Name: Alternatywne podejście do przygotowania próbki z niską liczbą komórek do analizy TEM (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Poznaj alternatywną metodę przygotowania próbek z niską liczbą komórek do analizy TEM. Protokół umożliwia uzyskanie jakościowych i ilościowych wyników z 10 000 komórek macierzystych krwi w sposób powtarzalny.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Instytutowi Badań Patologicznych za pomoc w badaniach nad analizą mikroskopu elektronowego w Centrum Medycznym Szpitala Dziecięcego w Cincinnati. Prace były wspierane przez NIH (American Society of Hematology Bridge award to-MDF; R01 DK102890 do MDF).

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez instytucjonalny komitet ds. zwierząt w Cincinnati Children's Research Foundation. W tym badaniu hematopoetyczne komórki macierzyste wyizolowano ze szpiku kostnego myszy wsobnych C57Bl/6 w wieku 2-4 miesięcy. Sortowanie komórek za pomocą FACS po barwieniu BM z różnymi producentami powierzchni, w tym Lineage, c-Kit, Sca-1, Flt3 i CD34, zastosowano do oczyszczania HSC w oparciu o strategię bramkowania Lin-Sca-1 + c-Kit + Flt3 - CD34 jako standardowy protokół opisany przed8.
UWAGA: Podczas tej procedury używa się kilku wysoce toksycznych substancji chemicznych. Są one toksyczne w przypadku wdychania i kontaktu ze skórą. Prosimy o noszenie rękawic i odzieży ochronnej. Pracuj w dygestoriach podczas pracy z tymi chemikaliami.
1. Komórki, utrwalanie, barwienie i wstępne osadzanie
<ol>
	<li>Sortowanie 10 000 hematopoetycznych komórek macierzystych (przy użyciu strategii bramkowania Lin-Sca-1+ c-Kit+ Flt3-CD34-; populacji LT-HSC) w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml zawierającej 600 μl zmodyfikowanej pożywki Dulbecco (IMDM) firmy Iscove z 10% płodową surowicą bydlęcą przy użyciu FACS.</li>
	<li>Odwirowywać posortowane HSC w ilości 1 000 x g przez 10 minut w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml za pomocą wirówki z odchylanymi wiadrami. Usunąć pożywkę przez delikatne zasysanie i pozostawić 200 μl pożywki w probówkach na każdym etapie. Na tym etapie osad komórkowy pozostaje niewidoczny w tubie.</li>
	<li>Utrwalić komórki, dodając 0,2 ml 2x roztworu utrwalającego w temperaturze pokojowej (RT) przez 1 godzinę1,9.
	<ol>
		<li>Roztwór utrwalający należy przygotować na świeżo przed użyciem. Przy 1x roztwór składa się z 3% paraformaldehydu i 2,5% aldehydu glutarowego w 0,1 M buforze kakodylowym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odwirować komórki przy 1 000 x g przez 10 minut w temperaturze 30 °C za pomocą wirówki z odchylanymi wiadrami.</li>
	<li>Przemyć komórki 600 μl 0,1 M buforu kakodylowego za pomocą wirowania i pozostawić 200 μl buforu w probówce po odwirowaniu.</li>
	<li>Wybarwić utrwalone komórki, dodając 200 μl roztworu 2 mg/ml błękitu Evansa w buforze kakodylowym i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Komórki będą pokolorowane na niebiesko.</li>
	<li>Przemyć komórki 3 razy 600 μl 0,1 M buforu kakodylowego za pomocą wirowania i za każdym razem pozostawić 200 μl buforu w probówce.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w buforze o objętości 200 μl i przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 0,5 ml. Wirować przy 1 000 x g przez 10 minut za pomocą wirówki stołowej. Delikatnie usunąć bufor, nie naruszając widocznego teraz osadu o drobnych komórkach, i pozostawić 50 μl buforu w probówce.</li>
	<li>Dodać 200 mg niskotopliwej agarozy do 5 ml 0,1 M buforu kakodylowego w probówce o pojemności 15 ml w celu uzyskania 4% roztworu agarozy. Rozpuść agarozę, przenosząc probówkę do wrzącej wody w szklanej butelce o pojemności 100 ml i utrzymuj ją w letnim miejscu do momentu użycia.</li>
	<li>Dodać 200 μl 4% niskotopliwej agarozy rozpuszczonej w 0,1 M buforze kakodylowym do zawiesiny komórek w probówce o pojemności 0,5 ml i natychmiast odwirować przy 1 000 x g przez 10 minut w temperaturze 30 °C za pomocą wirówki stołowej.</li>
	<li>Po upewnieniu się, że komórki granulowane na dnie probówki o pojemności 0,5 ml do półstałej agarozy po odwirowaniu, natychmiast przenieść probówkę do temperatury 4 °C lub lodu na 20 minut w celu zestalenia agarozy. Ten krok jest bardzo krytyczny, ponieważ mała widoczna osadka komórkowa na tym etapie powoduje dobre skupisko komórek pod mikroskopem elektronowym.</li>
	<li>Ostrożnie przenieść zestaloną agarozę zawierającą osad komórkowy z probówki na plastikową szalkę Petriego o średnicy 35 mm zawierającą bufor za pomocą igły3,10 o średnicy 27 G.</li>
	<li>Zestaloną agarozę zawierającą osad komórkowy przyciąć skalpelem na jeden kawałek o grubości około 1 - 2 mm. Przenieść kawałek agarozy zawierający osad komórkowy do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Przemyć 2 - 3 razy przy użyciu 600 μl 0,1 M buforu kakodylowego, dodając i usuwając bufor za pomocą pipety bez wirowania. Użyj tego kawałka agarozy zawierającego osad komórkowy do następnego kroku. Na tym etapie próbka może być przechowywana w temperaturze 4 °C przez noc przed przejściem do następnego etapu.</li>
</ol>
2. Osmyfikacja, Odwodnienie, Osadzanie
<ol>
	<li>Usunąć bufor kakodylowy z 1,5 ml probówki z osadem komórkowym zawierającym agarozę za pomocą pipety. Dodać 1,0 ml 1% roztworu tetratlenku osmu (OsO4) do dygestorium i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przemyć trzykrotnie 600 μl 0,1 M buforu kakodylowego i przenieść próbkę do szklanej fiolki scyntylacyjnej o pojemności 20 ml z nakrętką.</li>
	<li>Próbkę należy przetworzyć w celu odwodnienia, infiltracji i zatopienia w żywicy (np. LX-112) z seryjną wymianą następujących roztworów na płytce 6-dołkowej. Przesuń kawałek agarozy z granulkami komórkowymi za pomocą kleszczy.
	<ol>
		<li>Zanurzyć próbkę w 25% etanolu w temperaturze pokojowej na 15 minut.</li>
		<li>Zanurzyć próbkę w 50% etanolu w temperaturze pokojowej na 15 minut.</li>
		<li>Zanurzyć próbkę w 75% etanolu w temperaturze pokojowej na 15 minut.</li>
		<li>Zanurzyć próbkę w 95% etanolu w temperaturze pokojowej na 15 minut.</li>
		<li>Zanurzyć próbkę w 100% etanolu w temperaturze pokojowej na 15 minut, dwukrotnie.</li>
		<li>Zanurzyć próbkę w etanolu: żywica (3:1) w temperaturze pokojowej na 30 minut.</li>
		<li>Zanurzyć próbkę w etanolu: żywica (1:1) w temperaturze pokojowej na 30 minut.</li>
		<li>Zanurzyć próbkę w etanolu: żywica (1:3) w temperaturze pokojowej na 30 minut.</li>
		<li>Zanurzyć próbkę w czystej żywicy w temperaturze pokojowej na 60 minut, dwukrotnie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ostrożnie przenieś próbkę na dno gumowej formy w kształcie końcówki piramidy za pomocą kleszczy i dodaj więcej czystej żywicy na wierzchu próbki, aby wypełnić formę. Inkubować próbkę w temperaturze 60 °C przez 72 godziny w celu polimeryzacji żywicy.</li>
	<li>Usuń piramidę z żywicy spolimeryzowanej z form, przekręcając gumową formę. Małe czarne skupisko komórek powinno być widoczne w piramidzie spolimeryzowanej żywicy, jak opisano wcześniej7. Przymocuj piramidę z żywicy polimeryzowanej do cylindra montażowego za pomocą cyjanoakrylanu.</li>
</ol>
3. Przekrojowa i transmisyjna mikroskopia elektronowa
<ol>
	<li>Przytnij blok piramidy za pomocą żyletki i noża diamentowego po zamontowaniu bloku na ultramikrotomie. Wykonaj krótki, szeroki kształt trapezu z górną i dolną częścią bloku równoległymi do siebie i równomiernie ustawionymi bokami. Taki kształt piramidy pomaga w szeregowym cięciu.</li>
	<li>Ponadto przytnij blok wokół granulki komórki za pomocą noża diamentowego i usuń plastikowe sekcje wokół kawałka agarozy z granulki komórki.</li>
	<li>Wytnij odcinki 1 μm za pomocą ultramikrotomu. Przenieś sekcje 1 μm z łodzi wodnej na szklane szkiełko za pomocą narzędzia do rzęs i metalowego narzędzia do pętelki, jak wcześniej opisano7. Przenieś sekcje na szkiełkach i przenieś szkiełka na płytę grzejną (37 °C) w celu wysuszenia.</li>
	<li>Dodać kroplę roztworu błękitu toluidynowego do skrawków za pomocą strzykawki wyposażonej w filtr 0,22 μm i inkubować przez 3 minuty. Opłukać szkiełka wodą destylowaną i pozostawić skrawki do wyschnięcia. Sprawdź za pomocą mikroskopu świetlnego, aby określić położenie komórek.</li>
	<li>Ciąć ultracienkie odcinki (70 - 100 nm) za pomocą noża diamentowego. Przenieś 2-3 sekcje na siatkach o oczkach 200 z łodzi wodnej na szklaną szalkę Petriego za pomocą narzędzia do rzęs.</li>
	<li>Przenieść szklaną szalkę Petriego zawierającą kratki z sekcjami na płytę grzejną w temperaturze 30 °C w celu wysuszenia sekcji przez 30 minut.</li>
	<li>Zabarwić siatki kroplami 1% octanu uranylu w temperaturze pokojowej przez 10 minut, a następnie spłukać w wodzie destylowanej 6 - 8 razy. Plamić cytrynianem ołowiu Reynoldsa w temperaturze pokojowej przez 5 minut i spłukać w wodzie destylowanej 6 - 8 razy. Przenieść szklaną płytkę Petriego zawierającą ruszty na płytę grzejną w temperaturze 37 °C w celu wysuszenia sekcji.</li>
	<li>Przeanalizuj skrawki za pomocą mikroskopu elektronowego przy napięciu 80 kV7.</li>
</ol>

<ol><li>Bozzola, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conventional+specimen+preparation+techniques+for+transmission+electron+microscopy+of+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Conventional specimen preparation techniques for transmission electron microscopy of cultured cells.</a> Methods Mol Biol. 369, 1-18 (2007).</li>
<li>Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+techniques+in+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Novel techniques in electron microscopy.</a> Curr Opin Neurobiol. 14, 591-598 (2004).</li>
<li>Anderson, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+of+preparing+peripheral+leucocytes+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ulstract+Res%22%5BJournal%5D)">A method of preparing peripheral leucocytes for electron microscopy.</a> J Ulstract Res. 13, 263-268 (1965).</li>
<li>Taupin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+scarce+biological+samples+for+light+and+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Histochem%22%5BJournal%5D)">Processing scarce biological samples for light and transmission electron microscopy.</a> Eur J Histochem. 52, 135-139 (2008).</li>
<li>Mather, J., Stanbridge, C. M., Butler, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+the+removal+of+selected+cells+from+cytological+smear+preparations+for+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Method for the removal of selected cells from cytological smear preparations for transmission electron microscopy.</a> J Clin Pathol. 34, 1355-1357 (1981).</li>
<li>Oorschot, V., de Wit, H., Annaert, W. G., Klumperman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+flat-embedding+method+to+prepare+ultrathin+cryosections+from+cultured+cells+in+their+in+situ+orientation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">A novel flat-embedding method to prepare ultrathin cryosections from cultured cells in their in situ orientation.</a> J Histochem Cytochem. 50, 1067-1080 (2002).</li>
<li>Kumar, S., Ciraolo, G., Hinge, A., Filippi, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+and+reproducible+process+for+transmission+electron+microscopy+%28TEM%29+of+rare+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">An efficient and reproducible process for transmission electron microscopy (TEM) of rare cell populations.</a> J Immunol Methods. 404, 87-90 (2014).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+hematopoietic+stem+cells+with+SLAM+and+LSK+markers+for+the+detection+of+hematopoietic+stem+cell+function+in+normal+and+Trp53+null+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice.</a> Exp Hematol. 36, 1236-1243 (2008).</li>
<li>Hopwood, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reactions+between+formaldehyde%2C+glutaraldehyde+and+osmium+tetroxide%2C+and+their+fixation+effects+o+bovine+serum+albumin+and+on+tissue+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">The reactions between formaldehyde, glutaraldehyde and osmium tetroxide, and their fixation effects o bovine serum albumin and on tissue blocks.</a> Histochemistry. 24, 50-64 (1970).</li>
<li>Saini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+synthase+localization+in+the+rat+neutrophils%3A+immunocytochemical%2C+molecular%2C+and+biochemical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide synthase localization in the rat neutrophils: immunocytochemical, molecular, and biochemical studies.</a> J Leukoc Biol. 79, 519-528 (2006).</li>
<li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+small+GTPase+Rap1b+negatively+regulates+neutrophil+chemotaxis+and+transcellular+diapedesis+by+inhibiting+Akt+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The small GTPase Rap1b negatively regulates neutrophil chemotaxis and transcellular diapedesis by inhibiting Akt activation.</a> J Exp Med. 211, 1741-1758 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Metoda ta umożliwia analizę TEM przy niskiej liczbie komórek, dzięki zastosowaniu barwienia na niebiesko Evansa i zatapiania agarozy w celu zlokalizowania maleńkiej osadki komórkowej podczas procesów odwadniania, zatapiania żywicy i cięcia. Co ważne, utrzymuje razem klastry komórkowe i zachowuje ultrastrukturę komórki, co jest pożądane w przypadku badania wielu komórek w celu ilościowego określenia danych.
W badaniach TEM często wymagany jest osad komórkowy zawierający miliony komórek, który j...

Szczegóły ultrastrukturalne i sub-organelle komórek zostały głównie ujawnione przez badania z użyciem transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) z tkanek lub granulek komórkowych1,2. Stałe fragmenty tkanek można łatwo wykorzystać do badań mikroskopią elektronową. Jednak analizy TEM1,3 na komórkach w zawiesinie pozostają wyzwaniem i wymagają dużej liczby komórek, tj. milionów komórek. Z tego powodu analizy ultrastrukturalne rzadkich populacji komórek w zawiesinie, np. hematopoetycznych komórek macierzystych (HSC), nie są łatwe do oceny. Wielokrotne próby analizy TEM z rzadkich próbek przy użyciu metod cytospinowych lub jednowarstwowych nie pozwalają uzyskać istotnych danych ilościowych z ograniczonej liczby komórek. W związku z tym wymóg wysokiej liczby komórek ogranicza użycie tego potężnego narzędzia do zrozumienia subkomórkowych szczegółów ultrastrukturalnych rzadkich populacji komórek.
Kluczowym ograniczeniem dla badań TEM z ograniczoną liczbą komórek w zawiesinie jest lokalizacja komórek do przetwarzania, a zatem badania TEM z ograniczonych komórek o szczególnie małych rozmiarach pozostają wyzwaniem. Aby przeciwdziałać temu ograniczeniu, przyjęto kilka alternatywnych podejść: polimeryzacja zawiesiny komórkowej za pośrednictwem BSA/bisakryloamidu (BSA-BA), barwienie komórek barwnikiem w celu uwidocznienia ich na cienkim podłożu, w tym szkiełkach nakrywkowych, oraz analizy TEM z preparatów cytospinowych4-6. Sukces ten został jednak osiągnięty w bardzo ograniczonym stopniu, ponieważ w skrawkach po ultrasekcji znaleziono bardzo niewiele komórek. Kluczowe wyzwanie związane z identyfikacją rzadkich komórek utrzymuje się, ponieważ monowarstwa komórek pozostaje w większości niewidoczna w zestalonym żelu do podziału. Ponadto przygotowanie komórek cytospinowych może zmienić ich organizację komórkową ze względu na rozprzestrzenianie się komórek i kruchość struktury komórkowej. W związku z tym te nieodłączne wady uzasadniają nowatorskie podejście do przeprowadzania badań TEM na rzadkich populacjach komórek z większą spójnością. Aby przezwyciężyć ten problem, opisaliśmy nowatorską i alternatywną metodę przygotowania próbek do badań TEM z rzadkich populacji komórek7.
Tutaj raportujemy efektywny protokół przygotowania próbki do wykonania TEM z rzadkich próbek biologicznych z spójnymi wynikami jakościowymi i ilościowymi. Barwienie Evansa na niebiesko przeprowadzono po utrwaleniu w celu zlokalizowania maleńkiego osadu komórkowego z komórek o niskiej liczbie, tj. 10 000 hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych szpiku kostnego, które w przeciwnym razie pozostałyby niewidoczne, a osad osadzano w agarozie przed procesami odwadniania i zatapiania żywicy. Metoda ta grupuje komórki razem i umożliwia efektywną analizę ultrastruktury i organizacji subkomórkowej hematopoetycznych komórek macierzystych (identyfikowanych jako Lin-Sca-1+ c-Kit+ Flt3- CD34-; HSC), rzadka populacja komórek 0,2 - 0,5% w szpiku kostnym. Ten eksperymentalny protokół może być przydatny do przeprowadzania badań ultrastrukturalnych i uzyskiwania wyników ilościowych na wielu rzadkich, ale bardzo ważnych populacjach.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldehyd 20% Wodny roztwór Mikroskopia</td><td>elektronowa Sciences</td><td>15713</td><td>UWAGA Działa toksycznie przez drogi oddechowe, kontakt ze skórą. Nosić rękawice, używać dygestorium.</td></tr><tr><td>Aldehyd gluterowy 70% Wodny roztwór Mikroskopia</td><td>elektronowa Sciences</td><td>16350</td><td>UWAGA Działa toksycznie przez drogi oddechowe, kontakt ze skórą. Nosić rękawice, używać dygestorium.</td></tr><tr><td>Bufor kakodyladanu&nbsp;</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>12300</td><td>Przygotować 0,1 M buforu kakodylodanu (pH 7,4) w wodzie destylowanej, przechowywać w temperaturze 4 stopni C. <silny>UWAGA</silny> Działa drażniąco przez drogi oddechowe lub kontakt ze skórą, nosić rękawice i pracować w dygestorium.</td></tr><tr><td>Niebieski Evans&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>E-2129</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza niskotopliwa&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-5030</td><td></td></tr><tr><td>Tetratlenek osmu</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>19130</td><td>1 g w 50 ml 0,1 M buforu kakodylodanu do wytworzenia 2% zapasu OsO4, <silny>UWAGA</silny> Bardzo toksyczny przez drogi oddechowe lub kontakt ze skórą, silny utleniacz, nosić odzież ochronną, ochronę oczu, używać okapu wyciągowego.</td></tr><tr><td>Zestawy do zatapiania LX-112 (LADD&reg;)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DDSA (bezwodnik dodecenylusztynowy)</td><td>LADD</td><td>21340</td><td>Wymieszaj 16% DDSA; 30% NMA; 54% LX-112 razem, a następnie dodaj 1,4% DMP-30</td></tr><tr><td>NMA (bezwodnik nadic metylu)</td><td>LADD</td><td>21350</td><td></td></tr><tr><td>Żywice epoksydowe Epon 812 (LX-112)</td><td>LADD</td><td>21310</td><td>UWAGA Działa toksycznie przez wdychanie, kontakt ze skórą. Nosić rękawice, odzież ochronną, używać okapu wyciągowego.</td></tr><tr><td>DMP-30 (2,4,6-Tri(dimetyloaminometylo)fenol)</td><td>LADD</td><td>21370</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian ołowiu Reynoldsa (EM Stain II)</td><td>Leica</td><td></td><td>UWAGA Działa toksycznie przez drogi oddechowe, unikać kontaktu ze skórą lub oczami.</td></tr><tr><td>Octan uranylu (EM Stain I)</td><td>Leica</td><td>8072820</td><td>UWAGA Działa toksycznie przez drogi oddechowe, unikać kontaktu ze skórą lub oczami.</td></tr><tr><td>Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)</td><td>ATCC</td><td>30-2005</td><td>skład: NaCl, NaHCO3, HEPES, glukoza, Ca, Mg, pirogronian sodu etc. Szczegółowe informacje https://www.atcc.org/~/media/Attachments/E/9/7/E/4893.ashx</td></tr><tr><td>Forma do końcówki piramidy&nbsp;</td><td>Ted Pella</td><td>10585</td><td></td></tr><tr><td>cylindry montażowe</td><td>Ted Pella</td><td>10580</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-mikrotom&nbsp;</td><td>(Leica EM UC7)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siatki siatkowe 200 (nikil)</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>G-200 Ni</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop elektronowy</td><td>Hitachi model H-7650&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie silnika przechwytywania obrazu</td><td>AMT-600&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastikowe szalki Petriego 35 mm</td><td>Fisher scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quick Bond Super klej cyjanoakrylany&nbsp;</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>72588</td><td></td></tr><tr><td>Żyletki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szklane fiolki scyntylacyjne&nbsp;</td><td>Fisher naukowy&nbsp;</td><td>03-337-14</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka szklane&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Narzędzie</td><td></td><td></td><td></td>do rzęs</tr><tr><td>Narzędzie do metalowej pętli&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

alternatywne podejście do przygotowania próbki z niską liczbą komórek do analizy tem

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM) dostarcza szczegółów organizacji i ultrastruktury komórek. Jednak analiza TEM rzadkich populacji komórek, zwłaszcza komórek w zawiesinie, takich jak hematopoetyczne komórki macierzyste (HSC), pozostaje ograniczona ze względu na wymóg dużej liczby komórek podczas przygotowywania próbki. Istnieje kilka podejść cytospinowych lub jednowarstwowych do analizy TEM z rzadkich próbek, ale podejścia te nie pozwalają uzyskać istotnych danych ilościowych z ograniczonej liczby komórek. W tym miejscu opisano alternatywne i nowatorskie podejście do przygotowania próbek w badaniach TEM dla rzadkich populacji komórek, które umożliwia analizę ilościową.
Stosunkowo niska liczba komórek, tj. 10 000 HSC, została z powodzeniem wykorzystana do analizy TEM w porównaniu do milionów komórek zwykle używanych do badań TEM. W szczególności barwienie Evansa na niebiesko przeprowadzono po utrwaleniu paraformaldehydu i aldehydu glutarowego (PFA-GA) w celu uwidocznienia maleńkiej osadówki komórkowej, co ułatwiło osadzenie w agarozie. W ultracienkich skrawkach obserwowano skupiska licznych komórek. Komórki miały dobrze zachowaną morfologię, widoczne były ultrastrukturalne szczegóły kompleksu Golgiego i kilku mitochondriów. Ten wydajny, łatwy i powtarzalny protokół umożliwia przygotowanie próbki z małej liczby komórek i może być stosowany do jakościowej i ilościowej analizy TEM na rzadkich populacjach komórek z ograniczonych próbek biologicznych.

Opisano wydajny i spójny protokół przygotowania próbek do analizy TEM z niewielkiej liczby komórek. Barwienie po utrwaleniu błękitem Evansa oraz przeniesienie komórek do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 0.5 ml pomogły w wizualizacji niewielkiego osadu komórkowego7. Osmyzacja przy użyciu tetraoksydu osmu w agarozie umożliwiła łatwe wykrycie ciemnego osadu komórkowego podczas dehydratacji i zatapiania.
Przetłocz...

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania próbek o niskiej liczbie komórek do analizy za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM).

Alternatywne podejście do przygotowania próbki z niską liczbą komórek do analizy TEM

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

Ogólnym celem tej procedury jest przygotowanie próbek o niskiej liczbie komórek w celu przeprowadzenia analizy TEM w sposób wydajny i powtarzalny. Metoda ta może pomóc w ujawnieniu wszystkich struktur rzeczywistych komórek oraz lepszych uwarunkowań fizjologicznych w dziedzinie biomedycznej. Główną zaletą tej techniki jest możliwość uzyskania wyników zarówno jakościowych, jak i ilościowych z niewielkiej liczby komórek w sposób powtarzalny.W celu rozpoczęcia, należy posortować 10 000 hematopoetycznych komórek macierzystych (HSC) do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL zawierającej 600 µL zmodyfikowanej pożywki Dulbecco z dodatkiem 10% FBS. Następnie, używając wirówki z rotorami z koszyczkami, należy odwirować posortowane komórki HSC przy 1 000 ×g przez 10 minut.Użyć delikatnego odsysania, aby usunąć całe medium z wyjątkiem 200 µL. W celu utrwalenia komórek należy dodać 0,2 mL świeżo przygotowanego dwukrotnego (2X) roztworu utrwalającego i inkubować w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Następnie dodać 600 µL 0,1 M buforu kakodylowego, aby przemyć komórki.Ponownie odwiruj komórki, tym razem w temperaturze 30 °C. Następnie po wirowaniu, usuwając cały bufor z wyjątkiem 200 µL, dodaj 200 µL błękitu Evansa o stężeniu 2 mg/mL w buforze kakodylanowym i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 20 minut, aby zbarwić komórki. Do trzykrotnego przemycia komórek użyj 600 µL 0,1 M buforu kakodylanowego.Następnie resuspenduj komórki w pozostałych 200 µL buforu przed przeniesieniem zawiesiny komórkowej do probówki o pojemności 0,5 mL. Na tym etapie w probówce powinien być widoczny osad. W wirówce stołowej odwiruj komórki przy 1 000 ×g przez 10 minut.Następnie ostrożnie usuń bufor, nie naruszając widocznego teraz małego osadu komórkowego, pozostawiając w probówce 50 µL buforu. Przygotuj 4% roztwór agarozy, dodając 200 mg agarozy o niskiej temperaturze topnienia do 5 mL 0,1 M buforu kakodylanowego w probówce 15 mL. Rozpuść agarozę, przenosząc probówkę do wrzącej wody w szklanej butelce o pojemności 100 mL.Dodaj 200 µL roztworu agarozy do probówki z zawiesiną komórek. Natychmiast wiruj przy 1 000 ×g w temperaturze 30 °C przez 10 minut. Po potwierdzeniu, że komórki osadziły się w półstałej agarozie na dnie probówki, niezwłocznie przenieś probówkę do temperatury 4 °C lub na lód na 20 minut, aby agaroza stężała.Używając igły o rozmiarze 27 G, ostrożnie przenieś zestaloną agarozę zawierającą osad komórkowy do plastikowej szalki Petriego o pojemności 35 mL zawierającej 0,1 M bufor kakodylanowy. Za pomocą skalpela wytnij z zestalonej agarozy fragment o wielkości około jednego do dwóch milimetrów, zawierający osad komórkowy. Następnie przenieś go do nowej probówki o pojemności 1,5 mL.Dodaj 600 µL 0,1 M buforu kakodylanowego i przemyj agarozy osad komórkowy, dodając i usuwając bufor za pomocą pipety. Usuń bufor z agarozy osadu komórkowego, a następnie w dygestorium, mając na sobie odzież ochronną i rękawiczki, dodaj 1 mL 1% roztworu osmowego tetroksydu. Inkubuj osad komórkowy w temperaturze 4 °C przez jedną godzinę.Po inkubacji trzykrotnie przemyj próbkę. Przenieś ją do szklanej fiolki scyntylacyjnej o pojemności 20 mL z nakrętką. Następnie odwodnij próbkę, stosując serię stężeń etanolu.Następnie przeprowadź infiltrację próbki w rosnących stężeniach żywicy LX 112 w etanolu, a następnie inkubuj w 100% żywicy dwukrotnie przez 60 minut za każdym razem. Za pomocą pincety ostrożnie przenieś próbkę na dno gumowej formy w kształcie piramidalnej końcówki i dolej czystą żywicę na górę próbki, aby wypełnić formę. Inkubuj próbkę w temperaturze 60°C przez 72 godziny, aby spolimeryzować żywicę.Po spolimeryzowaniu żywicy należy wyjąć ją z form, wykręcając gumową formę. W piramidzie ze spolimeryzowanej żywicy widoczny powinien być mały, czarny skup komórek. Użyj cyjanoakrylanu, aby przymocować piramidę ze spolimeryzowanej żywicy do cylindra montażowego w celu wykonania przekrojów.Po zamocowaniu bloczka w ultramikrotomie należy użyć żyletki i noża diamentowego, aby przyciąć bloczek w kształcie piramidy, nadając mu krótki, szeroki kształt trapezoidalny, w którym góra i dół bloczka są do siebie równoległe, a boki mają równe kąty nachylenia. Następnie za pomocą noża diamentowego należy przyciąć bloczek wokół osadu komórkowego i usunąć sekcje plastiku otaczające fragment agarozy z osadem komórkowym. Za pomocą ultramikrotomu należy wykonać cięcia o grubości 1 µm, a następnie użyć narzędzia z rzęsą i metalowej pętli, aby przenieść skrawki z kąpieli wodnej na szkiełko przedmiotowe.Następnie umieść preparaty na płytce grzejnej w temperaturze 37 °C do wyschnięcia. Za pomocą strzykawki z filtrem 0,22 µm nanieś kroplę roztworu błękitu toluidyny na skrawki i inkubuj przez trzy minuty. Następnie opłucz preparaty wodą destylowaną i pozostaw skrawki do wyschnięcia.Po wysuszeniu sprawdź skrawki pod mikroskopem świetlnym, aby zidentyfikować położenie komórek. Następnie użyj noża diamentowego do wycięcia ultracienkich sekcji. Potem, za pomocą narzędzia do przenoszenia skrawków (tzw. rzęsy), przenieś dwa do trzech sekcji z łódeczki z wodą na siatki o oczkach 200 mesh i umieść je w szklanej płytce Petriego.Przenieś płytkę z siatkami na płytkę grzejną w temperaturze 30°C na 30 minut w celu wysuszenia przekrojów. Dodaj krople 1% octanu uranylu i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 minut, aby zabarwić siatki. Następnie przepłucz je sześć do ośmiu razy wodą destylowaną.Barwić cytrynianem ołowiu według metody Reynoldsa w temperaturze pokojowej przez pięć minut, a następnie wypłukać od sześciu do ośmiu razy. Przenieść szklaną płytkę Petrigo zawierającą siatki na płytkę grzejną w temperaturze 37°C w celu wysuszenia przekrojów. Na koniec przeanalizować przekroje za pomocą mikroskopu elektronowego przy napięciu 87 kV.Przedstawione tutaj przy małym powiększeniu są półcienkie przekroje barwione błękitem toluidyny z bloków zawierających niewielki osad komórkowy, które potwierdzają obecność skupiska komórek. Ten obraz przy większym powiększeniu pokazuje nienaruszoną morfologię komórek. Rycina ta przedstawia widok ogólny skupiska komórek w przekrojach ultracienkich, które zostały zabarwione octanem uranylu i cytrynianem ołowiu, a następnie poddane analizie za pomocą mikroskopii elektronowej.Przedstawiono tutaj pojedynczą komórkę HSC, co dowodzi, że morfologia i ultrastruktura komórek zostały dobrze zachowane. Mikrograf elektronowy pojedynczej komórki HSC przy większym powiększeniu ukazuje w szczegółach ultrastruktury wewnątrzkomórkowe. Ponadto obrazy przy dużym powiększeniu uchwyciły dobrze zachowaną strukturę i integralność organell subcellularnych, takich jak mitochondria.Po opanowaniu ta technika może być wykonana w ciągu pięciu do sześciu godzin, a w przypadku zaawansowanego barwienia niebieskim barwnikiem i zatapiania w agarozie, a następnie standardowej obróbki TEM, proces ten zajmie od pięciu do sześciu dni, jeśli zostanie przeprowadzony prawidłowo. Dzięki temu po obejrzeniu tego filmu będą Państwo mieli dobre wyobrażenie o tym, jak przygotowywać próbki z rzeczywistych preparatów komórkowych do analizy TEM.

an-alternative-approach-for-sample-preparation-with-low-cell-number

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszym artykule opisujemy prostą metodę izolacji pojedynczych komórek z pierwotnych kultur neuronalnych szczura oraz późniejszą analizę transkryptomu z wykorzystaniem amplifikacji aRNA. Metoda ta może zostać zastosowana do każdego typu komórek.

Analiza transkryptomu pojedynczych komórek

Ten protokół ma na celu odzyskanie i przygotowanie rzadkich komórek docelowych z mieszaniny z komórkami tła niebędącymi celem, do molekularnej charakterystyki genetycznej na poziomie pojedynczej komórki. Jakość DNA jest równa jakości pojedynczych komórek niepoddanych działaniu metody i pozwala na zastosowanie pojedynczych komórek (zarówno w oparciu o badania przesiewowe, jak i analizę celowaną).

Wstępne wzbogacanie komórek docelowych i amplifikacja całego genomu w celu dalszej charakterystyki pojedynczej komórki

Przedstawiono instrument i metody do przygotowania objętości próbek o rozmiarach nanolitrów do transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Nie są wymagane żadne etapy papierowego blottingu, co pozwala uniknąć szkodliwych konsekwencji, jakie może to mieć dla białek, znacznie zmniejszając utratę próbki i umożliwiając analizę lizatu pojedynczej komórki do wizualnej proteomiki.

Zminiaturyzowane przygotowanie próbki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Ten protokół opisuje ogólne procesy i kontrole jakości niezbędne do przygotowania zdrowych pojedynczych komórek dorosłych ssaków do wysokoprzepustowych preparatów RNA-Seq opartych na kropelkach. Dostępne są również parametry sekwencjonowania, wyrównanie odczytu i dalsza analiza bioinformatyczna pojedynczych komórek.

Transkryptomika pojedynczych komórek oparta na kropelkowym kodowaniu kreskowym tkanek dorosłych ssaków

Obecny protokół opisuje metodę pojedynczej komórki do iteracyjnych analiz epigenomicznych przy użyciu pojedynczej komórki wielokrotnego użytku. Pojedyncza komórka wielokrotnego użytku umożliwia analizę wielu znaczników epigenetycznych w tej samej pojedynczej komórce i statystyczną walidację wyników.

Pojedyncza komórka wielokrotnego użytku do iteracyjnych analiz epigenomicznych

Wykonalność i skuteczność wysokoprzepustowych metod sekwencyjnych scRNA zwiastuje erę jednokomórkowych w badaniach roślinnych. Przedstawiono tutaj solidną i kompletną procedurę izolowania określonych typów komórek korzenia rzodkiewnika (Arabidopsis thaliana) oraz późniejszej budowy i analizy biblioteki transkryptomu.

Izolacja i analiza transkryptomu typów komórek roślinnych

Ten protokół zapewnia zoptymalizowaną i skomplikowaną procedurę przygotowania próbek organoidów siatkówki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Nadaje się do zastosowań, które obejmują analizę synaps w dojrzałych organoidach siatkówki.

Przygotowanie próbek organoidów siatkówki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Ten protokół opisuje procedurę szybkiej dysocjacji próbek ludzkich i mysich guzów do sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek.

Dysocjacja próbek tkanek nowotworowych ludzi i myszy do sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek

Ten protokół przedstawia praktyczną metodę wykorzystującą Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) jako przykład rozwiązania problemu nierównomiernego rozkładu cząstek poprzez optymalizację przygotowania próbki, stanowiąc punkt odniesienia dla badaczy do efektywnego wyjaśniania struktur makromolekularnych za pomocą kriogenicznej mikroskopii elektronowej (cryo-EM).

Optymalizacja przygotowania próbek do kriogenicznej mikroskopii elektronowej

Przedstawiamy tutaj protokół automatyzacji analizy posttranslacyjnej modyfikacji histonów pojedynczych komórek, wykorzystując strategię znakowania izotopowego dwu-plexowego oraz trawienie ArgC. Ten workflow umożliwia ilościowe, powtarzalne i wysokoczułe profilowanie heterogeniczności chromatyny oraz odpowiedzi epigenetycznych w rozdzielczości pojedynczych komórek.

Automatyczne przygotowanie próbki do multipleksowanej analizy pojedynczokomórkowych modyfikacji histonów po translacji (sc-hPTM2)

Poznaj alternatywną metodę przygotowania próbek z niską liczbą komórek do analizy TEM. Protokół umożliwia uzyskanie jakościowych i ilościowych wyników z 10 000 komórek macierzystych krwi w sposób powtarzalny.

Alternatywne podejście do przygotowania próbki z niską liczbą komórek do analizy TEM

Przeglądaj więcej filmów