Name: Oparta na pływalności metoda określania poziomu tłuszczu u Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-01T11:15:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Poznaj metodę pływalnościową do szybkiego określania poziomu tłuszczu u larw Drosophila melanogaster. Ta technika umożliwia ekonomiczne i powtarzalne badanie zmian magazynowania lipidów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

K.E.H. był wspierany przez Training Grant in Molecular Biology NIH-T32-GM08730. Praca ta była wspierana przez NIH, NIDDK Grant 5K01DK095932 i AHA Award 12BGIA11930014 dla T.R.

1. Zbieraj jaja od much o interesujących genotypach
UWAGA: Idealne krzyżówki składają się ze 150 dziewiczych much i co najmniej 75 samców. Kolekcje stockowe powinny składać się z co najmniej 200 much.
<ol>
	<li>Przygotuj talerze z winogronami.
	<ol>
		<li>Dodać 37,5 g agaru do 1,5 l wody destylowanej w kolbie o pojemności 4 l.</li>
		<li>Mieszaj wodę i agar w autoklawie przez 50 minut w temperaturze 121 ºC (250 ºF).</li>
		<li>Podczas autoklawowania mieszaniny wody i agaru dodaj 50 g sacharozy do 500 ml soku winogronowego i mieszaj mieszadłem na rozgrzanej płytce mieszającej, aż sacharoza się rozpuści.</li>
		<li>Wyłącz ogień i kontynuuj mieszanie, aby schłodzić mieszaninę soku winogronowego i sacharozy do temperatury poniżej 70 °C. Sprawdzić temperaturę wewnętrzną za pomocą termometru alkoholowego.</li>
		<li>Dodać 3 g środka przeciwgrzybiczego Drosophila (np. Tegosept) do ciepłej mieszanki soku winogronowego i sacharozy i mieszać do rozpuszczenia.</li>
		<li>Gdy mieszanina wody i agaru zostanie wyjęta z autoklawu, pozwól kolbie ostygnąć w dotyku, od czasu do czasu obracając.</li>
		<li>Połącz mieszaninę wody/agaru i mieszaninę soku winogronowego/sacharozy i mieszaj, aż dobrze się wymieszają.</li>
		<li>Za pomocą pipety serologicznej dodaj 8 - 10 ml mieszanki winogron do pokrywki małej płytki Petriego (35 x 10 mm). Pozwól, aby mieszanina ukoronowała się wyżej niż wysokość ścianek pokrywy, aby utworzyć wypukły kształt.</li>
		<li>Pozostawić talerze winogronowe do ostygnięcia przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, a następnie przechowywać w hermetycznym pojemniku w temperaturze 4 ºC.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj pastę drożdżową.
	<ol>
		<li>Dodać 6 ml buforowego roztworu fosforanowego (PBS) do 4 g żywych aktywnych suszonych drożdży w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i mieszać szpatułką do uzyskania gładkiej konsystencji.</li>
		<li>Pastę drożdżową przechowywać w temperaturze 4 ºC.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodaj małą porcję (około 1/8 łyżeczki) pasty drożdżowej na środek talerza winogronowego. Wygładź wszelkie ostre krawędzie szpatułką.</li>
	<li>Umieść talerze winogronowe w inkubatorze, aż osiągną temperaturę otoczenia.</li>
	<li>Przenieś interesujące muchy do komory zbierania jaj i połóż na wierzchu talerz winogronowy z pastą drożdżową skierowaną do wewnątrz. Przyklej talerz winogronowy do komory na jajka, aby uniknąć wypadnięcia talerza. Upewnij się, że zapisałeś ważne informacje o genotypie i dacie na spodzie talerza z winogronami.</li>
	<li>Odwróć komorę na jajka, aby muchy mogły złożyć jaja na talerzu winogronowym.</li>
	<li>Umieścić pudełko lub pokrywę nad komorami do zbierania jaj i umieścić je w inkubatorze w temperaturze 25 °C.</li>
	<li>Pozwól muchom złożyć jaja przez 4 - 6 godzin.</li>
	<li>Zakończ zbieranie, wyjmując talerz winogronowy z komory na jaja i przenosząc muchy z powrotem do butelki z jedzeniem. Za pomocą szpatułki zetrzyj nadmiar pasty drożdżowej z talerza winogronowego. Przechowywać talerz winogronowy na większej szalce Petriego w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 25 ºC przez ~ 24 godziny.</li>
</ol>
2. Przenieś larwy do eksperymentalnego pokarmu
<ol>
	<li>Przygotuj eksperymentalne jedzenie. 
	UWAGA: Ten przepis na jedzenie jest oparty na przepisie18 z centrum zapasów Bloomington. Do ważnych zmian należy zwiększenie ilości drożdży w celu optymalizacji wartości odżywczej żywności ocenianej na podstawie czasu etapu wędrówki (między 112 a 120 godzinami po zebraniu jaj w temperaturze 25 ºC). Chociaż stwierdziliśmy, że ta receptura jest idealna dla zdrowia i rozwoju naszych eksperymentalnych larw, każda receptura żywieniowa jest dopuszczalna pod warunkiem kalibracji z kontrolami pozytywnymi i negatywnymi, których przykłady wymieniono w kroku 3.10.
	<ol>
		<li>Odmierzyć 1 600 ml wody destylowanej.</li>
		<li>Wymieszaj 134 g mąki kukurydzianej, 10,6 g Drosophila Agar Type II i trochę wody (~ 500 ml) w zlewce o pojemności 1 l. Miksuj przez 2 minuty za pomocą zmotoryzowanego miksera ręcznego.</li>
		<li>Wymieszaj 70 g żywych aktywnych suchych drożdży, 18,4 g mąki sojowej, 84,8 g ekstraktu słodowego i trochę wody (~ 500 ml) w kolejnej 1 litrowej zlewce. Miksuj przez 2 minuty za pomocą zmotoryzowanego miksera ręcznego.</li>
		<li>Zamieszaj każdą zlewkę i przelej do kolby o pojemności 4 l. Użyć pozostałej wody do wypłukania zlewek i dodać do kolby.</li>
		<li>Odmierz 140 ml jasnego syropu kukurydzianego i dodaj do kolby, mieszając.</li>
		<li>Autoklaw przez 50 minut w temperaturze 121 ºC (250 ºF) w stanie płynnym.</li>
		<li>Po sterylizacji w autoklawie wlać żywność do 4-litrowej zlewki i pozostawić do ostygnięcia. Wspomóż proces chłodzenia, mieszając go za pomocą zmotoryzowanego miksera ręcznego.</li>
		<li>Gdy kolba ostygnie na tyle, że można jej dotknąć, dodać 8,8 ml kwasu propionowego i 16,8 ml roztworu przeciwgrzybiczego Drosophila/etanolu. Dobrze wymieszaj. (Przygotować roztwór środka przeciwgrzybiczego Drosophila, dodając 380 g środka przeciwgrzybiczego Drosophila do 1 litra etanolu o 200 proof i mieszając na ciepłym talerzu aż do rozpuszczenia, upewniając się, że roztwór nie przekracza 70 °C.)</li>
		<li>Wlać pokarm do fiolek, aż pokarm osiągnie głębokość około 1 cala i pozostawić do ostygnięcia w temperaturze pokojowej przez 2 - 3 godziny. Zatkać fiolki i przechowywać w inkubatorze w temperaturze 25 °C. Zużyć w ciągu tygodnia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zanurz kilkakrotnie szpatułkę w górnej warstwie fiolki z jedzeniem, aby ją naciąć. Pomoże to larwom zakopać się i żerować.</li>
	<li>22 - 24 godziny po zakończeniu zbierania jaj użyj małego pędzla, aby zebrać 50 larw pierwszego stadium (L1) o tej samej przybliżonej wielkości. Umieść larwy w eksperymentalnym pokarmie. Wyczyść pędzel chusteczką laboratoryjną i upewnij się, że na pędzlu nie pozostały żadne larwy, zanim przejdziesz do innego genotypu.</li>
	<li>Umieścić fiolkę z larwami w inkubatorze w temperaturze 25 °C i pozostawić do rozwoju.</li>
</ol>
3. Określ poziom tłuszczu u larw
<ol>
	<li>Przygotuj rozwiązania.
	<ol>
		<li>Przygotuj 1 l bulionu 10x PBS.
		<ol>
			<li>Dodać 80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na2HPO4 i 2,4 g KH2PO4 do 800 ml wody w zlewce o pojemności 2 l. Mieszaj bez ognia, aż wszystkie sole się połączą. Doprowadzić pH do 7,4. Zwiększ objętość do 1 l wodą.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotuj 2 L 1x PBS. Dodać 200 ml 10 PBS roztworu podstawowego do 1 800 ml wody.</li>
		<li>Użyj tego zapasu 1x PBS, aby uzyskać 20% w/v sacharozy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyjąć fiolkę z larwami z inkubatora, gdy po bokach fiolki pojawi się 20-40 larw (zwykle piątego dnia po pobraniu jaj). Należy zanotować datę i godzinę testu, a także liczbę wędrujących larw.</li>
	<li>Przygotować roztwór doświadczalny, dodając 11,5 ml PBS i 9 ml 20% sacharozy do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Dodaj 20% sacharozy do fiolki, aż znajdzie się 0,5 - 1 cala od górnej części fiolki.</li>
	<li>Użyj szpatułki, aby delikatnie wymieszać górną warstwę pokarmu, aby uwolnić larwy, które nadal grzebią się w żywności. Wszystkie larwy wydostaną się na powierzchnię roztworu sacharozy.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy delikatnie przenieś larwy do początkowego stężenia sacharozy z kroku 3.3.</li>
	<li>Użyj szpatułki, aby delikatnie wymieszać larwy w tym roztworze.</li>
	<li>Zakryj stożkową rurkę i odwróć kilka razy, aby dokładnie wymieszać roztwór.</li>
	<li>Rozkręć stożkową rurkę i zakręć, aby utworzyć delikatny wir.</li>
	<li>Pozwól larwom się uspokoić, unosząc się na wierzch roztworu lub opadając na dno. Odczekaj 2 - 5 minut, aż larwy się usiądą. 
	UWAGA: Jeśli nadal istnieją larwy, które nie są na pewno ani pływające, ani tonące, wybierz linię, której chcesz użyć jako punktu odcięcia, aby oznaczyć larwy jako pływak lub ciężarek. Zastosuj to samo kryterium do wszystkich genotypów. Jako granicy używamy kąta na dole stożkowej rury. Larwy z mutacją ADP lub SIR217 mogą być stosowane jako kontrola dodatnia, a mutanty LSD219 mogą być używane jako kontrola ujemna do kalibracji testu.</li>
	<li>Zanotować liczbę pływających larw i badane stężenie właściwe.</li>
	<li>Dodać 1 ml 20% sacharozy do roztworu doświadczalnego, aby zwiększyć jego gęstość.</li>
	<li>Powtórz kroki od 3.7 do 3.10. Zapisz liczbę pływających larw i to nowe stężenie.</li>
	<li>Kontynuuj kroki 3.12 i 3.13 do momentu, gdy co najmniej 95% larw zacznie unosić się na wodzie.</li>
	<li>Użyj kleszczy, aby zebrać wszystkie larwy do naczynia preparacyjnego wypełnionego PBS.</li>
	<li>Obserwuj larwy pod mikroskopem i zwróć uwagę, czy są jakieś małe larwy, pre-poczwarki, poczwarki lub jakiekolwiek inne różnice między genotypami. 
	UWAGA: Idealnie, wszystkie larwy powinny wydawać się jednorodne i na tym samym etapie rozwoju. Zaobserwowaliśmy tylko spójne pomiary tłuszczu w tych warunkach.</li>
	<li>Zapisać całkowitą liczbę larw.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy przenieś 10 larw do chusteczki laboratoryjnej do wyschnięcia. Oznacz probówkę do mikrowirówki i umieść w niej 10 larw.</li>
	<li>Błyskawiczne zamrożenie larw w ciekłym azocie. Przechowywać probówkę w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>

<ol><li>Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila%2C+the+golden+bug%2C+emerges+as+a+tool+for+human+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics.</a> Nat Rev Genet. 6, 9-23 (2005).</li>
<li>Liu, Z., Huang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+metabolism+in+Drosophila+development+and+disease+Using+Drosophila+System+to+Study+Lipid+Metabolism+Lipids+Function+in+Drosophila+Early+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochim+Biophys+Sin%22%5BJournal%5D)">Lipid metabolism in Drosophila development and disease Using Drosophila System to Study Lipid Metabolism Lipids Function in Drosophila Early Development.</a> Acta Biochim Biophys Sin. 45 (1), 44-50 (2013).</li>
<li>Ruden, D. M., Lu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+conservation+of+metabolism+explains+howDrosophila+nutrigenomics+can+help+us+understand+human+nutrigenomics%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Nutr%22%5BJournal%5D)">Evolutionary conservation of metabolism explains howDrosophila nutrigenomics can help us understand human nutrigenomics.</a> Genes Nutr. 1 (2), 75-84 (2006).</li>
<li>Wolf, M. J., Rockman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila%2C+genetic+screens%2C+and+cardiac+function%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Drosophila, genetic screens, and cardiac function.</a> Circ. Res. 109, 794-806 (2011).</li>
<li>Trinh, I., Boulianne, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+obesity+and+its+associated+disorders+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Modeling obesity and its associated disorders in Drosophila.</a> Physiology (Bethesda). 28 (2), 117-124 (2013).</li>
<li>Azeez, O. I., Meintjes, R., Chamunorwa, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fat+body%2C+fat+pad+and+adipose+tissues+in+invertebrates+and+vertebrates%3A+the+nexus%5BTitle%5D)+AND+%22Lipids+Health+Dis%22%5BJournal%5D)">Fat body, fat pad and adipose tissues in invertebrates and vertebrates: the nexus.</a> Lipids Health Dis. 13, 71(2014).</li>
<li>Dourlen, P., Sujkowski, A., Wessells, R., Mollereau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+transport+proteins+in+disease%3A+New+insights+from+invertebrate+models%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Fatty acid transport proteins in disease: New insights from invertebrate models.</a> Prog. Lipid Res. 60, 30-40 (2015).</li>
<li>Hildebrandt, A., Bickmeyer, I., Kühnlein, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliable+Drosophila+body+fat+quantification+by+a+coupled+colorimetric+assay%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Reliable Drosophila body fat quantification by a coupled colorimetric assay.</a> PLoS One. 6 (9), e23796(2011).</li>
<li>Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+metabolism+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for studying metabolism in Drosophila.</a> Methods. 68, 105-115 (2014).</li>
<li>Al-Anzi, B., Zinn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+measurement+of+triglycerides+cannot+provide+an+accurate+measure+of+stored+fat+content+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Colorimetric measurement of triglycerides cannot provide an accurate measure of stored fat content in Drosophila.</a> PLoS One. 5 (8), e12353(2010).</li>
<li>Thanh, N. T. K., Stevenson, G., Obatoml, D., Bach, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+Lipids+in+Animal+Tissues+by+High-Performance+Thin-Layer+Chromatography+with+Densitometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Planar+Chromatogr%22%5BJournal%5D)">Determination of Lipids in Animal Tissues by High-Performance Thin-Layer Chromatography with Densitometry.</a> J. Planar Chromatogr. 13, 375-381 (2000).</li>
<li>Borrull, A., Lopez-Martinez, G., Poblet, M., Cordero-Otero, R., Rozes, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+the+separation+and+quantification+of+neutral+lipid+species+using+GC-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Lipid+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">A simple method for the separation and quantification of neutral lipid species using GC-MS.</a> Eur. J. Lipid Sci. Technol. 117, 274-280 (2015).</li>
<li>Shui, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+one+step+analysis+of+cellular+lipidomes+using+liquid+chromatography+coupled+with+mass+spectrometry%3A+application+to+Saccharomyces+cerevisiae+and+Schizosaccharomyces+pombe+lipidomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Toward one step analysis of cellular lipidomes using liquid chromatography coupled with mass spectrometry: application to Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe lipidomics.</a> Mol. Biosyst. 6, 1008-1017 (2010).</li>
<li>Farvid, M. S., Ng, T. W. K., Chan, D. C., Barrett, P. H. R., Watts, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+adiponectin+and+resistin+with+adipose+tissue+compartments%2C+insulin+resistance+and+dyslipidaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes.+Obes.+Metab%22%5BJournal%5D)">Association of adiponectin and resistin with adipose tissue compartments, insulin resistance and dyslipidaemia.</a> Diabetes. Obes. Metab. 7 (4), 406-413 (2005).</li>
<li>Urbanchek, M. G., Picken, E. B., Kalliainen, L. K., Kuzon, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+force+deficit+in+skeletal+muscles+of+old+rats+is+partially+explained+by+the+existence+of+denervated+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gerontol.+A.+Biol.+Sci.+Med.+Sci%22%5BJournal%5D)">Specific force deficit in skeletal muscles of old rats is partially explained by the existence of denervated muscle fibers.</a> J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 56A (5), B191-B197 (2001).</li>
<li>Mosher, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+between+Drosophila+Arc1+and+a+specific+population+of+brain+neurons+regulates+organismal+fat%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Coordination between Drosophila Arc1 and a specific population of brain neurons regulates organismal fat.</a> Dev. Biol. 405 (2), 280-290 (2015).</li>
<li>Reis, T., van Gilst, M. R., Hariharan, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+buoyancy-based+screen+of+drosophila+larvae+for+fat-+storage+mutants+reveals+a+role+for+Sir2+in+coupling+fat+Storage+to+Nutrient+Availability%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">A buoyancy-based screen of drosophila larvae for fat- storage mutants reveals a role for Sir2 in coupling fat Storage to Nutrient Availability.</a> PLoS Genet. 6 (11), e1001206(2010).</li>
<li>Current Bloomington Recipe for Drosophila Medium. , Bloomington Drosophila Stock Center at Indiana University. Available from:
 <a target="_blank" href="http://flystocks.bio.indiana.edu/Fly_Work/media-recipes/bloomfood.htm">http://flystocks.bio.indiana.edu/Fly_Work/media-recipes/bloomfood.htm</a> (2014).</li>
<li>Teixeira, L., Rabouille, C., Rørth, P., Ephrussi, A., Vanzo, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Perilipin%2FADRP+homologue+Lsd2+regulates+lipid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Drosophila Perilipin/ADRP homologue Lsd2 regulates lipid metabolism.</a> Mech. Dev. 120 (9), 1071-1081 (2003).</li>
<li>Perez, C. L., Van Gilst, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+13C+Isotope+Labeling+Strategy+Reveals+the+Influence+of+Insulin+Signaling+on+Lipogenesis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">A 13C Isotope Labeling Strategy Reveals the Influence of Insulin Signaling on Lipogenesis in C. elegans.</a> Cell Metab. 8, 266-274 (2008).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Istnieje wiele technik, które zostały opracowane do pomiaru poziomu lipidów 8-10. Jednak każda z tych metod ma pewne poważne wady, które są rozwiązywane przez test oparty na pływalności opisany powyżej. Po pierwsze, ten test jest niezwykle szybki. Badanie pełnego gradientu stężeń zajmuje nie więcej niż 30 - 60 minut. Jest to ogromny postęp w stosunku do większości obecnie stosowanych technik. Na przykład oznaczanie ilościowe lipidów przez stwardnienie rozsiane zajmuje 7-9 godzin na wyizol...

Drosophila melanogaster jest używana od ponad stu lat w badaniach genetycznych i innych podstawowych kwestiach biologicznych. W ciągu ostatnich kilku dekad stało się jasne, że Drosophila jest potężnym narzędziem w badaniu wielu chorób człowieka. Ponieważ 70-80% genów związanych z chorobami człowieka ma zidentyfikowany ortologmuchy 1-4, Drosophila zapewnia uproszczony, ale możliwy do przetłumaczenia system do badania złożonych chorób. Na takim badaniu skorzystał w szczególności metabolizm. Nie tylko genetyka metabolizmu jest dobrze zachowana między muchami a ludźmi, ale odpowiednie narządy i typy komórek są również bardzo podobne2,5. Na przykład ciało tłuszczowe muchy przechowuje zarówno triacyloglicerydy (TAG), jak i glikogen, funkcje analogiczne do tych pełnionych w wątrobie ssaków i białej tkance tłuszczowej6. Wykorzystanie Drosophila jako modelu otyłości u ludzi znacznie poprawiło naszą wiedzę na temat metabolizmu lipidów i genetyki otyłości7. Stadium rozwoju larwalnego jest szczególnie przydatne do badania segregacji składników odżywczych do przechowywania lub wykorzystania, ponieważ jest przeznaczone do żerowania i magazynowania energii do wykorzystania podczas poczwarki.
Obecnie istnieje wiele różnych metod ilościowych określania poziomu magazynowania tłuszczu u Drosophila. Najczęściej stosowaną metodą jest sprzężony test kolorymetryczny (CCA)8,9. CCA został opracowany do oznaczania poziomów TAG w ludzkiej surowicy i działa w oparciu o założenie, że glicerol uwolniony ze szkieletu trójglicerydów przejdzie kilka reakcji, ostatecznie powodując reakcję sprzężoną z redoks, w wyniku której powstaje kolorowy produkt. Następnie mierzy się absorbancję określonych długości fal światła w celu określenia początkowej ilości obecnego glicerolu. Jednak glicerol może być również uwolniony z mono- i diacyloglicerydów oprócz TAG i dlatego może nie być dokładną miarą zmagazynowanej tkanki tłuszczowej9. Co więcej, pigment oczu zmiażdżonych dorosłych much może zakłócać niektóre odczyty absorbancji i komplikować wyniki9,10. W związku z tym CCA musi towarzyszyć chromatografia cienkowarstwowa (TLC) i być przez nią zwalidowana, co pozwala na oddzielenie większości rodzin lipidów, które można określić ilościowo za pomocą densytometrii10,11. Jednak niektóre klasy lipidów, takie jak sterole, nie mogą być analizowane i muszą być oznaczone ilościowo w inny sposób12. Spektrometria mas (MS) jest dokładnym sposobem ilościowego oznaczania wszystkich klas głównych lipidów komórkowych12,13. Jednak procedury ekstrakcji lipidów niezbędne do analizy przez SM są zarówno czasochłonne (większość z nich zajmuje prawie cały dzień), jak i kosztowne. W tym artykule przedstawiamy alternatywną metodę szybkiego i taniego oznaczania poziomu tłuszczu w organizmie w larwach L3 Drosophila melanogaster.
Metoda przedstawiona poniżej wykorzystuje różnicę w gęstości między tkanką tłuszczową a tkanką beztłuszczową. Tkanka tłuszczowa ssaków ma gęstość około 0,9 g/ml14, a mięśnie szkieletowe gęstość 1,06 g/ml15. Różnica ta oznacza, że zwierzęta z większymi zapasami tłuszczu będą miały mniejszą gęstość niż zwierzęta z niższymi zapasami tłuszczu, co pozwoli im lepiej unosić się w roztworze o stałej gęstości. Ta właściwość pozwala na niezwykle szybkie przesiewanie dużej liczby zwierząt, a jednocześnie jest niedroga i nieinwazyjna. Analiza oparta na pływalności została wykorzystana zarówno do potwierdzenia fenotypów zmiany znanych regulatorów poziomu tłuszczu, jak i do identyfikacji nowych genetycznych i neurologicznych regulatorów otyłości16,17.

<table><tbody><tr><td>Bacto Agar</td><td>VWR</td><td>214030</td><td></td></tr><tr><td>Welch's Original 100% sok</td><td></td><td></td><td></td>winogronowy</tr><tr><td>sacharoza</td><td>Fisher</td><td>S512</td><td></td></tr><tr><td>Tegosept</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-259</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td></td><td></td><td>200 proof</td></tr><tr><td>Drożdże piekarskie</td><td>Fleichmann's</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Yellow Mączka kukurydziana</td><td>Quaker</td><td></td><td>Wzbogacony odkiełkowany</td></tr><tr><td>Drosophila Agar Typ II</td><td>Apex</td><td>66-104</td><td></td></tr><tr><td>Mąka sojowa</td><td>ADM Składniki specjalne</td><td>062-100</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt słodowy</td><td>Breiss</td><td>5748</td><td></td></tr><tr><td>Jasny syrop kukurydziany</td><td>Kwas propionowy Karo</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>U330-09</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher</td><td>50147491</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy</td><td>Sigma</td><td>P5655-100G</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu bezwodny</td><td>Fisher</td><td>S3933</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Fisher</td><td>P330-500</td><td></td></tr><tr><td>35 x 10 mm płytka Petriego</td><td>Fisher</td><td>08-757-100A</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Stożkowy</td><td>Fisher</td><td>50-869-569</td><td></td></tr></tbody></table>

oparta na pływalności metoda określania poziomu tłuszczu u drosophila

A Buoyancy-based Method of Determining Fat Levels in Drosophila

Drosophila melanogaster to kluczowy system eksperymentalny w badaniach nad regulacją tkanki tłuszczowej. Obecnie istnieje wiele technik pomiaru poziomu zmagazynowanego tłuszczu u Drosophila, ale większość z nich jest kosztowna i/lub pracochłonna i ma wyraźne ograniczenia. W tym miejscu przedstawiamy metodę szybkiego i taniego oznaczania poziomu tłuszczu w organizmie w larwach L3 Drosophila. Technika ta opiera się na różnicach w gęstości między tkanką tłuszczową a beztłuszczową i pozwala na szybkie wykrycie fenotypów tłuszczu i chudego ciała. Zweryfikowaliśmy dokładność tej metody przez porównanie z procentową zawartością tkanki tłuszczowej oznaczoną za pomocą neutralnej ekstrakcji lipidów i chromatografii gazowej sprzężonej ze spektrometrią mas (GCMS). Ponadto przedstawiamy szczegółowe protokoły pobierania i synchronizacji larw, a także odpowiednie receptury doświadczalne. Przedstawiona poniżej technika przezwycięża główne niedociągnięcia w najczęściej stosowanych metodach oznaczania ilościowego lipidów i zapewnia skuteczny sposób szybkiego i czułego badania przesiewowego larw L3 pod kątem fenotypów regulacji tłuszczu przy jednoczesnym zachowaniu integralności larw. Test ten ma szerokie zastosowanie w badaniu metabolizmu i regulacji tłuszczu za pomocą Drosophila.

Rysunek 1 przedstawia przykład tego, jak test oparty na wyporności może wykrywać zarówno większe, jak i mniejsze zasoby tłuszczu u genetycznie zmodyfikowanych larw. Rysunek 1A pokazuje, że pobudzenie lub wyciszenie określonego podzbioru neuronów (E347) w mózgu larwy indukuje odpowiednio mniejsze i większe zasoby tłuszczu. W obu przypadkach zastosowano tę samą kontrolę z tym samym tłem genetycznym. Rysunek 1B stanowi przykład tego, jak fen...

Tutaj prezentujemy metodę pomiaru poziomu tłuszczu w organizmie w trzecim stadium larwalnym (L3) Drosophila melanogaster. Metoda ta wykorzystuje stosunkowo niską gęstość tkanki tłuszczowej do różnicowania larw ze zmienionymi zapasami tłuszczu. Analiza oparta na pływalności jest cennym narzędziem do szybkich, powtarzalnych i ekonomicznych badań przesiewowych.

Oparta na pływalności metoda określania poziomu tłuszczu u Drosophila

Drosophila melanogaster is a key experimental system in the study of fat regulation. Numerous techniques currently exist to measure levels of stored fat ...

Ogólnym celem tego testu jest określenie wszelkich zmian w poziomach zapasów tłuszczu, które mogą być spowodowane zmianami genetycznymi, dietą lub leczeniem. Metody te mogą pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu metabolizmu, takie jak genetyczny lub neuronalny wpływ na predyspozycje do otyłości. Główną zaletą tej techniki jest to, że w porównaniu z innymi obecnie stosowanymi metodami jest ona szybka, ekonomiczna i bardzo powtarzalna.Osoby rozpoczynające pracę z tą metodą lub po raz pierwszy pracujące z larwami w stadium wędrownym mogą mieć trudności z tym protokołem, ponieważ harmonogram rozwojowy różnych genotypów może być bardzo zróżnicowany. Aby rozpocząć procedurę, nanieś niewielką ilość pasty drożdżowej na środek płytki z kratką. Wygładź wszelkie nierówności za pomocą szpachelki.Następnie przenieś wybrane muchy do komory do zbierania jaj i umieść na górze płytkę z kratką z pastą drożdżową, skierowaną do wewnątrz. Następnie przyklej płytkę z kratką do komory do zbierania jaj taśmą, aby zapobiec jej wypadnięciu. Pamiętaj, aby zapisać ważne informacje o genotypie i dacie na spodzie płytki z kratką.Następnie odwróć komorę do zbierania jaj, aby muchy mogły złożyć jaja na płytce z rastrem. Po tym czasie przykryj komorę do zbierania jaj otwartym pudełkiem i umieść ją w inkubatorze w temperaturze 25 degrees celsius na cztery do sześciu godzin, aby umożliwić muchom złożenie jaj. Po zakończeniu tego procesu wyjmij płytkę z rastrem z komory do zbierania jaj i przenieś muchy z powrotem do ich oryginalnej butelki z pożywką.Za pomocą szpatułki usuń nadmiar pasty drożdżowej z płytki kratowej. Następnie przechowuj płytkę kratową w większej szalce Petriego w inkubatorze z kontrolą wilgotności w temperaturze 25 degrees celsius przez 24 hours. W tej procedurze nacinaj górną warstwę pożywki, kilkukrotnie przebijając ją szpatułką, aby umożliwić larwom wgryzanie się i żerowanie.Od 22 do 24 godzin po zbiorze jaj użyj małego pędzelka, aby zebrać 50 larw pierwszego stadium o zbliżonej wielkości i umieść je w eksperymentalnej fiolce z pożywką. Bardzo ważne jest, aby do pożywki eksperymentalnej przenosić larwy o zbliżonej wielkości. Zapewni to ścisłą koordynację rozwoju larwalnego.Następnie oczyść pędzelek za pomocą chusteczki laboratoryjnej i upewnij się, że na pędzelku nie pozostały żadne larwy przed przejściem do kolejnego genotypu. Po tym etapie umieść fiolkę z larwami w inkubatorze w temperaturze 25 °C i pozostaw je do rozwoju. Wyjmij fiolkę z larwami z inkubatora, gdy od 20 do 40 larw zacznie wędrować w górę ścianek fiolki.Zanotuj datę i godzinę przeprowadzenia analizy oraz liczbę larw wędrujących. Następnie przygotuj roztwór eksperymentalny, dodając 11,5 milliliters PBS oraz dziewięć milliliters 20%sucrose do stożkowej probówki o pojemności 50 milliliter. Dolewaj 20%sucrose do fiolki, aż poziom cieczy znajdzie się jeden cal od górnej krawędzi fiolki.Za pomocą szpatułki delikatnie zamieszaj wierzchnią warstwę pożywki, aby uwolnić larwy, które wciąż się w niej zagłębiają. Wszystkie larwy wypłyną na powierzchnię roztworu sacharozy. Następnie ostrożnie przenieś larwy do początkowego roztworu sacharozy i delikatnie je zamieszaj.Podczas przenoszenia larw do roztworu eksperymentalnego należy uważać, aby ich nie ścisnąć ani nie przebić. Może to wpłynąć na wyniki analizy. Zakręć probówkę stożkową i odwróć ją kilka razy, aby dokładnie wymieszać roztwór.Następnie odkręć zakrętkę probówki stożkowej i zakręć nią, aby stworzyć delikatny wir. Odczekaj od dwóch do pięciu minut, aż larwy osiądą, wypływając na powierzchnię roztworu lub opadając na dno. Zapisz liczbę pływających larw oraz przetestowane stężenie sacharozy.Następnie do roztworu eksperymentalnego dodaje się 1 mL 20% sacharozy w celu zwiększenia jego gęstości. Następnie za pomocą szpatułki należy delikatnie zamieszać larwy. Po tym kroku zakręca się probówkę stożkową i kilkukrotnie odwraca ją do góry dnem, aby dokładnie wymieszać roztwór.Następnie należy odkręcić probówkę stożkową i zamieszać ją, aby utworzyć łagodny wir. Należy zapisać liczbę pływających larw oraz nowe stężenie. Proces ten należy kontynuować do momentu, aż co najmniej 95% larw będzie pływać.Dodać 20% sacharozy do probówki stożkowej, wypełniając ją do poziomu około 2,5 cm od górnej krawędzi. Następnie zebrać wszystkie larwy do naczynia sekcyjnego wypełnionego PBS. Obejrzeć larwy pod mikroskopem w celu wykrycia małych larw, przepoczwarek, poczwarek lub innych różnic między genotypami, aby upewnić się, że procedury zostały przeprowadzone prawidłowo.Następnie należy odnotować całkowitą liczbę larw. Po tym czasie przenieść 10 larw na chusteczkę laboratoryjną w celu osuszenia. Oznakować probówkę do mikrowirówki i umieścić w niej larwy.Następnie larwy należy zamrozić błyskawicznie w ciekłym azocie, a probówkę przechowywać w temperaturze -20 °C. Przedstawiono tutaj przykład tego, jak test oparty na wyporności może wykryć zarówno wyższy, jak i niższy poziom zgromadzonego tłuszczu w genetycznie zmodyfikowanych larwach. Rysunek ten pokazuje, że pobudzenie lub wyciszenie określonego podzbioru neuronów w mózgu larwy indukuje odpowiednio niższy i wyższy poziom zgromadzonego tłuszczu.W obu przypadkach zastosowano tę samą kontrolę o identycznym tle genetycznym. Poniżej przedstawiono przykład, w którym fenotyp uzyskany w teście gęstości zostaje potwierdzony poprzez ekstrakcję neutralnych lipidów i ich ilościowe oznaczenie metodą GCMS. Po opanowaniu techniki, przy prawidłowym przeprowadzeniu, badanie to można wykonać w ciągu 30 minut, a także równolegle dla innych genotypów.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby w miarę możliwości zsynchronizować rozwój larw doświadczalnych. Po zastosowaniu tej procedury larwy można gwałtownie zamrozić w ciekłym azocie, aby wykorzystać je w innych metodach, takich jak chromatografia gazowa sprzężona z spektrometrią mas, w celu uzyskania dodatkowych informacji, na przykład o specyficznych klasach typów lipidów w larwach. Po opracowaniu ta technika utorowała drogę badaczom metabolizmu do zbadania genetycznego i/lub neuronalnego wpływu na otyłość u Drosophila.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wiedzę na temat tego, jak szybko przeprowadzić przesiew genotypów pod kątem zmian w poziomach zgromadzonych tłuszczów.

a-buoyancy-based-method-of-determining-fat-levels-in-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film opisuje prostą metodę ilościowego oznaczania lokomocji muchy i pokazuje przeprowadzony test wspinaczki. Test wspinaczki muchowej jest ogólnym testem funkcji motorycznych, który opiera się na negatywnej odpowiedzi geotaksji.

Test wspinaczki muchowej: metoda testowania ogólnej lokomocji u Drosophila melanogaster

Naukowcy używają protokołu długości życia Drosophila do mierzenia, jak różne warunki eksperymentalne wpływają na długowieczność muszek i generowania krzywych przeżycia w tym procesie, aby określić ilościowo wyniki eksperymentu. Protokół próbki obejmuje test stosowany do badania wpływu narażenia na długowieczność substancji chemicznych zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego lub EDC, takich jak 17-α-etynyloestradiol (EE2).

Protokół długości życia dla Drosophila melanogaster: generowanie krzywych przeżycia w celu identyfikacji różnic w długości życia much

Drosophila melanogaster to potężny organizm modelowy do badania molekularnych podstaw regulacji długowieczności. W tym protokole omówione zostaną kroki związane z generowaniem powtarzalnego, populacyjnego pomiaru długowieczności, a także potencjalne pułapki i sposoby ich unikania.

Pomiar długości życia Drosophila melanogaster

Tutaj opisujemy metodę szybkiego i dokładnego pomiaru wydajności lotu u Drosophila, umożliwiając wysokoprzepustowe badania przesiewowe.

Ulepszona metoda dokładnego i szybkiego pomiaru charakterystyki lotu u Drosophila

Wprowadzenie małych cząsteczek do rozwijającego się zarodka Drosophila daje ogromne możliwości do charakteryzowania aktywności biologicznej nowych związków, leków i toksyn, a także do badania podstawowych ścieżek rozwojowych. Opisane tu metody nakreślają kroki, które pokonują naturalne bariery dla tego podejścia, rozszerzając użyteczność modelu zarodka Drosophila.

Metoda przenikania zarodków Drosophila do oznaczania aktywności drobnocząsteczkowej

Protokół opisuje prosty test do identyfikacji larw Drosophila melanogaster, które doświadczają niedotlenienia przy normalnym poziomie tlenu w atmosferze. Protokół ten pozwala odróżnić niedotlenione larwy od innych mutantów, które wykazują nakładające się fenotypy, takie jak powolność lub powolny wzrost.

Test kopania/tunelowania w celu wykrycia niedotlenienia u larw Drosophila melanogaster

Ten protokół ma na celu ocenę żywotności Drosophila na każdym etapie rozwoju, od zarodka do dorosłego osobnika. Metoda ta może być stosowana do określania i porównywania żywotności różnych genotypów lub warunków wzrostu.

Bezpośrednia i prosta metoda oceny żywotności Drosophila melanogaster od zarodka do dorosłego osobnika

Obecne metody pomiaru wrażliwości na alkohol u Drosophila są przeznaczone do testowania grup much. Przedstawiamy prosty, tani, wysokoprzepustowy test do oceny wrażliwości na sedację alkoholową u dużej liczby pojedynczych much. Metoda nie wymaga specjalistycznych narzędzi i może być wykonywana w dowolnym laboratorium przy użyciu powszechnie stosowanych materiałów.

Wysokoprzepustowa metoda pomiaru czasu sedacji alkoholowej u poszczególnych osobników Drosophila melanogaster

We wczesnym zarodku Drosophila wiele organelli jest ruchliwych. Zasadniczo można je obrazować na żywo za pomocą specjalnych sond fluorescencyjnych, ale skorupka jaja uniemożliwia bezpośrednie zastosowanie do zarodka. Protokół ten opisuje, w jaki sposób wprowadzić takie sondy za pomocą mikroiniekcji, a następnie analizować ruch organelli masowych za pomocą prędkości obrazu cząstek.

Wizualizacja zależnego od cytoszkieletu transportu organelli zawierających lipidy w zarodkach Drosophila

Tutaj opisano nieinwazyjne metody lokalizacji białek błony fotoreceptorowej i oceny zwyrodnienia siatkówki w oku złożonym Drosophila za pomocą fluorescencji eGFP.

Badanie transportu białek błonowych w komórkach fotoreceptorowych Drosophila przy użyciu białek znakowanych eGFP

Poznaj metodę pływalnościową do szybkiego określania poziomu tłuszczu u larw Drosophila melanogaster. Ta technika umożliwia ekonomiczne i powtarzalne badanie zmian magazynowania lipidów.

Oparta na pływalności metoda określania poziomu tłuszczu u Drosophila

Przeglądaj więcej filmów