Test pośredniej kokultury neuron-astrocyty: zestaw in vitro do szczegółowego badania interakcji neuron-glej

Ogólnym celem tego pośredniego testu kokultury jest zbadanie wpływu astrocytów na rozwój neuronów. Nasze laboratorium interesuje się rolą interakcji neuron-glej. Uważa się, że astrocyty przyczyniają się do tworzenia synaps, struktur łączących ośrodkowy układ nerwowy.

Aby zbadać ich rolę, zaprojektowaliśmy model in vitro, w którym możemy połączyć pierwotne astrocyty i pierwotne neurony embrionalne w oddzielnych przedziałach. Przedziały są połączone przepuszczalną membraną, która pozwala na analizę wymiany między oboma typami komórek. Korzystając z tego podejścia, byliśmy w stanie monitorować tworzenie się synaps przez okresy do czterech tygodni.

Ponadto za pomocą tego testu możliwe jest zbadanie indywidualnych ról astrocytów z jednej strony, a neuronów z drugiej. I wreszcie, możemy również bardziej szczegółowo zbadać sekretom naszych przedziałów komórkowych, który zawiera cząsteczki pośredniczące we wzajemnym wpływie obu przedziałów komórkowych w tym systemie. Ta metoda może dostarczyć wglądu w interakcje między neuronami a astrocytami.

Może być również stosowany do innych organizmów modelowych, takich jak komórki szczura. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą miały trudności, ponieważ wymagane jest doświadczenie, aby uzyskać optymalną operację dojrzewania tkanki hipokampa po sekcji. Aby wypreparować korę, usuń skórę z czaszki wzdłuż linii środkowej, zaczynając od szyi w górę w kierunku poziomu oczu.

Następnie przytrzymaj głowę za rostralny koniec za pomocą kleszczy i wykonaj nacięcie wzdłuż linii środkowej czaszki. Następnie odetnij lewą i prawą połowę czaszki, aby odsłonić mózg. Następnie podnieś mózg z czaszki i przenieś go na 10-centymetrową szalkę Petriego wypełnioną HBSS.

Postępuj w ten sam sposób z pozostałymi próbkami, aż wszystkie mózgi zostaną zebrane w naczyniu. Aby oddzielić korę, uszczypnij tylną część za pomocą kleszczy. Wykonaj nacięcie w linii środkowej między dwiema półkulami.

Ostrożnie przymocuj mózg i odetnij śródmózgowie i opuszkę węchową za pomocą drugiej pary kleszczy, co spowoduje powstanie dwóch połówek kory mózgowej. Następnie przymocuj jedną połówkę kory mózgowej za pomocą jednej pary kleszczy i oderwij opony, odrywając je od bocznej krawędzi. A następnie wyciąganie go z powierzchni kory mózgowej za pomocą drugiej pary kleszczy.

Ustaw połowę kory mózgowej tak, aby jej powierzchnia była skierowana w dół. Ostrożnie wypreparuj i usuń hipokamp w kształcie półksiężyca. Następnie przenieś korę do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.

Dodaj jeden ml denemu i 0,1% wv papainy do 2 ml probówki reakcyjnej. Zawiesinę inkubować w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż roztwór będzie klarowny. Dodaj L-cysteinę i DNAzę do mieszaniny i delikatnie wstrząśnij.

Następnie przefiltrować mieszaninę, aby uzyskać jeden ml sterylnego roztworu, a następnie dodać ją do tkanki korowej i inkubować przez 30 minut do jednej godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby zakończyć reakcję trawienia, dodaj jeden ml pożywki astrocytów i ostrożnie miareczkuj strawioną tkankę. Następnie dodać pięć ml pożywki astrocytów do zawiesiny komórek.

Gdy tkanka zostanie zdysocjowana na zawiesinę jednokomórkową, odwiruj ją przez pięć minut. Następnie ostrożnie odessać supernatant z powstałego osadu i ponownie zawiesić komórki w jednym ml pożywki astrocytowej. Dodać zawiesinę komórkową do kolb T75 uzupełnionych dziewięcioma ml pożywki dla astrocytów.

Po siedmiu dniach hodowli sprawdź, czy komórki utworzyły zlewającą się monowarstwę. Upewnij się, że temperatura jest ustawiona na 37 stopni Celsjusza, a filtr kolby jest uszczelniony folią laboratoryjną, aby zapobiec parowaniu dwutlenku węgla. Aby pozbyć się komórek progenitorowych i uzyskać czystą kulturę astrocytów, umieść kolby T75 na wytrząsarce orbitalnej i potrząsaj kulturami przez noc z prędkością 250 obrotów na minutę.

Następnego dnia odessać pożywkę i dodać 10 ml świeżej pożywki hodowlanej uzupełnionej 20 mikromolowymi RSE w celu wyeliminowania resztek dzielących się komórek. W tej procedurze umieść tyle wkładek, ile potrzeba w płytce 24-dołkowej. Pokryć każdą wkładkę 10 mikrogramami na ml poli d'lizyny i inkubować przez jedną godzinę.

Po godzinie umyj wkłady dwukrotnie PBS. W międzyczasie odessać pożywkę astrocytów i przemyć kulturę raz 10 ml PBS, aby upewnić się, że resztki surowicy zostały usunięte. Następnie dodaj trzy ml 0,05% trypsyny EDTA do kolb i inkubuj komórki do trypsynizacji przez około 10 minut.

Następnie delikatnie ponownie zawiesić komórki w siedmiu ml pożywki astrocytowej. Przenieść zawiesinę komórkową do probówki o pojemności 15 ml i odwirować przez pięć minut w sile 216 x g. Następnie ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w jednym ml pożywki astrocytowej.

Policz komórki za pomocą komory liczącej. Następnie napełnij 24-dołkową płytkę 500 mikrolitrami pożywki astrocytowej na dołek. Odessać PBS i przenieść 25 000 komórek i 500 mikrolitrów pożywki astrocytowej do każdej pojedynczej wkładki i inkubować kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Aby przeprowadzić sekcję hipokampów, przygotuj trzy 10-centymetrowe naczynia wypełnione pożywką i jedną probówkę o pojemności 2 ml z jednym ml pożywki. Wyciąć hipokampy z kory mózgowej i zebrać je do dwumililitrowej probówki wypełnionej preparatem. Bardzo ważne jest, aby hipokamp został odizolowany bez przylegającej tkanki z innych regionów OUN.

Dlatego po usunięciu hipokampa obce tkanki zanieczyszczające muszą zostać dodatkowo usunięte. Po rozbiorze przenieść probówkę do sterylnego stanowiska z przepływem laminarnym. Ostrożnie usunąć pożywkę z preparatu i strawić tkankę hipokampa z jednego ml roztworu trawiącego zawierającego papainę.

Po 15 minutach trawienia ostrożnie odciągnij roztwór wytrawiający, delikatnie odsysając pipetą. Ze względu na wysoką czułość neuronu bardzo ważne jest, aby ostrożnie miareczkować hipokamp, aby uniknąć pęcherzyków i uzyskać optymalną intensywność miareczkowania. Przemyj hipokampy trzykrotnie pożywką neuronową, dodając i ostrożnie odsysając jeden ml świeżej pożywki hodowlanej na cykl mycia.

Po ostatnim etapie płukania ostrożnie miareczkować tkankę w jednym ml pożywki neuronowej. Następnie policz komórki za pomocą komory liczącej. Umieść 35 000 komórek w 500 mikrolitrach pożywki neuronowej na dołek 24-dołkowej płytki i inkubuj neurony w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę.

Teraz wyjmij z inkubatora przygotowane wkładki, które zostały wysiane zlewającymi się monowarstwami astrocytów. Wymień pożywkę, odsysając pożywkę astrocytów i zastępując ją 500 mikrolitrami świeżej pożywki neuronowej. Następnie ostrożnie umieść wkładki z astrocytami w studzienkach zawierających kultury neuronów za pomocą sterylnych kleszczy.

Następnie umieść powstałą pośrednią kokulturę astrocytów neuronów z powrotem w inkubatorze do czasu eksperymentów. Ten obraz przedstawia monowarstwy utworzone przez astrocyty na błonie wstawiania hodowli komórkowej. Astrocyty są wybarwione immunologicznie pod kątem GFAP i MMP2.

Przedstawiony tu schemat ilustruje pośrednią konfigurację kokultury. Chociaż dwie kultury są fizycznie oddzielone, dzielą to samo medium. Dwa wydzielane molekularne mediatory interakcji glejowych neuronów ujawniają się w pożywce do hodowli CO przy użyciu western blot z wieloma izoformami TNC, bezpośredniego regulatora wzrostu i MMP2, modyfikatora macierzy pozakomórkowej.

To zdjęcie pokazuje, że pierwotne neurony rozwijają wysoce połączone sieci do 14 dnia uprawy. Kolokalizacja fagotu markera presynaptycznego z postsynaptycznym rusztowaniem PSD95 dokumentuje strukturalnie zakończoną formację synaptyczną. Podsumowując, korzystając z naszego systemu testów, wykazaliśmy, że możliwe jest połączenie pierwotnych astrocytów i pierwotnych neuronów w modelu kokultury.

Oba nadtypy są rozdzielone, ale mają ten sam nośnik. W związku z tym możemy również zbadać sekretom obu nadtypów w naszym modelu. W tym modelu synapsy rozwijają się i dojrzewają.

Co więcej, możemy również pokazać pojawianie się dodatkowych specyficznych struktur, takich jak sieci okołoneuronalne. W związku z tym nasz system modelowy doskonale nadaje się do badania wpływu astrocytów na powstawanie, plastyczność i funkcję synaps.