Technika infuzji mikrochirurgicznej myszy do celowanego dostarczania substancji do OUN przez tętnicę szyjną wewnętrzną
31 stycznia 2017
Obecny protokół opisuje technikę infuzji mikrochirurgicznej u myszy, która skutecznie dostarcza substancje bezpośrednio do mózgu przez tętnicę szyjną wewnętrzną.
Ogólnym celem tej techniki chirurgicznej jest dostarczenie substancji egzogennych do mózgu myszy bez penetracji czaszki. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w neurobiologii dotyczące działania leków, patogenów i egzosomów w mózgu. Główną zaletą tej techniki jest to, że powoduje minimalny uraz u zwierzęcia, zachowuje integralność sieci neuronalnej i osiąga wysokie stężenia substancji w mózgu.
Zacznij od podania izofluranu zmieszanego z tlenem w celu znieczulenia myszy w komorze indukcyjnej. Po indukcji znieczulenia przenieś zwierzę na powierzchnię chirurgiczną pod mikroskopem stereoskopowym i umieść stożek nosowy, aby utrzymać chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia. Upewnij się, że częstość oddechów wynosi około jednego do dwóch oddechów na sekundę bez sapania.
Ponadto upewnij się, że zwierzę nie reaguje na stymulację wąsów lub szczypanie palca u nogi. Użyj sterylnego wacika, aby nałożyć kroplę lubrykantu okulistycznego na każde oko, aby zapobiec wysuszeniu. Po ogoleniu miejsca operowanego maszynką do golenia, przygotuj obszar za pomocą 70% etanolu i chlorheksydyny.
Patrząc przez mikroskop stereoskopowy, użyj nożyczek chirurgicznych i kleszczy, aby utworzyć nacięcie w linii środkowej szyi od góry mostka do poniżej szczęki. Użyj kleszczy, aby ostrożnie oddzielić tkankę tłuszczową i łączną, aby odsłonić tchawicę. Następnie umieść miękki, okrągły przedmiot o średnicy około pięciu centymetrów pod tyłem szyi, aby przedłużyć szyję i jeszcze bardziej odsłonić obszar.
Następnie oddziel tkankę wokół tchawicy za pomocą haczyków lub zwijacza tkankowego. Po lewej stronie tchawicy ostrożnie rozsuń tkankę łączną, aby odsłonić lewą tętnicę szyjną wspólną lub CCA. Za pomocą kleszczy ostrożnie usuń całą tkankę łączną, aby odsłonić rozwidlenie CCA na początku zarówno zewnętrznych, jak i wewnętrznych tętnic szyjnych.
Po odsłonięciu ECA i ICA należy za pomocą kleszczy umieścić segment jednocentymetrowego szwu nylonowego pod tętnicą szyjną zewnętrzną. Następnie umieść drugi jednocentymetrowy segment. Następnie zawiąż stały węzeł w najwyższym możliwym punkcie ETO.
W najniższym możliwym punkcie ECA, bezpośrednio nad rozwidleniem CCA, zawiąż luźniejszy, rozpinany węzeł. Następnie użyj zacisków do naczyń, aby zamknąć CCA w najniższym możliwym punkcie i zamknąć ICA. Prawidłowe zamknięcie tętnicy szyjnej wewnętrznej przed wykonaniem małego nacięcia w tętnicy szyjnej zewnętrznej zapobiegnie krwawieniu.
Teraz, za pomocą nożyczek sprężynowych do mikrodysekcji, wykonaj dwumilimetrowe nacięcie w ECA między dwoma węzłami. Ważne jest, aby nacięcia były małe, ponieważ duże nacięcie spowoduje wyciek substancji, która ma być podawana. Zmontuj system infuzyjny, podłączając sześć cali rurki kapilarnej do strzykawki tuberkulinowej zawierającej 250 mikrolitrów substancji, która ma być podawana.
Następnie delikatnie wsunąć końcówkę rurki kapilarnej w nacięcie w ECA. Kontynuuj przesuwanie końcówki, aż osiągnie połowę odległości między rozwidleniem a klipsem na CCA. Zawiąż dolny węzeł ECA.
Sprawdź, czy węzeł jest wystarczająco luźny, aby umożliwić płynność kapilarną i wystarczająco szczelny, aby zapobiec przeciekaniu. Następnie wyjmij klips z ICA. Delikatnie docisnąć tłok strzykawki, umożliwiając infuzję substancji z prędkością około 10 mikrolitrów na sekundę.
Po infuzji substancji badanej umieścić klips z powrotem na ICA. Delikatnie wyjmij rurkę kapilarną. Następnie całkowicie zwiąż dolny węzeł ECA.
Usuń zacisk z ICA i CCA. Następnie zdejmij retraktor lub haczyki na chusteczki i poduszkę. Oczyść obszar, który ma być zszyty, sterylnym roztworem soli fizjologicznej, a następnie zamknij nacięcie za pomocą nylonowych szwów.
Po podaniu zatwierdzonego środka przeciwzapalnego i przeciwbólowego w celu złagodzenia dyskomfortu pooperacyjnego, umieść zwierzę w klatce na poduszce grzewczej na co najmniej godzinę i monitoruj powrót do zdrowia. Ten histogram pokazuje wykrywanie HIV za pomocą PCR w czasie rzeczywistym siedem dni po infuzji wirusa przez lewą tętnicę szyjną wewnętrzną. Zgodnie z oczekiwaniami, poziom wirusa jest wyższy w lewej półkuli.
Ten obraz immunofluorescencyjny pokazuje fragment mózgu myszy przedstawiający znacznik GFP CD63, marker egzosomu, po infuzji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych przez tętnicę szyjną wewnętrzną. Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe wyrażające CD63, pokazane na zielono, są związane z mikronaczyniem mózgowym myszy. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w 20 minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.
Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się chorobami neurodegeneracyjnymi do badania interakcji leków, patogenów i egzosomów u myszy.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje technikę mikrochirurgicznej infuzji u myszy, która pozwala na dostarczenie substancji bezpośrednio do mózgu poprzez tętnicę szyjną wewnętrzną. Metoda ta minimalizuje urazy i zachowuje integralność neuronów, zapewniając jednocześnie wysokie stężenia substancji w mózgu.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Mikrochirurgia
- Dostarczanie substancji
Wstęp
- Zrozumienie działania leków w mózgu.
- Badanie wpływu patogenów i egzosomów.
- Minimalizacja urazów zwierząt podczas eksperymentów.
- Zachowanie integralności sieci neuronalnej.
Cel badania
- Aby dostarczyć substancje egzogenne bez penetracji czaszki.
- Aby usprawnić badania z zakresu neuronauki.
- Aby osiągnąć wysokie stężenia substancji w mózgu.
Zastosowane metody
- Podanie izofluranu zmieszanego z tlenem w celu znieczulenia.
- Przeniesienie myszy na powierzchnię operacyjną pod stereomikroskop.
- Założenie maski nosowej w celu utrzymania znieczulenia.
- Monitorowanie częstotliwości oddechów podczas procedury.
Główne wyniki
- Skuteczne dostarczenie substancji do mózgu myszy.
- Minimalna trauma zwierzęcia.
- Zachowanie integralności sieci neuronalnej.
- Osiągnięcie wysokich stężeń substancji w mózgu.
Wnioski
- Technika ta jest skuteczna w badaniu funkcji mózgu.
- Stanowi ona mniej inwazyjną alternatywę dla tradycyjnych metod.
- Przyszłe zastosowania mogą obejmować testowanie leków oraz modelowanie chorób.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Celowane dostarczanie substancji do OUN pozostaje krytycznym wyzwaniem w opracowywaniu neuroterapii ze względu na barierę krew-mózg oraz systemową ekspozycję poza celem. Ta mikrosurgicalna technika infuzji umożliwia precyzyjne dostarczenie reagentów testowych w wysokim stężeniu bezpośrednio do mózgu myszy, co wspiera redukcję ryzyka mechanistycznego i wierność modeli translacyjnych. Minimalna inwazyjność oraz zachowanie integralności neuronalnej sprawiają, że metoda ta jest wysoce istotna dla wczesnego etapu walidacji celów oraz przedklinicznych badań nad OUN.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią analizę celów w OUN poprzez ominięcie barier systemowych.
- Wspiera badania mechanistyczne działania leków, patogenów lub egzosomów w tkance mózgowej.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów przy minimalnym urazie zakłócającym wyniki.
- Zwiększa pewność prognostyczną dla portfeli projektów celowanych w OUN.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Przygotowuje zwalidowane modele OUN in vivo do późniejszych analiz farmakodynamicznych lub oznaczeń biomarkerów.
- Zapewnia powtarzalne, zlokalizowane dostarczenie substancji w celu ilościowego pomiaru wyników.
- Zmniejsza zmienność w porównaniu z systemowymi drogami podania.
- Umożliwia wiarygodną ocenę przenikania związku do mózgu oraz jego efektu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z modelami OUN istotnymi dla chorób w badaniach nad biomarkerami translacyjnymi.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrywania po walidację przedkliniczną dzięki zachowaniu sieci neuronalnych.
- Wspiera dostosowany do ryzyka postęp w rozwoju kandydatów ukierunkowanych na OUN.
- Stanowi platformę do badania mechanizmów neurodegeneracyjnych i zakaźnych chorób OUN.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta technika infuzji znajduje zastosowanie na styku wczesnego etapu odkrywania leków i przedklinicznych badań nad ośrodkowym układem nerwowym, umożliwiając bezpośrednie dostarczenie substancji do badań mechanistycznych oraz walidacji celu przed optymalizacją związku wiodącego.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących działania leków w OUN i zaangażowania szlaków sygnałowych.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalną, ilościową ekspozycję OUN do rozwoju testów analitycznych.
- Analityka: Umożliwia pomiar dystrybucji specyficznej dla mózgu oraz efektów molekularnych.
- Badania translacyjne: Ułatwia dopasowanie do modeli OUN i biomarkerów istotnych dla danej choroby.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Zapewnia zestandaryzowaną, małoinwazyjną platformę dostarczania do OUN dla różnorodnych programów B+R.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach OUN.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje podawanie substancji do OUN przy wysokiej powtarzalności i minimalnej traumie zwierząt.
- Wartość strategiczna: Poprawia decyzje go/no-go dla zasobów celowanych w OUN i zmniejsza ryzyko biologiczne na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację programów OUN z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o solidne dane in vivo.
Wskazówki dotyczące implementacji
- Wymaga wiedzy i przeszkolenia w zakresie mikrochirurgii w celu zapewnienia spójności wykonania.
- Wymaga dostępu do stereomikroskopii oraz precyzyjnego oprzyrządowania do infuzji.
- Wymaga rygorystycznej standaryzacji między zespołami w celu zapewnienia powtarzalności.
- Może wymagać adaptacji dla różnych modeli zwierzęcych lub obszarów OUN.
- Potencjalne ograniczenia obejmują krzywą uczenia się techniki oraz czas trwania procedury.
