Name: Wytwarzanie platformy testów immunologicznych UV-VIS i spektroskopii Ramana (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Poznaj metodę wytwarzania platformy testów immunologicznych opartych na nanocząsteczkach złota z wykorzystaniem spektroskopii UV-VIS i Ramana. Technika ta umożliwia wykrywanie antygenów z wysoką czułością i dostosowanie do indywidualnych potrzeb badawczych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta nagrodą Research Catalyst Award przyznaną przez Uniwersytet Stanowy Utah. Autorzy pragną podziękować Annelise Dykes, Cameronowi Zabriskie'owi i Donaldowi Wooleyowi za ich wkład.

1. Przygotowanie buforów
<ol>
	<li>Fosforanowy bufor solny (PBS)
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć 50 ml 10x PBS w 450 ml wody klasy HPLC, aby uzyskać stężenie 1x PBS. Przesączyć roztwór przez filtr sterylny 0,22 µm.</li>
		<li>Przechowywać roztwór w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie buforu Tris-saline z Tween 20 (TBST)
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć 50 ml 10x buforu Tris-saline (TBS) w 450 ml wody klasy HPLC, aby uzyskać stężenie 1x. Dodać 250 μl Tween-20, aby uzyskać stężenie 0,05% (v/v) Tween-20. Przesączyć roztwór przez filtr sterylny 0,22 μm.</li>
		<li>Przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie roztworu blokującego z albuminą surowicy ludzkiej (HSA)
	<ol>
		<li>Odważyć 0,45 g HSA do 15 ml sterylnie przefiltrowanego 1x PBS, aby przygotować 3% (w/v) roztwór HSA. Mieszać roztwór na wortexie do całkowitego rozpuszczenia HSA.</li>
		<li>Przechowywać roztwór HSA w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: Jako roztwór blokujący można również zastosować albuminę surowicy bydlęcej (BSA).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie roztworu przeciwciała pegylowanego (PEG-Ab) 
	UWAGA: Roztwór przeciwciał musi być wolny od białek nośnikowych lub stabilizujących, takich jak BSA, które zakłócałyby reakcje koniugacji poprzez konkurowanie o miejsca wiązania n-hydroksysulfosukcynimidu (NHS). Jeśli przeciwciało znajduje się w buforze Tris lub glicynowym, należy przeprowadzić wymianę buforu, aby zapobiec zakłócaniu reakcji koniugacji NHS przez aminy lub sole amonowe. Jeśli przeciwciało jest w formie liofilizowanej, można je resuspenderować zgodnie z zaleceniami producenta do stężenia 1-10 mg/ml.
	<ol>
		<li>W przypadku przeciwciał w buforze Tris lub glicynowym, przeprowadzić wymianę buforu na 100 mM wodorowęglanu sodu przy użyciu kolumny odsalającej. Użyć buforu 100 mM do podniesienia pH do około 8,5 w celu przyspieszenia reakcji koniugacji.</li>
		<li>Nawilżyć orto-pirydylo-disiarczek-PEG-NHS (OPSS-PEG-NHS) w 100 mM wodorowęglanie sodu do objętości 1 ml przy stężeniu 1 mg/ml lub wyższym. 
		UWAGA: OPSS-PEG-NHS należy przygotować bezpośrednio przed użyciem i zużyć w ciągu około 20 min. Grupa NHS w OPSS-PEG-NHS ma okres półtrwania wynoszący około 20 min w roztworze wodnym o pH 8,5.</li>
		<li>Dodać OPSS-PEG-NHS do roztworu przeciwciał w stosunku koniugacji 2:1 (PEG:przeciwciało), który zostanie użyty dla próbek testowych. W oddzielnej probówce do mikrocentryfugi dodać OPSS-PEG-NHS do roztworu antygenu w stosunku koniugacji 2:1 dla kontroli. 
		UWAGA: Stosunek 2:1 zakłada 50% wydajność koniugacji. Celem jest oznakowanie każdego przeciwciała jednym łańcuchem PEG. Na tym etapie nadmierne oznakowanie jest lepsze niż niedostateczne. Do wyznaczenia odpowiednich objętości OPSS-PEG-NHS i roztworu przeciwciał należy użyć następującego równania: 
		<img alt="Równanie przedstawiające stosunki objętości i stężeń w analizie rozdzielania roztworów." src="/files/ftp_upload/54795/54795eq_2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Równanie"> 
		gdzie V to objętość, a C to stężenie wyrażone w cząsteczkach lub przeciwciałach na ml. Indeksy PEG i Ab odnoszą się odpowiednio do OPSS-PEG-NHS i przeciwciała. Objętość końcowa powinna wynosić około 250 μl.</li>
		<li>Inkubować roztwór PEG-Ab w temperaturze 4 °C przez 8 h lub przez noc. Przechowywać roztwór w alikwotach roboczych o objętości około 25 μl w temperaturze -20 °C, aby ograniczyć liczbę cykli zamrażania i rozmrażania, i pamiętać o użyciu probówek o niskim wiązaniu (low binding).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie sond UV-Vis/Ramana
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworu niezmodyfikowanych AuNP
	<ol>
		<li>Przygotować 2 ml roztworu AuNP o stężeniu około 1 x 1011 cząstek na ml.
		<ol>
			<li>Jeśli AuNP wymagają zagęszczenia, napełnić probówki wirówkowe o niskim stopniu wiązania 2 000 μl stocku AuNP i wirować przy 5 000 x g przez 20 min lub do momentu, aż nadsącz stanie się przejrzysty. Usunąć nadsącz za pomocą pipety, uważając, aby nie naruszyć osadu AuNP.</li>
			<li>Połączyć pozostałe roztwory AuNP w jednej probówce i oszacować stężenie, wykonując pomiar UV-Vis i porównując wartości ze znanymi stężeniami, ponieważ jest to zależność liniowa.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyznaczenie odpowiedniego stosunku znakowania reporterem Ramanowskim
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór roboczy reportera Ramanowskiego rozpuszczonego w metanolu. Stężenie to będzie zależne od użytego reportera. W niniejszej pracy przygotowano jodek 3,3′-dietylotiatrykarbocyjaniny (DTTC) w postaci roztworu roboczego o stężeniu 200 μM.</li>
		<li>Zakładając końcową objętość 100 μl dla każdego dołka, dodać do każdego dołka pierwszego rzędu płytki 96-dołkowej odpowiednią ilość roboczego roztworu reportera, tak aby stężenia reportera Ramanowskiego mieściły się w zakresie od 0,2 μM do 10 μM. Do każdego dołka dodać wodę klasy HPLC, aby objętość wyniosła 80 μl. Do każdego dołka dodać 20 μl AuNP, uzyskując końcową objętość 100 μl na dołek. Przykład przedstawiono w Tabeli 1.</li>
		<li>Zmierzyć widma UV-Vis w zakresie od 400 do 700 nm przy użyciu spektrofotometru UV-Vis do płytek. Odpowiednie stężenie to najwyższe stężenie z wyraźnymi pikami w widmach UV-Vis. Powtarzać krok 2.2.2 przy zwiększaniu stężeń, aż do znalezienia najwyższego stosunku stężenia reporterów Ramanowskich do AuNP. 
		UWAGA: Barwnik oraz kształt, rozmiar i producent AuNP wpływają na odpowiednie stężenie. W związku z tym opisane kroki muszą zostać ocenione i zmienione w zależności od użytych komponentów. W tym protokole wykorzystano barwnik naładowany dodatnio. W związku z tym wiązanie między AuNP a reporterem poprawiono, stosując AuNP naładowane ujemnie. Osiągnięto to poprzez zastosowanie AuNP stabilizowanych cytrynianem. Dalsze szczegóły znajdują się w sekcji Dyskusja.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wiązanie reportera Ramanowskiego i PEG-Ab z AuNP
	<ol>
		<li>Przygotować dwie partie po 1,5 ml AuNP i reportera Ramanowskiego o wcześniej wyznaczonym stężeniu, pozwalając reporterowi Ramanowskiemu wiązać się z AuNP przez 30 min w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Dodać pegylowane przeciwciało (PEG-Ab) do jednej partii roztworu AuNP i reportera Ramanowskiego, aby uzyskać stosunek przeciwciał do cząstek 200:1. Roztwór ten będzie służył do próbek testowych. W osobnej probówce mikrowirówkowej dodać pegylowany antygen do drugiej partii roztworu AuNP i reportera Ramanowskiego w stosunku przeciwciała do cząstek 200:1, aby służył on jako kontrola. Inkubować roztwory przez 30 min w temperaturze pokojowej. 
		UWAGA: Stosunek przeciwciał do cząstek będzie specyficzny dla użytych AuNP i barwnika i powinien być optymalizowany dla każdego indywidualnego przypadku. Celem jest uzyskanie najwyższego stosunku przeciwciał, do których mogą wiązać się sondy AuNP, przy jednoczesnym zapobieganiu agregacji cząstek. Aby wyznaczyć odpowiednie objętości do zmieszania, należy użyć następującego równania: 
		<img alt="Równanie stosunku przeciwciał do nanocząsteczek złota w metodzie immunoanalizy; pokazuje relację objętościową." src="/files/ftp_upload/54795/54795eq_200.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Równanie"> 
		gdzie V to objętość, a C to stężenie wyrażone w cząstkach lub przeciwciałach na ml. Objętość końcowa powinna wynosić około 1,5 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Blokowanie pozostałych miejsc na powierzchni AuNP za pomocą mPEG-SH.
	<ol>
		<li>Przygotować mPEG-SH poprzez rozpuszczenie stałego metoksy poli(glikolu etylenowego) tiolu do stężenia 200 μM w wodzie. Mieszać roztwór na wortexie do całkowitego rozpuszczenia mPEG-SH.</li>
		<li>Dodać mPEG-SH w stosunku 40 000:1 do roztworu AuNP-PEG-Ab przygotowanego w kroku 2.3. Inkubować roztwór w temperaturze pokojowej przez 10 min, aby zapewnić zablokowanie pozostałych miejsc na nanocząsteczce złota. Aby wyznaczyć odpowiednie objętości do zmieszania, należy użyć następującego równania: 
		<img alt="Wzór modyfikacji powierzchni nanocząsteczek, równanie chemiczne dla obliczenia parametru pegylacji." src="/files/ftp_upload/54795/54795eq_40000.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Równanie"> 
		gdzie V to objętość, a C to stężenie wyrażone w cząstkach lub przeciwciałach na ml. Objętość końcowa powinna wynosić około 1,5 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odzyskiwanie funkcjonalizowanych sond Ramanowskich.
	<ol>
		<li>Wirować cząstki przy 5 000 x g przez 20 min w probówkach wirówkowych o niskim stopniu wiązania lub do momentu, aż nadsącz stanie się przejrzysty. Usunąć nadsącz za pomocą pipety, uważając, aby nie naruszyć AuNP.</li>
		<li>Resuspenderować cząstki w 1 ml wcześniej przygotowanego roztworu 1x PBS. Oszacować stężenie AuNP, wykonując pomiar UV-Vis małej objętości roztworu (3 μl) i porównując wyniki z pomiarami znanego stężenia AuNP. Dostosować objętość tak, aby końcowy roztwór miał stężenie co najmniej 1 x 1011 cząstek na ml.</li>
		<li>Przechowywać roztwory w temperaturze 4 °C do czasu ich użycia do funkcjonalizacji płytki do immunoanalizy. Zużyć roztwory w ciągu jednego tygodnia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="3">Objętości poszczególnych komponentów do dodania (ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stężenie końcowe DTTC (mM)</td>
			<td>roztwór roboczy DTTC (200 mM)</td>
			<td>nanocząsteczki złota</td>
			<td>Woda</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2</td>
			<td>0.1</td>
			<td>20</td>
			<td>79.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.6</td>
			<td>0.3</td>
			<td>20</td>
			<td>79.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>0.5</td>
			<td>20</td>
			<td>79.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>1.0</td>
			<td>20</td>
			<td>79</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>2.5</td>
			<td>20</td>
			<td>77.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td>3.5</td>
			<td>20</td>
			<td>76.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>5.0</td>
			<td>20</td>
			<td>75</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Przykład rozcieńczania DTTC. Różne rozcieńczenia DTTC oraz odpowiadające im objętości roztworu zapasowego DTTC, roztworu nanocząsteczek złota i wody.
3. Przygotowanie płytki do immunoanalizy
<ol>
	<li>Przywiąż wybrany antygen do płytki immunoanalitycznej.
	<ol>
		<li>Przygotuj odpowiednią ilość rozcieńczonego antygenu (50 μg/mlaby wypełnić dołki polistyrenowe. Roztwór wymieszać w wirówce vorteksowej, a następnie bezzwłocznie dodać do dołków płytki. Pozostawić antygen do związania się z płytkami na 1 h w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wypłukać niezwiązane antygeny.
	<ol>
		<li>Usunąć nadmiar roztworu antygenu, wylewając go do pojemnika na odpady i uderzając płytką o blat stołu wyłożony ręcznikiem papierowym.</li>
		<li>Do dołków należy dodać bufor TBST w celu przemycia powierzchni, a następnie usunąć płuczkę w sposób opisany wcześniej. Krok ten należy powtórzyć jeszcze dwukrotnie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zablokuj pozostałe miejsca wiązania na płytce, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu.
	<ol>
		<li>Dodaj 70 μl roztworu blokującego HSA do każdej studzienki płytki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 min.</li>
		<li>Wyjąć i wypłukać płytkę, stosując tę samą procedurę, która została określona w kroku 3.2. Przykryć płytkę i przechowywać w stanie suchym w temperaturze 4 °C do momentu dalszego użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Funkcjonalizacja płytki do analizy immunoenzymatycznej.
	<ol>
		<li>Dodaj 70 μl nanocząsteczek sondy przygotowanych w sekcji 2 do pierwszej kolumny płytki 96-dołkowej, a kolejne kolumny rozcieńczyć, stosując rozcieńczenie seryjne 1:2. Inkubować płytkę przez co najmniej 1 h. Przykład przygotowania płytki do immunoanalizy przedstawiono w Rysunek 3.</li>
		<li>Umyj płytkę pięciokrotnie roztworem TBST, zgodnie ze szczegółami opisanymi w krokach 3.2, pamiętając o odpowiedniej utylizacji AuNPs. Po ostatnim przemyciu dodaj 70 μl 1x PBS do każdego dołka i przykryć uszczelką do płytek. 
		UWAGA: Próbki kontrolne powinny być przejrzyste. W przypadku wystąpienia nieswoistego wiązania próbki kontrolne będą miały kolor zbliżony do próbek badawczych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Badanie czułości testu za pomocą spektroskopii UV-Vis i Ramanowskiej.
	<ol>
		<li>Dla każdej studzienki zmierz widma UV-Vis w zakresie od 400 do 700 nm, korzystając z płytekowego spektrofotometru UV-Vis.</li>
		<li>Korzystając z odwróconego mikroskopu Ramanowskiego, ustaw ostrość obiektywu na powierzchni dołka zawierającego sondy AuNP. Pozyskaj widmo Ramanowskie dołka. Zbierz widmo w zakresie od 1800 cm⁻¹-1 do 400 cm-1Powtórz ten krok dla wszystkich studzienek.</li>
		<li>Za pomocą odpowiedniego oprogramowania spektralnego przeprowadź 11th korekcję linii bazowej za pomocą wielomianu trzeciego stopnia dla widm Ramana i 3rd stopień wielomianu dla widm UV-Vis.</li>
		<li>Przy użyciu odpowiedniego oprogramowania do analizy widm należy znormalizować widma Ramanowskie oraz UV-Vis. Wartość maksymalną należy ustawić na 1 i odpowiednio przeskalować wszystkie pozostałe wartości. W celu normalizacji widm Ramanowskich należy wybrać charakterystyczny pik polistyrenu, ustawić jego wartość na 1 i odpowiednio przeskalować wszystkie pozostałe wartości.</li>
		<li>Przy użyciu odpowiedniego oprogramowania spektralnego przeprowadź całkowanie piku dla każdego widma. W przypadku widm ramanowskich pik reprezentujący reporter ramanowski musi znajdować się w obszarze wolnym od pików polistyrenu. Aby przeprowadzić całkowanie piku, określ granice całkowania dla wybranego piku i zapisz pole powierzchni tego piku dla wszystkich próbek, w tym dla kontroli.</li>
		<li>Nanieś na wykres średnią powierzchnię piku analizowanego w funkcji logarytmu stężenia AuNP, uwzględniając słupki błędów dla każdego punktu, wskazujące odpowiadające mu odchylenie standardowe. Dopasuj te punkty kalibracyjne do czteroparametrowej krzywej logistycznej.</li>
		<li>Wyznacz wartość średnią dla próbki ślepej, obliczając średnią z powierzchni piku analizowanego dla próbki ślepej. Wyznacz odchylenie standardowe tych powierzchni; jest to odchylenie standardowe dla próbki ślepej.</li>
		<li>Dla tego samego piku analizowanego w poprzednim kroku wyznacz odchylenie standardowe powierzchni piku dla najniższego stężenia.</li>
		<li>Oblicz granicę tła (LOB) oraz dolną granicę wykrywalności (LLOD) zgodnie z wytycznymi podanymi w sekcji Wyniki reprezentatywne. Wykorzystaj te wartości wraz z krzywymi kalibracyjnymi 4PL, aby wyznaczyć LLOD w odniesieniu do stężenia AuNP.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Israelsen, N. D., Hanson, C., Vargis, E. Nanoparticle properties and synthesis effects on surface-enhanced Raman scattering enhancement factor: an introduction. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aIsraelsen%2C+ND+%22Sci.+World+J%22">Sci. World J</a>. , e124582(2015).</li>
<li>Wang, Y., Schlücker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+and+synthesis+of+SERS+labels%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Rational design and synthesis of SERS labels.</a> Analyst. 138 (8), 2224-2238 (2013).</li>
<li>Wang, Y., Yan, B., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SERS+tags%3A+novel+optical+nanoprobes+for+bioanalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">SERS tags: novel optical nanoprobes for bioanalysis.</a> Chem. Rev. 113 (3), 1391-1428 (2013).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+Immunoassay+Handbook%3A+Theory+and+applications+of+ligand+binding%2C+ELISA+and+related+techniques%22">The Immunoassay Handbook: Theory and applications of ligand binding, ELISA and related techniques</a>. , Elsevier Science: Oxford. Waltham, MA. (2013).</li>
<li>Cox, K. L., Devanarayan, V., Kriauciunas, A., Manetta, J., Montrose, C., Sittampalam, S. Immunoassay Methods. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCox%2C+KL+%22Assay+Guid.+Man%22">Assay Guid. Man</a>. , [Accessed: 28-Mar-2016] 
 <a target="_blank" href="
	http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK92434/
	">
	http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK92434/
	</a> (2004).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22ELISA+development+guide%22">ELISA development guide</a>. , [Accessed: 28-Mar-2016] 
 <a target="_blank" href="https://resources.rndsystems.com/pdfs/datasheets/edbapril02.pdf">https://resources.rndsystems.com/pdfs/datasheets/edbapril02.pdf</a> (2016).</li>
<li>Israelsen, N. D., Wooley, D., Hanson, C., Vargis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+Raman-labeled+nanoparticles+for+a+dual-modality%2C+light+scattering+immunoassay+on+a+polystyrene+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Eng%22%5BJournal%5D)">Rational design of Raman-labeled nanoparticles for a dual-modality, light scattering immunoassay on a polystyrene substrate.</a> J. Biol. Eng. 10, (2016).</li>
<li>Menges, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMenges%2C+F+%22Spekwin32+-+optical+spectroscopy+software.+Version+1.72.1%22">Spekwin32 - optical spectroscopy software. Version 1.72.1</a>. , [Accessed: 28-Mar-2016] 
 <a target="_blank" href="http://www.effemm2.de/spekwin/">http://www.effemm2.de/spekwin/</a> (2016).</li>
<li>Findlay, J. W. A., Dillard, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appropriate+calibration+curve+fitting+in+ligand+binding+assays%5BTitle%5D)+AND+%22AAPS+J%22%5BJournal%5D)">Appropriate calibration curve fitting in ligand binding assays.</a> AAPS J. 9 (2), E260-E267 (2007).</li>
<li>Yu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+Antibody+Binding+on+Protein+Microarrays+using+Microarray+Nonlinear+Calibration%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Quantifying the Antibody Binding on Protein Microarrays using Microarray Nonlinear Calibration.</a> BioTechniques. 54, 257-264 (2013).</li>
<li>Armbruster, D. A., Pry, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limit+of+blank%2C+limit+of+detection+and+limit+of+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Biochem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Limit of blank, limit of detection and limit of quantitation.</a> Clin. Biochem. Rev. 29 (Suppl 1), S49-S52 (2008).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22EP17-A2%3A+Evaluation+of+Detection+Capability+for+Clinical+Laboratory+Measurement+Procedures%3B+Approved+Guideline%22">EP17-A2: Evaluation of Detection Capability for Clinical Laboratory Measurement Procedures; Approved Guideline</a>. 32. No 8, Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA, 19087, USA. 
 <a target="_blank" href="http://shop.clsi.org/method-evaluation-documents/EP17.html">http://shop.clsi.org/method-evaluation-documents/EP17.html</a> (2012).</li>
<li>Leigh, S. Y., Som, M., Liu, J. T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+assessing+the+reliability+of+molecular+diagnostics+based+on+multiplexed+SERS-coded+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Method for assessing the reliability of molecular diagnostics based on multiplexed SERS-coded nanoparticles.</a> Plos One. 8 (4), e62084(2013).</li>
<li>Sinha, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+the+binding+potential+of+cell-surface+receptors+in+fresh+excised+specimens+via+dual-probe+modeling+of+SERS+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Quantification of the binding potential of cell-surface receptors in fresh excised specimens via dual-probe modeling of SERS nanoparticles.</a> Sci. Rep. 5, 8582(2015).</li>
<li>Shi, W., Paproski, R. J., Moore, R., Zemp, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+circulating+tumor+cells+using+targeted+surface-enhanced+Raman+scattering+nanoparticles+and+magnetic+enrichment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Detection of circulating tumor cells using targeted surface-enhanced Raman scattering nanoparticles and magnetic enrichment.</a> J. Biomed. Opt. 19, 056014(2014).</li>
<li>Xia, X., Li, W., Zhang, Y., Xia, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silica-coated+dimers+of+silver+nanospheres+as+surface-enhanced+Raman+scattering+tags+for+imaging+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Interface+Focus%22%5BJournal%5D)">Silica-coated dimers of silver nanospheres as surface-enhanced Raman scattering tags for imaging cancer cells.</a> Interface Focus. 3 (3), 20120092(2013).</li>
<li>McLintock, A., Cunha-Matos, C. A., Zagnoni, M., Millington, O. R., Wark, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+surface-enhanced+Raman+tags%3A+individual+nanorods+for+measurements+from+the+visible+to+the+infrared+%28514-1064+nm%29%5BTitle%5D)+AND+%22Acs+Nano%22%5BJournal%5D)">Universal surface-enhanced Raman tags: individual nanorods for measurements from the visible to the infrared (514-1064 nm).</a> Acs Nano. 8 (8), 8600-8609 (2014).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W szczegółowym protokole znajduje się kilka krytycznych punktów, do których należy się odnieść. Jedną z kwestii jest wybór reportera Ramana i nanocząstki złota. Chociaż protokół został napisany tak, aby można go było dostosować do indywidualnego użytku, jako przykład użyto DTTC reportera Ramana. DTTC jest dodatnio naładowanym reporterem i wiąże się z ujemnie naładowanymi powierzchniami, takimi jak AuNP pokryte cytrynianem. Protokół ten można dostosować do ujemnie naładowanych reporterów poprzez zastosowanie nanocząstek z...

Typowe testy immunologiczne typu sandwich pośrednio wykrywają obecność antygenu za pomocą dwóch przeciwciał. Wychwytywane przeciwciało jest związane z powierzchnią ciała stałego i tworzy kompleks przeciwciało-antygen, gdy znajduje się w pobliżu odpowiedniego antygenu. Następnie wprowadzane jest przeciwciało wykrywające, które wiąże się z antygenem. Po umyciu kompleks przeciwciało/antygen/przeciwciało pozostaje i jest wykrywany przez znakowane przeciwciało wykrywające, jak pokazano na rysunku 1A. Typowa detekcja odbywa się za pomocą detektora fluorescencyjnego lub kolorymetrycznego, ograniczającego multipleksowanie do 10 analitów ze względu na szerokie piki spektralne2,3. W przeciwieństwie do tego, systemy oparte na Ramanie mają znacznie węższe piki emisji, co skutkuje zwiększonymi możliwościami multipleksowania, a źródła twierdzą, że jednocześnie wykrywają do 100 analitów2,3.
Dostępnych jest wiele źródeł literatury, które omawiają ważne aspekty związane z testami immunologicznymi 4-6, takie jak szczegóły krok po kroku do tworzenia spersonalizowanych zestawów ELISA. Niestety, protokoły te służą do wykrywania fluorescencyjnego lub kolorymetrycznego, co ogranicza możliwości multipleksowania niestandardowych testów immunologicznych. Aby zaspokoić tę potrzebę, przedstawiamy szczegółową procedurę wytwarzania testu immunologicznego UV-Vis/Ramanowskiego, opublikowanego wcześniej7 dla bezpośredniego testu immunologicznego, jak pokazano na rysunku 1B.
Ten protokół obejmuje wytwarzanie funkcjonalizowanych sond opartych na nanocząstkach złota, zilustrowanych na rysunku 2. Procedura wytwarzania sond Raman/UV-Vis rozpoczyna się od wiązania reporterów Ramana z powierzchnią nanocząstek złota (AuNPs). AuNP są następnie funkcjonalizowane przeciwciałami, które są związane z glikolem polietylenowym (PEG). Pozostałe miejsca wiązania na AuNP są blokowane przez wiązanie tiolu glikolu metoksypolietylenowego (mPEG-SH) z AuNPs, aby zapobiec późniejszemu niespecyficznemu wiązaniu podczas analizy. Przygotowane sondy AuNP są testowane przez wiązanie z antygenami przymocowanymi do studzienek płytki polistyrenowej, jak pokazano na rysunku 1B. Po umyciu płytki sondy AuNP są wykrywane za pomocą spektroskopii UV-Vis, podczas gdy powiązane reportery Ramana są wykrywane za pomocą spektroskopii Ramana. Połączenie danych spektralnych UV-Vis i ramanowskich zapewnia dwie metody analizy, zwiększając możliwości tego testu immunologicznego.

<table><tbody><tr><td>Nanocząstka złota 60 nm</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>15708-6</td><td>Są to nanocząstki złota pokryte cytrynianem. Proszę zapoznać się z Dyskusją, aby zapoznać się z relacjami między reporterem Ramana a ładunkiem powierzchniowym AuNP i jego wpływem na prawidłowy wybór AuNP i/lub reportera Ramana.</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>339000000</td><td></td></tr><tr><td>Tris Sól fizjologiczna buforowana (10x) pH 7,5</td><td>Scy Tek</td><td>TBD999</td><td></td></tr><tr><td>Butelkowa jednostka filtracyjna</td><td>VWR</td><td>97066-202</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20 (polisorbat 20)</td><td>Scy Tek</td><td>TWN500</td><td>Stosowany jako środek emulgujący do etapów mycia.</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami 10x koncentrat, pH 7,4</td><td>Ski Tek</td><td>PBD999</td><td></td></tr><tr><td>Białko LoBind Tube 2.0&nbsp; </td><td>ml Probówki Eppendorfa</td><td>22431102</td><td>probówki LoBind zapobiegają wiązaniu białek i AuNP z powierzchniami probówek.</td></tr><tr><td>Białko LoBind Tube 0,5&nbsp; ml</td><td>Probówki Eppendorfa</td><td>22431064</td><td>probówki LoBind zapobiegają wiązaniu białek i AuNP z powierzchniami probówek.</td></tr><tr><td>Urządzenia do mikropłytek UniSeal</td><td>GE Healthcare</td><td>7704-0001</td><td>Służy do uszczelniania i przechowywania płytek funkcjonalnych.</td></tr><tr><td>Płytka testowa, z pokrywą o niskim parowaniu, 96 studni z płaskim dnem</td><td>Costar</td><td>3370</td><td></td></tr><tr><td>Woda klasy HPLC</td><td>Sigma Aldrich</td><td>270733-4L</td><td></td></tr><tr><td>3,3&prime;-Diethylthiatricarbocyjanina jodek (DTTC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>381306-250MG</td><td>Raman reporter</td></tr><tr><td>mPEG-Thiol, MW 5,000 - 1 gram</td><td>Laysan Bio, Inc.</td><td>MPEG-SH-5000-1g</td><td></td></tr><tr><td>OPSS-PEG-SVA, MW 5,000 - 1&nbsp; gram</td><td>Laysan Bio, Inc.</td><td>OPSS-PEG-SVA-5000-1g</td><td>OPSS-PEG-SVA ma końcówkę NHS.</td></tr><tr><td>Mysia IgG, kontrola całych cząsteczek</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31903</td><td>Antygen</td></tr><tr><td>Kozioł anty-mysi IgG (H + L) Adsorbowane krzyżowo przeciwciało wtórne</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31164</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór blokujący albuminę ludzkiej surowicy</td> Zamiast <td>tego można użyć albuminy surowicy bydlęcej Sigma</td> <td>Aldrich</td><td>A1887-1G</td>.</tr><tr><td>Mini wirówka</td><td>Fisher Schientific</td><td>12-006-900</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr UV-Vis</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nanodrop 2000c</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr UV-Vis</td><td>BioTek</td><td>Synergy 2</td><td></td></tr><tr><td>Kolumny odsalające</td><td>Thermor Scientific</td><td>87766</td><td></td></tr><tr><td>Zbudowany we własnym zakresie 785&nbsp; Odwrócony mikroskop Ramana nm</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Odwrócony mikroskop Ramana najlepiej nadaje się do prawidłowego ustawiania ostrości na powierzchni płytki studzienki. W przeciwnym razie zostanie użyte bardzo małe powiększenie ze względu na wysokość 96-dołkowej płytki. Użyto systemu zbudowanego we własnym zakresie, ponieważ był tańszy niż kupowanie od sprzedawcy. Można jednak użyć dowolnego dostępnego na rynku odwróconego mikroskopu ramanowskiego.</td></tr></tbody></table>

wytwarzanie platformy testów immunologicznych uv-vis i spektroskopii ramana

Fabricating a UV-Vis and Raman Spectroscopy Immunoassay Platform

Testy immunologiczne są używane do wykrywania białek na podstawie obecności powiązanych przeciwciał. Ze względu na ich szerokie zastosowanie w warunkach badawczych i klinicznych, można znaleźć dużą infrastrukturę instrumentów i materiałów do testów immunologicznych. Na przykład 96- i 384-dołkowe płytki polistyrenowe są dostępne na rynku i mają standardową konstrukcję, aby pomieścić maszyny do spektroskopii w ultrafiolecie widzialnym (UV-Vis) różnych producentów. Ponadto dostępna jest szeroka gama immunoglobulin, znaczników detekcyjnych i środków blokujących do niestandardowych projektów testów immunologicznych, takich jak testy immunoenzymatyczne (ELISA).
Pomimo istniejącej infrastruktury, standardowe zestawy ELISA nie spełniają wszystkich potrzeb badawczych, wymagając indywidualnego opracowania testu immunologicznego, co może być kosztowne i czasochłonne. Na przykład zestawy ELISA mają niskie możliwości multipleksowania (wykrywania więcej niż jednego analitu na raz), ponieważ zwykle zależą od metod fluorescencyjnych lub kolorymetrycznych do wykrywania. Analizy kolorymetryczne i fluorescencyjne mają ograniczone możliwości multipleksowania ze względu na szerokie piki spektralne. Natomiast metody oparte na spektroskopii Ramana mają znacznie większe możliwości multipleksowania ze względu na wąskie piki emisji. Kolejną zaletą spektroskopii Ramana jest to, że reporterzy Ramanowcy doświadczają znacznie mniej fotowybielania niż znaczniki fluorescencyjne1. Pomimo przewagi, jaką reporterzy Ramanowcy mają nad znacznikami fluorescencyjnymi i kolorymetrycznymi, protokoły wytwarzania testów immunologicznych opartych na Ramanie są ograniczone. Celem pracy jest przedstawienie protokołu przygotowania funkcjonalizowanych sond do użycia w połączeniu z płytkami polistyrenowymi do bezpośredniego wykrywania analitów za pomocą analizy UV-Vis i spektroskopii Ramana. Protokół ten pozwoli naukowcom na samodzielne podejście do przyszłego wykrywania wielu analitów, przy jednoczesnym wykorzystaniu wcześniej ustalonej infrastruktury.

W niniejszym badaniu do spektroskopii UV-Vis wykorzystano złote nanocząstki o rozmiarze 60 nm. Zebrano widma absorbancji UV-Vis w zakresie od 400 do 700 nm, a pola powierzchni pików dla każdego stężenia AuNP wyznaczono przy użyciu otwartoźródłowego oprogramowania do analizy widmowej8. Przed całkowaniem pików zebrane widma poddano korekcji linii bazowej z zastosowaniem dopasowania wielomianowego trójstopniowego. Pola powierzchni pików wykorzystano do wygenerowania logarytmicznej krzywej kalibracyjnej, co przeds...

Sondy optyczne oparte na nanocząstkach zostały zaprojektowane jako nośnik do wykrywania antygenów za pomocą spektroskopii Ramana i UV-Vis. W tym miejscu opisujemy protokół przygotowania takich sond do testu immunologicznego spektroskopii UV-Vis/Ramana w taki sposób, aby uwzględnić przyszłe możliwości multipleksowania.

Wytwarzanie platformy testów immunologicznych UV-VIS i spektroskopii Ramana

Immunoassays are used to detect proteins based on the presence of associated antibodies. Because of their extensive use in research and clinical settings, ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest zaprezentowanie opracowania konfigurowalnego testu immunoenzymatycznego opartego na nanocząsteczkach złota, który umożliwia analizę z wykorzystaniem spektroskopii UV-Vis oraz spektroskopii Ramanowskiej. Zastosowanie dwóch metod optycznych zapewnia wewnętrzną walidację testu i zwiększa jego elastyczność. Metoda ta odpowiada na kluczowe pytania dotyczące opracowywania testów immunoenzymatycznych opartych na nanocząsteczkach złota.Wyjaśnia on również, w jaki sposób funkcjonalizacja nanocząstki wykorzystana w tym teście wpłynie na absorpcję optyczną i rozproszenie światła. Niniejszy protokół jest wyjątkowy, ponieważ wykorzystuje materiały dostępne w typowych laboratoriach badawczych do wykonania platformy do immunoanalizy, którą można dostosować do indywidualnych potrzeb badawczych. Immunoanaliza opiera się na spektroskopii UV-Vis oraz spektroskopii ramanowskiej.Zastosowanie spektroskopii Ramana jest korzystniejsze niż metody fluorescencyjne lub kolorymetryczne, ponieważ charakteryzuje się ona węższymi szerokościami pasm, co pozwala na jednoczesną detekcję wielu biomarkerów. W celu rozpoczęcia procedury, nawodnij dwufunkcyjny czynnik sieciujący

fabricating-a-uv-vis-and-raman-spectroscopy-immunoassay-platform

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ilościowe, wysokoprzepustowe, w czasie rzeczywistym i bez znakowania wykrywanie biomolekuł (DNA, białek itp.) na powierzchniach SiO2 można osiągnąć za pomocą prostej techniki interferometrycznej, która opiera się na oświetleniu LED, minimalnej liczbie komponentów optycznych i kamerze. Sensor obrazowania odbiciowego interferometrycznego (IRIS) jest niedrogi, prosty w obsłudze i dostosowany do formatów mikromacierzy.

Detekcja biomolekularna z wykorzystaniem interferometrycznego czujnika obrazowania odbiciowego (IRIS)

W tym filmie opisujemy metodę bezpośredniego testu immunologicznego opartego na spektroskopii Ramana do wykrywania określonych antygenów docelowych. Przeciwciała, które są adsorbowane na powierzchni nanocząstek złota przyczepionych do sond Ramana, oddziałują z docelowymi antygenami i wytwarzają specyficzne widmo Ramana, które jest następnie wykrywane.

Bezpośredni test immunologiczny oparty na spektroskopii Ramana w celu wykrycia określonego antygenu

Opisujemy wytwarzanie i charakterystykę systemów nanobiologicznych łączących nanostrukturalne podłoża z unieruchomionymi białkami i aptamerami. Przedstawiono odpowiednie etapy eksperymentalne obejmujące litograficzną produkcję substratów nanostrukturalnych, biofunkcjonalizację i charakterystykę spektroskopii Ramana wzmocnionej powierzchniowo (SERS). Wykazano detekcję SERS białek unieruchomionych powierzchniowo oraz sondowanie wiązania białko-ligand i aptamer-ligand.

Powierzchniowo wzmocniona spektroskopia Ramana wykrywanie biomolekuł przy użyciu nanostrukturalnych substratów wytworzonych przez EBL

Przedstawiono procedurę wytwarzania i przeprowadzania opartego na filtrze testu spektroskopowego Ramana (SERS) do wykrywania zanieczyszczeń chemicznych (np. pestycydu ferbamu i antybiotyku ampicyliny).

Oparty na filtrze test spektroskopowy Ramana ze wzmocnieniem powierzchniowym do szybkiego wykrywania zanieczyszczeń chemicznych

Szczegółowo opisujemy metodę wytwarzania trójwymiarowych urządzeń mikroprzepływowych opartych na papierze do wykorzystania w rozwoju testów immunologicznych. Nasze podejście do montażu urządzeń to rodzaj wielowarstwowej, addytywnej produkcji. Demonstrujemy test immunologiczny typu sandwich, aby zapewnić reprezentatywne wyniki dla tego typu urządzeń opartych na papierze.

Wytwarzanie trójwymiarowych urządzeń mikroprzepływowych na bazie papieru do testów immunologicznych

Ten protokół opisuje produkcję małej, gotowej do użycia kasety, która może być zastosowana do wizualnego wykrywania wielu kwasów nukleinowych w jednym, łatwym w obsłudze teście. W tym podejściu wykorzystano matrycę kapilarną do multipleksu i wysoce skutecznego wykrywania celów GMO.

Wizualna detekcja wielu kwasów nukleinowych w układzie kapilarnym

Obecna diagnostyka multipleksowa do wykrywania wirusów Zika, chikungunya i denga wymaga skomplikowanego przygotowania próbek i kosztownego oprzyrządowania, a także jest trudna do użycia w środowiskach o niskich zasobach. Pokazujemy diagnostykę, która wykorzystuje amplifikację izotermiczną z sondami z przemieszczonymi niciami specyficznymi dla celu, aby wykryć i zróżnicować te wirusy z wysoką czułością i swoistością.

Multipleksowana platforma diagnostyczna oparta na amplifikacji izotermicznej do wykrywania wirusów Zika, Chikungunya i Denga 1

Ten protokół przedstawia zintegrowaną platformę spektroskopii Ramana i spektrometrii mas (MS), która jest w stanie osiągnąć rozdzielczość pojedynczej komórki. Spektroskopia Ramana może być stosowana do badania odpowiedzi komórkowej na leki, podczas gdy stwardnienie rozsiane może być wykorzystywane do ukierunkowanej i ilościowej analizy wychwytu i metabolizmu leków.

Zintegrowana platforma spektroskopii Ramana i spektrometrii mas do badania wychwytu, metabolizmu i efektów stosowania leków w pojedynczych komórkach

Cyfrowy mikrofluidyk oparty na elektrozwilżaniu to technika, która wykorzystuje sterowaną napięciem zmianę pozornego kąta zwilżania kropli o objętości mikrolitra, aby ułatwić jej manipulację. Połączenie tego z funkcjonalizowanymi kulkami magnetycznymi umożliwia integrację wielu operacji laboratoryjnych w celu przygotowania próbki i identyfikacji patogenów za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA).

Cyfrowa platforma mikroprzepływowa oparta na elektrozwilżaniu do zautomatyzowanego testu immunoenzymatycznego

Ten artykuł proponuje nową generację wieloparametrycznych platform analitycznych o zwiększonej przepustowości do charakterystyki podzbiorów pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Metoda opiera się na połączeniu multipleksowanych metod biodetekcji z analizami metrologicznymi i morfomechanicznymi za pomocą mikroskopii sił atomowych, w połączeniu ze spektroskopią Ramana, w celu kwalifikacji celów pęcherzykowych uwięzionych na biochipie mikromacierzy.

Multimodalna platforma analityczna na multipleksowanym chipie do obrazowania powierzchniowego rezonansu plazmonowego do analizy podzbiorów pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Przedstawiamy tutaj protokół analizy pojedynczych małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (sEV) za pomocą bezoznakowanego, powierzchniowego spektroskopii Ramana (SERS), umożliwiającej minimalnie inwazyjną diagnostykę chorób i ocenę sEV jako środków dostarczania terapii.

Badanie zastosowania powierzchniowo wzmocnionego rozpraszania Ramana opartego na biosensowaniu poszczególnych sEV w diagnostyce chorób i terapii

Poznaj metodę wytwarzania platformy testów immunologicznych opartych na nanocząsteczkach złota z wykorzystaniem spektroskopii UV-VIS i Ramana. Technika ta umożliwia wykrywanie antygenów z wysoką czułością i dostosowanie do indywidualnych potrzeb badawczych.

Wytwarzanie platformy testów immunologicznych UV-VIS i spektroskopii Ramana

Przeglądaj więcej filmów