LED Thermo Flow — połączenie optogenetyki z cytometrią przepływową
30 grudnia 2016
Optycznie kontrolowane substancje są potężnymi narzędziami do badania szlaków sygnałowych. Aby poszerzyć spektrum możliwych eksperymentów, opracowaliśmy urządzenie do badania substancji kontrolowanych optycznie w czasie rzeczywistym za pomocą cytometrii przepływowej: LED Thermo Flow.
Ogólnym celem tej metody jest stymulacja substancji kontrolowanych optycznie podczas pomiarów cytometrii przepływowej. To nowatorskie urządzenie może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie sygnalizacji komórkowej poprzez połączenie mocy substancji kontrolowanych optycznie z cytometrią przepływową. Po raz pierwszy narzędzia optogenetyczne mogą być charakteryzowane i analizowane za pomocą cytometrii przepływowej.
Do dziś nie istniała żadna porównywalna sprawdzona metoda. Na początek zawiesić transdukowane limfocyty B Ramosa w stężeniu miliona komórek na mililitr i przenieść je do szklanej probówki FACS. Następnie wymień O-ring cytometru przepływowego na gumowy O-ring i nałóż smar silikonowy, aby uzyskać lepsze uszczelnienie.
Włóż szklaną rurkę do cytometru przepływowego i umieść prototyp diody LED wokół rurki przy wyłączonych światłach. Zmierz intensywność fluorescencji Dronpa w kanale GFP. Najważniejszym etapem procedury jest obchodzenie się ze szklanymi rurkami.
Szklane probówki FACS są bardzo delikatne i dlatego zaleca się przećwiczenie wkładania szklanych probówek do cytometru przed wykonaniem eksperymentów. Następnie włącz światło LED o długości 500 nanometrów na zewnątrz rurki i kontynuuj pomiar intensywności fluorescencji Dronpa. Zwiększaj intensywność świateł LED, aż intensywność fluorescencji Dronpa zmniejszy się, w celu oszacowania minimalnego natężenia światła potrzebnego do zmierzenia fotoprzełączania białka Dronpa-Linker-Dronpa.
Następnie włącz 400-nanometrowe światło LED prototypu na zewnątrz rurki i kontynuuj pomiar intensywności fluorescencji Dronpa. Zwiększaj natężenie światła 400 nanometrowych diod LED, aż intensywność fluorescencji Dronpa wzrośnie. Zacznij od postępowania zgodnie z instrukcjami projektowania i produkcji zawartymi w dołączonym protokole tekstowym, aby wytworzyć wewnętrzną i zewnętrzną warstwę urządzenia LED do fotoprzełączania.
Włóż diody LED o długości fali 400 i 500 nanometrów do kanałów urządzenia. Przyklej je na miejscu i odrutuj zgodnie z zaleceniami. Te specyficzne długości fal zostaną wykorzystane do przełączania białek fuzyjnych Dronpa-Linker-Dronpa między ich ciemnymi i jasnymi stanami.
Następnie zmontuj urządzenie i upewnij się, że jest wodoszczelne, aby zapobiec wyciekom przed włączeniem transformatora. Po zmontowaniu urządzenia zbierz limfocyty Ramosa B i zawieś je w gęstości od trzech do dziesięciu milionów komórek na mililitr. Przenieś 600 mikrolitrów komórek do szklanej probówki FACS.
Umieść je na lodzie i chroń komórki przed światłem, dopóki nie zostaną zmierzone. Podłącz zmontowane urządzenie do podgrzanej pompy wodnej i ustaw temperaturę na 37 stopni Celsjusza. Następnie ostrożnie włóż szklaną rurkę FACS do urządzenia i podłącz ją do cytometru przepływowego.
Zapisz intensywność fluorescencji Dronpa w kanale GFP. Konstrukcja tego urządzenia optogenetycznego obejmuje komorę, którą można podłączyć do źródła wody obiegowej w celu utrzymania temperatury próbki na stałym poziomie. Podczas gdy urządzenie emitowało trzy różne długości fal, zaobserwowano tylko marginalny wzrost temperatury w próbce FACS, gdy przepływała przez nie woda o temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Konstrukt fuzyjny Dronpa-Linker-Dronpa został sklonowany i przetoczony do limfocytów B Ramosa. Po skierowaniu do stanu monomeru przez źródło światła o długości 500 nanometrów intensywność emisji maleje. Następnie, po przełączeniu źródła światła na światło 400 nanometrów, monomer Dronpa jest szybko przełączany w stan ściemniacza, a intensywność szybko wzrasta.
Za pomocą tego urządzenia cytozolowe białko fuzyjne Dronpa-Linker-Dronpa było w stanie być wielokrotnie fotoprzełączane. Przełączenie w stan ciemny następuje powoli, podczas gdy przejście w stan jasny następuje niemal natychmiast. Spontaniczne odzyskiwanie fluorescencji Dronpy w ciemności pokazuje, że skuteczne fotoprzełączanie na jasną formę wymaga specyficznego oświetlenia i tylko powoli zachodzi spontanicznie.
Analiza kinetyczna pokazuje, że prędkość fotoprzełączania jest ogólnie bardzo powtarzalna i że nawet po długiej inkubacji w ciemności tylko około dziesięciu procent fluorescencji jest odzyskiwane bez fotoprzełączania. Zgodnie z tą procedurą można przeprowadzić dowolną analizę cytometryczną przepływową, w tym pomiary strumienia wapnia, w celu zbadania funkcjonalności wybranego narzędzia optogenetycznego. Po jej opracowaniu, technika ta utoruje drogę naukowcom w dziedzinie optogenetyki do zbadania okablowania szlaków sygnalizacji komórkowej.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak ustalić protokół fotoprzełączania dla swojego konkretnego narzędzia optogenetycznego. Nie zapominaj, że światło UV może być bardzo niebezpieczne, a środki ostrożności, takie jak okulary ochronne, powinny być zawsze noszone podczas wykonywania tej procedury.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia nowatorskie urządzenie zaprojektowane do badania substancji sterowanych optycznie w czasie rzeczywistym przy użyciu cytometrii przepływowej. Dzięki integracji narzędzi optogenetycznych z pomiarami cytometrii przepływowej badacze mogą zgłębiać kluczowe pytania dotyczące sygnalizacji komórkowej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Sygnalizacja komórkowa
- Optogenetyka
- Cytometria przepływowa
Wstęp
- Substancje sterowane optycznie są cenne w badaniu szlaków sygnałowych.
- Cytometria przepływowa umożliwia analizę populacji komórkowych.
- Poprzednie metody nie łączyły tych dwóch potężnych technik.
- Niniejsza praca wprowadza urządzenie, które umożliwia taką integrację.
Cel badania
- Aby stymulować substancje sterowane optycznie podczas pomiarów cytometrycznych.
- Aby charakteryzować i analizować narzędzia optogenetyczne z wykorzystaniem cytometrii przepływowej.
- Aby dostarczyć nową metodę badania sygnalizacji komórkowej.
Zastosowane metody
- Zzawieszone przetransdukowane limfocyty B linii Ramos w stężeniu jeden milion komórek na mililitr.
- Przeniesienie komórek do szklanej probówki do analizy FACS.
- Wymiana czarnego pierścienia O-ring w cytometrze przepływowym na gumowy pierścień O-ring.
- Zastosowanie smaru silikonowego w celu zapewnienia lepszej szczelności.
Główne wyniki
- Urządzenie pomyślnie integruje stymulację optogenetyczną z cytometrią przepływową.
- Umożliwia analizę szlaków sygnałowych komórek w czasie rzeczywistym.
- Pozwala na po raz pierwszy na charakterystykę narzędzi optogenetycznych.
- Wypełnia lukę w istniejących metodologiach badania sygnalizacji komórkowej.
Wnioski
- To nowatorskie urządzenie stanowi znaczący postęp w badaniu sygnalizacji komórkowej.
- Otwiera ono nowe możliwości prowadzenia badań z wykorzystaniem substancji sterowanych optycznie.
- W przyszłych badaniach można wykorzystać tę metodę do analizy złożonych szlaków sygnalizacyjnych.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Integracja kontroli optogenetycznej z cytometrią przepływową umożliwia analizę dynamiki sygnalizacji w czasie rzeczywistym z rozdzielczością pojedynczych komórek, co pozwala wypełnić krytyczną lukę w mechanisticznym ograniczaniu ryzyka podczas walidacji celów. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną poprzez umożliwienie ilościowej, powtarzalnej oceny kinetyki przełączania fotochemicznego w żywych komórkach, co wspiera decyzje na wczesnym etapie odkryć. Tanie i adaptowalne rozwiązanie ułatwia ponowne wykorzystanie w ramach przedsiębiorstw w potokach rozwoju narzędzi optogenetycznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez przełączanie fotochemiczne narzędzi optogenetycznych w czasie rzeczywistym w żywych komórkach.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ilościowe odczyty fluorescencji w celu wyjaśnienia dynamiki szlaków i ograniczenia niejednoznaczności mechanistycznej.
- Wartość prognostyczna: Zwiększa pewność co do wyboru celu poprzez charakterystykę wydajności narzędzi optogenetycznych w warunkach istotnych fizjologicznie.
Przesiew i opracowanie analizy
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszych badań przesiewowych poprzez ustanowienie powtarzalnej kontroli optogenetycznej.
- Wartość operacyjna: Umożliwia standaryzację analizy dzięki precyzyjnej kontroli natężenia światła, długości fali i temperatury podczas pomiarów cytometrycznych.
- Skalowalność: Wspiera wysokoprzepustową analizę tysięcy komórek na sekundę, co ułatwia przygotowanie do badań przesiewowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy optogenetyczną charakterystykę na etapie odkryć z walidacją przedkliniczną, umożliwiając ocenę funkcjonalną w systemach istotnych dla danej choroby.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Pozwala na badanie funkcjonalności narzędzi optogenetycznych w złożonych szlakach sygnalizacyjnych, co zmniejsza ryzyko biologiczne na późnych etapach badań.
- Pewność prognostyczna: Generuje ilościowe dane kinetyczne, które stanowią podstawę do podejmowania decyzji o kontynuowaniu lub przerwaniu prac nad danym celem terapeutycznym.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta znajduje się na styku wczesnego etapu odkrywania i identyfikacji wiodących związków, umożliwiając testowanie hipotez oraz przygotowanie testów do oceny narzędzi optogenetycznych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez, umożliwiając manipulację i pomiar substancji sterowanych optycznie w czasie rzeczywistym w żywych komórkach.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość do analizy dzięki ustandaryzowanym, powtarzalnym pomiarom fotoprzełączania z rozdzielczością pojedynczej komórki.
- Analityka: Dostarcza ilościowe odczyty intensywności fluorescencji oraz analizę kinetyczną w celu porównania warunków i oceny wydajności narzędzi.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez charakteryzację narzędzi optogenetycznych w formacie kompatybilnym z przepływem i istotnym fizjologicznie.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje wielokrotnego użytku, niskokosztową platformę, którą można dostosować do różnych narzędzi optogenetycznych i planów doświadczalnych.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Przewidywalność funkcji narzędzi optogenetycznych, redukcja niejednoznaczności mechanistycznej w szlakach sygnalizacyjnych.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność pomiarów fotoprzełączania w populacjach komórek.
- Wartość strategiczna: Ulepszone decyzje typu go/no-go, efektywność kapitałowa w rozwoju narzędzi oraz zmniejszone ryzyko biologiczne na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja kandydatów optogenetycznych skorygowana o ryzyko na podstawie ilościowych profili kinetycznych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu optogenetyki, cytometrii przepływowej oraz podstawowego montażu urządzeń.
- Niezbędny jest dostęp do cytometru przepływowego, źródeł światła LED oraz systemu kontroli temperatury za pomocą pompy wodnej.
- Wymagana jest standaryzacja międzyzespołowa w celu zapewnienia spójnego dostarczania światła, kontroli temperatury i postępowania z próbkami.
- Uwzględniono kwestie adaptacji dla różnych typów komórek, narzędzi optogenetycznych oraz wymagań dotyczących długości fali.
- Uwzględniono ograniczenia praktyczne, takie jak kruchość szklanych rurek oraz zagrożenia związane ze światłem UV, wymagające zastosowania środków ochronnych.
