Name: Analiza cytometryczna przepływowa alergenu związanego z cząstkami bet v 1 w PM10 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: Poznaj metodę cytometrii przepływowej do ilościowego oznaczania alergenów w cząstkach PM10 z wykorzystaniem przeciwciał przeciwko Bet v 1. Technika ta umożliwia szybką analizę transportu alergenów do dróg oddechowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy chcieliby podziękować Katrin Bossmann, Anett Neumann i Eike Wolter (Niemiecka Agencja Ochrony Środowiska) za ich cenną pracę przygotowawczą.

UWAGA: Niniejszy protokół opisuje pośrednie barwienie cząstek PM10 za pomocą przeciwciała monoklonalnego (monoklonalne przeciwciało mysie IgG1, klon MA-3B4) przeciwko Bet v 1, głównemu komponentowi antygenowemu pyłku brzozy, oraz przeciwciała wtórnego znakowanego allofikocyjaniną (APC) (przeciwciało anty-mysie IgG1, klon A85-1), a następnie analizę na cytometrze przepływowym. Przy dostępności odpowiednich innych przeciwciał, metodę tę można rozszerzyć na detekcję innych antygenów związanych z cząstkami powietrza otoczenia.
1. Pobieranie próbek PM10
<ol>
	<li>Należy zebrać PM10 z powietrza otoczenia na filtrach z politetrafluoroetylenu (PTFE) przy użyciu niskowydajnego próbnika z natężeniem przepływu 2.3 m3/hr (Rysunek 1). Charakterystyka próbnika wykorzystanego w opisanych tutaj eksperymentach znajduje się w16. Czas pobierania zależy od wymaganej ilości PM10 (zazwyczaj od 1 do 10 dni).</li>
	<li>Po zakończeniu czasu inkubacji należy wyjąć filtr z próbnika i zamrozić go w temperaturze -20 °C do momentu użycia.</li>
</ol>
<img alt="Konfiguracja sprzętu do monitorowania pogody; czujniki temperatury, gromadzenie danych, badania klimatu." src="/files/ftp_upload/54721/54721fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Próbnik PM10 o niskim przepływie. Przykład próbnika PM10 o niskim przepływie. <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54721/54721fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
2. Usuwanie PM10 i pomiar liczby cząstek
<ol>
	<li>Pozostawić filtr PTFE do rozmrożenia na około 5 min. Następnie umieścić filtr w czystej polistyrenowej szalce Petriego (Rycina 2A). W przypadku przetwarzania więcej niż jednego filtra, dla każdego z nich należy użyć nowej szalki Petriego.</li>
	<li>Następnie przykryć filtr PTFE solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS). Protokół ten został opracowany dla końcowego stężenia PM10 wynoszącego 8x106 cząstek na ml (patrz krok 3.3). Aby uzyskać co najmniej takie stężenie, należy zastosować następującą empiryczną objętość PBS do przykrycia filtra: jeśli czas zbierania PM10 był &lt;2 dni, użyć 2 ml. Dla czasów inkubacji ≥2 dni użyć 4 ml. 
	UWAGA: W celu zwiększenia stężenia cząstek w zawiesinie PM10 można, jeśli jest to odpowiednie, połączyć zawiesiny z różnych filtrów.</li>
	<li>Przytrzymać filtr PTFE pęsetą i szczotkować elektryczną szczoteczką do zębów z głowicą typu sensitive przez 1 min (Ryciny 2B, 2C). Przenieść zawiesinę cząstek w PBS, zwaną dalej zawiesiną PM10, do czystej probówki reakcyjnej.</li>
</ol>
<img alt="Schemat procesu czyszczenia szalki Petriego za pomocą szczoteczki i siatki, przedstawiający kolejno etapy od A do C." src="/files/ftp_upload/54721/54721fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Usuwanie PM10 za pomocą elektrycznej szczoteczki do zębów. Filtr z politetrafluoroetylenu z pobranym PM10 umieszcza się w polistyrenowej szalce Petriego (A) i zalewa 4 ml PBS. Następnie PM10 jest usuwany za pomocą elektrycznej szczoteczki do zębów (B: przed szczotkowaniem oraz C: po szczotkowaniu przez 1 min). <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54721/54721fig2large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<ol start="4">
	<li>Zmierz stężenie cząstek PM10, np. przy użyciu licznika cząstek. Rozcieńcz odpowiednią objętość zawiesiny PM10, np. 50 µl w 10 ml izotonicznego buforu pomiarowego, wykonaj trzy pomiary i oblicz średnią całkowitą liczbę cząstek na ml. Należy upewnić się, że zastosowany licznik cząstek jest w stanie wykryć cząstki o odpowiedniej wielkości.</li>
</ol>
3. Barwienie Bet v 1
<ol>
	<li>Oblicz liczbę probórek reakcyjnych wymaganych do analizy próbki: Potrzebne są co najmniej trzy probówki: (i) jedna probówka z samą próbką (kontrola natywna), (ii) jedna probówka z próbką i przeciwciałem wtórnym (kontrola negatywna) oraz (iii) jedna probówka z próbką oraz przeciwciałami pierwotnym i wtórnym (próbka specyficzna). W przypadku pierwszego pomiaru przygotuj co najmniej dwie probówki dla (i), (ii) i (iii), aby dysponować wystarczającą ilością materiału do prawidłowego ustawienia cytometru (patrz krok 4.1).</li>
	<li>Oblicz ilość zawiesiny PM10 wymaganą dla określonej liczby probórek reakcyjnych. Każda probówka wymaga 50 µl zawiesiny.</li>
	<li>Dostosuj stężenie cząstek zmierzone w kroku 2.4 do objętości zawiesiny obliczonej w kroku 3.2, aby uzyskać końcowe stężenie 8x106 cząstek na ml, dodając odpowiednią ilość PBS. 
	UWAGA: Pozostałą zawiesinę PM10 można zamrozić w temperaturze -20 °C do przyszłych eksperymentów, choć w tym protokole zaleca się stosowanie świeżo przygotowanej zawiesiny PM10.</li>
	<li>Zablokuj niespecyficzne wiązanie, uzupełniając zawiesinę PM10 albuminą wołową (BSA) do końcowego stężenia 0,02%, używając roztworu stokowego, np. 1% BSA przygotowanego w PBS. Krótko wymieszaj na wortexie i inkubuj przez 20 min w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dla każdej próbki przeznaczonej do analizy cytometrycznej przenieś 50 µl zawiesiny z kroku 3.4 do czystej probówki reakcyjnej. Do probówek przeznaczonych do barwienia specyficznego dodaj monoklonalne przeciwciało mysie przeciwko Bet v 1 do końcowego stężenia 0,02 µg/µl, krótko wymieszaj na wortexie i inkubuj przez 60 min w temperaturze pokojowej.
	<ol>
		<li>Probówki z zawiesiną PM10-BSA przeznaczone jako kontrola natywna i kontrola negatywna powinny również pozostawać przez 60 min w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przemyj wszystkie próbki, dodając do każdej probówki 500 µl PBS uzupełnionego o 0,02% BSA, krótko wymieszaj na wortexie, a następnie odwiruj próbki przy 4 700 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej. Ostrożnie usuń nadsącz za pomocą pompy próżniowej.</li>
	<li>Powtórz krok 3.6.</li>
	<li>Określ całkowitą ilość wymaganego wtórnego przeciwciała anty-mysiego IgG1 znakowanego APC: 1 µg przeciwciała rozpuszczonego w 50 µl PBS z dodatkiem 0,02% BSA na probówkę reakcyjną. Rozcieńcz odpowiednią ilość przeciwciał w odpowiedniej objętości PBS uzupełnionego o 0,02% BSA.</li>
	<li>Dodaj 50 µl rozcieńczonego przeciwciała wtórnego do wszystkich probórek, z wyjątkiem probówki przeznaczonej na kontrolę natywną. Do tej ostatniej dodaj 50 µl PBS z dodatkiem 0,02% BSA. Wszystkie próbki wymieszaj na wortexie przez kilka sekund.</li>
	<li>Inkubuj wszystkie próbki przez 30 min w ciemności.</li>
	<li>Powtórz krok 3.6 dwukrotnie.</li>
	<li>Dodaj 50 µl PBS do każdej probówki, wymieszaj na wortexie i przeanalizuj próbki na cytometrze przepływowym.</li>
</ol>
4. Analiza cytometryczna
<ol>
	<li>Używając kontroli natywnej, dostosuj następujące parametry cytometru w celu optymalizacji analizy danych.
	<ol>
		<li>Za pomocą kontrolera progu rozproszenia przedniego (FSC) wyświetlanego na panelu sterowania urządzeniem, ustaw próg FSC na najniższą wartość (200) i rozpocznij analizę.</li>
		<li>Za pomocą kontrolera napięcia rozproszenia, dostosuj FSC oraz rozproszenie boczne (SSC) w taki sposób, aby wszystkie cząsteczki PM10 mogły zostać wykryte, a populacja cząsteczek znajdowała się mniej więcej w środku osi FSC i w dolnej połowie osi SSC.</li>
		<li>Za pomocą kontrolera napięcia fluorescencji, dostosuj napięcie APC oraz w razie potrzeby napięcie innej fluorescencji, np. izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC), która nie emituje światła o tej samej długości fali co APC. Upewnij się, że wszystkie cząsteczki są widoczne w dolnej połowie obu osi fluorescencji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Następnie przebadaj każdą próbkę, w tym kontrolę natywną, i zapisz dane FSC, SSC, APC oraz FITC dla co najmniej 10 000 cząsteczek na próbkę.</li>
	<li>Oceń dane za pomocą odpowiedniego oprogramowania. Zawartość zaadsorbowanego alergenu w konkretnej próbce można określić ilościowo na dwa sposoby:
	<ol>
		<li>Przeanalizuj intensywność fluorescencji APC wszystkich cząsteczek (wartość mediany) jako miarę obciążenia Bet v 1 we wszystkich cząsteczkach PM10. 
		UWAGA: Jeśli konkretna próbka zawierała alergen, intensywność fluorescencji APC powinna wzrosnąć w tej próbce w porównaniu z kontrolą negatywną. W przeciwieństwie do tego, inne intensywności fluorescencji (np. intensywność fluorescencji FITC) nie powinny ulec znaczącej zmianie.</li>
		<li>Oblicz procent cząsteczek PM10 z przyłączonym przeciwciałem anty-Bet v 1. W tym celu, w kontroli negatywnej, ustaw bramkę wokół cząsteczek uznanych za APC-dodatnie, skopiuj i wklej tę bramkę do konkretnej próbki, a następnie odejmij procent cząsteczek APC-dodatnich w kontroli negatywnej od procentu cząsteczek APC-dodatnich w konkretnej próbce.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Cakmak, S., Dales, R. E., Coates, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+air+pollution+increase+the+effect+of+aeroallergens+on+hospitalization+for+asthma%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Does air pollution increase the effect of aeroallergens on hospitalization for asthma?</a> J Allergy Clin Immunol. 129 (1), 228-231 (2012).</li>
<li>Barraza-Villarreal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Air+pollution%2C+airway+inflammation%2C+and+lung+function+in+a+cohort+study+of+Mexico+City+schoolchildren%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Air pollution, airway inflammation, and lung function in a cohort study of Mexico City schoolchildren.</a> Environ Health Perspect. 116 (6), 832-838 (2008).</li>
<li>Chen, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+association+of+ambient+air+pollution+with+airway+inflammation+in+schoolchildren%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">The association of ambient air pollution with airway inflammation in schoolchildren.</a> Am J Epidemiol. 175 (8), 764-774 (2012).</li>
<li>Cyprowski, M., Buczynska, A., Szadkowska-Stanczyk, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indoor+allergens+in+settled+dust+from+kindergartens+in+city+of+Lodz%2C+Poland%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Occup+Med+Environ+Health%22%5BJournal%5D)">Indoor allergens in settled dust from kindergartens in city of Lodz, Poland.</a> Int J Occup Med Environ Health. 26 (6), 890-899 (2013).</li>
<li>Brough, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+peanut+protein+in+the+home+environment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Distribution of peanut protein in the home environment.</a> J Allergy Clin Immunol. 132 (3), 623-629 (2013).</li>
<li>Galli, S. J., Tsai, M., Piliponsky, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+allergic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The development of allergic inflammation.</a> Nature. 454 (7203), 445-454 (2008).</li>
<li> World Health Organisation, R. O. f. E. Phenology and human health: allergic disorders: report on WHO meeting Rome, Italy. 16-17 January 2003, Copenhagen, Denmark, , WHO Regional Office for Europe. Chicago. 256(2003).</li>
<li>Wuthrich, B., Schindler, C., Leuenberger, P., Ackermann-Liebrich, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+atopy+and+pollinosis+in+the+adult+population+of+Switzerland+%28SAPALDIA+study%29.+Swiss+Study+on+Air+Pollution+and+Lung+Diseases+in+Adults%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Arch+Allergy+Immunol%22%5BJournal%5D)">Prevalence of atopy and pollinosis in the adult population of Switzerland (SAPALDIA study). Swiss Study on Air Pollution and Lung Diseases in Adults.</a> Int Arch Allergy Immunol. 106 (2), 149-156 (1995).</li>
<li>Grote, M., Valenta, R., Reichelt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abortive+pollen+germination%3A+a+mechanism+of+allergen+release+in+birch%2C+alder%2C+and+hazel+revealed+by+immunogold+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Abortive pollen germination: a mechanism of allergen release in birch, alder, and hazel revealed by immunogold electron microscopy.</a> J Allergy Clin Immunol. 111 (5), 1017-1023 (2003).</li>
<li>Namork, E., Johansen, B. V., Lovik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+allergens+adsorbed+to+ambient+air+particles+collected+in+four+European+cities%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Lett%22%5BJournal%5D)">Detection of allergens adsorbed to ambient air particles collected in four European cities.</a> Toxicol Lett. 165 (1), 71-78 (2006).</li>
<li>Süring, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PM10+contains+particle-bound+allergens%3A+Dust+analysis+by+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Env+Technol+Inn%22%5BJournal%5D)">PM10 contains particle-bound allergens: Dust analysis by Flow Cytometry.</a> Env Technol Inn. 5, 60-66 (2016).</li>
<li>Schappi, G. F., Suphioglu, C., Taylor, P. E., Knox, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentrations+of+the+major+birch+tree+allergen+Bet+v+1+in+pollen+and+respirable+fine+particles+in+the+atmosphere%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Concentrations of the major birch tree allergen Bet v 1 in pollen and respirable fine particles in the atmosphere.</a> J Allergy Clin Immunol. 100 (5), 656-661 (1997).</li>
<li>Buters, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+allergen+Bet+v+1+in+fractions+of+ambient+air+deviates+from+birch+pollen+counts%5BTitle%5D)+AND+%22Allergy%22%5BJournal%5D)">The allergen Bet v 1 in fractions of ambient air deviates from birch pollen counts.</a> Allergy. 65 (7), 850-858 (2010).</li>
<li>Buters, J. T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+Bet+v+1+from+birch+pollen+from+5+European+countries.+Results+from+the+HIALINE+study%5BTitle%5D)+AND+%22Atmos+Environ%22%5BJournal%5D)">Release of Bet v 1 from birch pollen from 5 European countries. Results from the HIALINE study.</a> Atmos Environ. 55, 496-505 (2012).</li>
<li>Ormstad, H., Johansen, B. V., Gaarder, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airborne+house+dust+particles+and+diesel+exhaust+particles+as+allergen+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Allergy%22%5BJournal%5D)">Airborne house dust particles and diesel exhaust particles as allergen carriers.</a> Clin Exp Allergy. 28 (6), 702-708 (1998).</li>
<li>Sven Leckel Ingenieurburo GmbH. LVS3/MVS6. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.leckel.de/index.php?option=com_docman&task=doc_download&gid=18
">http://www.leckel.de/index.php?option=com_docman&task=doc_download&gid=18
</a> (2016).</li>
<li>Brough, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peanut+protein+in+household+dust+is+related+to+household+peanut+consumption+and+is+biologically+active%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Peanut protein in household dust is related to household peanut consumption and is biologically active.</a> J Allergy Clin Immunol. 132 (3), 630-638 (2013).</li>
<li>Jochner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seasonal+variation+of+birch+and+grass+pollen+loads+and+allergen+release+at+two+sites+in+the+German+Alps%5BTitle%5D)+AND+%22Atmos+Env%22%5BJournal%5D)">Seasonal variation of birch and grass pollen loads and allergen release at two sites in the German Alps.</a> Atmos Env. , (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Krytycznym etapem protokołu jest zastosowanie odpowiedniego filtra do zbierania cząstek PM10 z otaczającego powietrza (patrz krok 1.1). Filtr musi być wystarczająco mocny, aby wytrzymać szczotkowanie elektryczną szczoteczką do zębów, a nie wszystkie materiały filtracyjne spełniają ten wymóg. Protokół barwienia ustalono przy stężeniu cząstek PM10 wynoszącym 8x106 cząstek na ml. Jeśli jednak materiał jest ograniczony, a łączenie próbek nie jest właściwe, metoda prawdopodobnie również zadziała, ale może być konieczne dostosowanie stężeń przeciwciał (patrz kroki 3.5 i 3.8).
Barwienie cząstkami PM10 metodą Bet v 1 nie spowodowało powstania odrębnych populacji cząstek barwionych dodatnio i ujemnie. Może to być spowodowane różnymi ilościami alergenu Bet v 1 zaadsorbowanego na każdej z cząstek, od bardzo małej do dużej ilości. Może to spowodować rozszerzenie sygnału APC, a tym samym przesunięcie populacji w kierunku pozytywnego nastawienia do APC. Ponieważ trudno jest oddzielić cząstki dodatnie od ujemnych, w celu określenia różnic w zawartości Bet v 1 w próbkach PM10>0,5 zastosowano dwie metody kwantyfikacji: (i) względną kwantyfikację poprzez pomiar mediany intensywności fluorescencji APC wszystkich cząstek oraz (ii) określenie procentu cząstek dodatnich APC. Jeśli chodzi o ładunek Bet v 1 cząstek z niskiego i wysokiego sezonu pylenia PM10>0,5, obie metody wykazały podobne wyniki. Mimo to zalecana jest względna kwantyfikacja na podstawie mediany intensywności fluorescencji wszystkich cząstek, ponieważ jest ona niezależna od umieszczenia bramki, a zatem prawdopodobnie mniej podatna na błędy.
Do tej pory w wielu badaniach analizowano zawartość alergenów w pyłach zawieszonych w otaczającym powietrzu poprzez ekstrakcję odpowiedniego alergenu, a następnie ilościowe oznaczanie za pomocą testu ELISA5,12-14,17. Istnieje zasadnicza różnica między opisaną tutaj procedurą a kwantyfikacją za pomocą testu ELISA: test ELISA określa ilościowo wyekstrahowany i rozpuszczony antygen, podczas gdy cytometria przepływowa analizuje antygen związany z cząstkami. Za pomocą testu ELISA ładunek Bet v 1 badanych próbek PM10 (n=8) był poniżej granicy wykrywalności wynoszącej 1,2 ng/ml (dane nie pokazane). Podobnie, Buters i inni nie zidentyfikowali Bet v 1 we frakcji PM <2,5 μm i tylko około 7% we frakcji 10 μm >PM >2,5 μm, ale ponad 93% we frakcji PM >10 μm otaczającego powietrza13. Kontrastujące wyniki testu ELISA z jednej strony i analizy FACS z drugiej strony mogą być spowodowane różnicami w metodzie wykrywania w połączeniu z rozbieżną czułością. Potrzebne są jednak dalsze badania, aby w pełni zrozumieć tę różnicę.
Metodą wizualizacji antygenu związanego z cząstkami jest skaningowa mikroskopia elektronowa10,14. Za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej Ormstad i in. uwidocznili Bet v 1 na powierzchni cząstek sadzy zawieszonych w powietrzu pobranych w sezonie wysokiego pylenia i w mniejszym stopniu na cząstkach pobranych w sezonie niskiego pylenia15. Ponadto stwierdzono, że alergeny z pyłków, lateksu, a także β-glukanów są adsorbowane przez cząstki spalania w otaczającym powietrzu10. Metoda ta nie pozwala jednak na ilościowe określenie alergenu związanego z cząstkami.
Za pomocą cytometrii przepływowej można określić ilościowo alergen Bet v 1 związany z cząstkami. Tak więc cytometria przepływowa może zaoferować nowy sposób charakteryzowania frakcji biologicznej PM10 od 10 do 0,5 μm, podobnie jak w przypadku innych odpowiednich przeciwciał, metoda ta może zostać rozszerzona o wykrywanie innych antygenów na cząsteczkach otaczającego powietrza, np. pleśni, alergenach roztoczy kurzu domowego lub LPS. Ponieważ cząsteczki PM10 dość łatwo adsorbują nie tylko materiał biologiczny, ale także chemikalia i metale, niespecyficzne wiązanie przeciwciał może jednak stanowić problem. Jeśli badane jest nowe przeciwciało, krytycznym krokiem jest udowodnienie specyficznego wiązania. Można to osiągnąć na przykład poprzez zablokowanie zdolności wiązania swoistego przeciwciała z odpowiednim antygenem przed barwieniem11.
Ponieważ zawartość pyłku brzozy w powietrzu może różnić się od liczby pyłków brzozy12,13,18, objawy alergiczne mogą być lepiej skorelowane z poziomem alergenu niż z liczbą pyłków14,18. W związku z tym przedstawiona metoda w połączeniu z danymi klinicznymi pozwala na zbadanie w przyszłych eksperymentach, czy reakcje alergiczne na brzozę odpowiadają obciążeniu alergenem Bet v 1 wynoszącym PM10>0,5.

Zanieczyszczenie powietrza jest uważane za ważną przyczynę środowiskową zwiększonej częstości występowania i nasilenia alergii oddechowych obserwowanych w ostatnich dziesięcioleciach1-3. Wzrosło również zainteresowanie dystrybucją powszechnych alergenów w pyle4,5.
Pyłek brzozy może wywołać katar sienny, ale może być również ważnym czynnikiem wywołującym astmę alergiczną6-8. Jest mało prawdopodobne, aby cały pyłek brzozy dostał się do dolnych dróg oddechowych lub znalazł się w PM10 ze względu na jego rozmiar (22 μm średnicy). Jednak alergeny pyłku brzozy, takie jak Bet v 1, główny składnik alergenu pyłku brzozy, mogą być uwalniane po pęknięciu pyłku9 i mogą wiązać się z cząsteczkami powietrza otoczenia10, a tym samym przedostawać się do dolnych dróg oddechowych. Rzeczywiście, wykazano, że PM10 może zawierać biologicznie aktywne alergeny, czego dowodem jest aktywacja in vitro bazofili z uczulonego na pyłki probandu11.
Zawartość alergenu Bet v 1 w próbkach PM10 została zbadana poprzez ekstrakcję odpowiedniego alergenu i późniejszą kwantyfikację za pomocą ELISA12-14. Za pomocą techniki ELISA mierzono rozpuszczony alergen, ale ilość cząstek naładowanych alergenem nadal pozostawała nieznana. Skaningowa mikroskopia elektronowa ujawniła cząstki obciążone alergenami, ale nie pozwoliła na określenie ilościowe10,15.
To badanie wykorzystuje cytometrię przepływową do ilościowego określenia proporcji cząstek PM10 załadowanych Bet v 1 w próbkach powietrza atmosferycznego. Ze względu na granicę wykrywalności cytometru przepływowego można badać tylko cząstki większe niż 0,5 μm. Frakcja >0,5 μm PM10 będzie dalej określana jako PM10>0,5.

<table><tbody><tr><td>Filtr teflonowy</td><td>Pall Life Sciences, USA</td><td>R2PL047</td><td>47 mm, 1.0 &micro; m</td></tr><tr><td>próbnik niskoobjętościowy</td><td>Sven Leckel Ingenieur B&uuml; ro GmbH, Niemcy</td><td>LVS3</td><td>przepływ powietrza 2,3 m3/h</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Biochrom, Niemcy</td><td>L1825</td><td>bez Ca/Mg, szczoteczka elektryczna o niskiej zawartości endotoksyn</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Braun, Niemcy</td><td>Licznik komórek Oral-B Vitality Sensitive</td><td></td></tr><tr><td>Casy&nbsp;</td><td>Sch&auml; rfe System GmbH, Niemcy</td><td>Model TTC</td><td>zakres wykrywalnej wielkości cząstek: 0,7 i mikro; m do 45&nbsp; &mikro; m</td></tr><tr><td>FACSCanto II&nbsp;</td><td>Becton Dickinson, Stany Zjednoczone</td><td>3-laserowe, 8-kolorowe (4-2-2)</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie FACS Diva v6.1.3&nbsp;</td>Albumina surowicy bydlęcej <td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(BSA)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>A2153-10G</td><td></td></tr><tr><td>monoklonalne mysie przeciwciało IgG1 przeciwko Bet v 1</td><td>Indoor Biotechnologies, Wielka Brytania</td><td>&nbsp; Klon MA-3B4</td><td>MA-3B4</td></tr><tr><td>Drugorzędowe przeciwciało anty-mysie IgG1 znakowane APC (allofikocyjaniną)&nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td>560089</td><td>klon A85-1</td></tr><tr><td>SPSSTM wersja oprogramowania 18&nbsp;</td><td>PASW Statistics 18, Hongkong, Chiny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish</td><td>Gosselin, Francja</td><td>BP50-02</td><td>D 55&nbsp; mm, H 15&nbsp; </td></tr><tr><td>mm Rura FACS&nbsp;</td><td>Becton Dickinson, Stany Zjednoczone</td><td>REF 352054</td><td>5 ml polistyrenu</td></tr><tr><td>CASYton</td><td>Roche Niemcy</td><td>REF 05651808001</td><td></td></tr><tr><td>Ślepe probówki Matrix</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>4140</td><td>1,4 ml,</td></tr><tr><td>Wirówka</td> PP <td>Heraeus, Thermo Scientific</td><td>Pompa próżniowa Megafuge 40R</td><td></td></tr><tr><td></td><td>INTEGRA Biosciences AG, Szwajcaria</td><td>Model 158 320</td><td>Inetrgra Vacusafe</td></tr><tr><td>rekombinowany antygen Bet v 1a&nbsp;</td><td>Indoor Biotechnologies, Wielka Brytania</td><td>LTR-BV1A-1</td><td>Stężenie: 2,0 mg/ml</td></tr></tbody></table>

analiza cytometryczna przepływowa alergenu związanego z cząstkami bet v 1 w pm10

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Cytometria przepływowa to metoda powszechnie stosowana do ilościowego oznaczania zawiesin ciał stałych, takich jak komórki lub bakterie, w zakresie wielkości od 0,5 do kilkudziesięciu mikrometrów średnicy. Oprócz scharakteryzowania właściwości rozpraszania do przodu i na boki, umożliwia wykorzystanie markerów znakowanych fluorescencyjnie, takich jak przeciwciała, do wykrywania odpowiednich struktur. Za pomocą pośredniego barwienia przeciwciałami zastosowano cytometrię przepływową do ilościowego oznaczania cząstek obciążonych alergenem pyłku brzozy (dokładnie Bet v 1) o średnicy od 0,5 do 10 μm w wdychanym pyle zawieszonym (PM10, wielkość cząstek ≤10 μm średnicy). Cząsteczki PM10 mogą pełnić rolę nośników zaadsorbowanych alergenów, mogąc transportować je do dolnych dróg oddechowych, gdzie mogą wywołać reakcje alergiczne.
Do tej pory zawartość alergenów w PM10 była badana za pomocą testów immunoenzymatycznych (ELISA) i skaningowej mikroskopii elektronowej. Test ELISA mierzy alergen rozpuszczony, a nie związany z cząstkami. W porównaniu ze skaningową mikroskopią elektronową, która może wizualizować cząstki obciążone alergenami, cytometria przepływowa może dodatkowo określić ich ilościowo. Ponieważ zawartość alergenów w powietrzu może odbiegać od liczby pyłków brzozy, objawy alergiczne mogą być lepiej korelowane z ekspozycją na alergen niż z liczbą pyłków. W połączeniu z danymi klinicznymi, przedstawiona metoda daje możliwość sprawdzenia w przyszłych eksperymentach, czy reakcje alergiczne na antygeny pyłku brzozy są związane z zawartością alergenu Bet v 1 w cząstkach PM10 >0,5 μm.

Adsorpcję alergenu Bet v 1 na cząsteczkach PM10&gt;0.5 określono ilościowo za pomocą pośredniego barwienia przeciwciałami i następującej analizy na cytometrze przepływowym. Jako matrycę posłużyła próbka PM10 pobrana w sezonie wysokiego pylenia. Zgodnie z opisem w kroku 3.1, kontrola negatywna składała się z cząsteczek PM10 inkubowanych wyłącznie z przeciwciałem wtórnym znakowanym APC (Rycina 3A). Cząsteczki PM10 zabarwione przeciwciałem anty-Bet v 1 oraz przeciwciałem wtórnym wykazały obecność cząsteczek obciążonych alergenem (Rycina 3B). Jak opisano w kroku 4.3, zastosowano dwa sposoby ilościowego oznaczenia ładunku alergenu: z jednej strony przeanalizowano medianę intensywności fluorescencji APC wszystkich cząsteczek, która wyniosła 137 dla kontroli negatywnej i 904 dla próbki specyficznej. Z drugiej strony określono procent cząsteczek z przyłączonym przeciwciałem anty-Bet v 1: wokół cząsteczek dodatnich dla APC w kontroli negatywnej ustawiono bramkę, którą następnie skopiowano i wklejono do próbki specyficznej. W kontroli negatywnej 3% cząsteczek PM10&gt;0.5 uznano za dodatnie dla APC. Procent ten fałszywie dodatnich cząsteczek odjęto od procenta cząsteczek dodatnich w próbce specyficznej, co dało wynik 77,5% cząsteczek PM10&gt;0.5 dodatnich dla APC w próbce specyficznej. Aby udowodnić, że zaobserwowane wiązanie przeciwciała anty-Bet v 1 było specyficzne, przed barwieniem zablokowano zdolność wiązania odpowiednim antygenem. Doprowadziło to do zmniejszenia wiązania przeciwciała anty-Bet v 1 o 69%, jeśli mierzono to intensywnością fluorescencji APC, i o 84%, jeśli mierzono to procentem cząsteczek PM10&gt;0.5 dodatnich dla Bet v 1 (Rycina 3C).
<img alt="Schemat analizy cytometrii przepływowej; wykresy rozrzutu APC vs FSC-A; badania oddziaływań antygen-przeciwciało." src="/files/ftp_upload/54721/54721fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Alergen Bet v 1 związany z cząsteczkami można zwizualizować za pomocą cytometrii przepływowej. Intensywność fluorescencji APC próbki PM10 z sezonu wysokiego pylenia barwionej tylko przeciwciałem wtórnym znakowanym APC (A), barwionej przeciwciałem pierwszorzędowym anty-Bet v 1, a następnie przeciwciałem wtórnym znakowanym APC (B) oraz po zablokowaniu przeciwciała pierwszorzędowego rekombinowanym antygenem Bet v 1 (C). Bramkę PAPC+ ustawiono wokół cząsteczek uznanych za APC-dodatnie (wyświetlone na czerwono), a podano odpowiednie wartości procentowe. Rysunek został lekko zmodyfikowany względem źródła11. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54721/54721fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Aby sprawdzić, czy metoda ta może zostać zastosowana do wykrycia różnic w ilości zaadsorbowanego Bet v 1 w próbkach PM10&gt;0,5 pobranych w sezonie wysokiego i niskiego stężenia pyłków, przeanalizowano 13 próbek PM10 z sezonu wysokiego oraz 6 próbek PM10 z sezonu niskiego. Rysunek 4 przedstawia istotne różnice w intensywności fluorescencji APC oraz w udziale cząstek PM10&gt;0,5 pozytywnych pod kątem Bet v 1 w próbkach PM10 z sezonu wysokiego stężenia pyłków w porównaniu do próbek PM10 z sezonu niskiego. Obie metody ilościowe wykazały w tym przypadku podobne wyniki.
<img alt="Intensywność fluorescencji APC i procent cząstek dodatnich pod kątem Bet v 1; wykresy pudełkowe porównujące sezony." src="/files/ftp_upload/54721/54721fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Próbki PM10 z sezonu niskiego i wysokiego zapylenia różnią się ilością zaabsorbowanego Bet v 1. PM10 z sezonu niskiego zapylenia pobrano jesienią/zimą 2013 (n=6), a PM10 z sezonu wysokiego zapylenia w maju 2012 i 2013 (n=13). (A) Intensywność fluorescencji APC cząstek PM10&gt;0.5 z sezonu wysokiego zapylenia była istotnie wyższa niż z sezonu niskiego zapylenia (mediana/min/max sezon wysoki: 796/313/1097; mediana/min/max sezon niski: 197/85/277). (B) PM10 z sezonu wysokiego zapylenia zawierało istotnie więcej cząstek PM10&gt;0.5 dodatnich pod kątem Bet v 1 niż PM10 z sezonu niskiego zapylenia (mediana/min/max sezon wysoki: 45.2/18.5/74.5; mediana/min/max sezon niski: 11.8/4.4/19.8). Wykresy pudełkowe przedstawiają odpowiednio wartości mediany (linia wewnętrzna pudełka), percentyle 25. i 75. (dolna i górna granica pudełka) oraz wartości minimalne i maksymalne (wąsy). ***p&lt;0.001 względem sezonu niskiego zapylenia, test U Manna-Whitneya. Rysunek został lekko zmodyfikowany względem źródła11. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54721/54721fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Tutaj prezentujemy protokół do ilościowego oznaczania cząstek obciążonych alergenami za pomocą cytometrii przepływowej. Cząstki pyłu zawieszonego w otoczeniu mogą pełnić rolę nośników zaadsorbowanych alergenów. Pokazujemy tutaj, że cytometria przepływowa, metoda szeroko stosowana do charakteryzowania zawieszonych ciał stałych o średnicy >0,5 μm, może być stosowana do pomiaru tych cząstek obciążonych alergenami.

Analiza cytometryczna przepływowa alergenu związanego z cząstkami bet v 1 w PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Ogólnym celem tej metody jest ilościowe oznaczenie cząstek pyłu zawieszonego w powietrzu obciążonych alergenami przy użyciu cytometrii przepływowej. Metoda ta może pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące ładunku alergenów w cząstkach PM10. Cząstki te mogą pełnić funkcję nośników zaabsorbowanych alergenów, potencjalnie transportując je do dolnych dróg oddechowych, a główną zaletą tej techniki jest fakt, że stanowi ona szybki sposób wizualizacji i ilościowego oznaczenia cząstek PM10 obciążonych alergenami.Opracowaliśmy tę metodę dla antygenu Bet v 1, jednak można ją zastosować również w przypadku innych antygenów. Procedurę zaprezentuje Sabine Bach, technik z naszego laboratorium. Na początek należy użyć próbnika niskoprzepływowego do pobrania z powietrza otoczenia pyłu zawieszonego o średnicy 10 µm lub mniejszej na filtry z politetrafluoroetylenu.Uruchom kolektor na okres od 1 do 10 dni, w zależności od ilości pyłów w powietrzu i pożądanej rozdzielczości czasowej. Po zakończeniu pobierania wyjmij filtr z próbownika i zamroź go w temperaturze -20 °C do czasu przeprowadzenia analizy.Gdy będą Państwo gotowi do kontynuowania analizy próbki, należy wyjąć filtr z politetrafluoroetylenu z zamrażarki i pozostawić go do rozmrożenia na około pięć minut. Następnie filtr należy umieścić w czystej polistyrenowej szalce Petriego i zalać odpowiednią ilością PBS, aby uzyskać stężenie 8×10⁶ cząsteczek na ml.Przytrzymać filtr pęsetą i szczotkować go za pomocą szczoteczki elektrycznej z końcówką dla zębów wrażliwych przez jedną minutę. Następnie przenieść zawiesinę cząstek w PBS do czystej probówki reakcyjnej. Rozcieńczyć 50 µL zawiesiny PM10 w 10 mL izotonicznego buforu pomiarowego.Użyj licznika cząstek, aby zmierzyć stężenie zebranych cząstek PM10. Oblicz średnie stężenie cząstek na podstawie trzech oddzielnych pomiarów. Jeśli stężenie pyłu okaże się zbyt niskie, a łączenie próbek jest dopuszczalne, wykorzystaj zawiesinę cząstek w PBS z jednej próbki do zebrania cząstek z innego filtra.W pierwszej kolejności należy określić liczbę wymaganych probówek reakcyjnych. Dla każdej zawiesiny PM10 przeznaczonej do analizy potrzebne są trzy rodzaje probówek: jedna z natywną próbką kontrolną, jedna z ujemną próbką kontrolną oraz jedna z próbką barwioną specyficznie.Następnie należy obliczyć wymaganą objętość zawiesiny PM10. Każda probówka reakcyjna wymaga 50 µL zawiesiny. Następnie, poprzez dodanie odpowiedniej ilości PBS, należy dostosować zmierzone w próbce stężenie cząstek do stężenia końcowego wynoszącego 8 × 10⁶ cząstek/mL.Następnie należy zablokować niespecyficzne wiązanie, uzupełniając zawiesinę PM10 0,02% BSA, rozcieńczając ją z roztworu stokowego 1% BSA przygotowanego w PBS. Zawiesinę PM10 BSA krótko wymieszać w wortexie i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Dla każdej próbki analizowanej metodą cytometrii przepływowej przenieść 50 µL zawiesiny do czystej probówki reakcyjnej.Do probówek reakcyjnych przeznaczonych do barwienia swoistego dodać monoklonalne przeciwciało mysie przeciwko Bet v 1 do stężenia końcowego 0,02 µg/µL. Próbówki krótko wymieszać w wirówce typu vortex, a następnie inkubować wszystkie próbki przez 60 minut w temperaturze pokojowej. Następnie wszystkie próbki przemyć, dodając do każdej probówki reakcyjnej 500 µL buforu PBS z dodatkiem 0,02% BSA i krótko mieszając w wirówce typu vortex.Następnie odwiruj próbki i ostrożnie odlej nadsącz za pomocą pompy próżniowej. Oblicz całkowitą potrzebną ilość przeciwciał wtórnych anty-mysich IgG1 znakowanych APC i rozcieńcz je odpowiednią objętością PBS z dodatkiem 0,02% BSA. Do wszystkich probówek reakcyjnych, z wyjątkiem kontroli natywnej, dodaj 50 µL rozcieńczonych przeciwciał wtórnych.Do kontroli natywnej dodać 50 µL PBS uzupełnionego o 0,02% BSA. Wszystkie próbki wymieszać w wstrząsarku vortex przez kilka sekund, a następnie inkubować przez 30 minut w ciemności. Po inkubacji wszystkie próbki przemyć dwukrotnie, zgodnie z wcześniejszym opisem.Po ostatnim przemyciu do każdej probówki z reakcją należy dodać 50 µL czystego PBS. Następnie próbki należy wymieszać w wirówce typu vortex i przeanalizować za pomocą cytometru przepływowego. Korzystając z kontroli natywnej, należy dostosować parametry cytometru w celu optymalizacji analizy danych.Najpierw ustaw próg rozpraszania w przód (forward scatter) na najniższą wartość 200 i rozpocznij analizę. Następnie użyj kontrolera napięcia rozpraszania, aby dostosować rozpraszanie w przód, a następnie rozpraszanie boczne (sideward scatter) w taki sposób, aby wszystkie cząstki PM10 zostały wykryte, a populacja cząstek znalazła się mniej więcej w środku osi rozpraszania w przód oraz w dolnej połowie osi rozpraszania bocznego. Zrestartuj analizę i zarejestruj dane.Następnie należy użyć kontrolera napięcia fluorescencji, aby dostosować napięcie dla fluorescencji przeciwciała wtórnego oraz inne napięcie fluorescencji, np. dla FITC. Po zakończeniu tej operacji należy zrestartować analizę i zarejestrować dane. Należy upewnić się, że wszystkie cząstki są widoczne w dolnej połowie obu osi fluorescencji.Kolejno analizuj każdą próbkę i zapisuj dane dotyczące rozproszenia przedniego, rozproszenia bocznego, fluorescencji przeciwciał wtórnych oraz dane FITC dla co najmniej 10 000 cząsteczek na próbkę. Jednym ze sposobów na ilościowe określenie zawartości zaabsorbowanego alergenu jest analiza intensywności fluorescencji APC wszystkich cząsteczek. W tym celu zmień statystyki, klikając przyciski mediany FITC oraz mediany APC.Następnie należy porównać odpowiednie wartości oraz kontrolę negatywną z wynikami uzyskanymi dla próbki specyficznie barwionej. Innym sposobem ilościowego oznaczenia zawartości zaabsorbowanego alergenu jest określenie procentowego udziału cząstek PM10 z wiążącymi się przeciwciałami anty-Bet v 1. Osiąga się to poprzez wstępne ustawienie bramki wokół cząstek uznanych za fałszywie dodatnie.Następnie należy kliknąć na próbkę poddaną specyficznemu barwieniu i, korzystając z tego samego bramkowania, wyodrębnić cząstki APC-dodatnie w tej próbce. W sezonie wysokiego stężenia pyłków znaczna liczba cząstek PM10 wiąże antygen Bet v 1. Rozpoznawanie Bet v 1 jest specyficzne, ponieważ w przypadku zablokowania przeciwciała pierwszorzędowego rekombinowaną wersją antygenu Bet v 1 sygnał ulega znacznemu obniżeniu.Porównanie cząstek PM10 zebranych podczas sezonu wysokiego stężenia pyłków z cząstkami z sezonu niskiego stężenia pyłków wykazało istotną różnicę w odsetku cząstek PM10 wykazujących pozytywny wynik w kierunku Bet v 1. Cząstki zebrane w sezonie wysokiego stężenia pyłków znacznie częściej zawierały antygen Bet v 1. Po opanowaniu techniki, analiza cytometryczna pobranych próbek PM10 może zostać przeprowadzona w ciągu czterech do pięciu godzin, pod warunkiem prawidłowego wykonania procedury.Należy pamiętać, że cytometria przepływowa wykrywa jedynie cząstki większe niż 5 mikrolitrów. Stosując tę procedurę, ważne jest zapamiętanie, że opracowaliśmy tę metodę w celu oznaczenia ładunku alergenu Bet v 1 w cząstkach PM10, co stanowi zasadniczą różnicę w stosunku do metody ELISA, w której analizowany jest antygen rozpuszczony. Jeśli zawartość Bet v 1 w powietrzu otoczenia różni się od liczby pyłków, objawy alergiczne mogą korelować z poziomem alergenu.W połączeniu z danymi klinicznymi metoda ta pozwala zbadać, czy reakcje alergiczne na pyłek brzozy odpowiadają poziomowi alergenu w PM10. Przy zastosowaniu innych odpowiednich przeciwciał metodę tę można rozszerzyć na wykrywanie innych antygenów na cząsteczkach powietrza otoczenia, takich jak LPS, pleśnie lub alergeny roztoczy kurzu domowego.

flow-cytometric-analysis-of-particle-bound-bet-v-1-allergen-in-pm10

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W niniejszym opracowaniu opisujemy protokoły izolacji makrofagów pęcherzykowych myszy, które są rezydującymi w płucach komórkami odporności wrodzonej, oraz badania ich aktywacji w odpowiedzi na kokulturę z nanocząsteczkami polianhydrydowymi.

Pozyskiwanie makrofagów pęcherzykowych myszy oraz ocena aktywacji komórkowej indukowanej przez nanocząsteczki polianhydrydu

Opisujemy strategię monitorowania dojrzewania i migracji komórek dendrytycznych płuc w odpowiedzi na owalbuminę w warunkach wywołanego owalbuminą alergicznego stanu zapalnego dróg oddechowych. Strategię tę można zmodyfikować w celu oceny migracji komórek dendrytycznych płuc w warunkach infekcji.

Analiza dojrzewania i migracji komórek dendrytycznych w płucach podczas alergicznego stanu zapalnego dróg oddechowych

W tym filmie pokazujemy test do oceny aktywacji bazofili w obecności testowego alergenu za pomocą cytometrii przepływowej.

Analiza aktywacji bazofili w obecności testowego alergenu za pomocą cytometrii przepływowej

Ta praca opisuje protokół, który wykorzystuje podejście komponentowe do badania wrażliwości na alergeny pyłków traw w kohorcie pacjentów z południowych Chin z alergicznym nieżytem nosa i/lub astmą.

Podejście diagnostyczne z rozdzielczością komponentową w badaniu alergenów pyłków traw u mieszkańców Chin z południa z alergicznym nieżytem nosa i/lub astmą

Celem tego artykułu jest dostarczenie szczegółowego opisu zalecanych procedur oceny funkcji oddechowych u świadomych myszy za pomocą dwukomorowej pletyzmografii.

Ocena funkcji oddechowych u przytomnych myszy za pomocą dwukomorowej pletyzmografii

Zrozumienie składu biologicznego pyłu zawieszonego w środowisku jest ważne dla badania jego znaczącego wpływu na zdrowie ludzi i rozprzestrzenianie się chorób. W tym przypadku zastosowaliśmy trzy rodzaje metod pobierania próbek bioaerozoli oraz analizę biologiczną drobnoustrojów unoszących się w powietrzu, aby lepiej zbadać społeczności drobnoustrojów unoszących się w powietrzu w różnych warunkach środowiskowych.

Analiza składu i rozmieszczenia bioaerozoli w różnych warunkach środowiskowych

Ten artykuł przedstawia protokół wykrywania specyficznej dla surowicy immunoglobuliny E za pomocą mikroprzepływowego systemu chemiluminescencji opartego na kartridżu oraz ocenę jego przydatności w diagnostyce alergii.

Zastosowanie technologii mikroprzepływowej Biochip do wykrywania immunoglobuliny E (sIgE) swoistej dla alergenu w surowicy

Alergeny środowiskowe, takie jak roztocza kurzu domowego (HDM), często zawierają substancje mikrobiologiczne, które aktywują wrodzoną odpowiedź immunologiczną w celu regulacji alergicznego stanu zapalnego. Przedstawiony protokół przedstawia identyfikację gatunków dsRNA w alergenach HDM oraz charakterystykę ich aktywności immunogennej w modulowaniu eozynofilowego zapalenia płuc.

Identyfikacja i charakterystyka immunogennych gatunków RNA w alergenach HDM, które modulują eozynofilowe zapalenie płuc

Tutaj prezentujemy test uwalniania mediatora, wykorzystujący linię komórkową białaczki bazofilowej szczura transfekowaną ludzkim receptorem IgE, aby symulować degranulację komórek efektorowych zwykle obserwowaną w reakcjach alergicznych typu 1. Metoda ta bada aktywność biologiczną alergenów w sposób wysoce czuły, powtarzalny i dostosowany do potrzeb.

Humanizowany test uwalniania mediatora jako odczyt siły działania alergenów

Szczegółowo opisujemy spójne, wysokiej jakości procedury stosowane w procesach pobierania próbek powietrza i biologicznych w indyjskich obiektach terenowych podczas dużego randomizowanego kontrolowanego badania. Informacje uzyskane w wyniku nadzoru nad zastosowaniami innowacyjnych technologii, dostosowanych do oceny narażenia w regionach wiejskich, umożliwiają lepsze praktyki gromadzenia danych w terenie z bardziej wiarygodnymi wynikami.

Wizualizacja procedur gromadzenia danych terenowych dotyczących oceny narażenia i biomarkerów na potrzeby badania sieci interwencyjnej ds. zanieczyszczenia powietrza w gospodarstwach domowych w Indiach

Ten artykuł opisuje szczegółowy protokół eksperymentalny do pomiaru zawartości węgla w makrofagach dróg oddechowych w celu oceny dawki ekspozycji wewnętrznej na poziomie indywidualnej ekspozycji na cząstki stałe.

Pomiar zawartości węgla w makrofagach dróg oddechowych narażonych na cząstki stałe zawierające węgiel

Poznaj metodę cytometrii przepływowej do ilościowego oznaczania alergenów w cząstkach PM10 z wykorzystaniem przeciwciał przeciwko Bet v 1. Technika ta umożliwia szybką analizę transportu alergenów do dróg oddechowych.

Analiza cytometryczna przepływowa alergenu związanego z cząstkami bet v 1 w PM10

Przeglądaj więcej filmów