Name: LED Thermo Flow — połączenie optogenetyki z cytometrią przepływową (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 49 s
Description: Poznaj metodę LED Thermo Flow łączącą optogenetykę z cytometrią przepływową do badania sygnałowania komórkowego w czasie rzeczywistym. Charakteryzuj narzędzia optogenetyczne w liniach Ramos B.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy J. Schmidtowi z Uniwersytetu we Fryburgu za skonstruowanie urządzenia. Dziękujemy P. Nielsenowi i D. Medgyesi za ich wsparcie i krytyczną lekturę tego manuskryptu. Badanie to było wspierane przez Deutsche Forschungsgemeinschaft za pośrednictwem SFB746 oraz przez Inicjatywę Doskonałości Niemieckiej Fundacji Badawczej (GSC-4, Spemann Graduate School).

1. Projektowanie i budowa urządzenia
<ol>
	<li>Eksperymenty pilotażowe 
	UWAGA: Wymagane natężenie światła dla określonego narzędzia optogenetycznego i typu komórki może się znacznie różnić. Eksperymenty pilotażowe z prototypami są przydatne do oszacowania minimalnego niezbędnego natężenia światła. Narzędziem optogenetycznym wykorzystanym w poniższych eksperymentach jest konstrukt fuzyjny Dronpa-Linker-Dronpa. Sekwencja Dronpa została uzyskana komercyjnie (patrz Lista materiałów). Długi łącznik został sklonowany pomiędzy dwiema sekwencjami Dronpa, aby umożliwić ekspresjonowanemu konstruktowi utworzenie wewnątrzcząsteczkowych (i międzycząsteczkowych) dimerów. Opisane poniżej kroki można dostosować do wielu innych narzędzi optogenetycznych lub substancji kontrolowanych optycznie.
	<ol>
		<li>Transdukować limfocyty Ramosa B za pomocą konstruktu zawierającego Dronpa-Linker-Dronpa zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi transdukcji przy użyciu supernatantu zawierającego retrowirusy z komórek pakujących. Zbieraj i licz komórki zgodnie z wcześniej opublikowanym protokołem13.</li>
		<li>Ponownie zawiesić komórki w stężeniu 1 x 106/ml w pożywce (RPMI 1640, 10% inaktywowany termicznie FCS, 2 mM L-glutamina, 100 U/ml penicyliny, 100 U/ml streptomycyny i 50 μM 2-merkaptoetanolu) i przenieść je do szklanej probówki FACS.</li>
		<li>Włożyć probówkę do cytometru przepływowego i zmierzyć intensywność fluorescencji Dronpa (kanał GFP)14,15.</li>
		<li>Nosić okulary ochronne do wszystkich dalszych kroków, aby chronić oczy przed potencjalnie szkodliwymi długościami fal.</li>
		<li>Ręcznie umieść światło LED o długości fali 500 nm na zewnątrz rurki i kontynuuj pomiar intensywności fluorescencji Dronpa.</li>
		<li>Zwiększaj liczbę i/lub intensywność diod LED, aż intensywność fluorescencji Dronpa zmniejszy się.</li>
		<li>Ręcznie umieść światło LED o długości fali 400 nm na zewnątrz tuby i kontynuuj pomiar intensywności fluorescencji Dronpa.</li>
		<li>Zwiększaj liczbę i/lub intensywność diod LED, aż intensywność fluorescencji Dronpa wzrośnie.</li>
		<li>Do budowy urządzenia należy użyć co najmniej tylu diod LED, ile przewidywano w razie potrzeby po fotoprzełączaniu w krokach 1.1.5 i 1.1.7.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Budowanie urządzenia 
	UWAGA: Urządzenie zostało zbudowane przez profesjonalny warsztat obróbki skrawaniem, Arbeitsgruppe Technik z Uniwersytetu we Fryburgu. Większość części jest wykonywana na zamówienie i nie jest dostępna na rynku. Dokładne wymiary każdej części przedstawiono na rysunkach 1 i 2. Aby wyjaśnić montaż tego urządzenia, dostępny jest dodatkowy film 1, a najważniejsze kroki opisano poniżej.
	<ol>
		<li>Kawałek młyna A z polichlorku winylu (PVC) z dokładnymi wymiarami pokazanymi na rysunku 1A.</li>
		<li>Włóż diody LED do wywierconych otworów w elemencie A i uszczelnij każdy otwór klejem PVC, aby zapobiec wyciekowi wody.</li>
		<li>Podłącz diody LED do transformatora wielokanałowego (każda długość fali powinna zajmować osobny kanał) o regulowanej mocy wyjściowej w zakresie 0-29 mA.</li>
		<li>Przymocuj zewnętrzną osłonę (B) za pomocą 3 do elementu A, jak pokazano, aby chronić diody LED przed uszkodzeniem fizycznym.</li>
		<li>Aby móc podłączyć urządzenie do pompy wodnej, należy wkleić zaciski rurowe (C) w wywiercone otwory elementu A (pokazane na rysunku 1a, przekrój Y: 9 mm i 61,5 mm) za pomocą kleju PVC.</li>
		<li>Wytnij rurkę z pleksiglasu o długości 58,5 mm (D1).</li>
		<li>Wykonaj elementy D2 i D3 z pleksiglasu, jak pokazano na rysunku 2.</li>
		<li>Przyklej kawałek D3 do spodu D1 za pomocą kleju do pleksiglasu.</li>
		<li>Przymocuj gumowy O-ring do elementu D2 i przyklej go do górnej części D1 za pomocą kleju do plexi. 
		UWAGA: Elementy D1, D2 i D3 razem tworzą część D.</li>
		<li>Włóż kawałek D do kawałka A za pomocą 3.</li>
		<li>Przetestuj urządzenie pod kątem wycieków wody przed podłączeniem zasilania do transformatora.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Pomiar kinetyki narzędzia optogenetycznego
<ol>
	<li>Przygotowywanie komórek
	<ol>
		<li>Hodowla limfocytów B Ramosa w pożywce RPMI (RPMI 1640, 10% inaktywowany termicznie FCS, 2 mM L-glutamina, 100 U/ml penicyliny, 100 U/ml streptomycyny i 50 μM 2-merkaptoetanolu) o gęstości 3-10 x 106 komórek/ml w 37 °C i 5% CO2 .</li>
		<li>Limfocyty B Ramosa zbiera się przez odwirowanie w temperaturze 350 x g i temperaturze 4 °C przez 5 minut.</li>
		<li>Policz komórki za pomocą komory liczącej Neubauera zgodnie z instrukcjami producenta i ponownie zawieś 1-5 x10 6 komórek w pożywce 600 μl.</li>
		<li>Przenieś komórki do szklanej probówki FACS, umieść je na lodzie i chroń przed światłem do czasu pomiaru.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować cytometr przepływowy i urządzenie.
	<ol>
		<li>Podłącz urządzenie do pompy podgrzewanej wody i ustaw temperaturę na 37 °C.</li>
		<li>W przypadku stosowania szklanych probówek FACS należy wymienić O-ring cytometru przepływowego na gumowy O-ring i dodatkowo nałożyć smar silikonowy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>pomiar
	<ol>
		<li>Ostrożnie włóż szklaną rurkę FACS do urządzenia i podłącz ją do cytometru przepływowego (rysunek 3).</li>
		<li>Rozpocznij pomiar i zapisz intensywność fluorescencji Dronpa (kanał GFP).</li>
		<li>Oświetlić próbkę komórki światłem o długości fali odpowiednio 400 nm lub 500 nm i zarejestrować intensywność fluorescencji Dronpa (kanał GFP).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>analiza danych
	<ol>
		<li>Analizuj dane eksperymentalne za pomocą odpowiedniego oprogramowania cytometru przepływowego. Wykreśl rozproszenie do przodu przeciwko rozproszeniu bocznemu i bramę żywych komórek. Wykreśl intensywność fluorescencji Dronpa w czasie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Dugue, G. P., Akemann, W., Knopfel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+concept+of+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">A comprehensive concept of optogenetics.</a> Prog Brain Res. 196, 1-28 (2012).</li>
<li>Tischer, D., Weiner, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+cell+signalling+with+optogenetic+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Illuminating cell signalling with optogenetic tools.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 551-558 (2014).</li>
<li>Toettcher, J. E., Voigt, C. A., Weiner, O. D., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+of+optogenetics+in+cell+biology%3A+interrogating+molecular+circuits+in+space+and+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">The promise of optogenetics in cell biology: interrogating molecular circuits in space and time.</a> Nat Methods. 8 (1), 35-38 (2011).</li>
<li>Zhang, K., Cui, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+intracellular+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of intracellular signaling pathways.</a> Trends Biotechnol. 33 (2), 92-100 (2015).</li>
<li>Bugaj, L. J., Choksi, A. T., Mesuda, C. K., Kane, R. S., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+protein+clustering+and+signaling+activation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Optogenetic protein clustering and signaling activation in mammalian cells.</a> Nat Methods. 10 (3), 249-252 (2013).</li>
<li>Bugaj, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+endogenous+transmembrane+receptors+through+optogenetic+Cry2+clustering%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Regulation of endogenous transmembrane receptors through optogenetic Cry2 clustering.</a> Nat Commun. 6, 6898(2015).</li>
<li>Strickland, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TULIPs%3A+tunable%2C+light-controlled+interacting+protein+tags+for+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">TULIPs: tunable, light-controlled interacting protein tags for cell biology.</a> Nat Methods. 9 (4), 379-384 (2012).</li>
<li>Taslimi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+optogenetic+clustering+tool+for+probing+protein+interaction+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">An optimized optogenetic clustering tool for probing protein interaction and function.</a> Nat Commun. 5, 4925(2014).</li>
<li>Toettcher, J. E., Gong, D., Lim, W. A., Weiner, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-based+feedback+for+controlling+intracellular+signaling+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Light-based feedback for controlling intracellular signaling dynamics.</a> Nat Methods. 8 (10), 837-839 (2011).</li>
<li>Toettcher, J. E., Weiner, O. D., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+optogenetics+to+interrogate+the+dynamic+control+of+signal+transmission+by+the+Ras%2FErk+module%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Using optogenetics to interrogate the dynamic control of signal transmission by the Ras/Erk module.</a> Cell. 155 (6), 1422-1434 (2013).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+a+photoactivatable+antigen+system+to+examine+B-cell+probing+termination+and+the+B-cell+receptor+sorting+mechanisms+during+B-cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Utilization of a photoactivatable antigen system to examine B-cell probing termination and the B-cell receptor sorting mechanisms during B-cell activation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (5), E558-E567 (2016).</li>
<li>Wend, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+protein+kinase+activity+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of protein kinase activity in mammalian cells.</a> ACS Synth Biol. 3 (5), 280-285 (2014).</li>
<li>Zhou, X. X., Chung, H. K., Lam, A. J., Lin, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+control+of+protein+activity+by+fluorescent+protein+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical control of protein activity by fluorescent protein domains.</a> Science. 338 (6108), 810-814 (2012).</li>
<li>Baumgarth, N., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+approach+to+multicolor+flow+cytometry+for+immunophenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping.</a> J Immunol Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).</li>
<li>Givan, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry%3A+an+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry: an introduction.</a> Methods Mol Biol. 699, 1-29 (2011).</li>
<li>Brakemann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reversibly+photoswitchable+GFP-like+protein+with+fluorescence+excitation+decoupled+from+switching%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A reversibly photoswitchable GFP-like protein with fluorescence excitation decoupled from switching.</a> Nat Biotechnol. 29 (10), 942-947 (2011).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

LED Thermo Flow to innowacyjne urządzenie do badania narzędzi optogenetycznych w cytometrze przepływowym.
Do tej pory próbki optogenetyczne były oświetlane jedynie za pomocą laserów mikroskopowych lub latarek11,12. W zależności od kąta i odległości latarki od próbki, spodziewana jest znaczna zmienność w ilości oświetlenia między eksperymentami. Ponadto istnieje ograniczenie liczby latarek, które jedna osoba może obsługiwać w eksperymencie. Ogranicza to repertuar eksperymentalny i od...

Narzędzia optogenetyczne zyskują na popularności, częściowo dlatego, że mogą być używane do rozszyfrowywania połączeń szlaków sygnałowych1-4. Opierają się one na zdolności białek fotoaktywowanych do zmiany ich konformacji i powinowactwa wiązania po oświetleniu światłem. Fuzja tych białek z elementami sygnałowymi pozwala na specyficzną regulację pojedynczego gracza w złożonych wewnątrzkomórkowych szlakach sygnałowych5-12. W związku z tym szlak sygnałowy może być badany z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną.
Większość badań optogenetycznych opartych na komórkach wykorzystuje metody oparte na mikroskopii w połączeniu z hodowlą w obecności światła, a następnie analizą biochemiczną11,12. Natomiast cytometr przepływowy pojedynczo izoluje komórki wzdłuż kapilary i mierzy wielkość komórki, ziarnistość i intensywność fluorescencji. Metoda ta ma duże zalety w porównaniu z mikroskopią lub metodami biochemicznymi, w tym możliwość analizy tysięcy żywych komórek w rozdzielczości pojedynczej komórki w bardzo krótkim czasie. Dlatego pożądane jest połączenie optogenetyki z cytometrią przepływową.
O ile nam wiadomo, nie ma ustalonego protokołu dla optogenetycznej cytometrii przepływowej. Powszechnie akceptowaną procedurą jest ręczne oświetlanie komórek spoza rurki reakcyjnej za pomocą latarek. Jednak ręczne oświetlenie w cytometrze przepływowym wymaga, aby światło przeszło przez rurkę reakcyjną i, w przypadku obrazowania żywych komórek, przez cylindryczną, podgrzewaną komorę wodną. Powoduje to znaczne rozproszenie światła i utratę światła. Co więcej, natężenie światła zapewniane przez oświetlenie ręczne nie jest odtwarzalne między eksperymentami (kąt, odległość itp.) i istnieje praktyczne ograniczenie liczby długości fal w jednym eksperymencie.
Konstruując urządzenie LED Thermo Flow, byliśmy w stanie przezwyciężyć te ograniczenia. Za pomocą tego urządzenia komórki mogą być oświetlane określonymi długościami fal w sposób kontrolowany temperaturą podczas pomiarów cytometrii przepływowej. Pozwala to na uzyskanie precyzyjnych i powtarzalnych ilości światła w eksperymentach i pomiędzy nimi.
Aby zademonstrować użyteczność naszego urządzenia in vivo, zarejestrowaliśmy sygnał fluorescencyjny Dronpa w komórkach B Ramosa podczas fotoprzełączania. Limfocyty B Ramosa pochodzą z ludzkiego chłoniaka Burkitta. Dronpa to białko fluorescencyjne, które występuje jako monomer, dimer lub tetramer. W postaci monomerycznej jest niefluorescencyjny. Oświetlenie światłem o długości fali 400 nm indukuje dimeryzację i tetrameryzację oraz sprawia, że białko Dronpa staje się fluorescencyjne. Proces ten można odwrócić poprzez oświetlenie światłem o długości fali 500 nm. Białko Dronpa zostało wykorzystane do kontrolowania funkcji i lokalizacji białek sygnałowych4,13.
Tutaj wyraziliśmy białko Dronpa-Linker-Dronpa w komórkach B Ramosa, aby zbadać fotoprzełączanie Dronpa w cytometrze przepływowym. Korzystając z naszego urządzenia, udało nam się sprawnie i powtarzalnie fotoswitch Dronpa, jednocześnie rejestrując jego intensywność fluorescencji w czasie rzeczywistym. Metoda ta zapewnia znaczne korzyści w porównaniu z obecnymi protokołami oświetlenia z oświetleniem ręcznym i znacznie poszerza repertuar eksperymentalny narzędzi optogenetycznych i związków klatkowych. Korzystanie z naszego urządzenia znacznie uprości i przyspieszy odkrywanie i opracowywanie nowych narzędzi optogenetycznych.

<table><tbody><tr><td>Szklana rurka FACS</td><td>Thermo Fisher Scientific; Waltham, Stany Zjednoczone</td><td>14-961-26</td><td>Rurki ze szkła borokrzemianowego 12x75 mm</td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy</td><td>BD Bioscienceg; Heidelberg, Niemcy</td> Dronpa <td>na specjalne zamówienie</td><td>Fortessa II</td></tr><tr><td>: pcDNA3-mNeptune2-N</td><td>Addgene; Cambridge, Stany Zjednoczone</td><td>41645</td><td></td></tr><tr><td>PolyJet</td><td>SignaGen, Rockville, Stany Zjednoczone</td><td>SL100688</td><td></td></tr><tr><td>LED 505 nm</td><td>Avago Technologies; Boeblingen, Niemcy</td><td>HLMP-CE34-Y1CDD</td><td></td></tr><tr><td>LED 400 nm</td><td>Avago Technologies; Boeblingen, Niemcy</td><td>UV5TZ-400-15</td><td></td></tr><tr><td>Rurka z pleksiglasu 15 mm</td><td>Maertin; Fryburg Bryzgowijski, Niemcy</td><td>76999</td><td></td></tr><tr><td>plexi 3 mm</td><td>Maertin; Fryburg Bryzgowijski, Niemcy</td><td>692230</td><td></td></tr><tr><td>plexi 2,5 mm</td><td>Maertin; Fryburg Bryzgowijski, Niemcy</td><td>692225</td><td></td></tr><tr><td>plexi 1,5 mm</td><td>Maertin; Fryburg Bryzgowijski, Niemcy</td><td>692215</td><td></td></tr><tr><td>Dachówka PCV 5 mm</td><td>Maertin; Fryburg Bryzgowijski, Niemcy</td><td>690020.005</td><td></td></tr><tr><td>Dachówka PCV 6 mm</td><td>Maertin; Fryburg Bryzgowijski, Niemcy</td><td>690020.006</td><td></td></tr><tr><td>Blok PVC 50 mm</td><td>Maertin; Fryburg Bryzgowijski, Niemcy</td><td>690020.050</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Niemcy</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>EMD; Niemcy</td><td>805740</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>PAN Biotech; Aidenbach, Niemcy</td><td>P30-3302</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Strptomycyna (10 000 U/ml)</td><td>Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Niemcy</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Klej do plexi Acrifix</td><td>Evonic industries, Essen, Niemcy</td><td>1R0192</td><td></td></tr><tr><td>Klej Tangit PVC-U</td><td>Henkel, D&uuml; sseldorf, Niemcy</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

led thermo flow — połączenie optogenetyki z cytometrią przepływową

LED Thermo Flow &#8212; Combining Optogenetics with Flow Cytometry

Narzędzia optogenetyczne pozwalają na izolowane, funkcjonalne badania prawie każdej cząsteczki sygnałowej w ramach złożonych szlaków sygnałowych. Główną przeszkodą jest kontrolowane dostarczanie światła do próbki komórki, stąd najpopularniejszymi narzędziami do badań optogenetycznych są analizy komórkowe oparte na mikroskopii oraz eksperymenty in vitro. Cytometr przepływowy ma wiele zalet w porównaniu z mikroskopem, w tym możliwość szybkiego pomiaru tysięcy komórek w rozdzielczości pojedynczej komórki. Jednak nie jest jeszcze szeroko stosowany w optogenetyce. Tutaj prezentujemy urządzenie, które łączy w sobie moc optogenetyki i cytometrii przepływowej: LED Thermo Flow. Urządzenie to oświetla ogniwa o określonych długościach fal, natężeniu światła i temperaturach podczas pomiarów cytometrii przepływowej. Można go zbudować przy niskich kosztach i używać z większością popularnych cytometrów przepływowych. Aby zademonstrować jego użyteczność, scharakteryzowaliśmy kinetykę fotoprzełączania białek Dronpa in vivo i w czasie rzeczywistym. Protokół ten może być dostosowany do prawie wszystkich substancji kontrolowanych optycznie i znacznie rozszerza zestaw możliwych eksperymentów. Co ważniejsze, znacznie uprości odkrywanie i opracowywanie nowych narzędzi optogenetycznych.

Wykorzystanie LED Thermo Flow w cytometrii przepływowej
Funkcjonalnym rdzeniem urządzenia jest cylindryczna komora, w której diody LED są rozmieszczone w sposób okrężny i skierowane do wewnątrz. Komora ta może zostać podłączona do dopływu wody i pompy, co umożliwia kontrolowanie temperatury diod LED, a także próbki komórek. Diody LED są podłączone do transformatora, dzięki czemu natężenie światła dla każdej długości fali może być ...

Optycznie kontrolowane substancje są potężnymi narzędziami do badania szlaków sygnałowych. Aby poszerzyć spektrum możliwych eksperymentów, opracowaliśmy urządzenie do badania substancji kontrolowanych optycznie w czasie rzeczywistym za pomocą cytometrii przepływowej: LED Thermo Flow.

LED Thermo Flow — połączenie optogenetyki z cytometrią przepływową

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the ...

Ogólnym celem tej metody jest stymulacja substancji kontrolowanych optycznie podczas pomiarów cytometrii przepływowej. To nowatorskie urządzenie może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie sygnalizacji komórkowej poprzez połączenie mocy substancji kontrolowanych optycznie z cytometrią przepływową. Po raz pierwszy narzędzia optogenetyczne mogą być charakteryzowane i analizowane za pomocą cytometrii przepływowej.Do dziś nie istniała żadna porównywalna sprawdzona metoda. Na początek zawiesić transdukowane limfocyty B Ramosa w stężeniu miliona komórek na mililitr i przenieść je do szklanej probówki FACS. Następnie wymień O-ring cytometru przepływowego na gumowy O-ring i nałóż smar silikonowy, aby uzyskać lepsze uszczelnienie.Włóż szklaną rurkę do cytometru przepływowego i umieść prototyp diody LED wokół rurki przy wyłączonych światłach. Zmierz intensywność fluorescencji Dronpa w kanale GFP. Najważniejszym etapem procedury jest obchodzenie się ze szklanymi rurkami.Szklane probówki FACS są bardzo delikatne i dlatego zaleca się przećwiczenie wkładania szklanych probówek do cytometru przed wykonaniem eksperymentów. Następnie włącz światło LED o długości 500 nanometrów na zewnątrz rurki i kontynuuj pomiar intensywności fluorescencji Dronpa. Zwiększaj intensywność świateł LED, aż intensywność fluorescencji Dronpa zmniejszy się, w celu oszacowania minimalnego natężenia światła potrzebnego do zmierzenia fotoprzełączania białka Dronpa-Linker-Dronpa.Następnie włącz 400-nanometrowe światło LED prototypu na zewnątrz rurki i kontynuuj pomiar intensywności fluorescencji Dronpa. Zwiększaj natężenie światła 400 nanometrowych diod LED, aż intensywność fluorescencji Dronpa wzrośnie. Zacznij od postępowania zgodnie z instrukcjami projektowania i produkcji zawartymi w dołączonym protokole tekstowym, aby wytworzyć wewnętrzną i zewnętrzną warstwę urządzenia LED do fotoprzełączania.Włóż diody LED o długości fali 400 i 500 nanometrów do kanałów urządzenia. Przyklej je na miejscu i odrutuj zgodnie z zaleceniami. Te specyficzne długości fal zostaną wykorzystane do przełączania białek fuzyjnych Dronpa-Linker-Dronpa między ich ciemnymi i jasnymi stanami.Następnie zmontuj urządzenie i upewnij się, że jest wodoszczelne, aby zapobiec wyciekom przed włączeniem transformatora. Po zmontowaniu urządzenia zbierz limfocyty Ramosa B i zawieś je w gęstości od trzech do dziesięciu milionów komórek na mililitr. Przenieś 600 mikrolitrów komórek do szklanej probówki FACS.Umieść je na lodzie i chroń komórki przed światłem, dopóki nie zostaną zmierzone. Podłącz zmontowane urządzenie do podgrzanej pompy wodnej i ustaw temperaturę na 37 stopni Celsjusza. Następnie ostrożnie włóż szklaną rurkę FACS do urządzenia i podłącz ją do cytometru przepływowego.Zapisz intensywność fluorescencji Dronpa w kanale GFP. Konstrukcja tego urządzenia optogenetycznego obejmuje komorę, którą można podłączyć do źródła wody obiegowej w celu utrzymania temperatury próbki na stałym poziomie. Podczas gdy urządzenie emitowało trzy różne długości fal, zaobserwowano tylko marginalny wzrost temperatury w próbce FACS, gdy przepływała przez nie woda o temperaturze 37 stopni Celsjusza.Konstrukt fuzyjny Dronpa-Linker-Dronpa został sklonowany i przetoczony do limfocytów B Ramosa. Po skierowaniu do stanu monomeru przez źródło światła o długości 500 nanometrów intensywność emisji maleje. Następnie, po przełączeniu źródła światła na światło 400 nanometrów, monomer Dronpa jest szybko przełączany w stan ściemniacza, a intensywność szybko wzrasta.Za pomocą tego urządzenia cytozolowe białko fuzyjne Dronpa-Linker-Dronpa było w stanie być wielokrotnie fotoprzełączane. Przełączenie w stan ciemny następuje powoli, podczas gdy przejście w stan jasny następuje niemal natychmiast. Spontaniczne odzyskiwanie fluorescencji Dronpy w ciemności pokazuje, że skuteczne fotoprzełączanie na jasną formę wymaga specyficznego oświetlenia i tylko powoli zachodzi spontanicznie.Analiza kinetyczna pokazuje, że prędkość fotoprzełączania jest ogólnie bardzo powtarzalna i że nawet po długiej inkubacji w ciemności tylko około dziesięciu procent fluorescencji jest odzyskiwane bez fotoprzełączania. Zgodnie z tą procedurą można przeprowadzić dowolną analizę cytometryczną przepływową, w tym pomiary strumienia wapnia, w celu zbadania funkcjonalności wybranego narzędzia optogenetycznego. Po jej opracowaniu, technika ta utoruje drogę naukowcom w dziedzinie optogenetyki do zbadania okablowania szlaków sygnalizacji komórkowej.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak ustalić protokół fotoprzełączania dla swojego konkretnego narzędzia optogenetycznego. Nie zapominaj, że światło UV może być bardzo niebezpieczne, a środki ostrożności, takie jak okulary ochronne, powinny być zawsze noszone podczas wykonywania tej procedury.

led-thermo-flow-combining-optogenetics-with-flow-cytometry

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film demonstruje test cytometrii przepływowej do ilościowego określenia poziomów ROS w organoidach jelitowych 3D uzyskanych od transgenicznych myszy wykazujących ekspresję GFP. Metoda ta zapewnia eksperymentalny model in vitro do zbadania skuteczności badanych związków w produkcji ROS.

Test cytometrii przepływowej do ilościowego określania stresu oksydacyjnego: Test do ilościowego określania reaktywnych form tlenu w organoidach jelitowych za pomocą sond fluorogennych

Ten film demonstruje cytometrię przepływową do pomiaru wychwytu mikrogleju przez fluorescencyjne biocząstki po dostrzodowisku do ciała szklistego w oku myszy. Cytometria przepływowa wykrywa żywe komórki wykazujące ekspresję CD11b i odróżnia fagocytarne komórki mikrogleju wykazujące zieloną fluorescencję od innych komórek szpikowych, w tym monocytów eksprymujących Ly6C i neutrofili wykazujących ekspresję Ly6G.

Pomiar wychwytu mikrogleju przez cząstki fluorescencyjne dostarczane do ciała szklistkowego za pomocą cytometrii przepływowej

Wideo demonstruje test cytometrii przepływowej rezonansu fluorescencji (FRET) w celu wykrycia aktywności wysiewu agregatów białkowych wyizolowanych z próbek biologicznych. Komórki ssaków wykazujące ekspresję białek reporterowych tau są inkubowane z kompleksami transdukcji liposomów zawierającymi nasiona tau. Nasiona te pośredniczą w agregacji białek reporterowych, prowadząc do generowania dodatniego sygnału FRET w cytometrze przepływowym.

Technika cytometrii przepływowej FRET do wykrywania agregacji białek reporterowych indukowanej nasionami Tau

Analiza cytometryczna cytometrii dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji dostarcza wysokoprzepustową metodę ilościową do badania interakcji białko-białko. Metodologia ta może być stosowana do mapowania miejsc wiązania białek oraz do badań przesiewowych czynników regulujących interakcję białko-białko.

Analiza cytometryczna cytometrii dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji: wysokoprzepustowa metoda ilościowa do badania interakcji białko-białko

Prezentujemy metody badania wpływu PSM i innych toksyn wydzielanych przez Staphylococcus aureus na neutrofile za pomocą cytometrii przepływowej i mikroskopii fluorescencyjnej.

Badanie oddziaływań Staphylococcus aureus z neutrofilami za pomocą cytometrii przepływowej i mikroskopii poklatkowej

Podczas gdy infiltrujące makrofagi są stale rekrutowane do tkanek dorosłych z krążących prekursorów, makrofagi rezydentne zasiewają swoją tkankę podczas rozwoju, gdzie są utrzymywane bez dalszego wkładu ze strony przodków. Niedawno zidentyfikowano prekursorów rezydujących makrofagów. W tym miejscu przedstawiono metody genetycznego mapowania losów rezydentnych przodków makrofagów.

Identyfikacja przodków erytromieloidów i ich potomstwa w zarodku myszy za pomocą cytometrii przepływowej

Ten protokół opisuje implementację systemu mikroskopii optycznej z asymetrycznym wykrywaniem i rozciąganiem w czasie do obrazowania pojedynczych komórek w ultraszybkim przepływie mikroprzepływowym oraz jego zastosowania w obrazowaniu cytometrii przepływowej.

Obrazowanie mikroprzepływowe Cytometria przepływowa za pomocą mikroskopii optycznej z asymetrycznym wykrywaniem i rozciąganiem w czasie (ATOM)

Tutaj prezentujemy protokół do analizy transferu informacji oscylacyjnych między komórkami za pomocą kontroli optogenetycznej i monitorowania ekspresji genów na żywo. Podejście to stanowi unikalną platformę do testowania funkcjonalnego znaczenia programów dynamicznej ekspresji genów w systemach wielokomórkowych.

Metoda optogenetyczna do kontroli i analizy wzorców ekspresji genów w interakcjach międzykomórkowych

Tutaj prezentujemy metodę opartą na cytometrii przepływowej do wizualizacji i kwantyfikacji wielu markerów związanych ze starzeniem się w pojedynczych komórkach.

Jednoczesne obrazowanie i wykrywanie za pomocą cytometrii przepływowej wielu fluorescencyjnych markerów starzenia w starczych komórkach nowotworowych wywołanych terapią

Wizualna, jednocząsteczkowa biochemia badana za pomocą komór mikroprzepływowych jest znacznie ułatwiona dzięki szklanemu cylindrowi, gazoszczelnym strzykawkom, stabilnym połączeniom rurek z komórkami przepływowymi i eliminacji pęcherzyków poprzez umieszczenie zaworów przełączających między strzykawkami a rurkami. Protokół opisuje podwójne pułapki optyczne, które umożliwiają wizualizację transakcji DNA i oddziaływań międzycząsteczkowych.

Zastosowanie podwójnej pęsety optycznej i mikrofluidyki do badań pojedynczych cząsteczek

Badanie opisuje metodę eksperymentów o wysokiej przepustowości z wykorzystą matrycę LED drukowaną w 3D, aby zoptymalizować ekspresję genów indukowanych światłem w HEK293T komórkach.

Szybka optymalizacja systemu indukowalnego światłem do kontroli ekspresji genów ssaków

Poznaj metodę LED Thermo Flow łączącą optogenetykę z cytometrią przepływową do badania sygnałowania komórkowego w czasie rzeczywistym. Charakteryzuj narzędzia optogenetyczne w liniach Ramos B.

LED Thermo Flow — połączenie optogenetyki z cytometrią przepływową

Przeglądaj więcej filmów