Name: Technika perfuzji nerki izolowanej u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Poznaj technikę perfuzji nerki izolowanej u myszy do badania funkcji nerkowych poza organizmem. Ta metoda pozwala wykluczyć wpływ układowy i analizować mechanizmy ostrego uszkodzenia nerek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Hansowi-Joachimowi Schurekowi za nieocenione porady naukowe. Autorzy pragną podziękować Monique Carrel i Michèle Heidemeyer za doskonałą pomoc techniczną, Davidowi Pentonowi Ribasowi i Nourdine Faresse za krytyczną lekturę rękopisu oraz Carstenowi Wagnerowi i Jürgowi Biberowi za przeciwciało NaPi-2a. Prace te były wspierane przez Szwajcarskie Narodowe Centrum Kompetencji w Badaniach Naukowych "Kidney.CH" oraz przez grant projektowy (310030_143929/1) ze Szwajcarskiej Narodowej Fundacji Nauki.

Wszystkie procedury z udziałem zwierząt opisane w niniejszym manuskrypcie zostały przeprowadzone zgodnie z prawem szwajcarskim i zatwierdzone przez administrację weterynaryjną kantonu Zurych w Szwajcarii.
1. Przygotowanie buforu
<ol>
	<li>Przygotować roztwory 1 – 4 oraz roztwór hormonu przeciwmoczowego (ADH) (Tabela 1).</li>
	<li>Przygotować bufor do dializy (Tabela 1). 
	UWAGA: Jest to bufor stosowany jako bufor dializacyjny podczas perfuzji. Później erytrocyty zostaną rozcieńczone w tym buforze w celu przygotowania ostatecznego perfuzatu.</li>
	<li>Przygotowanie erytrocytów.
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć 250 ml koncentratu erytrocytów ludzkich (materiał testowy otrzymany z lokalnego banku krwi) do 500 ml buforem do dializy. Odwirować przy 2 000 x g przez 8 min. Usunąć bufor, uważając, aby nie usunąć erytrocytów. Powtórzyć 3x.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować bufor albuminowy (albumina surowicy bydlęcej; BSA).
	<ol>
		<li>W 200 ml buforu do dializy rozpuścić 44 g BSA za pomocą mieszadła magnetycznego. Przefiltrować roztwór przez papier filtracyjny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować perfuzat.
	<ol>
		<li>Przefiltrować erytrocyty z kroku 1.3.1 przez papier filtracyjny do buforu BSA. Dopełnić do całkowitej objętości 800 ml buforem do dializy. 
		UWAGA: Jest to ostateczny perfuzat. Hematokryt powinien teraz wynosić od 8 do 12%. Perfuzat można przechowywać do 12 h w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Rozpoczęcie dializy i natleniania
<ol>
	<li>Włączyć łaźnię wodną otaczającą większy zbiornik z buforem, mniejszy zbiornik z buforem oraz komorę wilgotną (małą, dwuścienną komorę podgrzaną do 37 °C i 100% wilgotności, w której później umieszczona zostanie nerka) i ustawić temperaturę na 37 °C (Rysunek 2).</li>
	<li>Napełnić większy zbiornik buforem do dializy, a mniejszy zbiornik perfuzatem.</li>
	<li>Włączyć dopływ mieszaniny gazów 5% CO2/95% O2 do buforu do dializy.</li>
	<li>Uruchomić ciągłą dializę perfuzatu przeciwko buforowi do dializy. Należy pamiętać o zastosowaniu rurek do dializy o niskim strumieniu (low-flux). Przejść do kroku 3.</li>
</ol>
<img alt="Schemat cyklu komórkowego, szczegółowy proces z etapami i przejściami do badań w biologii molekularnej." src="/files/ftp_upload/54712/54712fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Schemat obwodu perfuzyjnego. Schemat przedstawia główne elementy obwodu perfuzyjnego oraz kierunek przepływu buforu. Wszystkie elementy otoczone ciemnoniebieską ramką są utrzymywane w temperaturze 37 °C za pomocą łaźni wodnej/termostatu. 1: Bufor dializacyjny o objętości co najmniej 3-krotnie większej niż objętość buforu perfuzyjnego jest stale napowietrzany mieszanką 95% O2/5% CO2. 2: Bufor dializacyjny i bufor perfuzyjny są stale dializowane względem siebie w rurce dializacyjnej za pomocą pompy perystaltycznej. 3: Dzięki tej dializie bufor perfuzyjny jest wzbogacony w 9% O2/5% CO2, a poziomy elektrolitów pozostają stałe przez cały czas trwania perfuzji. 4: Pompa perystaltyczna tłoczy bufor perfuzyjny w kierunku nerki. 5: Amortyzator (windkessel) niweluje fale perystaltyczne i działa jako pułapka na pęcherzyki powietrza. 6: Przetwornik ciśnienia (połączony z 4. (pompą perystaltyczną), aby utrzymać stałe ciśnienie, umożliwiając jednocześnie swobodny przepływ naprzemienny). 7: Przez cały czas trwania perfuzji nerka znajduje się w wilgotnej komorze, aby zapewnić 100% wilgotności powietrza i temperaturę nerki wynoszącą 37 °C. <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54712/54712fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
3. Procedura chirurgiczna cz. 1 (schemat wszystkich podwiązań przedstawiono na rysunku 3)
Uwaga: Wszystkie podwiązania należy wykonać przy użyciu nici chirurgicznej 5-0.
<ol>
	<li>Zanurzyć mysz w narkozie poprzez wstrzyknięcie dostronne (10 µl/g masy ciała, 20 mg/ml ketaminy i 1 mg/ml ksylazyny rozpuszczonych w 0,9% NaCl). Potwierdzić odpowiednią głębokość znieczulenia, sprawdzając brak odruchów kończyn tylnych.</li>
	<li>Utrzymać mysz w pozycji na plecach w wilgotnej komorze. Zabezpieczyć oczy maścią weterynaryjną. Umieścić strzykawkę o pojemności 1 ml pod kręgosłupem, aby unieść naczynia lędźwiowe.</li>
	<li>Wykonać medianową laparotomię od grzebienia łonowego do mostka, rozcinając najpierw skórę, a następnie mięśnie brzuszne za pomocą nożyczek.</li>
	<li>Usunąć jelita i ułożyć je po lewej stronie myszy, bocznie od jamy brzusznej.</li>
	<li>Uwolnić pęcherz moczowy z tkanki łącznej i zlokalizować oba moczonowody oraz cewkę moczową.</li>
	<li>Założyć więzadło wokół lewego moczonowodu (więzadło I). Zaciągnąć je.</li>
	<li>Założyć więzadło wokół cewki moczowej (więzadło II). Zaciągnąć je.</li>
	<li>Założyć więzadło typu „lasso” wokół całego pęcherza moczowego (więzadło III).</li>
	<li>Naciąć pęcherz moczowy na 1 mm.</li>
	<li>Kaniulować otwór za pomocą 2 cm rurki PE 50.</li>
	<li>Zaciągnąć więzadło III wokół rurki.</li>
	<li>Przeciąć lewy moczonowód i cewkę moczową dystalnie od więzadeł. Pęcherz jest teraz przymocowany tylko do prawego moczonowodu i może się swobodnie poruszać.</li>
	<li>Oczyścić aortę brzuszną z tkanki łącznej i tłuszczu.</li>
	<li>Założyć więzadło na środkową część aorty brzusznej (więzadło IV).</li>
	<li>Założyć więzadło wokół aorty poniżej przepony, pomiędzy górną tętnicą krezkową a pniem trzewnym (więzadło V).</li>
	<li>Założyć więzadło wokół górnej tętnicy krezkowej (więzadło VI).</li>
	<li>Założyć więzadło aortalne bezpośrednio poniżej prawej i powyżej lewej tętnicy nerkowej (więzadło VII).</li>
	<li>Założyć więzadło wokół pakietu żyły głównej (cava) (więzadło VIII). Przejść do kroku 4.</li>
</ol>
<img alt="Schemat układu sercowo-naczyniowego, przedstawiający naczynia czaszkowe i ogonowe, aortę oraz drogi żyły głównej." src="/files/ftp_upload/54712/54712fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Schematyczna ilustracja podwiązań wykonanych podczas operacji. Widok otwartej jamy brzusznej po laparotomii. Jelito zostało przesunięte w lewo. L i R oznaczają odpowiednio lewą i prawą nerkę. Czarne linie wskazują miejsce poszczególnych podwiązań. Podwiązania są najpierw nakładane, a następnie zaciskane w kolejności opisanej w tekście. X oznacza miejsce nacięcia do kaniulacji aorty. <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54712/54712fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
4. Napełnianie układu perfuzyjnego
<ol>
	<li>Uruchom pompę perystaltyczną i napełnij przewody perfuzatem. Należy upewnić się, że wszystkie pęcherzyki powietrza zostały z nich usunięte.</li>
	<li>Napełnij urządzenie windkessel perfuzatem do około połowy jego objętości.</li>
	<li>Skalibruj przetwornik ciśnienia do 0 mm Hg, gdy wszystkie przewody są wypełnione, a przepływ wynosi 0. W tym czasie trzymaj igłę perfuzyjną na poziomie nerki.</li>
	<li>Utrzymaj przepływ na stałym, minimalnym poziomie (0.6 ml/min) i przejdź do kroku 5.</li>
</ol>
5. Procedura chirurgiczna część 2
<ol>
	<li>Umieść zacisk pomiędzy podwiązką IV a rozgałęzieniem lewej tętnicy nerkowej.</li>
	<li>Wykonaj małe nacięcie w aorcie gudałnie względem podwiązki IV, dbając o to, aby nie przeciąć ściany grzbietowej.</li>
	<li>Rozszerz otwór w aorcie za pomocą rozszerzacza naczyń.</li>
	<li>Kaniuluj aortę za pomocą igły (długość 2 cm, wyciągnięty PE 50), przesuwając końcówkę dokładnie do zacisku.</li>
	<li>Otwórz zacisk.</li>
	<li>Przesuń końcówkę igły w kierunku kranialnym, aż dotrze ona do połączenia prawej tętnicy nerkowej z aortą.</li>
	<li>Zaciśnij podwiązkę VII.</li>
	<li>Zaciśnij podwiązkę IV.</li>
	<li>Otwórz klatkę piersiową nożyczkami, rozcinając przeponę. Jednym cięciem oddziel aortę, żyłę główną, serce i nerwy wegetatywne. Na tym etapie zwierzę zostaje uśmiercone poprzez szybkie wykrwawienie w stanie ciągłej głębokiej anestezji.</li>
	<li>Uruchom kontrolę ciśnienia pompy perfuzyjnej. Utrzymuj średnie ciśnienie w przedziale od 80 do 100 mmHg.</li>
	<li>Zaciśnij podwiązkę V.</li>
	<li>Zaciśnij podwiązkę VI.</li>
	<li>Zaciśnij podwiązkę VIII.</li>
	<li>Uwolnij prawą nerkę z tkanki łącznej oraz z otaczającej ją torebki tłuszczowej za pomocą nożyczek.</li>
	<li>Przetnij aortę proksymalnie względem podwiązki V.</li>
	<li>Przetnij tętnicę krezkową górną dystalnie względem podwiązki VI.</li>
	<li>Wycięcie pęczek naczyniowy podtrzymujący nerkę, dbając o to, aby nie przeciąć samych naczyń.</li>
	<li>Przetnij wątrobę w miejscu połączenia z nerką. Należy uwolnić nerkę, pozostawiając jednak niewielką część wątroby przytwierdzoną do niej, aby żyła główna pozostała otwarta.</li>
	<li>Wyjmij pęczek nerkowy z myszy. Wyjmij mysz z komory wilgotnej.</li>
	<li>Załóż podwiązkę typu „lasso” wokół połączenia wątroby i nerki (podwiązka IX).</li>
	<li>Kaniuluj żyłę główną za pomocą linii żylnej (2 cm PE 50).</li>
	<li>Zaciśnij podwiązkę IX. Odpływ żylny przez linię żylną powinien rozpocząć się natychmiast.</li>
	<li>Zamknij komorę wilgotną.</li>
</ol>
6. Analizy następcze
<ol>
	<li>Przez następną godzinę należy stale monitorować przepływ krwi oraz ciśnienie wewnątrznaczyniowe15. Należy zbierać odpływ żylny, który może zostać wykorzystany do analizy np. wydzielania reniny przez nerki7. Należy zbierać mocz w celu analizy stężenia elektrolitów oraz szybkości filtracji kłębuszkowej 14. Po 1 hr perfuzji nerki można zamrozić gwałtownie do analizy western blotting lub utrwalić do metod obrazowania16.</li>
</ol>

<ol><li>Carrel, A., Lindbergh, C. A. The culture of whole organs. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCarrel%2C+A+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22">Science (New York, N.Y.)</a>. 81 (2112), 621-623 (1935).</li>
<li>Skutul, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSkutul%2C+K+%22%C3%9Cber+Durchstr%C3%B6mungsapparate+Pfl%C3%BCger%27s+Archiv%22">Über Durchströmungsapparate Pflüger's Archiv</a>. 123 (4-6), 249-273 (1908).</li>
<li>Nizet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolated+perfused+kidney%3A+possibilities%2C+limitations+and+results%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">The isolated perfused kidney: possibilities, limitations and results.</a> Kidney Int. 7 (1), 1-11 (1975).</li>
<li>Weiss, C., Passow, H., Rothstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoregulation+of+flow+in+isolated+rat+kidney+in+the+absence+of+red+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Autoregulation of flow in isolated rat kidney in the absence of red cells.</a> Am J Physiol. 196 (5), 1115-1118 (1959).</li>
<li>Schurek, H. J., Kriz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphologic+and+functional+evidence+for+oxygen+deficiency+in+the+isolated+perfused+rat+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Morphologic and functional evidence for oxygen deficiency in the isolated perfused rat kidney.</a> Lab Invest. 53 (2), 145-155 (1985).</li>
<li>Stolte, H., Schurek, H. J., Alt, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glomerular+albumin+filtration%3A+a+comparison+of+micropuncture+studies+in+the+isolated+perfused+rat+kidney+with+in+vivo+experimental+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Glomerular albumin filtration: a comparison of micropuncture studies in the isolated perfused rat kidney with in vivo experimental conditions.</a> Kidney Int. 16 (3), 377-384 (1979).</li>
<li>Schweda, F., Wagner, C., Krämer, B. K., Schnermann, J., Kurtz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preserved+macula+densa-dependent+renin+secretion+in+A1+adenosine+receptor+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22AJP+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Preserved macula densa-dependent renin secretion in A1 adenosine receptor knockout mice.</a> AJP Renal Physiol. 284 (4), F770-F777 (2003).</li>
<li>Moers, C., Smits, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Machine+perfusion+or+cold+storage+in+deceased-donor+kidney+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Machine perfusion or cold storage in deceased-donor kidney transplantation.</a> N Engl J Med. 360 (1), 7-19 (2009).</li>
<li>Nicholson, M. L., Hosgood, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+transplantation+after+ex+vivo+normothermic+perfusion%3A+the+first+clinical+study%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Renal transplantation after ex vivo normothermic perfusion: the first clinical study.</a> Am J Transplant. 13 (5), 1246-1252 (2013).</li>
<li>Worner, M., Poore, S., Tilkorn, D., Lokmic, Z., Penington, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+low-cost%2C+small+volume+circuit+for+autologous+blood+normothermic+perfusion+of+rabbit+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Art+Org%22%5BJournal%5D)">A low-cost, small volume circuit for autologous blood normothermic perfusion of rabbit organs.</a> Art Org. 38 (4), 352-361 (2014).</li>
<li>Kaths, J. M., Spetzler, V. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normothermic+Ex+Vivo+Kidney+Perfusion+for+the+Preservation+of+Kidney+Grafts+prior+to+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation.</a> J Vis Exp. (101), e52909(2015).</li>
<li>Song, J. J., Guyette, J. P., Gilpin, S. E., Gonzalez, G., Vacanti, J. P., Ott, H. C. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSong%2C+JJ+%22Nature+Med%22">Nature Med</a>. 19 (5), 646-651 (2013).</li>
<li>Hall, A. M., Crawford, C., Unwin, R. J., Duchen, M. R., Peppiatt-Wildman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+imaging+of+the+functioning+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22JASN%22%5BJournal%5D)">Multiphoton imaging of the functioning kidney.</a> JASN. 22 (7), 1297-1304 (2011).</li>
<li>Lindell, S. L., Williams, N., Brusilovsky, I., Mangino, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+IPK%3A+A+Powerful+Tool+to+Partially+Characterize+Renal+Reperfusion+and+Preservation+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Transplant+J%22%5BJournal%5D)">Mouse IPK: A Powerful Tool to Partially Characterize Renal Reperfusion and Preservation Injury.</a> Open Transplant J. 5, 15-22 (2011).</li>
<li>Wagner, C., De Wit, C., Kurtz, L., Grünberger, C., Kurtz, A., Schweda, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin40+is+essential+for+the+pressure+control+of+renin+synthesis+and+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Connexin40 is essential for the pressure control of renin synthesis and secretion.</a> Circ Res. 100 (4), 556-563 (2007).</li>
<li>Czogalla, J., Vohra, T., Penton, D., Kirschmann, M., Craigie, E., Loffing, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mineralocorticoid+receptor+%28MR%29+regulates+ENaC+but+not+NCC+in+mice+with+random+MR+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCger%27s+Archiv%22%5BJournal%5D)">The mineralocorticoid receptor (MR) regulates ENaC but not NCC in mice with random MR deletion.</a> Pflüger's Archiv. , (2016).</li>
<li>Poosti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision-cut+kidney+slices+%28PCKS%29+to+study+development+of+renal+fibrosis+and+efficacy+of+drug+targeting+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Precision-cut kidney slices (PCKS) to study development of renal fibrosis and efficacy of drug targeting ex vivo.</a> Dis Model Mech. 8 (10), 1227-1236 (2015).</li>
<li>Rahgozar, M., Guan, Z., Matthias, A., Gobé, G. C., Endre, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+II+facilitates+autoregulation+in+the+perfused+mouse+kidney%3A+An+optimized+in+vitro+model+for+assessment+of+renal+vascular+and+tubular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nephrology%22%5BJournal%5D)">Angiotensin II facilitates autoregulation in the perfused mouse kidney: An optimized in vitro model for assessment of renal vascular and tubular function.</a> Nephrology. 9 (5), 288-296 (2004).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych i nic więcej do ujawnienia.

Izolowana perfundowana nerka u myszy jest narzędziem do badania funkcji nerek w kontrolowanym środowisku ex vivo przez 1 godzinę, wypełniając lukę między eksperymentami in vivo na nienaruszonych zwierzętach, które mogą być wadliwe pod wpływem wielu czynników ogólnoustrojowych, a eksperymentami in vitro na izolowanych segmentach nefronu lub hodowanych komórkach, które z konieczności zaniedbują wpływ nienaruszonej struktury narządu na funkcję. Według wiedzy autorów nie ma alternatywnej techniki, ...

Izolowana perfuzja narządów jest przedmiotem nieustannych starań fizjologów od wielu dziesięcioleci1. Technika ta umożliwia badanie funkcji narządu bez wpływów systemowych, takich jak ciśnienie krwi, hormony czy nerwy. Carl Eduard Loebell jest uważany za pierwszą osobę, która w 1849 roku opisała pomyślną perfuzję izolowanej nerki2. Od tego czasu aparatura do perfuzji przeszła znaczną udoskonalenie. Frey i Gruber wprowadzili sztuczne płuco do natleniania oraz pompy pulsacyjne do ciągłej perfuzji2. Podczas gdy pierwsi badacze studiowali głównie nerki dużych ssaków – mianowicie świń2 i psów3 – pierwszy raport o zastosowaniu nerek szczura, opracowany przez Weiss et al., stanowił kamień milowy w badaniach nad perfuzją narządów małych ssaków4. Schurek et al. zgłosili konieczność dodania erytrocytów ssaków do perfuzatu, aby zapewnić wystarczające natlenowanie kanalików nerkowych5. Kluczowe dla długoterminowych eksperymentów było wprowadzenie ciągłej dializy buforu przez tę samą grupę badawczą6. W 2003 roku Schweda et al. jako pierwsi opisali funkcjonalny model izolowanej perfuzji nerki mysiej (MIPK)7, który został później udoskonalony przez Rahgozar et al.18 oraz Lindell et al.14.
Choć technicznie bardziej wymagający niż model izolowanego perfundowanego nerk szczura, zastosowanie MIPK daje przewagę w postaci możliwości wykorzystania szerokiego spektrum myszy modyfikowanych genetycznie. Niniejszy artykuł przedstawia szczegóły opracsetowanej przez autorów metody perfuzji izolowanych nerek myszy przez 1 hr. Metoda ta pozwala na ciągłą ocenę prędkości przepływu nerkowego, oporu naczyniowego, uwalniania hormonów, analizę gazometryczną krwi, analizę moczu oraz podawanie leków. Po zakończeniu procedury nerki mogą zostać poddane analizie molekularnej i biochemicznej, utrwalone do badań mikroskopowych lub przeszczepione do myszy biorcy (Rysunek 1).
<img alt="Schemat perfuzji nerek z użyciem buforu półsyntetycznego, czynników wejściowych i mierzonych parametrów wyjściowych." src="/files/ftp_upload/54712/54712fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Przegląd możliwych parametrów wejściowych/wyjściowych dla izolowanej perfundowanej nerki. BGA: Analiza gazometryczna krwi. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54712/54712fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Technika ta prawdopodobnie zyska na znaczeniu w nadchodzących latach, ponieważ wraz z wprowadzeniem przedłużonej normotermicznej perfuzji nerek przed transplantacją (z zastosowaniem lub bez zastosowania leków przeciwodrzutowych lub leków do edycji genomu)8,9, 10, 11, bioinżynierii całych nerek z rusztowań odkomórkowionych12 oraz zastosowania wysokich dawek barwników fluorescencyjnych w obrazowaniu wielofotonowym13 omawianych jest wiele innowacyjnych zastosowań. Jest to również idealny model do badania roli specyficznych genów podczas ostrego uszkodzenia nerek14.
Przedstawiono szczegółowy protokół krok po kroku, który umożliwia innym laboratoriom pomyślne przeprowadzenie izolowanej perfuzji nerki myszy. W pierwszej kolejności określono skład i sposób przygotowania buforu. Następnie szczegółowo opisano zabieg chirurgiczny oraz zaprezentowano krytyczne etapy jego realizacji. Po trzecie przedstawiono dane reprezentatywne dla udanej preparatyki: przepływ krwi przez nerki, opór naczyniowy, współczynnik filtracji kłębuszkowej oraz frakcyjną ekskrecję elektrolitów – wszystkie jako funkcjonalne pomiary żywotności – a także mikrofotografie transmisyjne elektronowe morfologii różnych segmentów nefronów perfundowanych nerek utrwalonych po 1 hr perfuzji.

<table><tbody><tr><td>< silny> Obwód perfuzyjny: </td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Komora wilgotnościowa 834/8</td><td>Aparat Harvard/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-2901</td><td></td></tr><tr><td>Kanularna z koszem i bocznym portem</td><td>Aparatura Harvarda/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-2947</td><td></td></tr><tr><td>Termostat TC120-ST5&nbsp;</td><td>Aparatura Harvarda/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-4544</td><td></td></tr><tr><td>ISM 827/230V Pompa rolkowa Reglo Analogowa</td><td>aparatura Harvarda/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-0114</td><td></td></tr><tr><td>Zbiornik z płaszczem na roztwór buforowy 1 L</td><td>Aparatura Harvarda/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-3438</td><td></td></tr><tr><td>Zbiornik z płaszczem na roztwór buforowy 0,5 L</td><td>Aparatura Harvarda/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-3436</td><td></td></tr><tr><td>Przetwornik ciśnienia APT300&nbsp;</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-3862</td><td></td></tr><tr><td>TAM-D Przetwornik Plugsys</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-1793</td><td></td></tr><tr><td>SCP Kontroler serwomechanizmu Plugsys</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-2806</td><td></td></tr><tr><td>Windkessel&nbsp;</td><td>Aparatura Harvarda/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-3717</td><td></td></tr><tr><td>Akwizycja danych HSE-USB</td><td>Aparatura Harvarda/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-3330</td><td></td></tr><tr><td>Dializator niskostrumieniowy Diacap Polysulfon</td><td>B.Braun</td><td>7203525</td><td></td></tr><tr><td>Rurka PE do kaniulacji aorty 1,19 mm ID x 1,70 mm OD</td><td>Towary naukowe Inc.</td><td>BB31695-PE/8</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Odczynniki buforowe:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aminoplasmal 10%</td><td>B.Braun</td><td>134518064</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256-25G</td><td></td></tr><tr><td>Hydrat soli monosodowej kwasu L-glutaminowego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1626-100G</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa kwasu L-(-)-jabłkowego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1125-25G</td><td></td></tr><tr><td>Mleczan sodu L-L-Lmleczan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L7022-10G</td><td></td></tr><tr><td>sól sodowa kwasu alfa-ketoglutarowego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K1875-25G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31434-1KG-R</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761-5KG</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60130-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5378-500G</td><td></td></tr><tr><td>Kreatynina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4255-10G</td><td></td></tr><tr><td>Ampicylina</td><td>Roche</td><td>10835242001</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 * 6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2393-500G</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 * 6H2O&nbsp;</td><td>Riedel-de-Ha&euml; n</td><td>12074</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638-500G</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0876-500G</td><td></td></tr><tr><td>Hormon antydiuretyczny dDAVP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V2013-1MG</td><td></td></tr><tr><td>FITC-Inulina</td><td>Filtr Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td> używany do filtracji erytrocytów</td><td>Macherey-Nagel</td><td>MN 615</td><td></td></tr><tr><td>BGA Analiza:</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ABL 80 flex</td><td>Radiometr Medyczny mikroskop elektronowy ApS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>:</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Philips CM100 TEM</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

technika perfuzji nerki izolowanej u myszy

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

Mysia izolowana perfundowana nerka (MIPK) to technika utrzymywania nerki myszy w warunkach ex vivo w stanie perfundowanym i funkcjonalnym przez 1 godzinę. Jest to warunek wstępny do badania fizjologii izolowanego narządu i do wielu innowacyjnych zastosowań, które mogą być możliwe w przyszłości, w tym decelularyzacja perfuzyjna w bioinżynierii nerek lub podawanie leków zapobiegających odrzuceniu lub edycji genomu w wysokich dawkach w celu przygotowania nerki do przeszczepu. W czasie perfuzji można manipulować nerkami, oceniać czynność nerek i podawać różne farmaceutyki. Po zabiegu nerka może zostać przeszczepiona lub przetworzona do biologii molekularnej, analizy biochemicznej lub mikroskopii.
Ten artykuł opisuje perfuzat i technikę chirurgiczną potrzebną do perfuzji ex vivo nerek myszy. Podano szczegóły dotyczące aparatu perfuzyjnego i przedstawiono dane pokazujące żywotność preparatu nerkowego: przepływ krwi przez nerki, opór naczyniowy i dane dotyczące moczu jako funkcjonalne, mikrofotografie elektronów transmisyjnych różnych segmentów nefronu jako odczyty morfologiczne oraz western blot białek transportowych różnych segmentów nefronu jako odczyt molekularny.

Dzięki opisanej metodzie izolowane nerki mysze mogą pozostać żywe przez co najmniej 1 hr. Przebadaliśmy żywotność tkanki po 1 hr ciągłej perfuzji za pomocą metod funkcjonalnych (przepływ nerkowy i opór naczyniowy, analiza gazometryczna odpływu żylnego, współczynnik filtracji kłębuszkowej, frakcyjna wydalanie Na+ i K+ z moczem oraz osmolalność moczu) i morfologicznych (transmisyjna mikroskopia elektronowa, TEM) w czterech nerkach myszy C57Bl/6 typu dzikiego. Dodatkowo...

Mysia izolowana perfundowana nerka (MIPK) to technika utrzymywania nerki myszy w warunkach ex vivo w stanie perfundowanym i funkcjonalnym przez 1 godzinę. i technika chirurgiczna są szczegółowo opisane.

Technika perfuzji nerki izolowanej u myszy

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest analiza funkcji izolowanej nerki w modelu ex vivo perfuzji nerki myszy, z wyłączeniem wpływu ciśnienia krwi, hormonów lub autonomicznego układu nerwowego. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu nefrologii.Umożliwia wgląd w funkcjonowanie izolowanego narządu i służy jako eleganckie narzędzie do badania ostrego uszkodzenia nerek. Główną zaletą IPK jest możliwość badania funkcji narządu w izolacji od wpływów systemowych. Po przygotowaniu myszy do zabiegu, za pomocą nożyczek wykonaj laparotomię pośrodkową od grzebienia łonowego do mostka.Najpierw należy rozciąć skórę, a następnie mięśnie brzucha. Następnie należy usunąć jelita i ułożyć je po lewej stronie myszy, bocznie względem jamy brzusznej. Teraz należy uwolnić pęcherz moczowy z tkanki łącznej i odsłonić oba moczowody oraz cewkę moczową.W przypadku tych procedur wszystkie podwiązania należy wykonać przy użyciu szwów 5-0. Pierwsze podwiązanie należy założyć wokół lewego mocznika. Związać je ciasno podwójnym węzłem chirurgicznym.Następnie, stosując tę samą technikę, załóż ligaturę wokół cewki moczowej. Potem załóż ligaturę pętlową wokół całego pęcherza, ale pozostaw ją niezwiązaną. Po założeniu trzech pierwszych szwów, użyj nożyczek okularowych, aby wykonać nacięcie w pęcherzu o długości 1 mm.W miejsce nacięcia wprowadź kaniulę wykonaną z dwóch centymetrów rurki PE-50. Następnie zaciśnij ligaturę opasującą pęcherz, aby unieruchomić kaniulę. Po zakaniulowaniu pęcherza przetnij lewy moczowód oraz cewkę moczową dystalnie względem ligatur.Pęcherz powinien być teraz przymocowany jedynie do prawego moczowodu i powinien swobodnie się poruszać. Następnie należy usunąć tkankę łączną i tłuszcz otaczający aortę brzuszną. Potem należy założyć podwiązki w połowie odsłoniętej aorty oraz tuż poniżej przepony, pomiędzy tętnicą krezkową górną a pniem trzewnym.Każdą z tych ligature pozostaw również luźno. Następnie załóż ligature wokół tętnicy krezkowej górnej. Teraz załóż trzecią ligature wokół aorty bezpośrednio poniżej prawej tętnicy nerkowej i powyżej lewej tętnicy nerkowej.Jest to podwiązka numer siedem. Na koniec załóż podwiązkę wokół pakietu żyły ogonowej. Teraz umieść zacisk pomiędzy podwiązką numer siedem a rozgałęzieniem lewej tętnicy nerkowej.Następnie wykonaj niewielkie nacięcie aorty, za siedmią podwiązką (strona ogonowa), uważając, aby nie przeciąć ściany grzbietowej, i rozszerz otwór za pomocą rozszerzacza naczyń. Do otworu wprowadź dwucentymetrową kaniulę PE-50, wsuwając jej końcówkę bezpośrednio do zacisku. Następnie otwórz zacisk.Następnie przesuń końcówkę igły w kierunku kranialnym, aż dotrze ona do miejsca połączenia prawej tętnicy nerkowej z aortą. Teraz zaciśnij ligaturę siódmą, a następnie zaciśnij ligaturę w połowie aorty brzusznej. Kontynuuj, otwierając klatkę piersiową za pomocą nożyczek poprzez rozcięcie przepony.Następnie, jednym cięciem oddziel aortę, żyłę główną, serce i nerwy wegetatywne. Teraz uruchom kontrolę ciśnienia pompy perfuzyjnej i utrzymuj średnie ciśnienie w przedziale od 80 do 100 mmHg. Teraz zawiąż trzy pozostałe, niezwiązane ligatury wokół pakietu aorty i żyły ogonowej.Za pomocą nożyczek uwolnić prawą nerkę z otaczającej tkanki łącznej oraz oddzielić ją od torebki tłuszczowej. Przeciąć aortę proksymalnie względem ligatury znajdującej się między tętnicą krezkową górną a pniem trzewnym. Następnie przeciąć tętnicę krezkową górną dystalnie względem ligatury na tętnicy krezkowej górnej.Następnie należy usunąć pęczek naczyń podtrzymujących nerkę, uważając, aby nie przeciąć samych naczyń. Potem należy przeciąć wątrobę w miejscu jej połączenia z nerką, pozostawiając jednak niewielką część wątroby przymocowaną do niej, aby żyła główna pozostała otwarta. Kolejnym krokiem jest usunięcie pęczka nerkowego z myszy.Teraz pozostaw nerkę w komorze i wyjmij mysz. W miejscu połączenia wątroby i nerki umieść pętlę z nici. Następnie przeprowadź kaniulację żyły głównej za pomocą linii żylnej i zaciśnij pętlę.Nerka powinna teraz stabilnie spoczywać w pojemniku. Odpływ żylny przez linię żylną powinien rozpocząć się natychmiast. Odpływ moczu rozpocznie się po około trzech minutach.Perystaltyka moczowodu powinna rozpocząć się niezwłocznie i pozostać stabilna przez co najmniej jedną godzinę. Zamknij pudełko. Preparat jest teraz gotowy i powinien zachować żywotność przez co najmniej godzinę.Po zastosowaniu opisanego метода u myszy C57 black 6, badano żywotność tkanki w czterech nerkach po godzinie ciągłej perfuzji. Ciśnienie utrzymywano na stałym poziomie 100 mmHg. Przepływ perfuzatu oraz opór naczyniowy pozostały stabilne we wszystkich czterech nerkach.Wskaźnik filtracji kłębuszkowej oceniono za pomocą klirensu inuliny FITC, który z założenia miał wzrastać w czasie, lecz nie w sposób istotny. Frakcyjny wydalanie sodu i potasu oceniono po 55 minutach perfuzji. Parametry te uległy zwiększeniu w porównaniu z sytuacją in vivo.Po 55 minutach molalność moczu nie wzrosła powyżej osmolalności odpływu żylnego. Następnie nerki zostały utrwalone, a ich ultrastruktura oceniona za pomocą TEM. Kłębuszki w segmentach S1 kanalików bliższych pozostały w dużej mierze niezmienione.Niektóre, ale nie wszystkie segmenty S2 i S3 cewek bliższych w grubych częściach wznoszących pętli Henlego, które nie znajdowały się w pobliżu pęczków naczyniowych, wykazywały oznaki uszkodzenia narządu. Po dokładniejszej analizie stwierdzono, że cewki kręte dalsze oraz cewki zbiorcze nie wykazywały oznak martwicy. Ogólnie rzecz biorąc, obraz nerek odpowiadał doniesieniom dotyczącym izolowanych perfuzowanych nerek szczura.Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować metody analityczne, takie jak obrazowanie lub techniki FACS, a następnie przeprowadzić analizę białek lub RNA w celu uzyskania dalszych informacji.

the-mouse-isolated-perfused-kidney-technique

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Precyzyjny mysi model ostrego uszkodzenia nerek (AKI) wywołanego niedokrwieniem jest ważnym narzędziem do badania ostrego uszkodzenia nerek i potencjalnego poszukiwania środków terapeutycznych do leczenia uszkodzeń nerek. System obciążników wiszących zapewnia narzędzie do natychmiastowej i niezawodnej okluzji oraz reperfuzji tętnicy nerkowej bez powodowania zastoju nerkowego.

Zastosowanie systemu obciążeń wiszących do izolowanej okluzji tętnicy nerkowej

W tym filmie opisujemy procedurę pobierania nerki z przestrzeni zaotrzewnowej myszy. Wyekstrahowaną nerkę można następnie poddać mikrosekcji w celu uzyskania nienaruszonej nerki bez torebki nerkowej i otaczającej warstwy tłuszczu.

Ekstrakcja nienaruszonej nerki od myszy: technika uzyskiwania nerki bez torebki nerkowej z modeli mysich

Ten film opisuje metodę izolowania nienaruszonych kłębuszków nerkowych od nerek myszy. Otrzymane w ten sposób kapsułkowane i zdecapsulowane kłębuszki nerkowe mogą być dalej wykorzystywane do hodowli komórek nabłonka ciemieniowego z mysiej nerki.

Izolacja kłębuszków nerkowych: technika uzyskiwania nienaruszonych kłębuszków nerkowych z mysiej nerki

Opisujemy modele umiarkowanego i ciężkiego uszkodzenia nerek wywołanego niedokrwieniem i reperfuzją, w których myszy przechodzą jednostronne zaciskanie szypułki nerki, po którym następuje równoczesna lub opóźniona nefrektomia przeciwległa. Modele te konsekwentnie powodują dysfunkcję nerek i zwłóknienie pourazowe, ale ciężkość urazu i przeżycie zależą od pochodzenia myszy, wieku i sprzętu chirurgicznego.

Model niedokrwienno-reperfuzyjny ostrego uszkodzenia nerek i zwłóknienia pourazowego u myszy

Techniki, które są niezawodne i skuteczne w izolacji komórek odpornościowych nerek, są potrzebne do dalszych zastosowań. Wymaga to znakowania powierzchniowego przeciwciałami niewielkiej liczby komórek odpornościowych nerek. W niniejszym artykule opisujemy zwięzłą metodę izolacji komórek odpornościowych nerek, która pozornie osiąga ten cel.

Niezawodna i wysokowydajna izolacja komórek odpornościowych nerek

Ten protokół zapewnia efektywne kosztowo podejście do izolowania i charakteryzowania pierwotnych komórek kanalików nerkowych myszy, które następnie mogą być subhodowane w celu oceny funkcji biologicznych nerek ex vivo, w tym bioenergetyki mitochondrialnej.

Izolacja, charakterystyka i wysokoprzepustowa analiza strumienia zewnątrzkomórkowego pierwotnych komórek nabłonka kanalików nerkowych myszy

Tutaj prezentujemy protokół do mysiego znakowania in vivo białek powierzchniowych komórek kłębuszkowych za pomocą biotyny. Protokół ten zawiera informacje o tym, jak perfuzja nerek myszy, izolowanie kłębuszków nerkowych i przeprowadzanie endogennej immunoprecypitacji białka będącego przedmiotem zainteresowania.

Izolacja kłębuszków nerkowych i znakowanie in vivo białek powierzchniowych komórek kłębuszków nerkowych

Połączenie znakowania przeciwciałami, optycznego oczyszczania i zaawansowanej mikroskopii świetlnej pozwala na trójwymiarową analizę całych struktur lub organów. Opisano tutaj prostą metodę łączenia znakowania immunologicznego grubych plasterków nerki, oczyszczania optycznego za pomocą cynamonianu etylu oraz obrazowania konfokalnego, które umożliwia wizualizację i kwantyfikację trójwymiarowych struktur nerkowych.

Optyczne oczyszczanie i obrazowanie znakowanej immunologicznie tkanki nerki

Niniejszy artykuł zawiera szczegółowe instrukcje, które umożliwią badaczom wykonanie odwracalnej jednostronnej niedrożności moczowodu u myszy przy użyciu ustandaryzowanego modelu, który umożliwia analizę długoterminowych wyników strukturalnych i funkcjonalnych po odwróceniu przedłużonej niedrożności moczowodu.

Mysi model do oceny długoterminowych wyników strukturalnych i funkcjonalnych po odwróceniu przedłużającej się jednostronnej niedrożności moczowodu

W tym artykule przedstawiono model niedokrwiennej CKD z wykorzystaniem jednostronnego IRI nerki z kontralateralną nefrektomią wykonaną dzień przed pobraniem próbki; protokół ten umożliwia ocenę funkcjonalną opartą na surowicy, wysoką przeżywalność oraz powtarzalną patologię PREWKinek w ciągu 28 i 42 dni, zapewniając wszechstronną platformę do badań mechanistycznych i interwencyjnych.

Model myszy przejścia z ostrej do przewlekłej choroby nerek wywołanego niedokrwieniem nerek lub uszkodzeniem reperfuzyjnym

Do monitorowania zmian przepływu krwi mikronaczyniowej nerki podczas jednostronnej niedokrwienności nerki po resekcji prawej nerki u myszy zastosowano laserowy system obrazowania z kontrastem plamkowym (plamkowatym).

Perfuzja mikronaczyniowa monitorowana za pomocą laserowego obrazowania z kontrastem plamkowym podczas uszkodzenia niedokrwienia nerek i reperfuzji u myszy

Poznaj technikę perfuzji nerki izolowanej u myszy do badania funkcji nerkowych poza organizmem. Ta metoda pozwala wykluczyć wpływ układowy i analizować mechanizmy ostrego uszkodzenia nerek.

Technika perfuzji nerki izolowanej u myszy

Przeglądaj więcej filmów