Technika perfuzji nerki izolowanej u myszy
17 listopada 2016
Mysia izolowana perfundowana nerka (MIPK) to technika utrzymywania nerki myszy w warunkach ex vivo w stanie perfundowanym i funkcjonalnym przez 1 godzinę. i technika chirurgiczna są szczegółowo opisane.
Ogólnym celem tego protokołu jest analiza izolowanej funkcji nerek w nerce myszy z perfuzją ex vivo. Z wyłączeniem wpływu ciśnienia krwi, hormonów czy autonomicznego układu nerwowego. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania nefrologii.
Daje wnętrze funkcji izolowanych narządów i służy jako eleganckie narzędzie do badania ostrego uszkodzenia nerek. Główną zaletą IPK jest to, że funkcja narządów jest badana przy braku wpływów ogólnoustrojowych. Po przygotowaniu myszy do operacji, za pomocą nożyczek, wykonaj średnią laparotomię od grzebienia łonowego do mostka.
Najpierw otwórz skórę, a następnie mięśnie brzucha. Następnie usuń jelita i umieść je po lewej stronie myszy, z boku brzucha. Teraz uwolnij pęcherz z tkanki łącznej i odsłoń zarówno moczowody, jak i cewkę moczową.
W przypadku tych zabiegów umieść wszystkie ligatury za pomocą szwów 5-0. Pierwsza ligatura, którą należy umieścić, znajduje się wokół lewego moczowodu. Zamknij to szczelnie podwójnym węzłem chirurgicznym.
Następnie umieść ligaturę wokół cewki moczowej przy użyciu tej samej techniki. Następnie umieść ligaturę lasso wokół całego pęcherza, ale pozostaw ją rozwiązaną. Po założeniu pierwszych trzech szwów użyj nożyczek do oczu, aby wykonać nacięcie w pęcherzu o długości jednego milimetra.
W tym nacięciu umieść kaniulę wykonaną z dwóch centymetrów rurki PE-50. Teraz zamknij więzadło mocujące pęcherz na lasso, zabezpieczając kaniulę. Z kaniulowanym pęcherzem moczowym odetnij teraz lewy moczowód i cewkę moczową dystalnie od więzadeł.
Pęcherz moczowy powinien być teraz przymocowany tylko do prawego moczowodu i powinien się swobodnie poruszać. Następnie usuń tkankę łączną i tłuszcz otaczający aortę brzuszną. Następnie umieść ligatury wokół środka odsłoniętej aorty i tuż poniżej przepony między tętnicą krezkową górną a pniem trzewnym.
Trzymaj każdy z nich również luźno. Następnie umieść ligaturę wokół tętnicy krezkowej górnej. Teraz umieść trzecią ligaturę wokół aorty bezpośrednio pod prawą tętnicą nerkową i powyżej lewej tętnicy nerkowej.
To jest ligatura numer siedem. Na koniec umieść podwiązanie wokół pakietu żyły ogonowej. Teraz umieść zacisk między więzadłem numer siedem a rozgałęzieniem lewej tętnicy nerkowej.
Następnie wykonaj małe nacięcie w aorcie, doogonowo do podwiązania siódmego, uważając, aby nie przeciąć ściany grzbietowej i rozciągnąć otwór za pomocą rozszerzacza naczynia. Do otworu włóż dwucentymetrową ciągniętą kaniulę PE-50, wciskając końcówkę tuż w zacisk. Następnie otwórz zacisk.
Następnie popchnij końcówkę igły czaszkowo, aż dotrze do połączenia prawej tętnicy nerkowej i aorty. Teraz zamknij więzadło siódme, a następnie zamknij ligaturę w środku aorty brzusznej. Kontynuuj, otwierając klatkę piersiową nożyczkami, preparując przeponę.
Następnie jednym cięciem oddziel aortę, żyłę główną, serce i nerwy wegetatywne. Teraz rozpocznij kontrolę ciśnienia pompy perfuzyjnej i utrzymuj średnie ciśnienie między 80 a 100 milimetrów słupa rtęci. Teraz zamknij trzy pozostałe niezawiązane ligatury wokół aorty i pakietu żył ogonowych.
Za pomocą nożyczek uwolnij prawą nerkę z otaczającej tkanki łącznej i uwolnij ją z torebki tłuszczowej. Przetnij aortę proksymalnie do więzadła między tętnicą krezkową górną a pniem trzewnym. Następnie przeciąć tętnicę krezkową górną dystalnie do ligatury wokół tętnicy krezkowej górnej.
Teraz usuń wiązkę naczyń podtrzymujących nerkę, uważając, aby nie przeciąć samych naczyń. Następnie przeciąć wątrobę na połączeniu z nerką, ale pozostawić do niej przyczepioną niewielką część wątroby, tak aby żyła główna była przez nią otwarta. Następnym krokiem jest usunięcie pęczka nerek z myszy.
Teraz pozostaw nerkę w komorze i wyjmij mysz. Na połączeniu między wątrobą a nerką umieść ligaturę lasso. Następnie kanuluj żyłę główną linią żylną i zamknij ligaturę lasso.
Nerka powinna teraz stabilnie leżeć w pudełku. Odpływ żylny przez linię żylną należy rozpocząć natychmiast. Odpływ moczu rozpocznie się po około trzech minutach.
Perystaltyka moczowodu powinna rozpocząć się natychmiast i pozostać stabilna przez co najmniej godzinę. Zamknij pudełko. Przygotowanie jest już zakończone i powinno pozostać żywe przez co najmniej godzinę.
Po zastosowaniu opisanej metody na czarnych myszach C57 6, po godzinie ciągłej perfuzji przetestowano żywotność tkanek czterech nerek. Ciśnienie utrzymywało się na stałym poziomie 100 milimetrów słupa rtęci. Przepływ perfuzatu i opór naczyniowy pozostały stałe we wszystkich czterech nerkach.
Szybkość filtracji kłębuszkowej oceniano za pomocą klirensu inuliny FITC, który miał wzrosnąć w czasie, ale nie znacząco. Frakcyjne wydalanie sodu i potasu oceniano po 55 minutach perfuzji. Parametry te uległy zwiększeniu w porównaniu z sytuacją in vivo.
Po 55 minutach molalność pisuarów nie wzrosła powyżej osmolalności odpływu żylnego. Następnie nerki zostały unieruchomione, a ich ultrastruktura została oceniona za pomocą TEM. Kłębuszki nerkowe w segmentach S1 kanalików proksymalnych wydawały się w dużej mierze niezmienione.
Niektóre, ale nie wszystkie segmenty S2, S3 kanalików proksymalnych w grubych kończynach wstępujących, które nie znajdowały się blisko wiązek naczyniowych, wykazywały oznaki uszkodzenia narządów. Po bliższym przyjrzeniu się, dystalne kanaliki kręte i kanaliki zbiorcze nie wykazywały oznak martwicy. Ogólnie rzecz biorąc, nerki odzwierciedlały to, co zgłasza się w przypadku izolowanych perfuzji nerek szczurów.
Po tej procedurze można przeprowadzić metody analizy, takie jak obrazowanie lub fakty, a następnie analizę białka lub RNA w celu uzyskania dalszych informacji.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Technika izolowanej perfuzji nerki myszy (MIPK) umożliwia analizę funkcji nerek w warunkach ex vivo przez jedną godzinę. Metoda ta wyklucza wpływy systemowe, dostarczając informacji na temat funkcjonowania izolowanego organu oraz ostrego uszkodzenia nerek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Nefrologia
- Techniki perfuzji narządów
- Badania nad ostrym uszkodzeniem nerek
Wstęp
- Technika MIPK została opracowana w celu badania funkcji nerek bez wpływu ciśnienia krwi lub hormonów.
- Metoda ta jest kluczowa dla zrozumienia funkcjonowania izolowanego narządu.
- Służy ona jako cenny instrument do badania ostrego uszkodzenia nerek.
- Przygotowanie chirurgiczne obejmuje średnią laparotomię w celu uzyskania dostępu do nerki.
Cel badania
- Aby przeanalizować funkcję izolowanej nerki w kontrolowanym środowisku ex vivo.
- Aby wykluczyć wpływy systemowe na wydajność pracy nerki.
- Aby dostarczyć informacji na temat mechanizmów ostrego uszkodzenia nerek.
Zastosowane metody
- Przygotowanie myszy do zabiegu chirurgicznego.
- Laparotomia środkowa od grzebienia łonowego do mostka.
- Perfuzja izolowanej nerki specyficznymi buforami.
- Monitorowanie funkcji nerek podczas okresu perfuzji.
Główne wyniki
- Skuteczne utrzymanie funkcji nerek przez jedną godzinę ex vivo.
- Wykazanie efektów ostrego uszkodzenia nerek w kontrolowanych warunkach.
- Pozyskanie informacji na temat reakcji izolowanego organu na perfuzję.
- Walidacja techniki MIPK jako narzędzia badawczego.
Wnioski
- Technika MIPK jest skuteczna w badaniu funkcji nerek bez wpływu czynników ogólnoustrojowych.
- Metoda ta pozwala na lepsze zrozumienie mechanizmów ostrego uszkodzenia nerek.
- Stanowi ona platformę dla przyszłych badań z zakresu nefrologii.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Technika izolowanej perfuzji nerki myszy (MIPK) umożliwia mechanistyczną ocenę ryzyka celów nerkowych poprzez odizolowanie funkcji narządu od czynników zakłócających o charakterze systemowym. Wspiera to walidację celów oraz opracowywanie testów w programach odkrywania leków ukierunkowanych na nefrologię. Metoda ta zapewnia wiarygodną wartość prognostyczną przy ocenie kandydatów na leki w kontrolowanym, powtarzalnym systemie ex vivo.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Pozwala na weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez ocenę reakcji izolowanych nerek na związki chemiczne bez zakłóceń hormonalnych lub nerwowych.
- Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację celu poprzez bezpośredni pomiar przepływu krwi nerkowej, oporu naczyniowego i wydalania moczu.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję związków w portfelu badawczym poprzez identyfikację substancji zmieniających współczynnik filtracji kłębuszkowej lub gospodarkę elektrolitową w systemie istotnym dla danej choroby.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszych badań przesiewowych z ilościowymi odczytami funkcjonalnymi i molekularnymi.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje warunki analizy poprzez kontrolowane ciśnienie perfuzji i spójne ramy czasowe zbierania moczu.
- Wartość skalowalności: Umożliwia ponowne wykorzystanie platformy do modelowania ostrego uszkodzenia nerek oraz profilowania transporterów w poszczególnych segmentach nefronu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość translacyjna: Zachowuje istotność chorobową dzięki odczytom strukturalnym i molekularnym, w tym ultrastrukturze w TEM oraz analizie białek transportowych metodą western blot.
- Ciągłość przedkliniczna: Łączy etap odkryć z walidacją przedkliniczną, umożliwiając analizę tkanek po perfuzji w badaniach obrazowych, białkowych lub RNA.
- Decyzje uwzględniające ryzyko: Wspiera decyzje o dalszym rozwoju poprzez ujawnianie specyficznych dla segmentów wzorców uszkodzeń cewek w warunkach stresu perfuzyjnego.
Integracja potoków przetwarzania i przepływów pracy
Technika MIPK wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od testowania hipotez dotyczących celów terapeutycznych po identyfikację związków wiodących, zapewniając walidację funkcjonalną przed etapem badań przedklinicznych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez izolację funkcji nerek w celu wyjaśnienia efektów leków specyficznych dla danej ścieżki.
- Przesiewy: Zapewnia gotowość do analiz dzięki stabilnym parametrom perfuzji i mierzalnym wynikom, takim jak klirens inuliny FITC oraz frakcyjne wydalanie elektrolitów.
- Analityka: Generuje zestawy danych porównawczych poprzez pomiary oporu naczyniowego, współczynnika filtracji kłębuszkowej i osmolalności w celu oceny efektów związków.
- Badania translacyjne: Umożliwia kontynuację badań poprzez analizę tkanek po perfuzji w celu dopasowania biomarkerów i uzyskania wglądu w mechanizmy działania.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako wielokrotnego użytku platforma perfuzyjna do profilowania segmentów nefronów i badań nad inhibicją transporterów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną poprzez eliminację zmiennych systemowych w ocenie funkcji nerek.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki standaryzowanemu przygotowaniu chirurgicznemu i kontroli ciśnienia perfuzji (80–100 mmHg).
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez dostarczenie wczesnych danych o dysfunkcjach czynnościowych w kontekście specyficznym dla nerek.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko w oparciu o bezpośrednie odpowiedzi na poziomie narządu na perturbacje farmakologiczne.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie naczyniowej chirurgii mysiej oraz technik kaniulacji.
- Zależne od aparatury perfuzyjnej zdolnej do utrzymania stabilnego ciśnienia i przepływu.
- Wymaga standaryzacji między zespołami w celu zapewnienia spójności w rozmieszczeniu podwiązek i kaniulacji pęcherza.
- Rozważania dotyczące adaptacji obejmują specyficzne dla gatunku rozmiary naczyń oraz skład buforu perfuzyjnego.
- Ograniczenie praktyczne: okno żywotności wynoszące około jednej godziny ogranicza badania nad długotrwałą ekspozycją na związki.
