Metoda bezpośredniego segmentalnego dostarczania dowątrobowego przy użyciu modelu klamry Hilar wątroby szczura
2 kwietnia 2017
Unikalny model zacisku wnękowego wątroby szczura został opracowany do badania wpływu cząsteczek farmakologicznych na łagodzenie uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego. Model ten obejmuje bezpośrednią kaniulację dopływu wrotnego do niedokrwionego segmentu wątroby przez odgałęzienie żyły wrotnej, co pozwala na bezpośrednie dostarczenie wątrobowe.
Ogólnym celem tego unikalnego modelu klamry wnękowej wątroby szczura jest umożliwienie badania wpływu cząsteczek farmakologicznych będących przedmiotem zainteresowania na łagodzenie uszkodzenia reperfuzyjnego niedokrwiennego. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie transplantacji wątroby dotyczące tego, które cząsteczki mogą być bezpośrednio wprowadzane do wątroby, aby pomóc w pośredniczeniu w uszkodzeniu reperfuzyjnym niedokrwiennym. Główną zaletą tej techniki jest to, że cząsteczka będąca przedmiotem zainteresowania jest bezpośrednio wstrzykiwana do żyły wrotnej, zmniejszając objętość dystrybucji.
Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku przeszczepu wszystkich narządów, ponieważ pozwala ona na testowanie cząsteczek, które mogą być dodawane do perfuzatów narządowych w celu zmniejszenia uszkodzenia reperfuzyjnego niedokrwienia. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie ze względu na niewielki rozmiar gałęzi żyły wrotnej używanej do kaniulacji. Zacznij od potwierdzenia odpowiedniego poziomu sedacji poprzez uszczypnięcie palca u nogi, a następnie umieść szczura na podkładce rozgrzewającej pod mikroskopem preparacyjnym i unieruchamiaj kończyny.
Następnie wykonaj nacięcie skóry brzucha w linii środkowej od łona do mieczyka, a następnie podobne nacięcie w otrzewnej wzdłuż kresy białej. Wejdź do jamy brzusznej, uważając, aby nie uszkodzić pęcherza ani jelita, i uwolnij wątrobę z otrzewnej z przodu w pobliżu wyrostka mieczykowatego. Wykonaj poprzeczne nacięcie przez skórę i otrzewną na dolnej granicy prawego płata wątroby i użyj zakrzywionego zacisku na komary, aby cofnąć wyrostek mieczykowaty.
Użyj zwijaczy żeber, aby otworzyć żebra jak najdalej od linii środkowej i przeciąć więzadła sierpowe, przeponowe i żołądkowe. Następnie użyj zwilżonych sterylnych wacików, aby odwrócić wątrobę do góry i w razie potrzeby przeciąć dodatkowe więzadła, aby uzyskać dostęp do porta. Za pomocą gazy zwilżonej solą fizjologiczną obróć wątrobę instynktownie, a następnie usuń luźną tkankę łączną pokrywającą wnękę wrotną i luźną tkankę łączną pokrywającą długość żyły wrotnej.
Za pomocą kleszczy przepchnij luźną tkankę łączną z tyłu do lewej żyły wrotnej, tętnicy i przewodu żółciowego, aby utworzyć okno i luźno otoczyć naczynia szwem 4-0 Pottsa. Następnie usuń luźną tkankę łączną pokrywającą tylną gałąź do żyły wrotnej w prawej nerce. Następnie za pomocą strzykawki insulinowej pobierz 0,5 mililitra krwi z żyły głównej dolnej i przenieś krew do małej fiolki.
Odwirować próbkę i zebrać surowicę do nowej fiolki w celu natychmiastowego zamrożenia w ciekłym azocie. Wytnij dwa kawałki szwu 7-0. Umieść pierwszą pętlę 7-0 wokół lewej żyły wrotnej tak daleko, jak to możliwe, i użyj zakrzywionego zacisku na komary, aby cofnąć żyłę.
Umieść luźno zawiązaną drugą pętlę 7-0 na tylnej gałęzi do żyły wrotnej w pobliżu jej przecięcia z żyłą wrotną. Teraz naładuj pompę infuzyjną pięciomililitrową strzykawką zawierającą trzy mililitry odczynnika w 0,9% soli fizjologicznej i zalej rurkę. Użyj zacisku mikrochirurgicznego, aby chwycić dystalną żyłę wrotną, aby zmniejszyć krwawienie podczas kaniulacji, a małymi nożyczkami mikrochirurgicznymi wyciąć 0,5-milimetrowy otwór w żyle między szwem podporowym 7-0 a jego przecięciem z żyłą wrotną.
Za pomocą cewnika 27-0 należy kanulegować lewemu układowi żyły wrotnej, wprowadzając cewnik poza rozwidlenie lewej i prawej żyły wrotnej. Wlej jeden mililitr soli fizjologicznej, aby potwierdzić umieszczenie kaniuli i obserwuj, czy lewy boczny i środkowy płat wątroby bledną. Ręcznie oceń, czy cewnik znajduje się poza startem prawej żyły wrotnej, ale nie poza startem żyły wrotnej zasilającej płat środkowy, a następnie zaciśnij szew Pottsa, zabezpiecz cewnik szwem 7-0 i usuń zacisk z dystalnej żyły wrotnej.
Natychmiast rozpocznij infuzję dwóch mililitrów odczynnika będącego przedmiotem zainteresowania w ciągu 15-minutowego okresu podawania, z ciągłym monitorowaniem parametrów życiowych zwierzęcia przez cały czas trwania infuzji. Godzinę od początku czasu niedokrwiennego usuń szew Potts i cewnik, a następnie zaciśnij szew 7-0 na tylnej gałęzi do żyły wrotnej. Dwie godziny po rozpoczęciu reperfuzji powoli pobrać 0,5 mililitra krwi z żyły głównej dolnej, a następnie powoli przelewać krew do nowej fiolki.
W razie potrzeby delikatnie uciskaj, aby zatrzymać krwawienie z żyły. Następnie odwirować krew i zatrzasnąć połowę surowicy do dalszego przetwarzania, jak właśnie pokazano. W eksperymentalnym punkcie końcowym naciąć przeponę w kółko i odciąć wszelką dodatkową tkankę łączną, która pozostaje łącząca wątrobę z jamą otrzewnej.
Zbierz wątrobę i uzyskaj cztery duże próbki z lewego i środkowego płata oraz cztery duże próbki z prawego płata. Następnie umieść próbki w indywidualnie oznakowanych fiolkach i zamroź tkanki w ciekłym azocie w celu dalszego przetwarzania. Pomiar aminotransferazy alaninowej w surowicy u zwierząt z prawidłową solą fizjologiczną i PEG-SOD z zaciskiem wnękowym wykazuje istotną różnicę między poziomem ekspresji enzymów wątrobowych w surowicy kontrolnej a eksperymentalnym poziomem zwierzęcych enzymów wątrobowych po 120 minutach od reperfuzji.
Tkankowa ekspresja dialdehydu malonowego w prawym, niewnękowym płacie klamrowym nie wykazuje istotnej różnicy między grupą kontrolną a grupą eksperymentalną. Lewy klamra po wnęce i płat reperfuzyjny wykazują jednak znacznie wyższy poziom ekspresji dialdehydu malonowego w tkankach w porównaniu z płatem kontrolnym niereperfuzyjnym, nieinfuzjonowanym, a także z prawym płatem podawanym PEG-SOD. Ten sam wzorzec obserwuje się również w przypadku ekspresji glutationu w tkankach.
Analiza Western blot wskazuje na zwiększony poziom ekspresji rozszczepionej kaspazy-3 w lewym płacie po klamrze wnękowej i reperfuzji, który jest zmniejszony u zwierząt leczonych wlewem PEG-SOD, różnice, które zostały potwierdzone jako istotne za pomocą densytometrii. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w trzy godziny i 30 minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podejmując tę procedurę, należy pamiętać o uzyskaniu znacznej przyczepności na gałęzi żyły wrotnej w celu kaniulacji podczas zakładania dystalnego zacisku żyły wrotnej.
Po opanowaniu tej procedury można ją wykorzystać do zbadania wpływu różnych substancji farmakologicznych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak kaniulować lewy układ żyły wrotnej.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia unikalny model zaciskowy wnęki wątroby szczura, opracowany w celu badania wpływu cząsteczek farmakologicznych na uraz niedokrwienno-reperfuzyjny. Model ten umożliwia bezpośrednie dostarczanie substancji do wątroby poprzez żyłę wrotną, co ułatwia prowadzenie ukierunkowanych badań nad transplantacją wątroby.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Farmakologia
- Przeszczepy wątroby
Wstęp
- Uszkodzenie reperfuzyjne jest krytycznym problemem w transplantacji wątroby.
- Zrozumienie interwencji farmakologicznych może poprawić wyniki przeszczepów.
- Metody bezpośredniej infuzji mogą zwiększyć skuteczność czynników terapeutycznych.
- Wizualna demonstracja technik chirurgicznych jest niezbędna dla zapewnienia powtarzalności.
Cel badania
- Opracowanie modelu do badania środków farmakologicznych w przypadku urazu niedokrwienno-reperfuzyjnego wątroby.
- Ocena bezpośredniego wpływu infundowanych cząsteczek na stan zdrowia wątroby.
- Przedstawienie metodologii możliwej do zastosowania w innych scenariuszach transplantacji narządów.
Zastosowane metody
- Model zacisku wnęki wątroby szczura z kaniulacją żyły wrotnej.
- Bezpośrednia infuzja środków farmakologicznych do żyły wrotnej.
- Monitorowanie parametrów życiowych podczas procesu infuzji.
- Pobieranie i analiza próbek surowicy oraz tkanek po reperfuzji.
Główne wyniki
- Istotne różnice w poziomach siero-aminotransferazy alaninowej po leczeniu.
- Zwiększona ekspresja malondialdehydu w tkance leczonych płatów wątroby.
- Analiza Western blot wykazała zmienione poziomy kaspazy-3 w formie rozszczepionej.
- Wykazano potencjał środków farmakologicznych w łagodzeniu uszkodzeń.
Wnioski
- Model zaciskania wrotciela wątroby szczura jest skuteczny w badaniu obrażeń niedokrwienno-reperfuzyjnych.
- Techniki bezpośredniej infuzji mogą zwiększyć skuteczność terapeutyczną.
- Uzyskane wyniki mogą być pomocne w opracowywaniu przyszłych strategii w transplantologii narządów.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ten model zacisku wnęki wątroby szczura umożliwia ukierunkowane dostarczanie środków farmakologicznych do niedokrwiennych segmentów wątroby, co zmniejsza ekspozycję systemową i pozwala na lepsze zrozumienie mechanizmów uszkodzenia reperfuzyjnego. Dzięki możliwości bezpośredniej infuzji do systemu żyły wrotnej, metoda ta wspiera przedkliniczną ocenę związków cytoprotekcyjnych z poprawionym stosunkiem sygnału do szumu w punktach końcowych specyficznych dla tkanki. Podejście to pomaga w minimalizowaniu ryzyka związanego z głównymi kandydatami na leki w transplantologii wątroby oraz innych strategiach perfuzji organów poprzez odizolowanie efektów wątrobowych od czynników systemowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez dostarczanie badanych związków bezpośrednio do niedokrwionego płata wątroby, co pozwala na wyjaśnienie mechanizmów działania skierowanych w konkretny cel.
- Wartość operacyjna: Zmniejsza wymaganą objętość związku i minimalizuje efekty pozacelowe, zwiększając czułość analizy oraz specyficzność wobec celu.
- Wartość translacyjna: Wspiera walidację celu w istotnym dla choroby modelu I/R, zwiększając pewność co do istotności patofizjologicznej przed przejściem do badań na większych gatunkach.
Przesiewy i opracowanie testu
- Gotowość do analizy: Pozwala na uzyskanie mierzalnych odczytów biochemicznych, takich jak poziomy ALT w surowicy i MDA w tkance, co umożliwia standaryzowany screening związków pod kątem aktywności hepatoprotekcyjnej.
- Powtarzalność: Model chirurgiczny zapewnia spójne wzorce uszkodzeń niedokrwiennych, co wspiera wiarygodną ocenę zależności dawka-odpowiedź w różnych seriach doświadczalnych.
- Skalowalność: Po opanowaniu techniki procedura pozwala na wielokrotne testowanie wielu czynników farmakologicznych w kontrolowany sposób, specyficzny dla danego segmentu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie chorobowe: Naśladuje kliniczne niedokrwienie na ciepło podczas pobierania i transplantacji organów, stanowiąc model prognostyczny dla uszkodzenia i dysfunkcji przeszczepu.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Umożliwia ocenę działania środków antyoksydacyjnych i antyapoptotycznych (np. PEG-SOD) w odniesieniu do kluczowych markerów uszkodzeń, takich jak kaspaza-3 w formie rozszczepionej oraz peroksydacja lipidów.
- Ciągłość przedkliniczna: Ułatwia optymalizację wiodących związków poprzez powiązanie oddziaływania na cel w wątrobie z wynikami funkcjonalnymi w zakresie uwalniania enzymów i stresu oksydacyjnego.
Integracja potoków i przepływów pracy
Model ten wpisuje się w kontinuum od etapu odkrywania do badań przedklinicznych, umożliwiając wczesny screening mechanistyczny czynników cytoprotekcyjnych przed przeprowadzeniem szerszego profilowania farmakokinetycznego lub toksykologicznego.
- Biologia odkrywcza: Wspiera wyjaśnianie szlaków sygnałowych i walidację punktów uchwytu poprzez izolację efektów leków w segmencie wątroby poddanym urazowi niedokrwienno-reperfuzyjnemu (I/R).
- Screening: Umożliwia standaryzowaną ocenę skuteczności związków poprzez mierzalne parametry, takie jak uwalnianie ALT i powstawanie MDA.
- Analityka: Zapewnia multipleksowe odczyty (enzymatyczne, oksydacyjne, apoptozy), co pozwala na porównanie mechanizmów działania i potencji związków.
- Badania translacyjne: Łączy ochronę wątroby z wynikami istotnymi dla transplantologii, wspierając decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) nad strategiami konserwacji narządów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Platforma chirurgiczna może być wykorzystywana w ramach wielu kampanii testowania związków, maksymalizując zwrot z inwestycji (ROI) w rozwój modelu i szkolenie operatorów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa wiarygodność prognoz poprzez redukcję zmienności farmakokinetycznej i skupienie się na farmakodynamice specyficznej dla wątroby.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność dzięki standaryzacji dostępu naczyniowego i perfuzji segmentowej, minimalizując zmienność międzyosobniczą u zwierząt.
- Wartość strategiczna: Zwiększa efektywność identyfikacji związków wiodących poprzez umożliwienie szybkiego testowania zależności struktura-aktywność w odpowiednim kontekście patofizjologicznym.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację kandydatów cytoprotekcyjnych do programów transplantacyjnych z uwzględnieniem ryzyka, dostarczając dane mechanistyczne i dotyczące skuteczności na wczesnym etapie odkrywania.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w mikrosurgicalnej kaniulacji naczyniowej oraz znajomości anatomii wątroby gryzoni.
- Zależność od precyzyjnego instrumentarium, w tym mikrosyringów, cienkich nici chirurgicznych i systemów powiększenia.
- Konieczność zastosowania standaryzowanej opieki okołoperacyjnej, w tym utrzymania temperatury i monitorowania parametrów życiowych.
- Adaptacja metody do innych płatów lub organów może wymagać ponownego zmapowania anatomicznego i dostosowania rozmiaru naczyń.
- Ograniczenia praktyczne obejmują złożoność techniczną oraz zależność od operatora, co bez rygorystycznego szkolenia może wpływać na powtarzalność między laboratoryjną.
