Name: Test pośredniej kokultury neuron-astrocyty: zestaw in vitro do szczegółowego badania interakcji neuron-glej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: Poznaj metodę pośredniej kokultury neuron-astrocyty do badania interakcji neuron-glej in vitro. Ten protokół umożliwia analizę wpływu astrocytów na rozwój neuronów i formowanie synaps.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Obecna praca była wspierana przez niemiecką fundację badawczą (Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG: GRK 736, Fa 159/22-1; szkołę badawczą Uniwersytetu Ruhry w Bochum (GSC98/1) oraz program priorytetowy SSP 1172 "Glej i synapsa", Fa 159/11-1,2,3).

Eksperymenty na myszach były zgodne z niemieckim prawem i wytycznymi niemieckiego Towarzystwa Neurologicznego dotyczącymi hodowli zwierząt. Komisje ds. opieki nad zwierzętami i ich utylizacji Uniwersytetu Ruhry w Bochum udzieliły odpowiednich zezwoleń.
1. Przygotowanie i hodowla astrocytów korowych
Uwaga: Wykonaj te kroki protokołu co najmniej 7 dni przed przejściem do następnych kroków, ponieważ kultury astrocytów powinny przekształcić się w zlewające się monowarstwy zanim neurony zostaną przygotowane. Astrocyty pierwotne pochodzą z mieszanych kultur glejowych uzyskanych od młodych myszy około dnia pourodzeniowego (P) 0-3. Na każdą kolbę T75 należy użyć trzech mózgów (6 kory) do zainstalowania zębów.
<ol>
	<li>Przygotuj pożywkę astrocytów, uzupełniając zmodyfikowaną pożywkę Eagle (DMEM) firmy Dulbecco 10% v/v surowicy końskiej i 0,1% v/v gentamycyny w sterylnych warunkach. Przechowywać podłoże w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni.</li>
	<li>Pokryć 3 kolby T75 10 μg/ml poli-D-lizyny (PDL; w wodzie przeznaczonej do hodowli komórkowych) przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze 37 °C w obecności 6% v/v CO2 . Po pokryciu należy dwukrotnie przemyć kolby solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) w celu usunięcia niezwiązanych kationów i dodać 9 ml pożywki astrocytowej.</li>
	<li>Aby przygotować mózgi, dodaj 10 ml zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS) do 1x 10 cm szalki Petriego i 1 ml HBSS do 1x 15 ml probówki (niezależnie od liczby mózgów, które zostaną użyte). Trzymaj nożyczki chirurgiczne, 2 cienkie kleszcze i lornetkę w zasięgu ręki podczas zabiegu.</li>
	<li>Szybko odetnij 3 szczenięta nożyczkami chirurgicznymi i zbierz głowy do pustego 10-centymetrowego naczynia.
	<ol>
		<li>Wykonaj przygotowanie kory mózgowej pod lornetką. Za pomocą dwóch cienkich kleszczy usuń skórę grzbietową z czaszki w linii środkowej, zaczynając od szyi w górę w kierunku poziomu oczu. Następnie mózg z naczyniami krwionośnymi jest widoczny pod czaszką.</li>
		<li>Przymocuj głowę na końcu rostralnym za pomocą kleszczy i naciąć linię środkową czaszki, zaczynając od tylnego końca. Następnie odetnij prawą i lewą połowę czaszki, aby odsłonić mózg.</li>
		<li>Zamknij końcówkę kleszczy i umieść ją brzusznie pod mózgiem. Wyjmij mózg z czaszki i przenieś go na wypełnioną HBSS 10-centymetrową szalkę Petriego. Postępuj w ten sam sposób z pozostałą próbką, aż wszystkie mózgi zostaną zebrane w naczyniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po zebraniu mózgów zacznij od oddzielenia kory mózgowia, ściskając tyłomózgowie za pomocą kleszczy, takich jak nożyczki. Wykonaj nacięcie w linii środkowej między dwiema półkulami za pomocą jednej pary kleszczy. Ostrożnie przymocuj mózg kleszczami i odetnij śródmózgowie i opuszki węchowe za pomocą drugiego kleszcza, aby uzyskać połówki kory mózgowej.</li>
	<li>Przymocuj jedną połowę kory mózgowej za pomocą jednej pary kleszczy i oderwij opony mózgowe od półkul, odrywając je od bocznej krawędzi, a następnie wyciągając je z powierzchni kory za pomocą drugich kleszczy.</li>
	<li>Odwróć połowę kory mózgowej z powierzchnią skierowaną w dół w kierunku naczynia; ostrożnie wypreparuj i usuń hipokamp w kształcie półksiężyca za pomocą jednej pary kleszczy. Przenieś pojedyncze kory do stożkowej probówki o pojemności 15 ml za pomocą jednego zamkniętego kleszcza do przenoszenia pojedynczej kory.</li>
	<li>Po zebraniu całej kory należy przejść do sterylnego okapu z przepływem laminarnym i rozpocząć przygotowania do dysocjacji tkanki korowej.</li>
	<li>Dodaj 1 ml DMEM do probówki reakcyjnej o pojemności 2 ml i dodaj 0,1% w/v papainy (30 jednostek). Inkubować zawiesinę w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C aż do uzyskania oczyszczonego roztworu (około 3 min). Dodać 0,24 mg/ml L-cysteiny i 20 μg/ml DNAzy i delikatnie wstrząsnąć. 
	UWAGA: Do trawienia potrzeba około 1 ml roztworu enzymatycznego.</li>
	<li>Przefiltrować (wielkość porów 0,22 μm), aby uzyskać 1 ml sterylnego roztworu przed dodaniem go do tkanki korowej. Inkubować probówki przez 30 minut - 1 godzinę w temperaturze 37 °C (tj. w łaźni wodnej). 
	UWAGA: Kroki 1.11 - 1.14 są krytyczne i powinny zostać wykonane w ciągu 15 minut.</li>
	<li>Aby zakończyć reakcję trawienia, dodaj 1 ml pożywki astrocytów i ostrożnie rozdrobnij strawioną tkankę za pomocą pipety o pojemności 1 ml. W celu roztarcia delikatnie przesunąć tłok pipety, zasysając w ten sposób i wytłaczając zawiesinę tkanki korowej.</li>
	<li>Po dysocjacji tkanki do zawiesiny jednokomórkowej dodać 5 ml pożywki astrocytowej i wirować przez 5 minut przy 216 x g.</li>
	<li>Ostrożnie odessać supernatant z powstałego osadu i ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki astrocytowej.</li>
	<li>Dodać zawiesiny komórkowe do kolb T75 uzupełnionych 9 ml pożywki astrocytów (patrz 1.2).</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze w obecności 6% v/v CO2 . Po 4 dniach należy przeprowadzić pierwszą pełną wymianę podłoża (10 ml). Następnie zmieniaj pożywkę co 2 - 3 dni.</li>
	<li>Po 7 dniach sprawdź, czy komórki utworzyły zlewającą się monowarstwę. Jeśli nie, poczekaj kolejne 2 - 3 dni, aż zostanie osiągnięte całkowite zlanie się kultury. 
	UWAGA: Astrocyty mają duże, spłaszczone ciała komórkowe, lokalizują się na dnie kolby i nie rozwijają zauważalnych procesów komórkowych. Różnią się one od małych jasnych komórek progenitorowych z kontrastem fazowym i mikrogleju znajdującego się na wierzchu monowarstwy17.</li>
	<li>W celu pozbycia się komórek progenitorowych i uzyskania czystej kultury astrocytów, należy umieścić kolby T75 na wytrząsarce orbitalnej i wstrząsnąć kulturami O/N z prędkością 250 obr./min. Upewnić się, że temperatura jest ustawiona na 37 °C i że filtr kolby jest uszczelniony folią laboratoryjną w celu zapobieżenia parowaniu CO2 .</li>
	<li>Następnego dnia odessać pożywkę i dodać 10 ml świeżej pożywki hodowlanej uzupełnionej 20 μM cytozyno-1-β-D-arabinofuranozydu (AraC) w celu wyeliminowania resztek dzielących się komórek. 
	UWAGA: inkubacja z AraC przez 2 - 3 dni w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 6% CO2 da w wyniku czystą hodowlę astrocytów.</li>
	<li>Monitoruj czystość kultur astrocytów poprzez oględziny pod mikroskopem świetlnym. Jeśli resztkowe jasne komórki progenitorowe z kontrastem fazowym i mikroglej nadal znajdują się na wierzchu monowarstwyastrocytarnej 17 (patrz krok 1.16), powtórz kroki 1.18 i 1.19. 
	UWAGA: Zlewające się i czyste monowarstwy astrocytów można utrzymywać do 14 dni w inkubatorze (37 °C, 6% v/v CO2) przed przejściem do następnego kroku. Zmieniaj połowę podłoża co 3 dni. Nie zbieraj, nie zamrażaj i nie rozmrażaj astrocytów, ponieważ komórki te stracą swoje właściwości neuronalne w wyniku procedury przechowywania.</li>
</ol>
2. Przygotowanie astrocytów do kokultury pośredniej
Uwaga: 48 - 72 godziny przed przygotowaniem neuronów, przenieś astrocyty do wkładek do hodowli komórkowych. Ogólnie rzecz biorąc, pojedyncza kolba T75 dostarcza wystarczającą liczbę komórek, aby podtrzymać kultury neuronalne uzyskane za pomocą jednego preparatu.
<ol>
	<li>Umieść tyle wkładek, ile potrzeba, w płytkach 24-dołkowych. Pokryj każdą wkładkę 10 μg/ml PDL (rozpuszczonym w wodzie do hodowli komórkowych) przez około 1 godzinę w temperaturze 37 °C, 6% v/v CO2 . Po inkubacji należy dwukrotnie przemyć wkładki PBS. W międzyczasie przystąp do przygotowania astrocytów. 
	UWAGA: Wkładki wypełnione PBS można przechowywać do momentu, gdy zawiesina komórek astrocytów będzie gotowa do użycia.</li>
	<li>Odessać pożywkę astrocytów (za pomocą AraC) i przemyć kulturę jednorazowo 10 ml PBS, aby upewnić się, że wszelkie pozostałości surowicy zostały usunięte.</li>
	<li>Dodać 3 ml 0,05% trypsyny-EDTA (kwasu etylenodiaminotetraoctowego) do kolb i inkubować komórki do trypsynizacji w temperaturze 37 °C, 6% v/v CO2 przez około 10 minut.</li>
	<li>Kontroluj odrywanie komórek poprzez oględziny za pomocą mikroskopu i ułatwiaj odłączanie komórek, stukając bokiem kolb o pulpit. 
	UWAGA: Kroki 2.5 - 2.8 są krytyczne i powinny zostać zakończone w ciągu 15 - 20 minut.</li>
	<li>Po trypsynizacji delikatnie ponownie zawiesić komórki w pożywce astrocytowej o pojemności 7 ml i przenieść zawiesinę komórkową do probówki o pojemności 15 ml. Wirować przez 5 minut przy 216 x g.</li>
	<li>Ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki dla astrocytów.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą komory liczącej.</li>
	<li>Wypełnij dno studzienek 24-dołkowej płytki 500 μl pożywki astrocytowej i przenieś 25 000 komórek z 500 μl pożywki astrocytowej do każdej pojedynczej wkładki. Inkubować kulturę w temperaturze 37 °C, 6% v/v CO2, 
	UWAGA: Po 42 - 72 godzinach kultury osiągną około 100% zbieżności. Na tym etapie czystość kultury można zweryfikować za pomocą immunocytochemii11. Zlewające się kultury można utrzymywać do 7 dni, aż do przejścia do następnego kroku. Zmieniaj połowę podłoża co 3 dni.</li>
</ol>
3. Przygotowanie pierwotnych neuronów hipokampa
Uwaga: Pierwotne neurony hipokampa myszy powinny pochodzić z zarodków E15.5 - E16 ciężarnych myszy.
<ol>
	<li>Przygotować pożywkę neuronową (MEM z 10 mM pirogronianu sodu, 0,1% w/v albuminy jaja kurzego, 2% v/v suplementu B27 i 0,1% v/v gentamycyny (sterylnie przefiltrowana)) i pożywkę przygotowawczą (HBSS z 0,6% w/v glukozy i 10mM HEPES (kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazyno-etanosulfonowy)). Wstępnie ogrzać i wstępnie zrównoważyć pożywkę neuronową w kolbach filtracyjnych w temperaturze 37 °C, 6% v/v CO2 .</li>
	<li>Umieścić szklane szkiełka nakrywkowe (o średnicy 12 mm) w dołkach na płytkach 24-dołkowych (użyć specjalnych szkiełek nakrywkowych, które są nacięte do stosowania z wkładkami do hodowli komórkowych).
	<ol>
		<li>Pokryć przez co najmniej 1 godzinę 15 μg/ml poli-DL-ornityny w wodzie (klasy hodowli komórkowej) w temperaturze 37 °C. Użyć co najmniej 500 μl na studzienkę, aby upewnić się, że szkiełka nakrywkowe są całkowicie pokryte. Umyj studzienki dwukrotnie PBS. Pozostaw PBS w studzienkach do czasu posiewu komórek. Upewnij się, że studzienki nie wyschną.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby wypreparować hipokampy, przygotuj 3 naczynia o średnicy 10 cm wypełnione pożywką i 1 x probówkę o pojemności 2 ml z 1 ml pożywki do przygotowywania pokarmu. Przygotuj nożyczki i 2 cienkie kleszcze.</li>
	<li>Poświęć ciężarną mysz przez zwichnięcie szyjki macicy, wysterylizuj brzuch, myjąc go 70% v/v etanolem i otwórz brzuch ostrymi nożyczkami. Ostrożnie wyciąć paciorkę nożyczkami i przenieść narząd do naczynia o wymiarach 1x 10 cm wypełnionego podłożem do przygotowywania.</li>
	<li>Następnie usuń zarodki z macicy. Ostrożnie naciąć macicę i usunąć owodnię bez uszkadzania zarodków za pomocą 2 kleszczy. Następnie odetnij głowę każdemu zarodkowi nożyczkami i przenieś główki do drugiego 10-centymetrowego naczynia wyposażonego w pożywkę do przygotowania.</li>
	<li>Przystąpić do przygotowania głów (podobnie jak w przypadku preparatu opisanego w 1.4 - 1.7).
	<ol>
		<li>Unieruchomić głowę kleszczami i naciąć czaszkę i skórę w okolicy szyi w pobliżu tyłomózgowia, prostopadle do neuraksji. Użyj drugiej pary kleszczy, aby podnieść zarówno czaszkę, jak i zakrywającą skórę, a następnie zegnij miękką nasadkę czaszki w kierunku rostralnego końca głowy, odsłaniając w ten sposób mózg.</li>
		<li>Za pomocą 2 kleszczy odłącz mózg od jamy czaszki. Aby to zrobić, zamknij 1 parę kleszczy i oddziel mózg od czaszki, zaczynając od opuszki węchowej i przesuwając się w kierunku tyłomózgowia. Zbierz mózgi do innego 10-centymetrowego naczynia wypełnionego podłożem do przygotowywania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wypreparuj hipokampy z ugrupowań kory mózgowej, jak opisano powyżej, aby przygotować astrocyty (krok 1.6). Usuń hipokampy z każdej półkuli i zbierz je do probówki o pojemności 2 ml wypełnionej pożywką.</li>
	<li>Po zakończeniu sekcji należy przenieść probówkę do sterylnej ławy laminarnej i wytrawić tkankę hipokampa za pomocą 1 ml roztworu trawiącego zawierającego papainę. Przygotuj roztwór wytrawiający zgodnie z opisem w krokach 1.9 - 1.10, ale zamiast tego użyj MEM DMEM. 
	UWAGA: Kroki 3.9 - 3.12 są krytyczne i powinny zostać wykonane w ciągu 10 - 15 minut.</li>
	<li>Po zakończeniu trawienia ostrożnie pobrać roztwór wytrawiający, delikatnie odsysając pipetą.</li>
	<li>Przemyj hipokampy 3 razy pożywką neuronową, dodając kolejno, a następnie ostrożnie odsysając 1 ml świeżej pożywki hodowlanej na cykl mycia. Nie należy odwirowywać zawiesiny komórek.</li>
	<li>Po ostatnim etapie płukania ostrożnie rozetrzeć tkankę w 1 ml pożywki neuronowej.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą komory liczącej i umieść 35 000 komórek w pożywce neuronowej o pojemności 500 μl na pojedynczy dołek na płytce 24-dołkowej (płytka wspomniana w 3.2). 
	UWAGA: Opcjonalnie podwielokrotność komórki może być barwiona przeciwstawnie błękitem trypanowym w celu oceny żywotności preparatu komórkowego. Kontroluj gęstość posiewu poprzez oględziny za pomocą mikroskopu (zwykle 90 - 110 komórek na pole widzenia standardowego obiektywu 10X).</li>
	<li>Umieścić neurony w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 6% v/v CO2 przez 1 godzinę.</li>
	<li>Po inkubacji wyjąć przygotowane wkładki (wysiane zlewającymi się monowarstwami astrocytów) z inkubatora (patrz krok 2.8). Wymień pożywkę, odsysając pożywkę astrocytów i zastępując ją 500 μl świeżej pożywki neuronowej. 
	UWAGA: Wkładki powinny zawierać zlewające się monowarstwy astrocytów po 2 - 3 DIV (Days In Vitro).</li>
	<li>Ostrożnie umieść wstawki z astrocytami w studzienkach zawierających kultury neuronów (krok 3.13) za pomocą sterylnych kleszczy.</li>
	<li>Powstałą pośrednią kokulturę neuronów i astrocytów umieścić z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 6% v/v CO2, 
	UWAGA: W tych warunkach neurony mogą być hodowane przez okres do 4 tygodni w całkowicie zdefiniowanym pożywce. Nie jest konieczna żadna zmiana medium. W przypadku kultur długotrwałych zaleca się napełnianie pustych studzienek sterylną wodą w celu zmniejszenia parowania z płytki 24-dołkowej.</li>
	<li>Wykonaj analizy komórkowe in vitro po pożądanych okresach hodowli (np. dla immunocytochemii, PCR, Western blot, zapisów elektrofizjologicznych (patch clamp lub matryca wieloelektrodowa))7,15,18. 
	UWAGA: System hodowli nadaje się również do ostrego i przewlekłego leczenia farmakologicznego kultur11.</li>
</ol>

<ol><li>Volterra, A., Meldolesi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes%2C+from+brain+glue+to+communication+elements%3A+the+revolution+continues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocytes, from brain glue to communication elements: the revolution continues.</a> Nat Rev Neurosci. 6, 626-640 (2005).</li>
<li>Barreto, G. E., Gonzalez, J., Torres, Y., Morales, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic-neuronal+crosstalk%3A+implications+for+neuroprotection+from+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Astrocytic-neuronal crosstalk: implications for neuroprotection from brain injury.</a> Neurosci Res. 71, 107-113 (2011).</li>
<li>Araque, A., Carmignoto, G., Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+signaling+between+astrocytes+and+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Dynamic signaling between astrocytes and neurons.</a> Annu Rev Physiol. 63, 795-813 (2001).</li>
<li>Dityatev, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+formation+and+functions+of+chondroitin+sulfate-rich+extracellular+matrix+of+perineuronal+nets%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent formation and functions of chondroitin sulfate-rich extracellular matrix of perineuronal nets.</a> Dev Neurobiol. 67, 570-588 (2007).</li>
<li>Robinette, B. L., Harrill, J. A., Mundy, W. R., Shafer, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+assessment+of+developmental+neurotoxicity%3A+use+of+microelectrode+arrays+to+measure+functional+changes+in+neuronal+network+ontogeny%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroeng%22%5BJournal%5D)">In vitro assessment of developmental neurotoxicity: use of microelectrode arrays to measure functional changes in neuronal network ontogeny.</a> Front Neuroeng. 4, 1(2011).</li>
<li>Voigt, T., Opitz, T., de Lima, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronous+Oscillatory+Activity+in+Immature+Cortical+Network+Is+Driven+by+GABAergic+Preplate+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synchronous Oscillatory Activity in Immature Cortical Network Is Driven by GABAergic Preplate Neurons.</a> J Neurosci. 21 (22), 8895-8905 (2001).</li>
<li>Geissler, M., Faissner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+indirect+co-culture+set+up+of+mouse+hippocampal+neurons+and+cortical+astrocytes+on+microelectrode+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A new indirect co-culture set up of mouse hippocampal neurons and cortical astrocytes on microelectrode arrays.</a> J Neurosci Methods. 204, 262-272 (2012).</li>
<li>Yu, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+and+astroglial+TGFbeta-Smad3+signaling+pathways+differentially+regulate+dendrite+growth+and+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromolecular+Med%22%5BJournal%5D)">Neuronal and astroglial TGFbeta-Smad3 signaling pathways differentially regulate dendrite growth and synaptogenesis.</a> Neuromolecular Med. 16, 457-472 (2014).</li>
<li>Yu, P., Wang, H., Katagiri, Y., Geller, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+model+of+reactive+astrogliosis+and+its+effect+on+neuronal+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">An in vitro model of reactive astrogliosis and its effect on neuronal growth.</a> Methods Mol Biol. 814, 327-340 (2012).</li>
<li>Kucukdereli, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+excitatory+CNS+synaptogenesis+by+astrocyte-secreted+proteins+Hevin+and+SPARC%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Control of excitatory CNS synaptogenesis by astrocyte-secreted proteins Hevin and SPARC.</a> PNAS. 108, E440-E449 (2011).</li>
<li>Pyka, M., Busse, C., Seidenbecher, C., Gundelfinger, E. D., Faissner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+are+crucial+for+survival+and+maturation+of+embryonic+hippocampal+neurons+in+a+neuron-glia+cell-insert+coculture+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Synapse%22%5BJournal%5D)">Astrocytes are crucial for survival and maturation of embryonic hippocampal neurons in a neuron-glia cell-insert coculture assay.</a> Synapse. 65, 41-53 (2011).</li>
<li>Navarrete, M., Araque, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+synaptic+transmission%3A+astrocytes+rule%21%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Basal synaptic transmission: astrocytes rule!</a> Cell. 146, 675-677 (2011).</li>
<li>Christopherson, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombospondins+are+astrocyte-secreted+proteins+that+promote+CNS+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Thrombospondins are astrocyte-secreted proteins that promote CNS synaptogenesis.</a> Cell. 120, 421-433 (2005).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li>
<li>Geissler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+hippocampal+neurons%2C+which+lack+four+crucial+extracellular+matrix+molecules%2C+display+abnormalities+of+synaptic+structure+and+function+and+severe+deficits+in+perineuronal+net+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Primary hippocampal neurons, which lack four crucial extracellular matrix molecules, display abnormalities of synaptic structure and function and severe deficits in perineuronal net formation.</a> J Neurosci. 33, 7742-7755 (2013).</li>
<li>Dzyubenko, E., Gottschling, C., Faissner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuron-Glia+Interactions+in+Neural+Plasticity%3A+Contributions+of+Neural+Extracellular+Matrix+and+Perineuronal+Nets%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Plast%22%5BJournal%5D)">Neuron-Glia Interactions in Neural Plasticity: Contributions of Neural Extracellular Matrix and Perineuronal Nets.</a> Neural Plast. 2016, 5214961(2016).</li>
<li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).</li>
<li>Pyka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondroitin+sulfate+proteoglycans+regulate+astrocyte-dependent+synaptogenesis+and+modulate+synaptic+activity+in+primary+embryonic+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Chondroitin sulfate proteoglycans regulate astrocyte-dependent synaptogenesis and modulate synaptic activity in primary embryonic hippocampal neurons.</a> Eur J Neurosci. 33, 2187-2202 (2011).</li>
<li>Eroglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+astrocyte-secreted+matricellular+proteins+in+central+nervous+system+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Commun+Signal%22%5BJournal%5D)">The role of astrocyte-secreted matricellular proteins in central nervous system development and function.</a> J Cell Commun Signal. 3, 167-176 (2009).</li>
<li>Ethell, I. M., Ethell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinases+in+brain+development+and+remodeling%3A+synaptic+functions+and+targets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinases in brain development and remodeling: synaptic functions and targets.</a> J Neurosci Res. 85, 2813-2823 (2007).</li>
<li>Theocharidis, U., Long, K., ffrench-Constant, C., Faissner, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTheocharidis%2C+U+%22Prog+Brain+Res%22">Prog Brain Res</a>. Dityatev, A. lexander, Wehrle-Haller, B. ernhard, Asla, P. itkänen 214, Elsevier. 3-28 (2014).</li>
<li>Dityatev, A., Rusakov, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+signals+of+plasticity+at+the+tetrapartite+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Molecular signals of plasticity at the tetrapartite synapse.</a> Curr Opin Neurobiol. 21, 353-359 (2011).</li>
<li>Ippolito, D. M., Eroglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+synapses%3A+an+immunocytochemistry-based+assay+to+quantify+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22JoVe%22%5BJournal%5D)">Quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse.</a> JoVe. , (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Głównym celem obecnego protokołu jest całkowite oddzielenie kultur neuronalnych i astrocytowych, przy jednoczesnym utrzymaniu ich we wspólnym pożywce. Z tego powodu czystość uzyskanych kultur powinna być zweryfikowana na początku zabiegu. Zalecamy stosowanie tubuliny specyficznej dla neuronów, neurofilamentów lub białka NeuN jako markerów neuronalnych, GFAP jako markera astrocytowego, antygenu O4 jako markera prekursorowego oligodendrocytów i białka Iba1 w celu identyfikacji mikrogleju.
Zachow...

Przez ostatnie dziesięciolecia, ogólna interpretacja funkcji neurogleju ewoluowała od przypisywania jedynie pomocniczej do aktywnej roli regulacyjnej dotyczącej funkcji neuronalnej1. Ze względu na ich znaczący wpływ na homeostazę mózgu w zdrowiu i chorobie2, astrocyty są szczególnie interesujące dla społeczności naukowej. W ciągu ostatnich kilku lat wiele badań koncentrowało się na interakcjach neuron-glej in vivo i in vitro3. Jednak większość systemów hodowli nie pozwala na oddzielną analizę obu typów komórek i ich odpowiednich sekretomów.
Kilka podejść wykorzystuje bezpośrednią kokultywację neuronów i gleju w celu osiągnięcia długotrwałego przetrwania i fizjologicznie istotnego rozwoju sieci neuronalnej4-6. Obecny protokół osiąga te same cele, przy jednoczesnym utrzymaniu obu typów komórek fizycznie oddzielonych7. W porównaniu z kondycjonowaną pożywką8,9, nasz system pozwala na badanie dwukierunkowej komunikacji między neuronami a astrocytami. Ekspresja wydzielanych cząsteczek sygnałowych może być monitorowana, gdy komórki dojrzewają we wspólnym pożywce. Ta możliwość jest szczególnie istotna, ponieważ astrocyty uwalniają rozpuszczalne czynniki, takie jak cytokiny, czynniki wzrostu i cząsteczki macierzy zewnątrzkomórkowej10,11, regulując w ten sposób wzrost i funkcję neuronów7,12. W ten sposób wykazano, że dodanie trombospondyny do komórek zwojowych siatkówki in vitro indukuje tworzenie synaps13. Jednak inne, jeszcze nieznane czynniki są niezbędne, aby synapsy działały13. Co więcej, cząsteczki uwalniane przez astrocyty muszą zostać zidentyfikowane, aby zrozumieć podstawy interakcji neuron-glej.
Hodowla pierwotnych neuronów i astrocytów myszy i szczura została opisana wcześniej14-16. Przedstawiamy tutaj eleganckie i wszechstronne narzędzie do łączenia obu typów komórek w ramach pośredniego podejścia do kokultury. Ponieważ te dwie kultury są fizycznie oddzielone, a jednocześnie korzystają z tego samego podłoża, wpływ neuronów, astrocytów i rozpuszczalnych cząsteczek może być analizowany oddzielnie, tworząc w ten sposób potężne narzędzie do badań interakcji neuron-glej.

<table><tbody><tr><td>Reodczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Woda klasy do hodowli komórkowych</td><td>MilliQ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytozyna-&#946;-D-arabinofuranozyd (AraC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1768</td><td>UWAGA: H317, H361</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco (Life Technologies)&nbsp;</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Worthington</td><td>LS002007</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1397</td><td>UWAGA: H317-334</td></tr><tr><td></td><td>Glukoza Serva</td><td>22700</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>14170-088</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Serum dla koni</td><td>Biochrom AG</td><td>S9135</td><td></td></tr><tr><td>L-cysteina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-2529</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Gibco (Life Technologies)</td> <td>31095-029</td><td></td></tr><tr><td>Albumina jaja</td><td>kurzego Sigma-Aldrich</td><td>A7641</td><td>UWAGA: H334</td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington</td><td>3126</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>samodzielnie wykonana</td><td></td><td></td></tr><tr><td>poli-D-lizyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0899</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-ornityna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3655</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-24-well-plates</td><td>Thermoscientific/Nunc</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka (do&nbsp; kohodowli pośredniej)</td><td>BD Falcon</td><td>353504</td><td></td></tr><tr><td>Lornetka</td><td>Leica</td><td>MZ6</td><td></td></tr><tr><td>Wkładki do hodowli komórkowych</td><td>Wirówka BD Falcon</td><td>353095</td><td></td></tr><tr><td>Komora</td> licząca <td>Heraeus</td><td>Multifuge 3S-R</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Marienfeld</td><td>650010</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>FST Dumont</td> <td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe szklane (12&nbsp; mm)</td><td>Carl Roth (Menzel- Gl&auml; ser)</td><td>P231.1</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>Heracell 240i</td><td></td></tr><tr><td>Mikroprobówka (2 mL)</td><td>Sarstedt</td><td>72,691</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Leica</td><td>DMIL</td><td></td></tr><tr><td>Millex Jednostka filtrująca napędzana strzykawką</td><td></td><td></td> Wytrząsarka orbitalna Millipore SLGV013SL <td></td></tr><tr><td></td><td>Nowy Brunszwik Scientific</td><td>Innova 4000</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Szalki Petriego (10 cm)</td><td>Pipeta Sarstedt</td><td>833,902</td><td></td></tr><tr><td>(1 ml)</td><td>Gilson</td><td>Pipetman 1000</td><td></td></tr><tr><td>Sterylny stół roboczy</td><td>The Baker Company</td><td>Laminar Flow SterilGARD III</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne</td><td>FST Dumont</td><td>14094-11</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>Henry</td><td>Schein 9003016</td><td></td></tr><tr><td>Kolba T75</td><td>Rurka Sarstedt</td><td>833,911,002</td><td></td></tr><tr><td>(15 ml)</td><td>Sarstedt</td><td>64,554,502</td><td></td></tr><tr><td>Łaźnia wodna</td><td>GFL</td><td>Łaźnia wodna typ 1004</td><td></td></tr></tbody></table>

test pośredniej kokultury neuron-astrocyty: zestaw in vitro do szczegółowego badania interakcji neuron-glej

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

Prawidłowy rozwój i funkcjonowanie neuronów jest warunkiem wstępnym rozwoju i dorosłego mózgu. Jednak mechanizmy leżące u podstaw wysoce kontrolowanego tworzenia i utrzymywania złożonych sieci neuronalnych nie są do tej pory w pełni poznane. Otwarte pytania dotyczące neuronów w zdrowiu i chorobie są zróżnicowane i sięgają od zrozumienia podstawowego rozwoju do badania patologii związanych z człowiekiem, np. choroby Alzheimera i schizofrenii. Najbardziej szczegółową analizę neuronów można przeprowadzić in vitro. Jednak neurony są wymagającymi komórkami i potrzebują dodatkowego wsparcia astrocytów, aby mogły przetrwać przez długi czas. Ta heterogeniczność komórkowa jest w konflikcie z celem analizy neuronów i astrocytów. Przedstawiamy tutaj test hodowli komórkowej, który pozwala na długotrwałą kohodowlę czystych pierwotnych neuronów i astrocytów, które mają to samo chemicznie zdefiniowane podłoże, a jednocześnie są fizycznie oddzielone. W tej konfiguracji kultury przeżywają do czterech tygodni, a test nadaje się do różnych badań dotyczących interakcji neuron-glej.

Analiza kultur neuronalnych za pomocą pośredniego systemu kokultury jest wieloaspektowa i może być przeprowadzana na różnych etapach dojrzewania kultur. Dzięki możliwości utrzymania komórek przez okres do 4 tygodni, możliwe jest prowadzenie długoterminowych badań tych kultur.
Schemat w środkowym lewym panelu Rysunku 1 przedstawia układ kokultywacji. Z wykorzystaniem tego systemu można przeprowadzić obrazowanie ż...

Ten protokół opisuje pośrednią kokulturę neuron-astrocyt do analizy interakcji neuron-glej.

Test pośredniej kokultury neuron-astrocyty: zestaw in vitro do szczegółowego badania interakcji neuron-glej

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

Ogólnym celem niniejszego testu pośredniej kokultury jest zbadanie wpływu astrocytów na rozwój neuronów. Nasze laboratorium interesuje się rolą oddziaływań neuronowo-glejowych. Przyjmuje się, że astrocyty przyczyniają się do tworzenia synaps, czyli struktur łączących w ośrodkowym układzie nerwowym.Aby zbadać ich rolę, opracowaliśmy model in vitro, w którym możemy łączyć pierwotne astrocyty i pierwotne neurony embrionalne w osobnych komorach. Komory są połączone przepuszczalną membraną, co umożliwia analizę wymiany między oboma typami komórek. Stosując to podejście, byliśmy w stanie monitorować tworzenie synaps w okresach do czterech tygodni.Ponadto, za pomocą tego testu możliwe jest zbadanie indywidualnych ról astrocytów z jednej strony oraz neuronów z drugiej strony. Wreszcie, możemy również szczegółowiej zbadać sekretom naszych przedziałów komórkowych, który zawiera cząsteczki pośredniczące we wzajemnym oddziaływaniu obu przedziałów komórkowych w tym systemie. Metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat interakcji między neuronami a astrocytami.Metoda ta może być również zastosowana w przypadku innych organizmów modelowych, takich jak komórki szczura. Zazwyczaj osoby początkujące w

the-indirect-neuron-astrocyte-coculture-assay-an-vitro-set-up-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Niniejszy artykuł opisuje nowy protokół oraz zestaw odczynników opracowanych do czułego pomiaru efektów neurotoksyczności związków i metod leczenia w kokulturach neuronów i astrocytów z wykorzystaniem analizy wysokotreściowej (high content analysis). Wyniki wskazują, że analiza wysokotreściowa stanowi obiecującą, nową technologię w ocenie neurotoksyczności.

Test kokultury neuronów i astrocytów do wysokoprzepustowej analizy treści (high content analysis) w badaniach neurotoksyczności

W niniejszym protokole opisaliśmy nową metodę badania wpływu heterogeniczności komórek glejowych na wzrost aksonów z wykorzystaniem systemu kokultury in vitro. Glejowe komórki kory mózgu szczura hodowano do osiągnięcia konfluencji, a następnie kokultywowano z wysoko oczyszczonymi neuronami z zwojów korzeni grzbietowych szczura. Bezpośrednio w tej samej kulturze porównano wpływ różnych komórek glejowych na adhezję neuronów oraz wzrost aksonów. Metoda ta stanowi nowy sposób bezpośredniego badania...

Badanie wpływu heterogeniczności komórek glejowych na wzrost aksonów z wykorzystaniem nowej metody kokultury

Niniejsze badanie opisuje procedury tworzenia nowatorskiej platformy do kokultury aksonów neuronalnych i (astro)gleju. W tym systemie kokultury możliwa staje się manipulacja bezpośrednią interakcją między pojedynczym aksonem (i pojedynczą komórką glejową), co pozwala na analizę mechanistyczną wzajemnego sygnalizowania między neuronem a glejem.

Analiza obrazowa oddziaływań neuronów z glejem w systemie kokultury aksonów neuronowych i gleju opartym na mikrofluidycznej platformie hodowlanej (MCP)

Ten film ilustruje metodę ustanawiania pośredniej kokultury neuronów i astrocytów przy użyciu podejścia opartego na podziałach. W tej konfiguracji neurony i astrocyty są przestrzennie oddzielone, ale mają wspólne uwarunkowane podłoże. Czynniki neurotroficzne uwalniane przez astrocyty sprzyjają różnicowaniu neuronów i tworzeniu połączeń synaptycznych, co sugeruje interakcje neuron-glej.

Technika pośredniej kohodowli neuronów i astrocytów do badania interakcji neuron-glej

Ten film demonstruje ustanowienie kokultury ludzkich neuronów indukowanych (iN) i indukowanych komórek prekursorowych oligodendrocytów (iOPC). iN są mieszane z iOPC w kokulturze, a następnie inkubowane, aby wspierać dojrzewanie zarówno iN do neuronów, jak i iOPC do oligodendrocytów. Neurony tworzą połączenia synaptyczne z innymi neuronami i oligodendrocytami, podczas gdy oligodendrocyty rozwijają osłonki mielinowe wokół aksonów neuronów.

Metoda wspólnej hodowli do modelowania interakcji neuron-oligodendrocyty

Ten film demonstruje ustanowienie wspólnej kultury neuronów i astrocytów do rejestrowania aktywności sieci neuronalnej. Po ustaleniu wspólnej hodowli neuronów ruchowych i astrocytów na płytce z matrycą wieloelektrodową (MEA), synchroniczna rytmiczna aktywność elektryczna sieci neuronalnej została zarejestrowana zewnątrzkomórkowo za pomocą MEA.

Rejestrowanie aktywności elektrofizjologicznej sieci neuronalnej w kokulturze neuron-astrocyt

Ten film demonstruje ocenę aktywności elektrycznej neuronów w kokulturze pochodzących z hiPSC korowych neuronów glutaminergicznego i komórek glejaka przy użyciu urządzenia mikroprzepływowego z układami wieloelektrodowymi.

Ocena interakcji neuronów glutaminergicznego i komórek glejaka w kokulturze

Zrozumienie złośliwego zachowania raka wymaga stworzenia dokładnych modeli interakcji komórek nowotworowych z elementami mikrośrodowiska guza, takimi jak makrofagi. W tym miejscu opisujemy dwie metody badania interakcji komórek glejaka z makrofagami związanymi z nowotworem i mikroglejem, w których oceniany jest wpływ na inwazję glejaka.

Testy kokulturowe w celu zbadania stymulacji makrofagów i mikrogleju inwazji glejaka

W tym protokole staramy się opisać powtarzalną metodę łączenia zdysocjowanych ludzkich neuronów i astrocytów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych w kokultury sfer 3D, utrzymywania tych sfer w warunkach swobodnego pływania, a następnie mierzenia aktywności obwodów synaptycznych kul za pomocą immunoanalizy i zapisów z matrycy wieloelektrodowej.

Modelowanie mikroukładów synaptycznych z kokulturami 3D astrocytów i neuronów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Tutaj prezentujemy proste podejście wykorzystujące specyficzne podłoża hodowlane, które pozwala na tworzenie kultur wzbogaconych o neurony i astrocyty, lub kultur gleju neuronów z kory embrionalnej, o wysokiej wydajności i odtwarzalności.

Model hodowli komórkowej do badania roli interakcji neuron-glej w niedokrwieniu

Ten protokół opisuje kokulturę mikrogleju i neuronów utworzoną z pierwotnych komórek nerwowych wyizolowanych z embrionalnych zarodków myszy w 15-16 dniach embrionalnych oraz pierwotnego mikrogleju generowanego z mózgów nowonarodzonych myszy w 1-2 dniach po urodzeniu.

Generowanie i kokultura mysich pierwotnych mikrogleju i neuronów korowych

Poznaj metodę pośredniej kokultury neuron-astrocyty do badania interakcji neuron-glej in vitro. Ten protokół umożliwia analizę wpływu astrocytów na rozwój neuronów i formowanie synaps.

Test pośredniej kokultury neuron-astrocyty: zestaw in vitro do szczegółowego badania interakcji neuron-glej

Przeglądaj więcej filmów