LED Thermo Flow — połączenie optogenetyki z cytometrią przepływową
December 30th, 2016
Optycznie kontrolowane substancje są potężnymi narzędziami do badania szlaków sygnałowych. Aby poszerzyć spektrum możliwych eksperymentów, opracowaliśmy urządzenie do badania substancji kontrolowanych optycznie w czasie rzeczywistym za pomocą cytometrii przepływowej: LED Thermo Flow.
Ogólnym celem tej metody jest stymulacja substancji kontrolowanych optycznie podczas pomiarów cytometrii przepływowej. To nowatorskie urządzenie może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie sygnalizacji komórkowej poprzez połączenie mocy substancji kontrolowanych optycznie z cytometrią przepływową. Po raz pierwszy narzędzia optogenetyczne mogą być charakteryzowane i analizowane za pomocą cytometrii przepływowej.
Do dziś nie istniała żadna porównywalna sprawdzona metoda. Na początek zawiesić transdukowane limfocyty B Ramosa w stężeniu miliona komórek na mililitr i przenieść je do szklanej probówki FACS. Następnie wymień O-ring cytometru przepływowego na gumowy O-ring i nałóż smar silikonowy, aby uzyskać lepsze uszczelnienie.
Włóż szklaną rurkę do cytometru przepływowego i umieść prototyp diody LED wokół rurki przy wyłączonych światłach. Zmierz intensywność fluorescencji Dronpa w kanale GFP. Najważniejszym etapem procedury jest obchodzenie się ze szklanymi rurkami.
Szklane probówki FACS są bardzo delikatne i dlatego zaleca się przećwiczenie wkładania szklanych probówek do cytometru przed wykonaniem eksperymentów. Następnie włącz światło LED o długości 500 nanometrów na zewnątrz rurki i kontynuuj pomiar intensywności fluorescencji Dronpa. Zwiększaj intensywność świateł LED, aż intensywność fluorescencji Dronpa zmniejszy się, w celu oszacowania minimalnego natężenia światła potrzebnego do zmierzenia fotoprzełączania białka Dronpa-Linker-Dronpa.
Następnie włącz 400-nanometrowe światło LED prototypu na zewnątrz rurki i kontynuuj pomiar intensywności fluorescencji Dronpa. Zwiększaj natężenie światła 400 nanometrowych diod LED, aż intensywność fluorescencji Dronpa wzrośnie. Zacznij od postępowania zgodnie z instrukcjami projektowania i produkcji zawartymi w dołączonym protokole tekstowym, aby wytworzyć wewnętrzną i zewnętrzną warstwę urządzenia LED do fotoprzełączania.
Włóż diody LED o długości fali 400 i 500 nanometrów do kanałów urządzenia. Przyklej je na miejscu i odrutuj zgodnie z zaleceniami. Te specyficzne długości fal zostaną wykorzystane do przełączania białek fuzyjnych Dronpa-Linker-Dronpa między ich ciemnymi i jasnymi stanami.
Następnie zmontuj urządzenie i upewnij się, że jest wodoszczelne, aby zapobiec wyciekom przed włączeniem transformatora. Po zmontowaniu urządzenia zbierz limfocyty Ramosa B i zawieś je w gęstości od trzech do dziesięciu milionów komórek na mililitr. Przenieś 600 mikrolitrów komórek do szklanej probówki FACS.
Umieść je na lodzie i chroń komórki przed światłem, dopóki nie zostaną zmierzone. Podłącz zmontowane urządzenie do podgrzanej pompy wodnej i ustaw temperaturę na 37 stopni Celsjusza. Następnie ostrożnie włóż szklaną rurkę FACS do urządzenia i podłącz ją do cytometru przepływowego.
Zapisz intensywność fluorescencji Dronpa w kanale GFP. Konstrukcja tego urządzenia optogenetycznego obejmuje komorę, którą można podłączyć do źródła wody obiegowej w celu utrzymania temperatury próbki na stałym poziomie. Podczas gdy urządzenie emitowało trzy różne długości fal, zaobserwowano tylko marginalny wzrost temperatury w próbce FACS, gdy przepływała przez nie woda o temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Konstrukt fuzyjny Dronpa-Linker-Dronpa został sklonowany i przetoczony do limfocytów B Ramosa. Po skierowaniu do stanu monomeru przez źródło światła o długości 500 nanometrów intensywność emisji maleje. Następnie, po przełączeniu źródła światła na światło 400 nanometrów, monomer Dronpa jest szybko przełączany w stan ściemniacza, a intensywność szybko wzrasta.
Za pomocą tego urządzenia cytozolowe białko fuzyjne Dronpa-Linker-Dronpa było w stanie być wielokrotnie fotoprzełączane. Przełączenie w stan ciemny następuje powoli, podczas gdy przejście w stan jasny następuje niemal natychmiast. Spontaniczne odzyskiwanie fluorescencji Dronpy w ciemności pokazuje, że skuteczne fotoprzełączanie na jasną formę wymaga specyficznego oświetlenia i tylko powoli zachodzi spontanicznie.
Analiza kinetyczna pokazuje, że prędkość fotoprzełączania jest ogólnie bardzo powtarzalna i że nawet po długiej inkubacji w ciemności tylko około dziesięciu procent fluorescencji jest odzyskiwane bez fotoprzełączania. Zgodnie z tą procedurą można przeprowadzić dowolną analizę cytometryczną przepływową, w tym pomiary strumienia wapnia, w celu zbadania funkcjonalności wybranego narzędzia optogenetycznego. Po jej opracowaniu, technika ta utoruje drogę naukowcom w dziedzinie optogenetyki do zbadania okablowania szlaków sygnalizacji komórkowej.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak ustalić protokół fotoprzełączania dla swojego konkretnego narzędzia optogenetycznego. Nie zapominaj, że światło UV może być bardzo niebezpieczne, a środki ostrożności, takie jak okulary ochronne, powinny być zawsze noszone podczas wykonywania tej procedury.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overview
W tym artykule przedstawiono nowatorskie urządzenie przeznaczone do badań w czasie rzeczywistym substancji sterowanych optycznie z wykorzystaniem cytometrii przepływowej. Integrując narzędzia optogenetyczne z pomiarami cytometrycznymi przepływowymi, badacze mogą badać kluczowe pytania dotyczące sygnalizacji komórkowej.
Kluczowe Elementy Badania
Dział Obszaru Nauki
- Sygnalizacja komórkowa
- Optogenetyka
- Cytometria przepływowa
Wprowadzenie
- Substancje sterowane optycznie są cenne do badania szlaków sygnalizacyjnych.
- Cytometria przepływowa umożliwia analizę populacji komórek.
- Poprzednie metody nie łączyły tych dwóch potężnych technik.
- Niniejsze badanie wprowadza urządzenie, które umożliwia tę integrację.
Cel Badania
- Do stymulacji substancji sterowanych optycznie podczas pomiarów cytometrycznych przepływowych.
- Do charakteryzowania i analizy narzędzi optogenetycznych z wykorzystaniem cytometrii przepływowej.
- Do zapewnienia nowej metody badania sygnalizacji komórkowej.
Zastosowane Metody
- Zawiesina transfekowanych limfocytów B Ramosa w stężeniu jednego miliona komórek na mililitr.
- Przeniesienie komórek do szklanej probówki FACS.
- Wymieniono czarny O-ring cytometru przepływowego na gumowy O-ring.
- Nałożono smar silikonowy w celu zapewnienia lepszego uszczelnienia.
Główne Wyniki
- Urządzenie z powodzeniem integruje stymulację optogenetyczną z cytometrią przepływową.
- Umożliwia analizę w czasie rzeczywistym szlaków sygnalizacji komórkowej.
- Umożliwia po raz pierwszy charakteryzację narzędzi optogenetycznych.
- Wypełnia lukę w istniejących metodologiach badania sygnalizacji komórkowej.
Wnioski
- Niniejsze nowatorskie urządzenie stanowi znaczący postęp w badaniu sygnalizacji komórkowej.
- Otwiera nowe możliwości badawcze z wykorzystaniem substancji sterowanych optycznie.
- Przyszłe badania mogą wykorzystać tę metodę do badania złożonych szlaków sygnalizacyjnych.
Często Zadawane Pytania
Executive Industry Relevance
Integrating optogenetic control with flow cytometry enables real-time, single-cell resolution analysis of signaling dynamics, addressing a critical gap in mechanistic de-risking for target validation. This approach enhances predictive confidence by allowing quantitative, reproducible assessment of photoswitching kinetics in live cells, supporting early discovery decisions. The low-cost, adaptable design facilitates enterprise reuse across optogenetic tool development pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through real-time photoswitching of optogenetic tools in live cells.
- Operational Value: Provides quantitative fluorescence readouts to clarify pathway dynamics and reduce mechanistic ambiguity.
- Predictive Value: Supports target confidence by characterizing optogenetic tool performance under physiologically relevant conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by establishing reproducible optogenetic control.
- Operational Value: Enables assay standardization through precise light intensity, wavelength, and temperature control during flow cytometric measurements.
- Scalability: Supports high-throughput analysis of thousands of cells per second, facilitating screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase optogenetic characterization to preclinical validation by enabling functional assessment in disease-relevant systems.
- Mechanistic De-risking: Allows exploration of optogenetic tool functionality in complex signaling pathways, reducing late-stage biological risk.
- Predictive Confidence: Generates quantitative kinetic data to inform go/no-go decisions in target advancement.
Pipeline & Workflow Integration
The method positions itself at the intersection of early discovery and lead identification, enabling hypothesis testing and assay readiness for optogenetic tool evaluation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by allowing real-time manipulation and measurement of optically controlled substances in live cells.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized, reproducible photoswitching measurements at single-cell resolution.
- Analytics: Provides quantitative fluorescence intensity readouts and kinetic analysis to compare conditions and assess tool performance.
- Translational Research: Enables preclinical continuity by characterizing optogenetic tools in a flow-compatible, physiologically relevant format.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, low-cost platform adaptable to diverse optogenetic tools and experimental designs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in optogenetic tool function, reduction of mechanistic ambiguity in signaling pathways.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of photoswitching measurements across cell populations.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions, capital efficiency in tool development, and reduced late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of optogenetic candidates based on quantitative kinetic profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optogenetics, flow cytometry, and basic device assembly.
- Needs access to a flow cytometer, LED light sources, and temperature control via water pump.
- Demands cross-team standardization for consistent light delivery, temperature control, and sample handling.
- Involves adaptation considerations for different cell types, optogenetic tools, and wavelength requirements.
- Includes practical limitations such as glass tube fragility and UV light hazards requiring protective measures.
