz przewody do źródła zasilania. Użyj termopary, aby zmierzyć temperaturę włókna. W celu skalibrowania urządzenia, ostrożnie nanieś pipetą 2 µL roztworu leku na włókno i pozwól etanolowi całkowicie odparować w temperaturze pokojowej.Zmieniaj napięcie prądu tak, aby bolus leku odparował w ciągu dziesięciu sekund od włączenia zasilania. Lek nie powinien ulec rozkładowi termicznemu. Przy dokładnej inspekcji na suchym włóknie zazwyczaj można dostrzec osad.Aby podać leki pszczole, należy umieścić pszczołę (wolno latającą lub unieruchomioną) w probówce i ostrożnie przymocować pokrywkę z wystającymi przewodami. Następnie należy włączyć źródło zasilania na 10 sekund i odczekać kolejne 50 sekund, aż odparowany związek zostanie w pełni wchłonięty przez pszczołę, a dopiero potem wyjąć owada. Specyficzne efekty w procesach mózgowych można łatwo uzyskać po iniekcji w klatkę piersiową.Na przykład, za pomocą tej techniki podawano inhibitory transkrypcji, aby zidentyfikować fazy pamięci wymagające ekspresji genów. Uzyskano selektywne i zależne od czasu efekty w zadaniach pamięciowych. Dyfuzja cząsteczek do hemolimfy głowowej prowadzi do szybkich, zależnych od dawki efektów osiąganych poprzez iniekcję do ocelli.Przy określonych stężeniach dawek, rozproszone allatostatyny obniżyły wyniki w teście uczenia się węchowego. Aby zbadać właściwości przestrzenne i czasowe konkretnych obszarów mózgu, przywiązane pszczoły poddano treningowi w paradygmacie warunkowania PER zapachu, a następnie wstrzyknięto prokanę do kielichów ciał grzybkowatych lub do płatów pionowych. Podczas późniejszego testowania pamięci, upośledzenie wyników zaobserwowano wyłącznie u pszczół, u których wykonano zastrzyki obustronnie.W arenie z wieloma poidełkami pszczoły były delikatnie odławywane w momencie, gdy miały usiąść na poidełku z roztworem sacharozy o stężeniu 1 M. Odłowione pszczoły poddano działaniu 100 µg odparowanej kokainy w formie wolnej zasady, co doprowadziło do zwiększenia intensywności żerowania przy poidełkach z roztworem 0,5 M, ale nie przy poidełkach z roztworem 2 M. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak podawać leki pszczołom w wolnym locie lub unieruchomionym, zarówno drogą iniekcji, jak i odparowania.Po opanowaniu tych technik można je z łatwością zastosować u dużej liczby pszczół w ciągu kilku godzin. Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak warunkowanie wyciągania trąbki, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące neurobiologii uczenia się i pamięci.

neuropharmacological-manipulation-restrained-free-flying-honey-bees

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Prezentujemy sposób wdrożenia metody farmakologii behawioralnej w paradygmacie apetycyjnego warunkowania węchowego u pszczół miodnych (Apis mellifera) poprzez systemiczne podawanie leków. Metoda ta pozwala w prosty i niezawodny sposób badać mechanizmy leżące u podstaw uczenia się i tworzenia pamięci.

Farmakologia behawioralna w klasycznym warunkowaniu odruchu wyciągania trąbka u pszczoły miodowej (Apis mellifera)

W tym protokole pokazujemy, jak kondycjonować zaprzęgnięte pszczoły miodne do bodźców dotykowych i wprowadzamy technikę przechwytywania ruchu 2D do analizy kinematyki wzorca próbkowania anteny na małą skalę.

Kondycjonowanie dotykowe i analiza ruchu w strategiach pobierania próbek czułków u pszczół miodnych (Apis mellifera L.)

W tym protokole opisujemy dwie strategie, które jednocześnie tłumią dwa geny (podwójny knockdown genu) u pszczół miodnych. Następnie przedstawiamy, jak wykorzystać test odpowiedzi na rozszerzenie trąby (PER) do zbadania wpływu knockdownu podwójnego genu na percepcję smakową pszczoły miodnej.

Pomiar podwójnego knockdownu genu i percepcji smakowej za pośrednictwem RNAi u pszczół miodnych (Apis mellifera)

Protokół warunkowania Proboscis Extension Response (PER), opracowany dla pszczół miodnych (Apis mellifera), dostarcza ekologicznie istotnych i łatwo mierzalnych środków do badania kilku różnych mechanizmów uczenia się u wielu gatunków owadów.

Protokół odpowiedzi na wydłużenie trąby do badania plastyczności behawioralnej u owadów: zastosowanie do badań podstawowych, biomedycznych i rolniczych

U pszczół miodnych ustalono jednoczesne zewnątrzkomórkowe długoterminowe zapisy z dwóch różnych neuropile mózgowych lub dwóch różnych dróg anatomicznych. Nagrania te pozwalają na badanie czasowych aspektów przetwarzania neuronalnego w różnych obszarach mózgu zarówno na poziomie pojedynczego neuronu, jak i na poziomie zespołu u zachowującego się zwierzęcia.

Jednoczesne długoterminowe zapisy na dwóch etapach przetwarzania neuronalnego u zachowujących się pszczół miodnych

Opisano nowy test behawioralny do badania krótkoterminowych reakcji smakowych swobodnie poruszających się trzmieli (Bombus terrestris) na składniki odżywcze i toksyny w roztworze.

Nowatorski test behawioralny do badania reakcji smakowych osobników, swobodnie poruszających się trzmieli (Bombus terrestris)

Tutaj opisujemy nasz szczegółowy protokół przygotowania jednokohortowych kolonii pszczół miodnych - użyteczne narzędzie do analizy fizjologii pracowników związanych z rolą. Opisujemy również szczegółowe protokoły leczenia pracowników hormonem juwenilnym i ekdyzonem, aby ocenić udział tych hormonów w regulacji zachowania i/lub fizjologii pracowników.

Przygotowanie kolonii jednokohortowych i leczenie hormonalne robotnic pszczół miodnych w celu analizy fizjologii związanej z rolą i/lub układem hormonalnym

Utrata kolonii pszczół miodnych stanowi wyzwanie dla służb zajmujących się zapylaniem upraw. Obecne praktyki ochrony owadów zapylających uzasadniają alternatywne podejście do minimalizacji kontaktu pszczół miodnych ze szkodliwymi pestycydami przy użyciu odstraszających środków chemicznych. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe metody protokołu śledzenia wizualnego w celu odstraszania pszczół.

Protokół śledzenia wideo w celu przesiewania środków chemicznych odstraszających pszczoły miodne

Ten protokół opisuje kroki korzystania z nowatorskiego oprogramowania, SwarmSight, do śledzenia klatka po klatce pozycji anteny owada i trąbki z konwencjonalnych kamer internetowych przy użyciu konwencjonalnych komputerów. Darmowe oprogramowanie typu open source przetwarza klatki około 120 razy szybciej niż ludzie i działa z dokładnością lepszą niż ludzka.

SwarmSight: Śledzenie w czasie rzeczywistym ruchów anteny owadów i odruchu wysuwania trąbki przy użyciu zwykłego preparatu i konwencjonalnego sprzętu

Aby przetestować hamujące działanie środków farmakologicznych na fosfolipazę C (PLC) w różnych regionach mózgu pszczoły miodnej, przedstawiamy test biochemiczny do pomiaru aktywności PLC w tych regionach. Test ten może być przydatny do porównywania aktywności PLC między tkankami, a także wśród pszczół wykazujących różne zachowania.

Wykrywanie aktywności fosfolipazy C w homogenacie mózgu pszczoły miodnej

Prezentowany tutaj jest protokół użycia systemu CRISPR-Cas9 do zmniejszenia produkcji białka w mózgu dorosłej pszczoły miodnej w celu zbadania swoistości przeciwciał.

Testowanie przeciwciał przeciwko receptorom anty-RDL i anty-mGlutR1 w skrawkach mózgu pszczoły miodnej przy użyciu CRISPR-Cas9

Poznaj metody podawania leków pszczołom miodnym Apis mellifera w badaniach neuroetologii i socjobiologii. Techniki obejmują podawanie doustne oraz iniekcje do tułowia, ocellusa lub traktu ocellarnego.

Neurofarmakologiczna manipulacja skrępowanych i swobodnie latających pszczół miodnych, Apis mellifera

Przeglądaj więcej filmów