Name: Oparta na pływalności metoda określania poziomu tłuszczu u Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-01T11:15:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Poznaj metodę pływalnościową do szybkiego określania poziomu tłuszczu u larw Drosophila melanogaster. Ta technika umożliwia ekonomiczne i powtarzalne badanie zmian magazynowania lipidów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

K.E.H. był wspierany przez Training Grant in Molecular Biology NIH-T32-GM08730. Praca ta była wspierana przez NIH, NIDDK Grant 5K01DK095932 i AHA Award 12BGIA11930014 dla T.R.

1. Zbieraj jaja od much o interesujących genotypach
UWAGA: Idealne krzyżówki składają się ze 150 dziewiczych much i co najmniej 75 samców. Kolekcje stockowe powinny składać się z co najmniej 200 much.
<ol>
	<li>Przygotuj talerze z winogronami.
	<ol>
		<li>Dodać 37,5 g agaru do 1,5 l wody destylowanej w kolbie o pojemności 4 l.</li>
		<li>Mieszaj wodę i agar w autoklawie przez 50 minut w temperaturze 121 ºC (250 ºF).</li>
		<li>Podczas autoklawowania mieszaniny wody i agaru dodaj 50 g sacharozy do 500 ml soku winogronowego i mieszaj mieszadłem na rozgrzanej płytce mieszającej, aż sacharoza się rozpuści.</li>
		<li>Wyłącz ogień i kontynuuj mieszanie, aby schłodzić mieszaninę soku winogronowego i sacharozy do temperatury poniżej 70 °C. Sprawdzić temperaturę wewnętrzną za pomocą termometru alkoholowego.</li>
		<li>Dodać 3 g środka przeciwgrzybiczego Drosophila (np. Tegosept) do ciepłej mieszanki soku winogronowego i sacharozy i mieszać do rozpuszczenia.</li>
		<li>Gdy mieszanina wody i agaru zostanie wyjęta z autoklawu, pozwól kolbie ostygnąć w dotyku, od czasu do czasu obracając.</li>
		<li>Połącz mieszaninę wody/agaru i mieszaninę soku winogronowego/sacharozy i mieszaj, aż dobrze się wymieszają.</li>
		<li>Za pomocą pipety serologicznej dodaj 8 - 10 ml mieszanki winogron do pokrywki małej płytki Petriego (35 x 10 mm). Pozwól, aby mieszanina ukoronowała się wyżej niż wysokość ścianek pokrywy, aby utworzyć wypukły kształt.</li>
		<li>Pozostawić talerze winogronowe do ostygnięcia przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, a następnie przechowywać w hermetycznym pojemniku w temperaturze 4 ºC.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj pastę drożdżową.
	<ol>
		<li>Dodać 6 ml buforowego roztworu fosforanowego (PBS) do 4 g żywych aktywnych suszonych drożdży w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i mieszać szpatułką do uzyskania gładkiej konsystencji.</li>
		<li>Pastę drożdżową przechowywać w temperaturze 4 ºC.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodaj małą porcję (około 1/8 łyżeczki) pasty drożdżowej na środek talerza winogronowego. Wygładź wszelkie ostre krawędzie szpatułką.</li>
	<li>Umieść talerze winogronowe w inkubatorze, aż osiągną temperaturę otoczenia.</li>
	<li>Przenieś interesujące muchy do komory zbierania jaj i połóż na wierzchu talerz winogronowy z pastą drożdżową skierowaną do wewnątrz. Przyklej talerz winogronowy do komory na jajka, aby uniknąć wypadnięcia talerza. Upewnij się, że zapisałeś ważne informacje o genotypie i dacie na spodzie talerza z winogronami.</li>
	<li>Odwróć komorę na jajka, aby muchy mogły złożyć jaja na talerzu winogronowym.</li>
	<li>Umieścić pudełko lub pokrywę nad komorami do zbierania jaj i umieścić je w inkubatorze w temperaturze 25 °C.</li>
	<li>Pozwól muchom złożyć jaja przez 4 - 6 godzin.</li>
	<li>Zakończ zbieranie, wyjmując talerz winogronowy z komory na jaja i przenosząc muchy z powrotem do butelki z jedzeniem. Za pomocą szpatułki zetrzyj nadmiar pasty drożdżowej z talerza winogronowego. Przechowywać talerz winogronowy na większej szalce Petriego w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 25 ºC przez ~ 24 godziny.</li>
</ol>
2. Przenieś larwy do eksperymentalnego pokarmu
<ol>
	<li>Przygotuj eksperymentalne jedzenie. 
	UWAGA: Ten przepis na jedzenie jest oparty na przepisie18 z centrum zapasów Bloomington. Do ważnych zmian należy zwiększenie ilości drożdży w celu optymalizacji wartości odżywczej żywności ocenianej na podstawie czasu etapu wędrówki (między 112 a 120 godzinami po zebraniu jaj w temperaturze 25 ºC). Chociaż stwierdziliśmy, że ta receptura jest idealna dla zdrowia i rozwoju naszych eksperymentalnych larw, każda receptura żywieniowa jest dopuszczalna pod warunkiem kalibracji z kontrolami pozytywnymi i negatywnymi, których przykłady wymieniono w kroku 3.10.
	<ol>
		<li>Odmierzyć 1 600 ml wody destylowanej.</li>
		<li>Wymieszaj 134 g mąki kukurydzianej, 10,6 g Drosophila Agar Type II i trochę wody (~ 500 ml) w zlewce o pojemności 1 l. Miksuj przez 2 minuty za pomocą zmotoryzowanego miksera ręcznego.</li>
		<li>Wymieszaj 70 g żywych aktywnych suchych drożdży, 18,4 g mąki sojowej, 84,8 g ekstraktu słodowego i trochę wody (~ 500 ml) w kolejnej 1 litrowej zlewce. Miksuj przez 2 minuty za pomocą zmotoryzowanego miksera ręcznego.</li>
		<li>Zamieszaj każdą zlewkę i przelej do kolby o pojemności 4 l. Użyć pozostałej wody do wypłukania zlewek i dodać do kolby.</li>
		<li>Odmierz 140 ml jasnego syropu kukurydzianego i dodaj do kolby, mieszając.</li>
		<li>Autoklaw przez 50 minut w temperaturze 121 ºC (250 ºF) w stanie płynnym.</li>
		<li>Po sterylizacji w autoklawie wlać żywność do 4-litrowej zlewki i pozostawić do ostygnięcia. Wspomóż proces chłodzenia, mieszając go za pomocą zmotoryzowanego miksera ręcznego.</li>
		<li>Gdy kolba ostygnie na tyle, że można jej dotknąć, dodać 8,8 ml kwasu propionowego i 16,8 ml roztworu przeciwgrzybiczego Drosophila/etanolu. Dobrze wymieszaj. (Przygotować roztwór środka przeciwgrzybiczego Drosophila, dodając 380 g środka przeciwgrzybiczego Drosophila do 1 litra etanolu o 200 proof i mieszając na ciepłym talerzu aż do rozpuszczenia, upewniając się, że roztwór nie przekracza 70 °C.)</li>
		<li>Wlać pokarm do fiolek, aż pokarm osiągnie głębokość około 1 cala i pozostawić do ostygnięcia w temperaturze pokojowej przez 2 - 3 godziny. Zatkać fiolki i przechowywać w inkubatorze w temperaturze 25 °C. Zużyć w ciągu tygodnia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zanurz kilkakrotnie szpatułkę w górnej warstwie fiolki z jedzeniem, aby ją naciąć. Pomoże to larwom zakopać się i żerować.</li>
	<li>22 - 24 godziny po zakończeniu zbierania jaj użyj małego pędzla, aby zebrać 50 larw pierwszego stadium (L1) o tej samej przybliżonej wielkości. Umieść larwy w eksperymentalnym pokarmie. Wyczyść pędzel chusteczką laboratoryjną i upewnij się, że na pędzlu nie pozostały żadne larwy, zanim przejdziesz do innego genotypu.</li>
	<li>Umieścić fiolkę z larwami w inkubatorze w temperaturze 25 °C i pozostawić do rozwoju.</li>
</ol>
3. Określ poziom tłuszczu u larw
<ol>
	<li>Przygotuj rozwiązania.
	<ol>
		<li>Przygotuj 1 l bulionu 10x PBS.
		<ol>
			<li>Dodać 80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na2HPO4 i 2,4 g KH2PO4 do 800 ml wody w zlewce o pojemności 2 l. Mieszaj bez ognia, aż wszystkie sole się połączą. Doprowadzić pH do 7,4. Zwiększ objętość do 1 l wodą.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotuj 2 L 1x PBS. Dodać 200 ml 10 PBS roztworu podstawowego do 1 800 ml wody.</li>
		<li>Użyj tego zapasu 1x PBS, aby uzyskać 20% w/v sacharozy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyjąć fiolkę z larwami z inkubatora, gdy po bokach fiolki pojawi się 20-40 larw (zwykle piątego dnia po pobraniu jaj). Należy zanotować datę i godzinę testu, a także liczbę wędrujących larw.</li>
	<li>Przygotować roztwór doświadczalny, dodając 11,5 ml PBS i 9 ml 20% sacharozy do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Dodaj 20% sacharozy do fiolki, aż znajdzie się 0,5 - 1 cala od górnej części fiolki.</li>
	<li>Użyj szpatułki, aby delikatnie wymieszać górną warstwę pokarmu, aby uwolnić larwy, które nadal grzebią się w żywności. Wszystkie larwy wydostaną się na powierzchnię roztworu sacharozy.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy delikatnie przenieś larwy do początkowego stężenia sacharozy z kroku 3.3.</li>
	<li>Użyj szpatułki, aby delikatnie wymieszać larwy w tym roztworze.</li>
	<li>Zakryj stożkową rurkę i odwróć kilka razy, aby dokładnie wymieszać roztwór.</li>
	<li>Rozkręć stożkową rurkę i zakręć, aby utworzyć delikatny wir.</li>
	<li>Pozwól larwom się uspokoić, unosząc się na wierzch roztworu lub opadając na dno. Odczekaj 2 - 5 minut, aż larwy się usiądą. 
	UWAGA: Jeśli nadal istnieją larwy, które nie są na pewno ani pływające, ani tonące, wybierz linię, której chcesz użyć jako punktu odcięcia, aby oznaczyć larwy jako pływak lub ciężarek. Zastosuj to samo kryterium do wszystkich genotypów. Jako granicy używamy kąta na dole stożkowej rury. Larwy z mutacją ADP lub SIR217 mogą być stosowane jako kontrola dodatnia, a mutanty LSD219 mogą być używane jako kontrola ujemna do kalibracji testu.</li>
	<li>Zanotować liczbę pływających larw i badane stężenie właściwe.</li>
	<li>Dodać 1 ml 20% sacharozy do roztworu doświadczalnego, aby zwiększyć jego gęstość.</li>
	<li>Powtórz kroki od 3.7 do 3.10. Zapisz liczbę pływających larw i to nowe stężenie.</li>
	<li>Kontynuuj kroki 3.12 i 3.13 do momentu, gdy co najmniej 95% larw zacznie unosić się na wodzie.</li>
	<li>Użyj kleszczy, aby zebrać wszystkie larwy do naczynia preparacyjnego wypełnionego PBS.</li>
	<li>Obserwuj larwy pod mikroskopem i zwróć uwagę, czy są jakieś małe larwy, pre-poczwarki, poczwarki lub jakiekolwiek inne różnice między genotypami. 
	UWAGA: Idealnie, wszystkie larwy powinny wydawać się jednorodne i na tym samym etapie rozwoju. Zaobserwowaliśmy tylko spójne pomiary tłuszczu w tych warunkach.</li>
	<li>Zapisać całkowitą liczbę larw.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy przenieś 10 larw do chusteczki laboratoryjnej do wyschnięcia. Oznacz probówkę do mikrowirówki i umieść w niej 10 larw.</li>
	<li>Błyskawiczne zamrożenie larw w ciekłym azocie. Przechowywać probówkę w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>

<ol><li>Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila%2C+the+golden+bug%2C+emerges+as+a+tool+for+human+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics.</a> Nat Rev Genet. 6, 9-23 (2005).</li>
<li>Liu, Z., Huang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+metabolism+in+Drosophila+development+and+disease+Using+Drosophila+System+to+Study+Lipid+Metabolism+Lipids+Function+in+Drosophila+Early+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochim+Biophys+Sin%22%5BJournal%5D)">Lipid metabolism in Drosophila development and disease Using Drosophila System to Study Lipid Metabolism Lipids Function in Drosophila Early Development.</a> Acta Biochim Biophys Sin. 45 (1), 44-50 (2013).</li>
<li>Ruden, D. M., Lu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+conservation+of+metabolism+explains+howDrosophila+nutrigenomics+can+help+us+understand+human+nutrigenomics%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Nutr%22%5BJournal%5D)">Evolutionary conservation of metabolism explains howDrosophila nutrigenomics can help us understand human nutrigenomics.</a> Genes Nutr. 1 (2), 75-84 (2006).</li>
<li>Wolf, M. J., Rockman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila%2C+genetic+screens%2C+and+cardiac+function%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Drosophila, genetic screens, and cardiac function.</a> Circ. Res. 109, 794-806 (2011).</li>
<li>Trinh, I., Boulianne, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+obesity+and+its+associated+disorders+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Modeling obesity and its associated disorders in Drosophila.</a> Physiology (Bethesda). 28 (2), 117-124 (2013).</li>
<li>Azeez, O. I., Meintjes, R., Chamunorwa, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fat+body%2C+fat+pad+and+adipose+tissues+in+invertebrates+and+vertebrates%3A+the+nexus%5BTitle%5D)+AND+%22Lipids+Health+Dis%22%5BJournal%5D)">Fat body, fat pad and adipose tissues in invertebrates and vertebrates: the nexus.</a> Lipids Health Dis. 13, 71(2014).</li>
<li>Dourlen, P., Sujkowski, A., Wessells, R., Mollereau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+transport+proteins+in+disease%3A+New+insights+from+invertebrate+models%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Fatty acid transport proteins in disease: New insights from invertebrate models.</a> Prog. Lipid Res. 60, 30-40 (2015).</li>
<li>Hildebrandt, A., Bickmeyer, I., Kühnlein, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliable+Drosophila+body+fat+quantification+by+a+coupled+colorimetric+assay%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Reliable Drosophila body fat quantification by a coupled colorimetric assay.</a> PLoS One. 6 (9), e23796(2011).</li>
<li>Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+metabolism+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for studying metabolism in Drosophila.</a> Methods. 68, 105-115 (2014).</li>
<li>Al-Anzi, B., Zinn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+measurement+of+triglycerides+cannot+provide+an+accurate+measure+of+stored+fat+content+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Colorimetric measurement of triglycerides cannot provide an accurate measure of stored fat content in Drosophila.</a> PLoS One. 5 (8), e12353(2010).</li>
<li>Thanh, N. T. K., Stevenson, G., Obatoml, D., Bach, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+Lipids+in+Animal+Tissues+by+High-Performance+Thin-Layer+Chromatography+with+Densitometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Planar+Chromatogr%22%5BJournal%5D)">Determination of Lipids in Animal Tissues by High-Performance Thin-Layer Chromatography with Densitometry.</a> J. Planar Chromatogr. 13, 375-381 (2000).</li>
<li>Borrull, A., Lopez-Martinez, G., Poblet, M., Cordero-Otero, R., Rozes, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+the+separation+and+quantification+of+neutral+lipid+species+using+GC-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Lipid+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">A simple method for the separation and quantification of neutral lipid species using GC-MS.</a> Eur. J. Lipid Sci. Technol. 117, 274-280 (2015).</li>
<li>Shui, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+one+step+analysis+of+cellular+lipidomes+using+liquid+chromatography+coupled+with+mass+spectrometry%3A+application+to+Saccharomyces+cerevisiae+and+Schizosaccharomyces+pombe+lipidomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Toward one step analysis of cellular lipidomes using liquid chromatography coupled with mass spectrometry: application to Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe lipidomics.</a> Mol. Biosyst. 6, 1008-1017 (2010).</li>
<li>Farvid, M. S., Ng, T. W. K., Chan, D. C., Barrett, P. H. R., Watts, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+adiponectin+and+resistin+with+adipose+tissue+compartments%2C+insulin+resistance+and+dyslipidaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes.+Obes.+Metab%22%5BJournal%5D)">Association of adiponectin and resistin with adipose tissue compartments, insulin resistance and dyslipidaemia.</a> Diabetes. Obes. Metab. 7 (4), 406-413 (2005).</li>
<li>Urbanchek, M. G., Picken, E. B., Kalliainen, L. K., Kuzon, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+force+deficit+in+skeletal+muscles+of+old+rats+is+partially+explained+by+the+existence+of+denervated+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gerontol.+A.+Biol.+Sci.+Med.+Sci%22%5BJournal%5D)">Specific force deficit in skeletal muscles of old rats is partially explained by the existence of denervated muscle fibers.</a> J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 56A (5), B191-B197 (2001).</li>
<li>Mosher, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+between+Drosophila+Arc1+and+a+specific+population+of+brain+neurons+regulates+organismal+fat%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Coordination between Drosophila Arc1 and a specific population of brain neurons regulates organismal fat.</a> Dev. Biol. 405 (2), 280-290 (2015).</li>
<li>Reis, T., van Gilst, M. R., Hariharan, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+buoyancy-based+screen+of+drosophila+larvae+for+fat-+storage+mutants+reveals+a+role+for+Sir2+in+coupling+fat+Storage+to+Nutrient+Availability%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">A buoyancy-based screen of drosophila larvae for fat- storage mutants reveals a role for Sir2 in coupling fat Storage to Nutrient Availability.</a> PLoS Genet. 6 (11), e1001206(2010).</li>
<li>Current Bloomington Recipe for Drosophila Medium. , Bloomington Drosophila Stock Center at Indiana University. Available from:
 <a target="_blank" href="http://flystocks.bio.indiana.edu/Fly_Work/media-recipes/bloomfood.htm">http://flystocks.bio.indiana.edu/Fly_Work/media-recipes/bloomfood.htm</a> (2014).</li>
<li>Teixeira, L., Rabouille, C., Rørth, P., Ephrussi, A., Vanzo, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Perilipin%2FADRP+homologue+Lsd2+regulates+lipid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Drosophila Perilipin/ADRP homologue Lsd2 regulates lipid metabolism.</a> Mech. Dev. 120 (9), 1071-1081 (2003).</li>
<li>Perez, C. L., Van Gilst, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+13C+Isotope+Labeling+Strategy+Reveals+the+Influence+of+Insulin+Signaling+on+Lipogenesis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">A 13C Isotope Labeling Strategy Reveals the Influence of Insulin Signaling on Lipogenesis in C. elegans.</a> Cell Metab. 8, 266-274 (2008).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Istnieje wiele technik, które zostały opracowane do pomiaru poziomu lipidów 8-10. Jednak każda z tych metod ma pewne poważne wady, które są rozwiązywane przez test oparty na pływalności opisany powyżej. Po pierwsze, ten test jest niezwykle szybki. Badanie pełnego gradientu stężeń zajmuje nie więcej niż 30 - 60 minut. Jest to ogromny postęp w stosunku do większości obecnie stosowanych technik. Na przykład oznaczanie ilościowe lipidów przez stwardnienie rozsiane zajmuje 7-9 godzin na wyizol...

Drosophila melanogaster jest używana od ponad stu lat w badaniach genetycznych i innych podstawowych kwestiach biologicznych. W ciągu ostatnich kilku dekad stało się jasne, że Drosophila jest potężnym narzędziem w badaniu wielu chorób człowieka. Ponieważ 70-80% genów związanych z chorobami człowieka ma zidentyfikowany ortologmuchy 1-4, Drosophila zapewnia uproszczony, ale możliwy do przetłumaczenia system do badania złożonych chorób. Na takim badaniu skorzystał w szczególności metabolizm. Nie tylko genetyka metabolizmu jest dobrze zachowana między muchami a ludźmi, ale odpowiednie narządy i typy komórek są również bardzo podobne2,5. Na przykład ciało tłuszczowe muchy przechowuje zarówno triacyloglicerydy (TAG), jak i glikogen, funkcje analogiczne do tych pełnionych w wątrobie ssaków i białej tkance tłuszczowej6. Wykorzystanie Drosophila jako modelu otyłości u ludzi znacznie poprawiło naszą wiedzę na temat metabolizmu lipidów i genetyki otyłości7. Stadium rozwoju larwalnego jest szczególnie przydatne do badania segregacji składników odżywczych do przechowywania lub wykorzystania, ponieważ jest przeznaczone do żerowania i magazynowania energii do wykorzystania podczas poczwarki.
Obecnie istnieje wiele różnych metod ilościowych określania poziomu magazynowania tłuszczu u Drosophila. Najczęściej stosowaną metodą jest sprzężony test kolorymetryczny (CCA)8,9. CCA został opracowany do oznaczania poziomów TAG w ludzkiej surowicy i działa w oparciu o założenie, że glicerol uwolniony ze szkieletu trójglicerydów przejdzie kilka reakcji, ostatecznie powodując reakcję sprzężoną z redoks, w wyniku której powstaje kolorowy produkt. Następnie mierzy się absorbancję określonych długości fal światła w celu określenia początkowej ilości obecnego glicerolu. Jednak glicerol może być również uwolniony z mono- i diacyloglicerydów oprócz TAG i dlatego może nie być dokładną miarą zmagazynowanej tkanki tłuszczowej9. Co więcej, pigment oczu zmiażdżonych dorosłych much może zakłócać niektóre odczyty absorbancji i komplikować wyniki9,10. W związku z tym CCA musi towarzyszyć chromatografia cienkowarstwowa (TLC) i być przez nią zwalidowana, co pozwala na oddzielenie większości rodzin lipidów, które można określić ilościowo za pomocą densytometrii10,11. Jednak niektóre klasy lipidów, takie jak sterole, nie mogą być analizowane i muszą być oznaczone ilościowo w inny sposób12. Spektrometria mas (MS) jest dokładnym sposobem ilościowego oznaczania wszystkich klas głównych lipidów komórkowych12,13. Jednak procedury ekstrakcji lipidów niezbędne do analizy przez SM są zarówno czasochłonne (większość z nich zajmuje prawie cały dzień), jak i kosztowne. W tym artykule przedstawiamy alternatywną metodę szybkiego i taniego oznaczania poziomu tłuszczu w organizmie w larwach L3 Drosophila melanogaster.
Metoda przedstawiona poniżej wykorzystuje różnicę w gęstości między tkanką tłuszczową a tkanką beztłuszczową. Tkanka tłuszczowa ssaków ma gęstość około 0,9 g/ml14, a mięśnie szkieletowe gęstość 1,06 g/ml15. Różnica ta oznacza, że zwierzęta z większymi zapasami tłuszczu będą miały mniejszą gęstość niż zwierzęta z niższymi zapasami tłuszczu, co pozwoli im lepiej unosić się w roztworze o stałej gęstości. Ta właściwość pozwala na niezwykle szybkie przesiewanie dużej liczby zwierząt, a jednocześnie jest niedroga i nieinwazyjna. Analiza oparta na pływalności została wykorzystana zarówno do potwierdzenia fenotypów zmiany znanych regulatorów poziomu tłuszczu, jak i do identyfikacji nowych genetycznych i neurologicznych regulatorów otyłości16,17.

<table><tbody><tr><td>Bacto Agar</td><td>VWR</td><td>214030</td><td></td></tr><tr><td>Welch's Original 100% sok</td><td></td><td></td><td></td>winogronowy</tr><tr><td>sacharoza</td><td>Fisher</td><td>S512</td><td></td></tr><tr><td>Tegosept</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-259</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td></td><td></td><td>200 proof</td></tr><tr><td>Drożdże piekarskie</td><td>Fleichmann's</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Yellow Mączka kukurydziana</td><td>Quaker</td><td></td><td>Wzbogacony odkiełkowany</td></tr><tr><td>Drosophila Agar Typ II</td><td>Apex</td><td>66-104</td><td></td></tr><tr><td>Mąka sojowa</td><td>ADM Składniki specjalne</td><td>062-100</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt słodowy</td><td>Breiss</td><td>5748</td><td></td></tr><tr><td>Jasny syrop kukurydziany</td><td>Kwas propionowy Karo</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>U330-09</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher</td><td>50147491</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy</td><td>Sigma</td><td>P5655-100G</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu bezwodny</td><td>Fisher</td><td>S3933</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Fisher</td><td>P330-500</td><td></td></tr><tr><td>35 x 10 mm płytka Petriego</td><td>Fisher</td><td>08-757-100A</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Stożkowy</td><td>Fisher</td><td>50-869-569</td><td></td></tr></tbody></table>

oparta na pływalności metoda określania poziomu tłuszczu u drosophila

A Buoyancy-based Method of Determining Fat Levels in Drosophila

Drosophila melanogaster to kluczowy system eksperymentalny w badaniach nad regulacją tkanki tłuszczowej. Obecnie istnieje wiele technik pomiaru poziomu zmagazynowanego tłuszczu u Drosophila, ale większość z nich jest kosztowna i/lub pracochłonna i ma wyraźne ograniczenia. W tym miejscu przedstawiamy metodę szybkiego i taniego oznaczania poziomu tłuszczu w organizmie w larwach L3 Drosophila. Technika ta opiera się na różnicach w gęstości między tkanką tłuszczową a beztłuszczową i pozwala na szybkie wykrycie fenotypów tłuszczu i chudego ciała. Zweryfikowaliśmy dokładność tej metody przez porównanie z procentową zawartością tkanki tłuszczowej oznaczoną za pomocą neutralnej ekstrakcji lipidów i chromatografii gazowej sprzężonej ze spektrometrią mas (GCMS). Ponadto przedstawiamy szczegółowe protokoły pobierania i synchronizacji larw, a także odpowiednie receptury doświadczalne. Przedstawiona poniżej technika przezwycięża główne niedociągnięcia w najczęściej stosowanych metodach oznaczania ilościowego lipidów i zapewnia skuteczny sposób szybkiego i czułego badania przesiewowego larw L3 pod kątem fenotypów regulacji tłuszczu przy jednoczesnym zachowaniu integralności larw. Test ten ma szerokie zastosowanie w badaniu metabolizmu i regulacji tłuszczu za pomocą Drosophila.

Rysunek 1 przedstawia przykład tego, jak test oparty na wyporności może wykrywać zarówno wyższe, jak i niższe zapasy tłuszczu w genetycznie zmodyfikowanych larwach. Rysunek 1A pokazuje, że pobudzenie lub wyciszenie określonej podgrupy neuronów (E347) w mózgu larwy indukuje odpowiednio niższe i wyższe zapasy tłuszczu. W obu przypadkach zastosowano tę samą kontrolę tła genetycznego. Rysunek 1B stanowi przykład tego, jak fenotyp uzyskany za ...

Tutaj prezentujemy metodę pomiaru poziomu tłuszczu w organizmie w trzecim stadium larwalnym (L3) Drosophila melanogaster. Metoda ta wykorzystuje stosunkowo niską gęstość tkanki tłuszczowej do różnicowania larw ze zmienionymi zapasami tłuszczu. Analiza oparta na pływalności jest cennym narzędziem do szybkich, powtarzalnych i ekonomicznych badań przesiewowych.

Oparta na pływalności metoda określania poziomu tłuszczu u Drosophila

Drosophila melanogaster is a key experimental system in the study of fat regulation. Numerous techniques currently exist to measure levels of stored fat ...

Ogólnym celem tego testu jest określenie wszelkich zmian w poziomach zapasów tłuszczu, które mogą być spowodowane zmianami genetycznymi, dietą lub leczeniem. Metody te mogą pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu metabolizmu, takie jak genetyczny lub neuronalny wpływ na predyspozycje do otyłości. Główną zaletą tej techniki jest to, że w porównaniu z innymi obecnie stosowanymi metodami jest ona szybka, ekonomiczna i bardzo powtarzalna.Osoby rozpoczynające pracę z tą metodą lub po raz pierwszy pracujące z larwami w stadium wędrownym mogą mieć trudności z tym protokołem, ponieważ harmonogram rozwojowy różnych genotypów może być bardzo zróżnicowany. Aby rozpocząć procedurę, nanieś niewielką ilość pasty drożdżowej na środek płytki z kratką. Wygładź wszelkie nierówności za pomocą szpachelki.Następnie przenieś wybrane muchy do komory do zbierania jaj i umieść na górze płytkę z kratką z pastą drożdżową, skierowaną do wewnątrz. Następnie przyklej płytkę z kratką do komory do zbierania jaj taśmą, aby zapobiec jej wypadnięciu. Pamiętaj, aby zapisać ważne informacje o genotypie i dacie na spodzie płytki z kratką.Następnie odwróć komorę do zbierania jaj, aby muchy mogły złożyć jaja na

a-buoyancy-based-method-of-determining-fat-levels-in-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film demonstruje test do monitorowania zakwaszenia jelit u muszek Drosophila. Po spożyciu pokarmu uzupełnionego barwnikiem wskaźnikowym pH, zakwaszenie światła jelita powoduje zmianę koloru barwnika. Oględziny przewodu pokarmowego much w celu zbadania zmiany koloru dostarczają dowodów na zakwaszenie.

Test monitorowania zakwaszenia jelit: technika badania zakwaszenia światła jelita u Drosophila przy użyciu niebieskiego barwnika bromofenolowego

Prezentujemy solidne metody biochemiczne i mikroskopowe do badania zapasów lipidów Caenorhabditis elegans. Szybka, prosta procedura barwienia utrwalającego do fluorescencyjnego obrazowania kropelek lipidów wykorzystuje właściwości spektralne lipofilowego barwnika czerwieni nilowej. Następnie przedstawiono pomiar biochemiczny triglicerydów i fosfolipidów z wykorzystaniem ekstrakcji do fazy stałej i chromatografii gazowej ze spektrometrią mas.

Biochemiczna i wysokoprzepustowa ocena mikroskopowa masy tłuszczowej w Caenorhabditis elegans

Tutaj opisujemy metodę szybkiego i dokładnego pomiaru wydajności lotu u Drosophila, umożliwiając wysokoprzepustowe badania przesiewowe.

Ulepszona metoda dokładnego i szybkiego pomiaru charakterystyki lotu u Drosophila

Zaburzenia metaboliczne należą do najczęstszych chorób u ludzi. Genetycznie podatny organizm modelowy D. melanogaster może być wykorzystany do identyfikacji nowych genów regulujących metabolizm. W artykule opisano stosunkowo prostą metodę, która pozwala na badanie tempa przemiany materii u much poprzez pomiar ich produkcji CO2 .

Pomiar tempa przemiany materii u Drosophila za pomocą respirometrii

Danio pręgowany staje się cennym modelem przetwarzania lipidów w diecie i chorób metabolicznych. Opisano protokoły żywienia larw bogatych w lipidy, obrazowanie na żywo fluorescencyjnych analogów lipidów w diecie oraz ilościowe oznaczanie spożycia pokarmu. Techniki te można zastosować do różnych technik badań przesiewowych, obrazowania i dociekań opartych na hipotezach.

Paradygmat żywienia wysokotłuszczowego dla larw danio pręgowanego: karmienie, obrazowanie na żywo i kwantyfikacja spożycia pokarmu

Test CApillary FEeder (CAFE) jest prostą, niedrogą i wysoce niezawodną metodą badania mechanizmów leżących u podstaw przyjmowania pokarmu. Stosowany w połączeniu z wysoce wszechstronnym modelem genetycznym Drosophila melanogaster, stanowi potężny środek do uzyskania nowego wglądu w mechanizmy regulacyjne przyjmowania pokarmu.

Test CApillary FEeder mierzy spożycie pokarmu u Drosophila melanogaster

Ta praca przedstawia metodę szybkiego i precyzyjnego ilościowego określenia pigmentacji brzucha Drosophila melanogaster za pomocą cyfrowej analizy obrazu. Metoda ta usprawnia procedury między akwizycją fenotypu a analizą danych i obejmuje montowanie próbek, akwizycję obrazu, ekstrakcję wartości pikseli i pomiar cech.

Kwantyfikacja pigmentacji jamy brzusznej u Drosophila melanogaster

To jest protokół żywieniowy diety wysokotłuszczowej do wywoływania otyłości u Drosophila, model do zrozumienia podstawowych mechanizmów molekularnych związanych z lipotoksycznością. Zapewnia również wysokoprzepustowy test triacyloglicerydowy do pomiaru akumulacji tłuszczu u Drosophila i potencjalnie innych modeli (owadów) w różnych warunkach dietetycznych, środowiskowych, genetycznych lub fizjologicznych.

Żywienie dietą wysokotłuszczową i wysokoprzepustowy test triacyloglicerydowy u Drosophila melanogaster

Przedstawione tutaj są szczegółowe metody preparowania i barwienia kropelkami lipidów enocytów u larw Drosophila przy użyciu BODIPY 493/503, barwnika fluorescencyjnego specyficznego dla kropelek lipidów.

Rozwarstwienie i barwienie kropelkami lipidów enocytów u larw Drosophila

Opisany tutaj jest protokół, który umożliwia kolorymetryczną kwantyfikację ilości jedzenia spożywanego w określonym przedziale czasu przez larwy Drosophila melanogaster wystawione na działanie diety o różnej jakości makroskładników. Testy te są przeprowadzane w kontekście neuronalnego badania termogenetycznego.

Kwantyfikacja spożycia makroskładników odżywczych w termogenetycznym badaniu przesiewowym neuronów przy użyciu larw Drosophila

Obecny protokół opisuje indukcję autofagii w ciele tłuszczowym larw Drosophila melanogaster poprzez wyczerpanie składników odżywczych i analizuje zmiany w autofagii za pomocą transgenicznych szczepów much.

Analiza autofagii wywołanej głodem w ciele tłuszczowym larw Drosophila melanogaster

Poznaj metodę pływalnościową do szybkiego określania poziomu tłuszczu u larw Drosophila melanogaster. Ta technika umożliwia ekonomiczne i powtarzalne badanie zmian magazynowania lipidów.

Oparta na pływalności metoda określania poziomu tłuszczu u Drosophila

Przeglądaj więcej filmów