Name: Wizualizacja limfocytów z ekspresją IL-22 przy użyciu myszy reporterowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Poznaj metodę wizualizacji limfocytów produkujących IL-22 przy użyciu myszy reporterowych. Ta technika umożliwia identyfikację komórek odpornościowych in vivo w tkankach myszy oraz badanie odpowiedzi immunologicznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Kelli Czarra i Megan Karwan za pomoc techniczną dla zwierząt, Kathleen Noer i Robertę Matthai za pomoc w cytometrii przepływowej oraz Donnie Butcher i Miriam R. Anver za analizę patologiczną. Projekt ten był wspierany przez grant z Ely and Edythe Broad Foundation (dla Scotta Duruma) i został sfinansowany w całości lub w części z funduszy federalnych z National Cancer Institute, National Institutes of Health, na podstawie umowy nr 1. HHSN261200800001E (MRA).

Wszystkie zwierzęta otrzymały odpowiednią opiekę zgodnie z procedurami eksperymentalnymi opisanymi w Przewodniku po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych z 2011 roku Komitetu Frederick National Laboratory for Cancer Research.
1. Generacja myszy reporterowych IL-22-tdTomato metodą rekombinacji BAC
UWAGA: Myszy powinny być nieprzytomne i nie ruszać się w odpowiedzi na szkodliwy bodziec. Wysterylizuj obszar operacyjny 70% etanolem i wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne za pomocą sterylizatora z kulkami szklanymi.
<ol>
	<li>Oczyść DNA BAC (RP23-401E11, długość klonu 228391 bps) metodą ekstrakcji alkalicznej10,11. Scharakteryzuj klon BAC przez trawienie SpeI 5 μg RP23-401E11, aby potwierdzić prawidłowy rozmiar docelowego genu. UWAGA: DNA BAC zostało strawione na 14 fragmentów.</li>
	<li>Wstaw gen reporterowy TdTomato do miejsca Not I/Sal I wektora wahadłowego PLD53SC-A-GFP-B11 i zastąp gen GFP w tym samym miejscu. Następnie, używając BAC RP23-401E11 jako matrycy, amplifikować pola homologii (A i B) do pierwszego translacji eksonu Il-22 (ekson 1) metodą PCR (95 °C 2 min; 30 cykli po 95 °C przez 30 sekund, 55 °C przez 30 sekund i 72°C przez 30 sekund; i końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 10 minut). W systemie reakcyjnym 50 μl PCR dodać 50 ng (1 μl) DNA BAC, 0,5 μl starterów (10 μM), 40 μl PCR superMix o wysokiej wierności i 8 μl H2O. 
	UWAGA: Podkłady dla pudełek A i B są następujące: A pudełko do przodu: 5'- TGGCGCGCCGGAGCTGTGAAGAAAG i odwrotnie: 5'- CAGAGATCGCAAGTGTCAAC; B box Do przodu: 5'- GTTAATTAACTGCCCGTCAACA i do tyłu: 5'- TGGCCGGCCTGAGCACCTGCTT CATC10. Podkreślono miejsca występowania enzymów restrykcyjnych (Asc I i Pac I).</li>
	<li>Związać 500 ng Asc I strawionego A i 500 ng fragmentów B strawionych przez Pac I na 50 ng wektora PLD53SC-ATB (tdTomato) w temperaturze 16 °C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Przekształć oczyszczony wektor PLD53SC-ATB w komórki kompetentne BAC11 i hoduj je na płytkach agarowych Luria-Bertani(LB) z chloramfenikolem (20 μg/ml) i ampicyliną (30 μg/ml) w temperaturze 37 °C. Wybierz dwie do trzech kolonii kointegracji z płytek głównych Ch/Amp.</li>
	<li>Zaszczepić każdą kolonię w 1 ml LB uzupełnionym 20 μg/ml chloramfenikolu i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C i 225 obr./min. Rozprowadzić 100 μl każdej mieszaniny na płytce LB-agar (10 g Peptone 140, 5 g ekstraktu drożdżowego, 12 g agaru i 1 l wody; pH 7,5) uzupełnione chloramfenikolem i 4-4,5% sacharozy. Inkubować kulturę przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Wybierz zarówno duże, jak i małe kolonie i ponownie pokryj je na dwóch płytkach z agarem LB z chloramfenikolem. Następnie naświetl płytki ze światłem UV lub bez niego na 30 sekund i wybierz wrażliwe na promieniowanie UV kolonie do dalszej analizy.</li>
	<li>Zidentyfikuj zmodyfikowane DNA BAC metodą PCR przy użyciu heterozygotycznego startera tdTomato/IL-22 (Naprzód: 5' ACT TgT gCg ATC TCT gAT ggT; Rewers: 5' TgT AAT Cgg ggA TgT Cgg C). Warunki pracy termocyklera są następujące: 95 °C przez 2 minuty; 30 cykli w temperaturze 95 °C przez 30 sekund, 56 °C przez 30 sekund i 72 °C przez 30 sekund; i końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 10 min.</li>
	<li>Potwierdź sekwencję zmodyfikowanego obszaru BAC poprzez bezpośrednie sekwencjonowanie BAC DNA12.</li>
	<li>Znieczulić mysz biorcę dawką 0,25% tribromoetanolu do jamy otrzewnej podczas wszczepiania mikrowstrzykniętych zygot myszom C57BL/6c w pseudociąży.</li>
	<li>Linearyzować konstrukt BAC IL-22-tdTomato (10 μg) przez trawienie z 5 μl endonukleazy restrykcyjnej Pi-SceI w 100 μl układu reakcyjnego i mikrowstrzyknąć zlinearyzowane DNA BAC do zapłodnionych jaj samic C57BL/6 w stadium przedjądrowym13. Przeprowadź badania przesiewowe myszy transgenicznych za pomocą analizy Southern blot DNA wyizolowanego z biopsji ogona przy użyciu standardowych procedur.</li>
</ol>
2. Preparat jednokomórkowy ze śledziony, grasicy, węzłów chłonnych i łaty Peyera
UWAGA: IL-22-tdMyszy reporterskie były utrzymywane w National Cancer Institute (NCI, Frederick, MD). Metoda eutanazji jest zgodna z najnowszymi wytycznymi AVMA dotyczącymi eutanazji. Wszystkie myszy zostały poddane eutanazji za pomocą inhalacji CO2 14.
<ol>
	<li>Poddaj mysz mysz IL-22-tdTomato w komorze CO2 i połóż ją na czystej podkładce. Wysterylizuj skórę brzucha, spryskując ją 70% alkoholem i rozetnij. Usuń śledzionę w lewym boku i grasicę za mostkiem.</li>
	<li>Aby pobrać węzły krezkowe (znajdujące się w tkance krezki) i łaty Peyera (małe guzki limfoidalne w okolicy jelita krętego), należy pobrać perłowo-białe węzły krezkowe w pobliżu ściany jelita cienkiego za pomocą kleszczy preparacyjnych z drobno ząbkowanymi końcówkami, a następnie usunąć całe jelito cienkie i okrężnicę z organizmu. Znajdź przedłużone owalne plamy (łaty Peyera) wzdłuż jelita i odetnij je nożyczkami. Zmiel te tkanki limfatyczne (węzły chłonne i plastry Peyera) pojedynczo między dwoma matowymi szkiełkami do jednokomórkowej zawiesiny w buforze PBS / 1% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) na lodzie.</li>
	<li>Zmielić tkanki śledziony lub grasicy, stosując tę samą metodę, co w kroku 2.2. Odwirować zawiesinę śledziony przez 8 minut w 500 x g i 4 °C. Dodać 1 ml buforu lizującego ACK na śledzionę do osadów komórkowych.</li>
	<li>Dobrze wymieszaj i odstaw na 1 minutę. Do każdej próbki dodać 9 ml sterylnego buforu soli fizjologicznej (PBS). Wirować przez wirowanie przez 8 minut w sile 500 x g i temperaturze 4 °C w celu usunięcia czerwonych krwinek. 
	UWAGA: Nie dodawaj buforu lizującego ACK do komórek grasicy.</li>
	<li>Powstałe leukocyty należy zawiesić ponownie w 5 ml PBS i przepuścić komórki przez sitko o wielkości 100 μm. Zebrać granulki komórek przez odwirowanie przy 500 x g przez 8 min.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 5 ml pożywki RPMI lub buforze FACS i policzyć żywe komórki za pomocą 0,4% roztworu barwnika błękitu trypanowego/PBS.</li>
</ol>
3. Izolacja limfocytów śródnabłonkowych i komórek blaszki właściwej z jelit
<ol>
	<li>Otwórz skórę brzucha jak w kroku 2.1, przeciąć jelito cienkie, od dwunastnicy (obok żołądka) do jelita krętego (w pobliżu wyrostka robaczkowego) i całej okrężnicy, tuż nad odbytem. Usuń dodatkową tkankę tłuszczową i krezkową za pomocą kleszczy. Natychmiast umieść jelita w lodowatym PBS.</li>
	<li>Poszukaj plam Peyera (małych, szorstkich guzków) wzdłuż dystalnego obszaru jelita cienkiego. Usuń masy za pomocą kleszczy i otwórz jelito wzdłuż za pomocą nożyczek. Dokładnie przepłucz jelito 10 ml lodowatego PBS.</li>
	<li>Inkubować tkanki w 20 ml buforu do wstępnego wytrawiania (5 mM EDTA i 1 mM ditiotreitolu w zrównoważonym roztworze soli Hanka (HBSS)) przez 30 minut w temperaturze 37 °C z powolnymi obrotami (50 obr./min) w shakerze. Po każdej z 2 inkubacji usuń warstwę komórek nabłonka, zawierającą limfocyty śródnabłonkowe (IEL), poprzez intensywne wirowanie (30 sekund przy 12 000 obr./min) i przepuść wszystkie tkanki przez sitko do komórek o średnicy 100 μm.</li>
	<li>Dodać 20 ml nowego roztworu EDTA do tkanki w celu drugiej inkubacji przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Przepuścić frakcje IEL przez sitko do komórek o wielkości 100 μm i połączyć je z poprzednimi frakcjami. Pozostałe fragmenty jelita należy przechowywać na lodzie, który ma być poddany leczeniu w kroku 3.9.</li>
	<li>Odwirować zebrane frakcje IEL przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Przepłukać zebrane frakcje IEL 10 ml HBSS/5% FBS i odwirowywać je przez 5 minut w temperaturze 800 x g i 4 °C.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 8 ml 44% pożywki z krzemionki koloidalnej15 i nałożyć na nie 5 ml 67% pożywki z krzemionki koloidalnej. Odwirować mieszaninę komórek o gradiencie 44%/67,5% przez 20 minut w temperaturze pokojowej i 1 500 x g.</li>
	<li>Zbierz komórki IEL z pasma na interfejsie. Najpierw usunąć wierzchnią warstwę supernatantu (około 5 ml) za pomocą pipety o pojemności 1 ml. Następnie zbierz IELs na przecięciu gradientu ośrodka z krzemionki koloidalnej.</li>
	<li>Umyj IELs, dodając 10 ml pożywki RPMI. Obracać komórki przez 5 minut w temperaturze 800 x g i 4 °C. Ponownie zawiesić IELs w 5 ml RPMI dla kroku 3.15.</li>
	<li>W celu wyizolowania limfocytów blaszki właściwej (LPL) należy zmielić fragmenty tkanki jelitowej z etapu 3.4 na małe kawałki za pomocą nożyczek (1 mm) i wytrawić kawałki za pomocą 10 ml buforu wytrawiającego (0,05 g kolagenazy, 0,05 g DNazy i 0,3 g dypazy II w RPMI/5% FBS) przez 15-20 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Przefiltrować mieszaninę przez sitko o wielkości 70 μm. Supernatant przepływowy zawiera uwolniony LPL.</li>
	<li>Całkowicie strawić fragmenty jelita, powtarzając kroki 3.9-3.10 (zwykle należy je powtórzyć 3 razy). Za każdym razem należy połączyć supernatanty zawierające LPL.</li>
	<li>Zebrać komórki przez wirowanie przez 5 minut w temperaturze 1,500 x g i temperaturze pokojowej i ponownie zawiesić granulki w RPMI/5% FBS. Przepuść je przez sitko o wielkości 40 μm.</li>
	<li>Zawiesić granulki komórek w 10 ml 40% frakcji koloidalnej krzemionki o gradiencie 40:80 i nałożyć je na 5 ml frakcji 80% w probówce o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Przeprowadzić separację gradientu gęstości przez wirowanie przez 20 minut przy 1 500 x g i temperaturze pokojowej15.</li>
	<li>Zbierz LPL, jak opisano w kroku 3.7. Umyj je raz 10 ml PBS i ponownie zawieś granulki w 1 ml PBS/1% buforu FBS lub pożywki RPMI.</li>
	<li>Policz żywotne komórki (zarówno IELs, jak i LPL) za pomocą 0,4% roztworu niebieskiego barwnika trypanowego/PBS.</li>
</ol>
4. Ekspresja IL-22-tdPomidor w zapaleniu jelita grubego
<ol>
	<li>Przygotować zawiesiny pojedynczych komórek śledziony od myszy IL-22-TdTomato w stężeniu 1 x 107 komórek/ml w sterylnym PBS, jak opisano w krokach 2.1-2.4.</li>
	<li>Oczyść limfocyty T CD4 + za pomocą metody izolacji ujemnej komórek CD4 myszy10. Oznacz je anty-CD4-APC (klon RM4-5, 0,5 μl/1 x 106 komórek w buforze PBS/1% FBS) i anty-CD45RB-FITC (klon 16A, 0,5 μl/1 x 106 komórek w PBS/1% buforze FBS) przez inkubację w temperaturze 4 °C przez 30 min.</li>
	<li>Wirować komórki przez 5 minut w temperaturze 500 x g i w temperaturze 4 °C. Przemyć komórki 2 ml buforu PBS/1% FBS i ponownie zawiesić je w 1 ml buforu barwiącego PBS/1% FBS.</li>
	<li>Uruchom oznaczone limfocyty T na maszynie do cytometrii przepływowej16. Bramkować komórki w populacji limfocytów T i sortować podwójnie dodatnie komórki CD4 + CD45RB (długość fali wykryta przy laserach 488 nm i 633 nm). </li>
	<li>Zebrać posortowane komórki przez wirowanie przez 5 minut w temperaturze 500 x g i temperaturze 4 °C. Zawiesić granulki komórek w sterylnym buforze PBS o stężeniu 1 x 106 komórek/ml. Wstrzyknąć komórki (0,5 x 106) do otrzewnej każdej myszy biorcy Rag1-/-.</li>
	<li>Poświęć myszy biorcy pod CO2 w różnych punktach czasowych. Pobrać węzły chłonne krezkowe oraz jelito cienkie i grube, jak opisano w krokach 2.1 i 2.2. Umieść każdy węzeł chłonny krezkowy i przecięte jelito (papier/jelito/kanapka papierowa) w 4% paraformaldehydzie (PFA; uchwyt pod okapem oparowym) na noc, aby utrwalić tkanki. Zastąp PFA 18% sacharozą na 16-24 godziny, a następnie zamroź tkanki do cięcia.</li>
	<li>Użyj maszyny do kriostatu, aby przeciąć tissue17,18,19. Podgrzej skrawki tkanek do temperatury pokojowej przez około 60 minut i umieść je w acetonie na 10 minut w temperaturze pokojowej. Suszyć je w temperaturze pokojowej przez około 5 minut.</li>
	<li>Dodać FBS w nadmiarze, usunąć go pipetą i dodać anty-RFP w rozcieńczeniu 1:200 w 0,1% BSA/1x PBS. Inkubować przeciwciało w temperaturze 37 °C przez 60 minut.</li>
	<li>Przepłukać skrawki w 1x PBS przez 10 minut i nałożyć odpowiednie przeciwciało drugorzędowe (kozie przeciwciało anty-królicze 568) na tkankę, rozcieńczoną w stosunku 1:300 w 1% BSA/1x PBS, przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Opłucz szkiełka w 1x PBS przez 10 minut, wytrzyj je do sucha i dodaj szkiełka nakrywkowe.</li>
	<li>Wizualizacja wszystkich próbek za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego przy stałym oświetleniu (RFP: filtr wzbudzenia 540-580 nm) przy użyciu obiektywu 40X.</li>
</ol>

<ol><li>Awasthi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+IL-23+receptor+gfp+reporter+mice+reveal+distinct+populations+of+IL-17-producing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: IL-23 receptor gfp reporter mice reveal distinct populations of IL-17-producing cells.</a> J Immunol. 182, 5904-5908 (2009).</li>
<li>Price, A. E., Reinhardt, R. L., Liang, H. E., Locksley, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marking+and+quantifying+IL-17A-producing+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Marking and quantifying IL-17A-producing cells in vivo.</a> PLoS One. 7, e39750(2012).</li>
<li>Kamanaka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+interleukin-10+in+intestinal+lymphocytes+detected+by+an+interleukin-10+reporter+knockin+tiger+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Expression of interleukin-10 in intestinal lymphocytes detected by an interleukin-10 reporter knockin tiger mouse.</a> Immunity. 25, 941-952 (2006).</li>
<li>Sonnenberg, G. F., Fouser, L. A., Artis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Border+patrol%3A+regulation+of+immunity%2C+inflammation+and+tissue+homeostasis+at+barrier+surfaces+by+IL-22%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Border patrol: regulation of immunity, inflammation and tissue homeostasis at barrier surfaces by IL-22.</a> Nat Immunol. 12, 383-390 (2011).</li>
<li>Dumoutier, L., Louahed, J., Renauld, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+characterization+of+IL-10-related+T+cell-derived+inducible+factor+%28IL-TIF%29%2C+a+novel+cytokine+structurally+related+to+IL-10+and+inducible+by+IL-9%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cloning and characterization of IL-10-related T cell-derived inducible factor (IL-TIF), a novel cytokine structurally related to IL-10 and inducible by IL-9.</a> J Immunol. 164, 1814-1819 (2000).</li>
<li>Cella, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+natural+killer+cell+subset+provides+an+innate+source+of+IL-22+for+mucosal+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A human natural killer cell subset provides an innate source of IL-22 for mucosal immunity.</a> Nature. 457, 722-725 (2009).</li>
<li>Sanos, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RORgammat+and+commensal+microflora+are+required+for+the+differentiation+of+mucosal+interleukin+22-producing+NKp46%2B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">RORgammat and commensal microflora are required for the differentiation of mucosal interleukin 22-producing NKp46+ cells.</a> Nat Immunol. 10, 83-91 (2009).</li>
<li>Spits, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+lymphoid+cells--a+proposal+for+uniform+nomenclature%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Innate lymphoid cells--a proposal for uniform nomenclature.</a> Nat Rev Immunol. 13, 145-149 (2013).</li>
<li>Mazzucchelli, R. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+identification+of+IL-7+producing+cells+in+reporter+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Visualization and identification of IL-7 producing cells in reporter mice.</a> PLoS One. 4, e7637(2009).</li>
<li>Shen, W., Hixon, J. A., McLean, M. H., Li, W. Q., Durum, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-22-Expressing+Murine+Lymphocytes+Display+Plasticity+and+Pathogenicity+in+Reporter+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-22-Expressing Murine Lymphocytes Display Plasticity and Pathogenicity in Reporter Mice.</a> Front Immunol. 6, 662(2015).</li>
<li>Gong, S., Yang, X. W., Li, C., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+modification+of+bacterial+artificial+chromosomes+%28BACs%29+using+novel+shuttle+vectors+containing+the+R6Kgamma+origin+of+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Highly efficient modification of bacterial artificial chromosomes (BACs) using novel shuttle vectors containing the R6Kgamma origin of replication.</a> Genome Res. 12, 1992-1998 (2002).</li>
<li>Shen, W., Huang, Y., Tang, Y., Liu, D. P., Liang, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+method+to+modify+BACs+to+generate+large+recombinant+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A general method to modify BACs to generate large recombinant DNA fragments.</a> Mol Biotechnol. 31, 181-186 (2005).</li>
<li>Cho, A., Haruyama, N., Kulkarni, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol.+Chapter%22%5BJournal%5D)">Generation of transgenic mice.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter. Chapter 19, Unit 19 11(2009).</li>
<li>Danneman, P. J., Stein, S., Walshaw, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humane+and+practical+implications+of+using+carbon+dioxide+mixed+with+oxygen+for+anesthesia+or+euthanasia+of+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">Humane and practical implications of using carbon dioxide mixed with oxygen for anesthesia or euthanasia of rats.</a> Lab Anim Sci. 47, 376-385 (1997).</li>
<li>Omata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+coccidian+enteroepithelial+stages+of+Toxoplasma+gondii+from+the+intestinal+mucosa+of+cats+by+Percoll+density-gradient+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation of coccidian enteroepithelial stages of Toxoplasma gondii from the intestinal mucosa of cats by Percoll density-gradient centrifugation.</a> Parasitol Res. 83, 574-577 (1997).</li>
<li>Kumar, N., Borth, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-cytometry+and+cell+sorting%3A+an+efficient+approach+to+investigate+productivity+and+cell+physiology+in+mammalian+cell+factories%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Flow-cytometry and cell sorting: an efficient approach to investigate productivity and cell physiology in mammalian cell factories.</a> Methods. 56, 366-374 (2012).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryosectioning+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Cryosectioning tissues.</a> CSH Protoc. 2008, pdb.prot4991(2008).</li>
<li>Hilbe, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+automated+cellular+imaging+system+and+manual+microscopy+for+immunohistochemically+stained+cryostat+sections+of+lung+cancer+specimens+applying+p53%2C+ki-67+and+p120%5BTitle%5D)+AND+%22Oncol+Rep%22%5BJournal%5D)">Comparison of automated cellular imaging system and manual microscopy for immunohistochemically stained cryostat sections of lung cancer specimens applying p53, ki-67 and p120.</a> Oncol Rep. 10, 15-20 (2003).</li>
<li>Suzuki, Y., Furukawa, M., Abe, J., Kashiwagi, M., Hirose, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+porcine+trappin-2+%28SKALP%2Felafin%29+in+trachea+and+large+intestine+by+in+situ+hybridization+and+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Localization of porcine trappin-2 (SKALP/elafin) in trachea and large intestine by in situ hybridization and immunohistochemistry.</a> Histochem Cell Biol. 114, 15-20 (2000).</li>
<li>Wolk, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-22+increases+the+innate+immunity+of+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">IL-22 increases the innate immunity of tissues.</a> Immunity. 21, 241-254 (2004).</li>
<li>Brand, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-22+is+increased+in+active+Crohn%27s+disease+and+promotes+proinflammatory+gene+expression+and+intestinal+epithelial+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">IL-22 is increased in active Crohn's disease and promotes proinflammatory gene expression and intestinal epithelial cell migration.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 290, G827-G838 (2006).</li>
<li>Nagalakshmi, M. L., Rascle, A., Zurawski, S., Menon, S., Waal Malefyt, de, R, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-22+activates+STAT3+and+induces+IL-10+by+colon+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunopharmacol%22%5BJournal%5D)">Interleukin-22 activates STAT3 and induces IL-10 by colon epithelial cells.</a> Int Immunopharmacol. 4, 679-691 (2004).</li>
<li>Maloy, K. J., Powrie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+homeostasis+and+its+breakdown+in+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intestinal homeostasis and its breakdown in inflammatory bowel disease.</a> Nature. 474, 298-306 (2011).</li>
<li>Andoh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-22%2C+a+member+of+the+IL-10+subfamily%2C+induces+inflammatory+responses+in+colonic+subepithelial+myofibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Interleukin-22, a member of the IL-10 subfamily, induces inflammatory responses in colonic subepithelial myofibroblasts.</a> Gastroenterology. 129, 969-984 (2005).</li>
<li>Bhan, A. K., Mizoguchi, E., Smith, R. N., Mizoguchi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colitis+in+transgenic+and+knockout+animals+as+models+of+human+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Colitis in transgenic and knockout animals as models of human inflammatory bowel disease.</a> Immunol Rev. 169, 195-207 (1999).</li>
<li>Mombaerts, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+development+of+inflammatory+bowel+disease+in+T+cell+receptor+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spontaneous development of inflammatory bowel disease in T cell receptor mutant mice.</a> Cell. 75, 274-282 (1993).</li>
<li>Powrie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+regulation+in+the+intestine%3A+a+balancing+act+between+effector+and+regulatory+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Immune regulation in the intestine: a balancing act between effector and regulatory T cell responses.</a> Ann N Y Acad Sci. 1029, 132-141 (2004).</li>
<li>Ahlfors, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-22+fate+reporter+reveals+origin+and+control+of+IL-22+production+in+homeostasis+and+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-22 fate reporter reveals origin and control of IL-22 production in homeostasis and infection.</a> J Immunol. 193, 4602-4613 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

IL-22 odgrywa istotną rolę we wrodzonej obronie gospodarza i przebudowie tkanek. Komórki wytwarzające IL-22 zostały zidentyfikowane ex vivo przez barwienie wewnątrzkomórkowe. Jednak nadal trudno jest śledzić ekspresję IL-22 in situ, zarówno w stanie normalnym, jak i w stanach zapalnych. Protokół ten opisuje nowatorską metodę opracowania mysiego modelu reporterowego IL-22, który umożliwia nam lokalizację komórek wykazujących ekspresję reporterową in vivo. Gen reporterowy kodujący TdTomato został...

Specyficzna dla typu komórki ekspresja genów reporterowych jest przydatna do identyfikacji komórek aktywnie wyrażających cel w tkankach w stanach homeostatycznych i zaburzonych. Pozwala również na oczyszczenie tych komórek, które pozostają żywotne, w celu zbadania ich innych właściwości. Myszy reporterowe zostały wykorzystane do wyjaśnienia mechanizmu działania określonych cytokin, czynników transkrypcyjnych i elementów regulatorowych. Poprzednie strategie1,2,3 w dużej mierze polegały na wbiciu reportera do docelowego locus w chromosomie myszy, co było czasochłonną i kosztowną procedurą. W związku z tym pożądana jest prostsza metoda generowania myszy reporterowych.
Cytokiny to szeroka klasa małych, wydzielanych białek/peptydów, które regulują reakcje immunologiczne poprzez sygnalizację międzykomórkową. Interleukina 22 (IL-22) jest cytokiną o wielu opisanych działaniach, w tym funkcji bariery, naprawy tkanek i stanu zapalnego4. Chociaż IL-22 została początkowo odkryta jako produkt komórek T5, kolejne doniesienia wykazały jej ekspresję w komórkach NK u ludzi6 i myszy7 oraz w innych klasach wrodzonych limfocytów8. Pomimo szeroko zakrojonych obserwacji komórek wytwarzających IL-22, wizualizacja IL-22 wymagała wcześniej stymulacji ex vivo i przepuszczalności do barwienia przeciwciałami. Dlatego nowe myszy reporterowe IL-22 byłyby bardzo przydatnym narzędziem do badania funkcji IL-22 w procesach homeostatycznych i patogennych.
Tutaj opracowaliśmy uproszczony transgeniczny model myszy reporterowej do obserwacji komórek produkujących IL-22 in vivo i in vitro. Korzystając z metody rekombinacji BAC9, wstawiliśmy sekwencję cDNA tdTomato z fragmentami sygnału Poly A do locus IL-22 i zastąpiliśmy ekson 1. Inne nieulegające translacji regiony, eksony i elementy regulatorowe nie zostały zakłócone, ponieważ chcielibyśmy naśladować naturalną regulację IL-22 w jak największym stopniu. Miejsce insercji reportera przerywa sekwencję sygnału, co powoduje akumulację reportera wewnątrz komórek wytwarzających, w przeciwieństwie do samej IL-22, która jest szybko wydzielana. Ta nowa metoda może być również zastosowana do generowania myszy reporterowych dla innych wydzielanych białek.

<table><tbody><tr><td>RP23-401E11</td><td>BAC Thermo Fisher Scientific</td><td>RPCI23. C</td><td>Need Identyfikator genu: 50929</td></tr><tr><td>NucleoBond BAC 100</td><td>Takara Clontech</td><td>740579</td><td></td></tr><tr><td>PCR SuperMix High Fidelity</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10790020</td><td></td></tr><tr><td>PI-SceI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0696S</td><td></td></tr><tr><td>SpeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0133S</td><td></td></tr><tr><td>LB Bulion</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10855-001</td><td>1 l: 10 g SELECT Peptone 140, 5 g ekstraktu drożdżowego SELECT, 5 g chlorku sodu&nbsp;</td></tr><tr><td>Anty-mysz CD3</td><td>eBioscience</td><td>11-0031</td><td></td></tr><tr><td>Anty-mysz CD4</td><td>eBioscience</td><td>17-0041</td><td></td></tr><tr><td>Anty-mysz CD45</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MCD4530</td><td></td></tr><tr><td>Anty-mysz CD45RB</td><td>eBioscience</td><td>11-0455</td><td></td></tr><tr><td>Anty-mysie RFP</td><td>Abcam</td><td>Ab62341</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, bez wapnia, bez magnezu, bez czerwieni fenolowej</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14175145</td><td>KCl, KH2PO4, Na2HPO4, NaHCO3, NaCl, D-Glucose</td></tr><tr><td>Dnase I</td><td></td> Roche <td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>ACK bufor lizujący</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1049201</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE healthcare nauki przyrodnicze</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza D</td><td>Roche</td><td>11088858001</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II (proteaza obojętna, stopień II)</td><td>Roche</td><td>4942078001</td><td></td></tr><tr><td>IX70 mikroskop fluorescencji odwróconej</td><td>Olympus</td><td></td><td>Zapytaj o wycenę</td></tr><tr><td>Mikroskop Nikon Eclipse 80i</td><td>Nikon</td><td></td><td>Zapytaj o wycenę</td></tr><tr><td>Wytrząsarka Dynal</td><td>Mikroskopia elektronowa Science</td><td>61050-10</td><td></td></tr><tr><td>FACSAria</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td>Zapytaj o wycenę</td></tr><tr><td>LSRII SORP/cytometria przepływowa</td><td>Becton, Dickinson and Company&nbsp;</td><td></td><td>Zapytaj o wycenę</td></tr></tbody></table>

wizualizacja limfocytów z ekspresją il-22 przy użyciu myszy reporterowych

Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice

Myszy reporterowe były szeroko stosowane do obserwacji lokalizacji ekspresji docelowych genów. Protokół ten koncentruje się na strategii mającej na celu ustanowienie nowego transgenicznego modelu myszy reporterowej. Zdecydowaliśmy się na wizualizację ekspresji genu interleukiny (IL) 22, ponieważ cytokina ta ma ważne działanie w jelicie, gdzie przyczynia się do naprawy tkanek uszkodzonych przez stan zapalny. Systemy reporterowe oferują znaczne korzyści w porównaniu z innymi metodami identyfikacji produktów in vivo. W przypadku IL-22 w innych badaniach najpierw wyizolowano komórki z tkanek, a następnie ponownie stymulowano komórki in vitro. IL-22, która jest normalnie wydzielana, została uwięziona w komórkach za pomocą leku, a do jej wizualizacji użyto barwienia wewnątrzkomórkowego. Metoda ta identyfikuje komórki zdolne do wytwarzania IL-22, ale nie określa, czy robiły to in vivo. Projekt reporterowy obejmuje wprowadzenie genu białka fluorescencyjnego (tdTomato) do genu IL-22 w taki sposób, że białko fluorescencyjne nie może być wydzielane, a zatem pozostaje uwięzione w komórkach wytwarzających in vivo. Producenci fluorescencji mogą być następnie wizualizowani w skrawkach tkanek lub za pomocą analizy ex vivo za pomocą cytometrii przepływowej. Sam proces budowy reportera obejmował rekombinację bakteryjnego sztucznego chromosomu, który zawierał gen IL-22. Ten zmodyfikowany chromosom został następnie wprowadzony do genomu myszy. Homeostatyczną ekspresję reporterową IL-22 zaobserwowano w różnych tkankach myszy, w tym w śledzionie, grasicy, węzłach chłonnych, plastrze Peyera i jelicie, za pomocą analizy cytometrii przepływowej. Zapalenie jelita grubego wywołano przez transfer komórek T (CD4 + CD45RBhigh) i uwidoczniono ekspresję reporterową. Dodatnie limfocyty T były najpierw obecne w węzłach chłonnych krezkowych, a następnie gromadziły się wewnątrz blaszki właściwej dystalnej tkanki jelita cienkiego i okrężnicy. Strategia wykorzystująca BAC dała dobrą ekspresję reporterową w porównaniu z ekspresją IL-22 i jest prostsza niż procedury knock-in.

Mysi transgen reporterowy IL-22 został stworzony przy użyciu recombineeringu w celu modyfikacji bakteryjnego sztucznego chromosomu zawierającego locus IL-22. Rycina 1 przedstawia schemat wektora pBACe3.6 zawierającego gen sacBII, marker selekcji pozytywnej oraz gen oporności na chloramfenikol11. Po wprowadzeniu tdTomato do eksonu 1 doszło do przerwania sekwencji peptydu sygnałowego, co pokazano na Rycynie 2. W ten sposób r...

Opisujemy tutaj transgeniczny model myszy reporterowej do wizualizacji komórek wytwarzających IL-22 wewnątrz różnych tkanek myszy. Ta metoda może być wykorzystana do śledzenia lokalizacji innych cytokin lub białek wydzielniczych u myszy.

Wizualizacja limfocytów z ekspresją IL-22 przy użyciu myszy reporterowych

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new ...

Ogólnym celem tej procedury modyfikacji genetycznej myszy jest identyfikacja, oczyszczenie i scharakteryzowanie komórek odpornościowych wytwarzających IL-22. Komórki układu odpornościowego uwalniają mediatory zwane cytokinami, które są odpowiedzialne za obronę nas przed obcymi czynnikami, takimi jak bakterie, i odbudowę uszkodzonych tkanek. IL-22 jest jedną z takich cytokin i przypisuje się jej wiele działań, od naprawy tkanek po patologię.Doniesiono, że wiele różnych typów komórek w układzie odpornościowym jest zdolnych do jego wytwarzania. Aby wyjaśnić, które komórki faktycznie produkują IL-22, opracowaliśmy nową mysz reporterową IL-22. Umożliwiło nam to zidentyfikowanie odpowiednich producentów IL-22 in vivo u myszy w normalnych warunkach i w modelu nieswoistego zapalenia jelit.Wykorzystaliśmy również komórki reporterowe do oczyszczenia ekspresorów IL-22 w celu określenia ich innych właściwości. Pokrótce przedstawiono metodę generowania myszy reporterowych oraz opisano metody analizy. Opisane metody można zastosować do innych genów w celu identyfikacji ekspresorów i oczyszczenia żywotnych komórek eksprymujących w celu dalszej charakterystyki.Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na

visualization-of-il-22-expressing-lymphocytes-using-reporter-mice

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Niniejsza procedura opisuje detekcję i izolację leukocytów TH17 myszy, które po stymulacji aktywnie wydzielają IL-17.

Wykrywanie i izolacja żywych limfocytów T wydzielających IL-17 u myszy

Stabilne przyżyciowe obrazowanie komórek odpornościowych w wątrobie w wysokiej rozdzielczości jest wyzwaniem. W tym miejscu zapewniamy wysoce czułą i wiarygodną metodę badania migracji i interakcji komórka-komórka komórek odpornościowych w wątrobie myszy przez długi czas (około 6 godzin) za pomocą wielofotonowej laserowej mikroskopii skaningowej w połączeniu z monitorowaniem intensywnej terapii.

Długoterminowe przyżyciowe obrazowanie mikroskopii wielofotonowej komórek odpornościowych w zdrowej i chorej wątrobie przy użyciu myszy reporterowych CXCR6.Gfp

Opisana tutaj metoda pozwala na wizualizację zależnej od promotora IL-8 aktywacji stanu zapalnego w płucach myszy za pomocą nieinwazyjnego obrazowania bioluminescencyjnego (BLI). To samo zwierzę może być poddawane BLI wielokrotnie przez okres do dwóch miesięcy od momentu dostarczenia konstruktu reporterowego lucyferazy.

Przejściowo transgenizowany model myszy IL-8 do długoterminowego monitorowania in vivo reakcji zapalnych

Ten protokół opisuje, jak ustanowić system reporterowy, który może być używany do identyfikacji i ilościowego określania interakcji receptor-ligand.

System BW Reporter do badania oddziaływań receptor-ligand

Tutaj demonstrujemy metody ilościowego oznaczania in vivo wyjścia leukocytów z naiwnej, zapalnej i złośliwej skóry myszy. Przeprowadzamy bezpośrednie porównanie dwóch modeli: transdermalnej aplikacji FITC i fotokonwersji in situ. Ponadto wykazujemy przydatność fotokonwersji do śledzenia wychodzenia leukocytów z guzów skóry.

Kwantyfikacja wychodzenia leukocytów przez naczynia limfatyczne z mysiej skóry i guzów

Ten protokół opisuje technikę obrazowania różnych populacji komórek w drenujących węzłach chłonnych bez zmian w strukturze narządu.

Wizualizacja struktury węzłów chłonnych i lokalizacji komórkowej za pomocą mikroskopii konfokalnej ex-vivo

Tutaj opisujemy prostą metodę obrazowania konfokalnego, aby zobrazować lokalizację in situ komórek wydzielających cytokinę Interferon gamma w mysich wtórnych narządach limfatycznych. Protokół ten można rozszerzyć o wizualizację innych cytokin w różnych tkankach.

Obrazowanie wytwarzania interferonu gamma in situ w śledzionie myszy po zakażeniu Listeria monocytogenes

Opisujemy metodę wizualizacji IELs γδ znakowanych GFP za pomocą obrazowania przyżyciowego mysiego jelita cienkiego za pomocą mikroskopii konfokalnej z odwróconym wirującym dyskiem. Technika ta umożliwia śledzenie żywych komórek w błonie śluzowej przez okres do 4 godzin i może być wykorzystana do badania różnych interakcji jelitowych między układem odpornościowym a nabłonkiem.

Obrazowanie przyżyciowe limfocytów śródnabłonkowych w jelicie cienkim myszy

Wrodzone komórki limfoidalne grupy 2 (ILC2), zaangażowane w zapalenie typu 2, głównie uczestniczą w odpowiedzi na infekcję robakami pasożytniczymi, choroby alergiczne, homeostazę metaboliczną i naprawę tkanek. W tym badaniu przedstawiono procedurę izolacji ILC2 z mysiej błony śluzowej nosa i wykrywania ekspresji CD226.

Izolacja wrodzonych komórek limfoidalnych grupy 2 z błony śluzowej nosa myszy w celu wykrycia ekspresji CD226

Limfocyty T i ILC2 wykazujące ekspresję IL-9 są indukowane podczas infekcji N. brasiliensis, jednak ich charakterystyka została w dużej mierze przeoczona w zakażonym jelicie ze względu na ich niską częstotliwość i różnicową kinetykę. Protokół ten opisuje izolację tych komórek z różnych narządów docelowych i potwierdzenie ich tożsamości za pomocą cytometrii przepływowej na różnych etapach infekcji.

Strategia badania komórek limfoidalnych wytwarzających IL-9 w modelu zakażenia Nippostrongylus brasiliensis

Opisujemy metodę wykorzystania limfocytów naciekających nowotwór (TIL) od myszy za pomocą cytometrii przepływowej do adoptywnego transferu komórek. Protokół ten ma na celu weryfikację specyficznej cytotoksyczności TIL wobec nowotworów w mysim modelu syngenicznego raka trzustki, dostarczając informacji na temat rozwoju adoptywnych terapii komórkowych w raku trzustki.

Izolacja oparta na cytometrii przepływowej i ocena terapeutyczna limfocytów naciekających nowotwór w mysim modelu raka trzustki

Poznaj metodę wizualizacji limfocytów produkujących IL-22 przy użyciu myszy reporterowych. Ta technika umożliwia identyfikację komórek odpornościowych in vivo w tkankach myszy oraz badanie odpowiedzi immunologicznej.

Wizualizacja limfocytów z ekspresją IL-22 przy użyciu myszy reporterowych

Przeglądaj więcej filmów