Alternatywne podejście do przygotowania próbki z niską liczbą komórek do analizy TEM

Ogólnym celem tej procedury jest przygotowanie próbek o małej liczbie komórek do przeprowadzenia analizy TEM w sposób wydajny i powtarzalny. Metoda ta może pomóc w ujawnieniu wszystkich struktur prawdziwych komórek i lepszych warunkach fizjologicznych w dziedzinie biomedycyny. Główną zaletą tej techniki jest to, że zarówno jakościowe, jak i ilościowe wyniki można uzyskać z niskiej liczby komórek w powtarzalny sposób.

Na początek wykorzystaj fakty, aby posortować 10 000 hematopoetycznych komórek macierzystych lub HSC do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Zawiera 600 mikrolitrów modyfikowanej pożywki dulbecco z izokowami z 10% FBS. Za pomocą wirówki z odchylanymi wiadrami wirować posortowane HSC z prędkością 1 000 razy G przez 10 minut.

Użyj aspiracji gentile, aby usunąć wszystko oprócz 200 mikrolitrów pożywki. Aby utrwalić komórki, dodaj 0,2 ml świeżo przygotowanego roztworu utrwalającego dwa X i inkubuj w temperaturze pokojowej przez godzinę. Następnie dodaj 600 mikrolitrów 0,1-molowego buforu kakodylowego, aby przepłukać komórki.

Ponownie odwiruj komórki, tym razem w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Następnie po odwirowaniu i usunięciu wszystkich oprócz 200 mikrolitrów buforu, dodaj 200 mikrolitrów dwóch miligramów na mililitr błękitu Evansa w buforze kakodylowym i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 20 minut, aby zabarwić komórki. Użyj 600 mikrolitrów 0,1-molowego buforu kakodylowego, aby trzykrotnie przemyć komórki.

Następnie ponownie zawiesić komórki w pozostałych 200 mikrolitrach buforu przed przeniesieniem zawiesiny komórki do probówki o pojemności 0,5 ml. Na tym etapie granulat powinien być widoczny w tubie. Za pomocą wirówki stołowej wiruj komórki z prędkością 1 000 razy G przez 10 minut.

Następnie delikatnie usuń bufor, nie naruszając widocznej teraz maleńkiej osadki komórek, pozostawiając 50 mikrolitrów buforu w probówce. Przygotuj 4% roztwór agarozy, dodając 200 miligramów niskotopliwej agarozy do pięciu mililitrów 0,1-molowego buforu kakodylanu w probówce o pojemności 15 ml. Rozpuść agarozę, przenosząc probówkę do wrzącej wody w szklanej butelce o pojemności 100 ml.

Dodaj 200 mikrolitrów roztworu agarozy do probówki z zawiesiną komórkową. Natychmiast odwirować w temperaturze 1000 razy G i 30 stopni Celsjusza przez 10 minut. Po upewnieniu się, że komórki są osadzone w półstałej agarozie na dnie probówki, natychmiast przenieś probówkę do czterech stopni Celsjusza lub lodu na 20 minut, aby zestalić agarozę.

Za pomocą igły o rozmiarze 27 ostrożnie przenieś zestaloną agarozę zawierającą osad komórkowy na plastikową szalkę Petriego o pojemności 35 ml zawierającą 0,1-molowy bufor kakodylowy. Za pomocą skalpela przyciąć zestaloną agarozę zawierającą osad komórkowy na jeden kawałek o grubości około jednego do dwóch milimetrów. Następnie przenieś go do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.

Dodać 600 mikrolitrów 0,1-molowego buforu kakodylowego i umyć osad komórek agarozy za pomocą pipety, aby dodać i usunąć bufor. Usunąć bufor z osadu komórek agarozy i w okapie oparowym, ubrany w odzież ochronną i rękawice, dodać jeden mililitr 1% roztworu tetratlenku osmu. Inkubować osad komórkowy w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez godzinę.

Po inkubacji umyć próbkę trzykrotnie. Przenieść go do szklanej fiolki scyntylacyjnej o pojemności 20 ml z nakrętką. Następnie odwodnić próbkę za pomocą serii etanolu.

Następnie infiltruj próbkę w rosnących stężeniach żywicy LX 112 w etanolu, a następnie inkubuj w 100% żywicy dwa razy przez 60 minut za każdym razem. Za pomocą kleszczy ostrożnie przenieś próbkę na dno gumowej formy w kształcie końcówki piramidy i dodaj czystą żywicę na próbkę, aby wypełnić formę. Inkubować próbkę w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 72 godziny w celu polimeryzacji żywicy.

Gdy żywica zostanie spolimeryzowana, usuń ją z form, przekręcając gumową formę. W piramidzie spolimeryzowanej żywicy powinno być widoczne małe czarne skupisko komórek. Użyj cyjanoakrylanu, aby przymocować piramidę z żywicy polimeryzowanej do cylindra montażowego w celu przekrojenia.

Po zamontowaniu bloku na ultramikrotomie za pomocą żyletki i noża diamentowego przyciąć blok piramidy, tworząc krótki, szeroki kształt trapezu, w którym górna i dolna część bloku są równoległe do siebie i mają równomiernie ustawione boki. Następnie użyj noża diamentowego, aby przyciąć blok wokół granulki komórkowej i usuń plastikowe odcinki wokół kawałka agarozy z granulki komórki. Za pomocą ultramikrotomu wytnij jeden mikrometr i użyj narzędzia do rzęs i metalowej pętli, aby przenieść skrawki z łodzi wodnej na szklane zjeżdżalnię.

Następnie umieść szkiełka na gorącej płycie w temperaturze 37 stopni Celsjusza do wyschnięcia. Za pomocą strzykawki z filtrem 0,22 mikrometra dodaj kroplę roztworu błękitu teluatynowego do skrawków i inkubuj przez trzy minuty. Następnie wodą destylowaną podnieś szkiełka i pozostaw sekcje do wyschnięcia.

Po wysuszeniu sprawdź skrawki pod mikroskopem świetlnym, aby określić położenie komórek. Następnie użyj noża diamentowego, aby wyciąć ultra cienkie sekcje. Następnie za pomocą narzędzia do rzęs przenieś dwie do trzech sekcji na siatki o oczkach 200 z łodzi wodnej i umieść w szklanej szalce Petriego.

Przełóż naczynie z kratkami na gorącą płytę w temperaturze 30 stopni Celsjusza na 30 minut, aby wysuszyć sekcje. Dodaj krople 1% octanu uranylu i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 minut, aby zabarwić siatki. Następnie użyj wody destylowanej do spłukania od sześciu do ośmiu razy.

Plamić cytrynianem ołowiu Reynoldsa w temperaturze pokojowej przez pięć minut, a następnie spłukać sześć do ośmiu razy. Przenieś szklaną szalkę Petriego zawierającą kratki na płytę grzejną o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby wysuszyć sekcje. Na koniec przeanalizuj skrawki za pomocą mikroskopu elektronowego o napięciu 87 kilowoltów.

Pokazane tutaj w małym powiększeniu są półcienkie toluidynowe zabarwione na niebiesko skrawki bloków zawierających maleńką osadkę komórkową, które potwierdzają skupisko komórek. Ten obraz w większym powiększeniu pokazuje nienaruszoną morfologię komórek. Rysunek ten przedstawia pole widzenia klastra komórkowego z ultracienkich odcinków, które zostały wybarwione octanem uranylu i cytrynianem ołowiu i przeanalizowane za pomocą mikroskopii elektronowej.

Pokazano tutaj pojedynczy HSC, co pokazuje, że morfologia i ultrastruktura komórek były dobrze zachowane. Bardzo szczegółowy mikrograf elektronowy pojedynczego HSC w większym powiększeniu pokazuje wewnątrzkomórkowe ultrastruktury. Ponadto obrazy w dużym powiększeniu uchwyciły dobrze zachowaną strukturę i integralność organelli subkomórkowych, takich jak mitochondria.

Po opanowaniu technikę tę można wykonać w ciągu pięciu do sześciu godzin, a w przypadku zaawansowanego barwienia na niebiesko i zatapiania agarozy, normalne przetwarzanie TEM zajmie od pięciu do sześciu dni, jeśli zostanie wykonane prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu dobrze rozumiesz, jak przygotować próbki z prawdziwej komórki do analizy TEM.