Wizualizacja limfocytów z ekspresją IL-22 przy użyciu myszy reporterowych

Ogólnym celem tej procedury modyfikacji genetycznej myszy jest identyfikacja, oczyszczenie i scharakteryzowanie komórek odpornościowych wytwarzających IL-22. Komórki układu odpornościowego uwalniają mediatory zwane cytokinami, które są odpowiedzialne za obronę nas przed obcymi czynnikami, takimi jak bakterie, i odbudowę uszkodzonych tkanek. IL-22 jest jedną z takich cytokin i przypisuje się jej wiele działań, od naprawy tkanek po patologię.

Doniesiono, że wiele różnych typów komórek w układzie odpornościowym jest zdolnych do jego wytwarzania. Aby wyjaśnić, które komórki faktycznie produkują IL-22, opracowaliśmy nową mysz reporterową IL-22. Umożliwiło nam to zidentyfikowanie odpowiednich producentów IL-22 in vivo u myszy w normalnych warunkach i w modelu nieswoistego zapalenia jelit.

Wykorzystaliśmy również komórki reporterowe do oczyszczenia ekspresorów IL-22 w celu określenia ich innych właściwości. Pokrótce przedstawiono metodę generowania myszy reporterowych oraz opisano metody analizy. Opisane metody można zastosować do innych genów w celu identyfikacji ekspresorów i oczyszczenia żywotnych komórek eksprymujących w celu dalszej charakterystyki.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie immunologii dotyczące aktywności biologicznej IL-22 i właściwości komórek, które ją wytwarzają. Procedurę zademonstrują ze mną Julie Hixon, biolożka, Caroline Andrews, doktor habilitowany i Wenqing Li, naukowiec z laboratorium dr Durhama. Po wstawieniu genu reporterowego tdTomato do wektora wahadłowego, zastępując gen GFP w tym samym miejscu, należy użyć odpowiedniego sztucznego chromosomu bakteryjnego lub matrycy BAC do amplifikacji pudełek homologii A i B do pierwszego translowanego eksonu IL-22 w 50-mikrolitrowym systemie reakcji PCR.

Następnie przekształć oczyszczone wektory w kompetentne komórki bakteryjne BAC na płytkach agarowych Luria-Bertani lub LB zawierających chloramfenikol i ampicylinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji zaszczepić dwie do trzech kolonii w jednym mililitrze bulionu LB, uzupełnionego chloramfenikolem w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 225 obr./min. Po godzinie rozprowadź 100 mikrolitrów każdej mieszaniny na płytce agarowej LB uzupełnionej chloramfenikolem i sacharozą na nocną hodowlę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnego ranka umieść duże kolonie na nowej płytce agarowej LB z chloramfenikolem, a małe kolonie na innej płytce agarowej LB i wystawiaj płytki na działanie światła UV przez 30 sekund. Następnie wybierz wrażliwą na promieniowanie UV kolonię i użyj heterozygotycznego startera tdTomato IL-22, aby potwierdzić obecność zmodyfikowanego DNA BAC metodą PCR. Po usunięciu śledziony i grasicy użyj drobnopunktowych, ząbkowanych kleszczy preparacyjnych, aby pobrać perłowobiałe węzły chłonne krezkowe w pobliżu ściany jelita cienkiego.

Następnie usuń całe jelito cienkie i okrężnicę i użyj nożyczek, aby usunąć wydłużone owalne plamy Peyera wzdłuż jelita. Po zebraniu wszystkich tkanek limfatycznych zmiel węzły chłonne krezkowe i plastry Peyera między dwoma matowymi szkiełkami w PBS uzupełnionym FBS na lodzie. Po wytworzeniu pojedynczych zawiesin pojedynczych komórek śledziony i grasicy w ten sam sposób, odwiruj komórki śledziony, a następnie lizę czerwonych krwinek śledziony z jednym mililitrem śledziony Lysing Buffers.

Po minucie przywróć izotoniczność za pomocą dziewięciu mililitrów PBS i ponownie odwiruj komórki. Ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach PBS i przefiltrować komórki przez sitko o średnicy 100 mikronów. Następnie zebrać komórki przez kolejne odwirowanie, ponownie zawieszając osad w pięciu mililitrach pożywki RPI w celu wyliczenia przez wykluczenie błękitu trypanowego.

Po pobraniu jelita cienkiego od dwunastnicy do jelita krętego wraz z całą okrężnicą użyj kleszczy, aby usunąć dodatkową tkankę tłuszczową i krezkową z jelita i natychmiast umieść tkankę jelita w lodowatym PBS. Użyj kleszczy, aby zebrać plamy Peyera wzdłuż dystalnego obszaru jelita cienkiego. Następnie użyj nożyczek, aby otworzyć jelito wzdłuż i dokładnie spłucz tkankę 10 mililitrami lodowatego PBS.

Przenieść próbkę do 20 mililitrów buforu do wstępnego wytrawiania na dwie 30-minutowe inkubacje w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 50 obr./min w wytrząsarce, wirując tkankę przez 30 sekund przy 12 000 obr./min i przeciskając wszystkie fragmenty przez sitko do komórek o wielkości 100 mikronów pod koniec każdej inkubacji w celu zebrania warstwy komórek nabłonka. Następnie dodaj 20 mililitrów świeżego roztworu EDTA do zawiesiny komórkowej na kolejne 30 minut inkubacji z wytrząsaniem w temperaturze 37 stopni Celsjusza, filtrując i schładzając komórki nabłonka jelitowego pod koniec inkubacji, jak właśnie pokazano. Umieść pozostałe fragmenty jelita na lodzie i zbierz zebrane komórki nabłonka jelitowego przez odwirowanie, a następnie przemyj 10 mililitrami HBSS uzupełnionego FBS

Ponownie zawiesić przemyty osad w ośmiu mililitrach 44% koloidalnego podłoża krzemionkowego i pokryć zawiesinę ogniw pięcioma mililitrami 67% koloidalnego podłoża krzemionkowego. Oddziel komórki przez odwirowanie i użyj pipety o pojemności jednego mililitra, aby usunąć górne pięć mililitrów pożywki do separacji komórek. Następnie zbierz komórki na granicy faz i umyj komórki nabłonka jelitowego w 10 mililitrach pożywki RPMI, ponownie zawieszając osad w pięciu mililitrach świeżego RPMI.

Po przygotowaniu zawiesin pojedynczych komórek śledziony od myszy IL-22 td-Tomato, jak właśnie pokazano. Ponownie zawiesić komórki w stężeniu od jednego do 10 do siódmego na mililitr w sterylnym PBS i użyć metody izolacji ujemnych komórek CD4 myszy w celu oczyszczenia limfocytów T CD4-dodatnich. Następnie znakuj limfocyty T przeciwciałami anty-CD4 i anty-CD45RB przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Pod koniec inkubacji zebrać komórki przez odwirowanie, a następnie przemyć w dwóch mililitrach PBS uzupełnionych FBS. Ponownie zawiesić przemyty osad w jednym mililitrze świeżego PBS i FBS i posortować znakowane limfocyty T za pomocą cytometrii przepływowej według ich koekspresji CD4 i CD45RB. Gdy wszystkie komórki zostaną posortowane, zbierz je przez odwirowanie i ponownie zawieś osad w stężeniu od 10 do sześciu komórek na mililitr w sterylnym PBS w celu wstrzyknięcia komórek do biorców myszy z nokautem RAG1.

Aby stworzyć mysią IL-22 reporterową transkombinację, wykorzystano rekombinację transgenu w celu zmodyfikowania bakteryjnego sztucznego chromosomu przenoszącego szarańczę IL-22, który zawiera również marker selekcji pozytywnej i gen oporności na antybiotyki chloramfenikol. Po wprowadzeniu tdTomato do eksonu1 sekwencja peptydu sygnałowego została zakłócona, uwięziając reporter tdTomato wewnątrz komórek wykazujących ekspresję IL-22 i umożliwiając ich wykrycie i izolację za pomocą cytometrii przepływowej. Aby przetestować wierność reporterów IL-22, splenocyty generowane in vitro można hodować w warunkach Th22 lub obojętnych z ekspresją IL-22 tdTomato widoczną zarówno za pomocą cytometrii przepływowej, jak i mikroskopii fluorescencyjnej.

In vivo, reportery IL-22 wykryte w różnych tkankach myszy w warunkach homeostazy, przy czym większość sygnału obserwowano w komórkach blaszki właściwej z jelita, ale nie w pachowym węźle chłonnym, śledzionie lub grasicy. W mysim modelu zapalenia jelita grubego wywołanego przeniesieniem reporterowych CD4-dodatnich komórek T CD45RB do myszy z nokautem RAG1, reportery tdTomato są najpierw wizualizowane w węzłach chłonnych krezki, ale ich ostateczna akumulacja w blaszce właściwej dystalnej tkanki jelita cienkiego i okrężnicy. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o wyborze odpowiedniego klonu BAC.

Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak tworzenie modeli infekcji płuc lub skóry, przy użyciu tej myszy reporterowej, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące roli IL-22 w obronie gospodarza i naprawie tkanek. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie immunologii do zbadania funkcji wydzielanych białek, które wykazują niską ekspresję, przy użyciu modelu mysiego, takiego jak ten. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wygenerować transgeniczną mysz reporterową i zidentyfikować geny reporterowe IL-22 in vitro i in vivo.