Name: Indukcja udaru niedokrwiennego i reperfuzji niedokrwiennej u myszy przy użyciu techniki niedrożności tętnicy środkowej i wizualizacji obszaru zawału (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Poznaj metodę indukcji udaru niedokrwiennego u myszy poprzez okluzję tętnicy środkowej mózgu z zachowaniem tętnicy zewnętrznej. Technika umożliwia bezpośrednie podawanie leków do półkuli dotkniętej zawałem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować dr Lei Chen (Icahn School of Medicine at Mount Sinai, NY), który jako pierwszy stworzył ten model w naszym laboratorium. Wspierane częściowo przez HL126559, DA039576, MH098891, MH63022, MH072567, DA027569 i NSC 2015/17/B/NZ7/02985. Dr Luc Bertrand jest częściowo wspierany przez stypendium podoktorskie American Heart Association (16POST31170002).

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez University of Miami Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health (NIH). Wymagane jest stosowanie sterylnego sprzętu i technik aseptycznych.
1. Przygotowanie szwu okluzyjnego
<ol>
	<li>Użyj szwu o średnicy 0,21 mm dla myszy o masie ciała od 20 do 25 g i 0,23 mm dla myszy o masie ciała 25 - 35 g. Wybór rodzaju szwów do zabiegu MCAO zależy od masy ciała zwierzęcia.</li>
	<li>Za pomocą srebrnego pisaka zaznacz szew na 9 mm, zaczynając od końcówki pokrytej silikonem. Będzie to służyć jako wskazówka dotycząca długości wsunięcia.</li>
</ol>
2. Przygotowanie do operacji
<ol>
	<li>Znieczulić mysz izofluranem zmieszanym z tlenem, używając laboratoryjnego systemu znieczulającego. Użyj izofluranu przy ustawieniu 5 i przepływu tlenu przy 2 w maszynie komercyjnej (patrz tabela materiałów). Przenieś zwierzę na powierzchnię operowaną i podtrzymaj znieczulenie za pomocą stożka nosowego (użyj izofrunu ustawionego na 1,5 - 2,5 i przepływu tlenu na 2).
	<ol>
		<li>Upewnij się, że częstość oddechów myszy wynosi około 1-2 oddechów na sekundę bez łapania oddechu. Ponadto upewnij się, że zwierzę nie wykazuje reakcji stymulacji wąsów i odruchu pedałowania (szczypania palców). Monitoruj częstość oddechów i wysiłek podczas zabiegu, co najmniej co 5 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nałóż kroplę lubrykantu okulistycznego na każde oko za pomocą sterylnego wacika, aby zapobiec ich wysuszeniu podczas zabiegu. Alternatywnie nałóż maść okulistyczną na oko ze sterylnej tubki farmaceutycznej.</li>
	<li>Odwróć zwierzę na plecy i ogol obszar nacięcia. Następnie dokładnie zdezynfekuj obszar operacyjny za pomocą 70% etanolu, następnie chlorheksydyny i końcowego wacika z 70% etanolem. Umieść zwierzę na ciepłej powierzchni chirurgicznej pod mikroskopem stereoskopowym.</li>
</ol>
3. Rozwarstwienie tętnicy szyjnej wspólnej i rozgałęzienia wewnętrzne/zewnętrzne
<ol>
	<li>Za pomocą nożyczek chirurgicznych i kleszczy należy wykonać płytkie nacięcie w linii środkowej szyi, od góry mostka do poniżej żuchwy (około 3 - 4 cm). Wokół obszaru operacyjnego należy umieścić serwetę chirurgiczną, aby zapobiec kontaktowi narzędzi z niesterylnymi powierzchniami. Serweta chirurgiczna została pominięta w obecnym filmie, aby ułatwić filmowanie.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy ostrożnie oddziel tkankę tłuszczową i łączną, aby odsłonić tchawicę. Tkanka powinna łatwo i naturalnie rozdzielać się na obie strony.</li>
	<li>Umieść poduszkę (okrągły przedmiot o średnicy około 0,5 cm) z tyłu szyi myszy, aby przedłużyć szyję, dodatkowo odsłaniając obszar do operacji.</li>
	<li>Otwórz nacięcie za pomocą zwijacza tkanek lub haczyków.</li>
	<li>Po lewej stronie tchawicy zwierzęcia ostrożnie rozsuń tkankę łączną, aby odsłonić lewą tętnicę szyjną wspólną (CCA). Uważaj, aby nie uszkodzić nerwów i głównych żył w pakiecie z CCA.</li>
	<li>Kontynuuj odsłanianie CCA, uważając, aby oderwać się od leżącej pod spodem tkanki i odsłonić górne rozgałęzienie "Y" tętnicy mózgowej wewnętrznej (ICA) i tętnicy mózgowej zewnętrznej (ECA). Aby pomóc w odłączeniu CCA, włóż zakrzywione kleszcze pod CCA, aby przebić tkankę łączną, a następnie powoli pozwól im się otworzyć.</li>
</ol>
4. Przygotowanie CCA do założenia szwu MCAO
<ol>
	<li>Umieść 3 segmenty nylonowego szwu o długości około 4 cm pod CCA. Upewnij się, że CCA nie jest skręcona, ponieważ drastycznie skomplikowałoby to wprowadzenie szwu.</li>
	<li>W najniższym możliwym punkcie zamknij dolny szew za pomocą stałego węzła.</li>
	<li>Zawiąż górny szew tuż pod rozgałęzieniem ICA/ECA za pomocą zdejmowanego węzła poślizgowego.</li>
	<li>Zawiąż środkowy szew za pomocą odpinanego węzła poślizgowego, ale utrzymuj go szeroko otwartym. Ważne jest, aby pozostawić dużo miejsca, aby nie utrudniać zakładania szwów.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek sprężynowych do mikrodysekcji wykonaj nacięcie w CCA między dolnymi i środkowymi szwami. Wykonaj nacięcie 0,2 mm w pobliżu dolnego szwu.</li>
</ol>
5. Niedrożność tętnicy środkowej mózgu
<ol>
	<li>Za pomocą kleszczy włóż szew MCAO do nacięcia CCA, prowadząc go do góry. Wykonaj ten krok szybko po kroku 4.5, aby zapobiec krzepnięciu i zamknięciu otworu CCA. W przypadku, gdy wprowadzenie szwu jest zablokowane, użyj końcówek kleszczy, aby ponownie otworzyć nacięcie.</li>
	<li>Delikatnie zawiąż środkowy szew na silikonowej części do szwu MCAO za pomocą węzła poślizgowego, aby ograniczyć przepływ krwi wokół niego, ale na tyle luźno, aby mógł się swobodnie poruszać.</li>
	<li>Ostrożnie odpiąć górny szew, upewniając się, że szew MCAO nie wyślizguje się.</li>
	<li>Wprowadzić szew MCAO do ICA na kilka milimetrów, a następnie ponownie zamknąć szew górny, w taki sam sposób, jak opisano w kroku 5.2.</li>
	<li>Poprowadź szew MCAO do obszaru okluzji. Wskazaniem udanego wprowadzenia jest niewielka ilość cofania się krwi z nacięcia CCA oraz to, że srebrny znak 9 mm znajduje się między nacięciem CCA a rozwidleniem ICA/ECA. Dalsze potwierdzenie udanej okluzji można uzyskać za pomocą metod monitorowania, takich jak laserowy dopplerowski system monitorowania przepływu krwi15,16. 
	UWAGA: Spadek przepływu krwi o 90% do środkowego obszaru mózgu po stronie okluzji wskazuje na udaną okluzję.</li>
	<li>Po udanej okluzji mocno zawiąż środkowy i górny szew. W przypadku wykonywania pozorowanego zakładania nie należy ponownie zakładać szwów, ale natychmiast przejść do kroku 7.3.</li>
</ol>
6. Zamykanie nacięć i opieka pooperacyjna
<ol>
	<li>Wsuń szwy w obszar nacięcia.</li>
	<li>Usuń retraktor lub haczyki na chusteczki i poduszkę.</li>
	<li>Oczyść obszar szwu za pomocą sterylnej soli fizjologicznej i bawełnianego wacika.</li>
	<li>Zamknij nacięcie za pomocą nylonowego szwu/igły i kleszczy.</li>
	<li>Podawać leki przeciwzapalne (np. karprofen 10 mg/kg s.c.) i przeciwbólowe (np. buprenorfina 0,1 mg/kg s.c., dwa razy dziennie) w celu złagodzenia dyskomfortu pooperacyjnego. Umieść myszy w klatce umieszczonej na podgrzewanej podkładce, aby zapobiec hipotermii i zapewnić dostęp do wody i zmiękczonego pokarmu ad labium.</li>
	<li>Monitorować powrót zwierząt do zdrowia (5 - 10 min) i objawy udaru. Mogą się one wahać od łagodnego paraliżu bocznego i krążenia do ciężkiego skurczu przeciwległego boku i toczenia. W dyskusji wymieniono kilka punktów oceny. Zwierzęta wykazujące objawy niewydolności oddechowej lub ciężkie drgawki powinny zostać poddane eutanazji.</li>
	<li>W zależności od protokołu reperfuzji niedokrwiennej, szew MCAO należy pozostawić na miejscu od 30 minut do 120 minut lub dłużej. Skrócenie czasu okluzji zapobiega śmiertelności.</li>
	<li>W przypadku trwałej niedrożności należy pozostawić szew MCAO na miejscu na 24 godziny, jednak należy spodziewać się znacznej śmiertelności. Po upływie tego czasu przejdź do kroku 7.
	<ol>
		<li>Jeśli używasz modelu stałej okluzji, trzymaj myszy w klatce do punktu końcowego. W tym czasie usuń szew (kroki od 7.1 do 7.8). Zabieg ten można wykonać również po eutanazji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Reperfuzja
<ol>
	<li>Ponownie znieczulić zwierzę (postępować zgodnie z instrukcjami w ppkt 2.1) i usunąć szwy zamykające ranę.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy i separatorów tkanek ponownie otwórz nacięcie i odsłoń CCA.</li>
	<li>Ostrożnie zdejmij górny szew i delikatnie pociągnij za szew MCAO, aż część pokryta silikonem znajdzie się na środkowym węźle.</li>
	<li>Ponownie zawiąż górny węzeł na szwie, aby zapobiec przepływowi krwi przez szew (nie musi to być węzeł poślizgowy).</li>
	<li>Ostrożnie rozepnij środkowy węzeł i przeciągnij szew poza górny węzeł, ale trzymaj go w CCA.</li>
	<li>Szczelnie zamknij górny węzeł, aby zablokować przepływ krwi w tętnicy.</li>
	<li>Wyciągnij całkowicie szew MCAO i szczelnie zamknij środkowy węzeł.</li>
	<li>Szew MCAO może być wielokrotnie używany. Po każdym użyciu należy dokładnie oczyścić szew w 70% etanolu, aby usunąć zanieczyszczenia (np. krew lub tkanki) za pomocą sterylnej gazy. Następnie umieść szew w woreczku sterylizatora i wysterylizuj go.</li>
	<li>Powtórz kroki 6.1 - 6.4 i monitoruj powrót do zdrowia zwierząt.</li>
</ol>
8. Analiza tkankowa
<ol>
	<li>Aby monitorować objętość wyrzutową, należy przeciąć mózg.
	<ol>
		<li>Poddaj mysz eutanazji w dwuetapowym procesie. Najpierw należy wystawić zwierzę na przedawkowanie izofluranu do momentu zatrzymania oddychania. W przypadku barwienia TTC należy natychmiast odciąć głowę myszy i przystąpić do ekstrakcji mózgu. W przypadku wycinków mózgu (np. do analiz barwienia immunologicznego) przed dekapitacją należy przeprowadzić perfuzję przez nakłucie serca.  </li>
		<li>Odetnij głowę u podstawy czaszki i odetnij skórę głowy od otworu szyi do szczytu czaszki aż między oczami. Mając odsłoniętą czaszkę, przetnij kość po obu stronach, zaczynając od podstawy czaszki otwierającej się do oczodołu. Wykonaj to cięcie wzdłuż szerokiej części czaszki. Uważaj, aby nie sięgać nożyczkami zbyt głęboko, aby nie uszkodzić mózgu.</li>
		<li>Następnie przetnij kość między dwoma oczodołami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Za pomocą kleszczy podnieś górną część czaszki, aby odsłonić mózg. Opór powinien być tylko niewielki. Jeśli nie podnosi się łatwo, nacięcia czaszki mogą być niekompletne. Delikatnie podważ mózg za pomocą, zakrzywionych kleszczy. Mózg może być nadal połączony kilkoma nerwami. Postępuj powoli, usuwając po drodze załączniki.</li>
	<li>Umieść świeży mózg w matrycy mózgowej o średnicy 1 mm, dodaj kilka kropli PBS i pokrój wzdłuż matrycy za pomocą żyletki lub ostrza kriostatu.</li>
	<li>Przenieść mózg do naczynia o średnicy 100 mm i dodać roztwór barwiący (2% chlorek 2,3,5-trifenylotetrazolu [TTC] rozpuszczony w PBS), aby przykryć dno naczynia. Za pomocą dwóch kleszczy oddziel wszystkie plasterki mózgu (przodem do dołu) i ułóż je w kolejności na dnie naczynia. 
	UWAGA: Barwienie zmieni żywotną tkankę na czerwoną, a tkanka nieżywotna pozostanie biała. Podgrzanie roztworu do 37 °C przyspieszy barwienie. Oznaki udaru (białe) można zauważyć już po 90 minutach od udaru i pozostają one widoczne przez ponad 7 dni. Obrazowanie powinno być wykonane wraz z linijką, aby umożliwić obliczenie objętości wyrzutu.</li>
	<li>Przetwarzaj wypreparowane mózgi do sekcji, barwienia immunologicznego, izolacji białek lub wielu innych procedur17,18,19.</li>
</ol>

<ol><li>Cuomo, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antithrombin+reduces+ischemic+volume%2C+ameliorates+neurologic+deficits%2C+and+prolongs+animal+survival+in+both+transient+and+permanent+focal+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Antithrombin reduces ischemic volume, ameliorates neurologic deficits, and prolongs animal survival in both transient and permanent focal ischemia.</a> Stroke. 38 (12), 3272-3279 (2007).</li>
<li>Wauquier, A., Melis, W., Janssen, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+neurological+assessment+of+the+post-resuscitative+effects+of+flunarizine%2C+verapamil+and+nimodipine+in+a+new+model+of+global+complete+ischaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Long-term neurological assessment of the post-resuscitative effects of flunarizine, verapamil and nimodipine in a new model of global complete ischaemia.</a> Neuropharmacology. 28 (8), 837-846 (1989).</li>
<li>Liu, F., McCullough, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Middle+cerebral+artery+occlusion+model+in+rodents%3A+methods+and+potential+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Middle cerebral artery occlusion model in rodents: methods and potential pitfalls.</a> J Biomed Biotechnol. 2011, 464701(2011).</li>
<li>Chiu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+tissue+plasminogen+activator+for+acute+ischemic+stroke%3A+feasibility%2C+safety%2C+and+efficacy+in+the+first+year+of+clinical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Intravenous tissue plasminogen activator for acute ischemic stroke: feasibility, safety, and efficacy in the first year of clinical practice.</a> Stroke. 29 (1), 18-22 (1998).</li>
<li>Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+middle+cerebral+artery+occlusion+without+craniectomy+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.</a> Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).</li>
<li>Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. <a target="_blank" href="https://www.jstage.jst.go.jp/article/jstroke1979/8/1/8_1_1/_article">Experimental studies of ischemic brain edema, I: a new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area.</a> Jpn J Stroke. 8, 1-8 (1986).</li>
<li>Liu, F., Schafer, D. P., McCullough, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TTC%2C+fluoro-Jade+B+and+NeuN+staining+confirm+evolving+phases+of+infarction+induced+by+middle+cerebral+artery+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">TTC, fluoro-Jade B and NeuN staining confirm evolving phases of infarction induced by middle cerebral artery occlusion.</a> J Neurosci Methods. 179 (1), 1-8 (2009).</li>
<li>Liu, F., Yuan, R., Benashski, S. E., McCullough, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+experimental+stroke+outcome+across+the+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Changes in experimental stroke outcome across the life span.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 29 (4), 792-802 (2009).</li>
<li>Wang, R. Y., Wang, P. S., Yang, Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+age+in+rats+following+middle+cerebral+artery+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22Gerontology%22%5BJournal%5D)">Effect of age in rats following middle cerebral artery occlusion.</a> Gerontology. 49 (1), 27-32 (2003).</li>
<li>Baskerville, T. A., Macrae, I. M., Holmes, W. M., McCabe, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+gender+on+%27tissue+at+risk%27+in+acute+stroke%3A+A+diffusion-weighted+magnetic+resonance+imaging+study+in+a+rat+model+of+focal+cerebral+ischaemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">The influence of gender on 'tissue at risk' in acute stroke: A diffusion-weighted magnetic resonance imaging study in a rat model of focal cerebral ischaemia.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 36 (2), 381-386 (2016).</li>
<li>Cai, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-transplantation+of+hippocampal+neural+stem+cells+and+astrocytes+and+microvascular+endothelial+cells+improve+the+memory+in+ischemic+stroke+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Clin+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Co-transplantation of hippocampal neural stem cells and astrocytes and microvascular endothelial cells improve the memory in ischemic stroke rat.</a> Int J Clin Exp Med. 8 (8), 13109-13117 (2015).</li>
<li>Cheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenously+delivered+neural+stem+cells+migrate+into+ischemic+brain%2C+differentiate+and+improve+functional+recovery+after+transient+ischemic+stroke+in+adult+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Clin+Exp+Pathol%22%5BJournal%5D)">Intravenously delivered neural stem cells migrate into ischemic brain, differentiate and improve functional recovery after transient ischemic stroke in adult rats.</a> Int J Clin Exp Pathol. 8 (3), 2928-2936 (2015).</li>
<li>Nagai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+Administration+of+Cilostazol+Nanoparticles+Ameliorates+Acute+Ischemic+Stroke+in+a+Cerebral+Ischemia%2FReperfusion-Induced+Injury+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Intravenous Administration of Cilostazol Nanoparticles Ameliorates Acute Ischemic Stroke in a Cerebral Ischemia/Reperfusion-Induced Injury Model.</a> Int J Mol Sci. 16 (12), 29329-29344 (2015).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+PEP-1-GDNF+is+protective+after+focal+cerebral+ischemia+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Intravenous PEP-1-GDNF is protective after focal cerebral ischemia in rats.</a> Neurosci Lett. 617, 150-155 (2016).</li>
<li>Hedna, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validity+of+Laser+Doppler+Flowmetry+in+Predicting+Outcome+in+Murine+Intraluminal+Middle+Cerebral+Artery+Occlusion+Stroke%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vasc+Interv+Neurol%22%5BJournal%5D)">Validity of Laser Doppler Flowmetry in Predicting Outcome in Murine Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion Stroke.</a> J Vasc Interv Neurol. 8 (3), 74-82 (2015).</li>
<li>Tajima, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducibility+of+measuring+cerebral+blood+flow+by+laser-Doppler+flowmetry+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci+%28Elite+Ed%29%22%5BJournal%5D)">Reproducibility of measuring cerebral blood flow by laser-Doppler flowmetry in mice.</a> Front Biosci (Elite Ed). 6, 62-68 (2014).</li>
<li>Fang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scutellarin+regulates+microglia-mediated+TNC1+astrocytic+reaction+and+astrogliosis+in+cerebral+ischemia+in+the+adult+rats%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Scutellarin regulates microglia-mediated TNC1 astrocytic reaction and astrogliosis in cerebral ischemia in the adult rats.</a> BMC Neurosci. 16, 84(2015).</li>
<li>Evilsizor, M. N., Ray-Jones, H. F., Lifshitz, J., Ziebell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer+for+immunohistochemistry+on+cryosectioned+rat+brain+tissue%3A+example+staining+for+microglia+and+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Primer for immunohistochemistry on cryosectioned rat brain tissue: example staining for microglia and neurons.</a> J Vis Exp. (99), e52293(2015).</li>
<li>Kramer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TTC+staining+of+damaged+brain+areas+after+MCA+occlusion+in+the+rat+does+not+constrict+quantitative+gene+and+protein+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">TTC staining of damaged brain areas after MCA occlusion in the rat does not constrict quantitative gene and protein analyses.</a> J Neurosci Methods. 187 (1), 84-89 (2010).</li>
<li>Wu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keep+warm+and+get+success%3A+the+role+of+postischemic+temperature+in+the+mouse+middle+cerebral+artery+occlusion+model%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Bull%22%5BJournal%5D)">Keep warm and get success: the role of postischemic temperature in the mouse middle cerebral artery occlusion model.</a> Brain Res Bull. 101, 12-17 (2014).</li>
<li>Liu, S., Zhen, G., Meloni, B. P., Campbell, K., Winn, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+Stroke+Model+Guidelines+for+Preclinical+Stroke+Trials+%281st+Edition%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Stroke+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Rodent Stroke Model Guidelines for Preclinical Stroke Trials (1st Edition).</a> J Exp Stroke Transl Med. 2 (2), 2-27 (2009).</li>
<li>Tsuchiya, D., Hong, S., Kayama, T., Panter, S. S., Weinstein, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+suture+size+and+carotid+clip+application+upon+blood+flow+and+infarct+volume+after+permanent+and+temporary+middle+cerebral+artery+occlusion+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of suture size and carotid clip application upon blood flow and infarct volume after permanent and temporary middle cerebral artery occlusion in mice.</a> Brain Res. 970 (1-2), 131-139 (2003).</li>
<li>Wolff, G., Davidson, S. J., Wrobel, J. K., Toborek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise+maintains+blood-brain+barrier+integrity+during+early+stages+of+brain+metastasis+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Exercise maintains blood-brain barrier integrity during early stages of brain metastasis formation.</a> Biochem Biophys Res Commun. 463 (4), 811-817 (2015).</li>
<li>Wrobel, J. K., Wolff, G., Xiao, R., Power, R. F., Toborek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+Selenium+Supplementation+Modulates+Growth+of+Brain+Metastatic+Tumors+and+Changes+the+Expression+of+Adhesion+Molecules+in+Brain+Microvessels%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Trace+Elem+Res%22%5BJournal%5D)">Dietary Selenium Supplementation Modulates Growth of Brain Metastatic Tumors and Changes the Expression of Adhesion Molecules in Brain Microvessels.</a> Biol Trace Elem Res. , (2015).</li>
<li>Chen, L., Swartz, K. R., Toborek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vessel+microport+technique+for+applications+in+cerebrovascular+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Vessel microport technique for applications in cerebrovascular research.</a> J Neurosci Res. 87 (7), 1718-1727 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konkurencji ani konfliktu interesów.

Pomyślne zastosowanie opisanej metody MCAO jest w dużym stopniu zależne od zrozumienia anatomii przepływu krwi w mózgu. Ponieważ prawidłowe umieszczenie szwu jest trudne do zauważenia ze względu na brak bezpośrednich wskazówek wizualnych, ważne jest, aby opanować procedurę przed użyciem jej do badań śledczych. Objętość wyrzutowa powinna być analizowana, aby zapewnić spójne wyniki. Dodanie laserowego systemu Dopplera może pomóc w określeniu pomyślnej okluzji przepływu krwi i powinno być stosowane okresowo, aby upewnić się...

Badanie chorób sercowo-naczyniowych, takich jak udar mózgu, opiera się na wykorzystaniu modeli in vivo. Aby zrozumieć możliwe implikacje niedokrwienia, toksyczności leków i/lub leczenia, istnieje potrzeba użycia odpowiedniego, ustandaryzowanego, wiarygodnego i powtarzalnego modelu choroby, który umożliwia badania porównawcze między grupami leczenia. W tym manuskrypcie używamy myszy, biorąc pod uwagę dostępność dużej liczby myszy transgenicznych i standaryzowane modele oceny. Opracowano wyniki grabieży do oceny deficytów motorycznych i behawioralnych po eksperymentalnym udarze niedokrwiennym mózgu i następującej po nim rekonwalescencji1,2.
Dostępnych jest kilka modeli udaru niedokrwiennego, takich jak całkowite globalne niedokrwienie mózgu, niepełne globalne niedokrwienie, wieloogniskowe niedokrwienie mózgu i ogniskowe niedokrwienie mózgu. Ta ostatnia grupa jest również kategorią udaru mózgu najczęściej występującą u pacjentów. Większość zdarzeń jest inicjowana przez powstanie niedrożności zatorowej lub zakrzepowej w lub w pobliżu tętnicy środkowej mózgu (MCA). Biorąc pod uwagę te parametry, przedstawiony model ściśle naśladuje etiologię choroby udaru mózgu u człowieka i sprawia, że uzyskane wyniki są bardzo istotne3. Niemniej jednak przełożenie odkryć z modeli zwierzęcych na leczenie chorób u ludzi okazało się wyzwaniem. Do tej pory tylko stosowanie trombolitycznego tkankowego aktywatora plazminogenu zostało zatwierdzone do leczenia ostrego udaru niedokrwiennego mózgu4.
Wśród modeli ogniskowego niedokrwienia mózgu u myszy, model udaru tylnego krążenia mózgowego i model zakrzepicy żył mózgowych są wysoce inwazyjne, co zmniejsza ich przydatność i ogranicza zakres analiz, które można wykonać. Jednak inne techniki, takie jak model zatorowy, model fotozakrzepicy, model udaru indukowanego endoteliną-1 i model niedrożności środkowej tętnicy mózgowej (MCAO) ze szwem śródświetlnym, są dostępne do stosowania bez takich ograniczeń. Model MCAO jest techniką opisaną w tym protokole. Oferuje niezawodną metodę wywoływania ogniskowego niedokrwienia mózgu, która może być łatwo reperperfowana i wykonywana w sposób wysokoprzepustowy. Istnieją dwa podejścia do tego modelu, a mianowicie metody Zea-Longa i Koizumi. Różnią się one nieznacznie sposobem wprowadzania szwu okluzyjnego do naczynia krwionośnego. W technice Zea-Longa szew jest wprowadzany przez tętnicę szyjną zewnętrzną5. Przedstawiona tutaj technika jest zmodyfikowana w stosunku do metody Koizumi, w której szew okluzyjny jest wprowadzany przez tętnicę szyjną wspólną6.
Model MCAO został z powodzeniem zastosowany do oceny różnych zdarzeń występujących podczas udaru niedokrwiennego. Po reperfuzji można zaobserwować obrzęk mózgu wraz z uszkodzeniem bariery krew-mózg. Szczytowa śmierć neuronów jest zwykle obserwowana po 24 godzinach; Jednak po 7 dniach wraca do poziomu wyjściowego<klasa SUP="xref">7. U ludzi płeć i wiek są ważnymi zmiennymi przy określaniu wyniku udaru, obserwuje się to również u myszy i szczurów8,9,10. W kilku publikacjach wykorzystano model MCAO w celu zademonstrowania skuteczności leczenia11,12,13,14.

<table><tbody><tr><td>Szew MCAO 0,23 mm</td><td>Doccol</td><td>702345PK5Re</td><td></td></tr><tr><td>Szew MCAO 0,21 mm</td><td>Doccol</td><td>702145PK5Re</td><td></td></tr><tr><td>Srebrne</td><td>zszywki do długopisów</td><td>503205</td><td></td></tr><tr><td>Maszyna anestezjologiczna</td><td>Vetequip</td><td>901806</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne</td><td>Narzędzie do nauki o tematyce precyzyjnej</td><td>14558-09</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze chirurgiczne z prostą końcówką</td><td>Fine narzędzie naukowe</td><td>00108-11</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze chirurgiczne z końcówką kątową</td><td>Narzędzie do nauki</td><td>precyzyjnej 00109-11</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe</td><td>Narzędzie do nauki precyzyjnej</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Szew nylonowy</td><td>Braintree scintific</td><td>SUT-S 104</td><td></td></tr><tr><td>Szew zamykający</td><td>VWR</td><td>95057-036</td><td></td></tr><tr><td>Izofluran</td><td>Piramal</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2,3,5- Chlorek trifenylotetrazolu</td><td>FisherSci</td><td>50-121-8005</td><td></td></tr><tr><td>Blok mózgowy</td><td>Braintree scintific</td><td>BS-A 5000C</td><td></td></tr><tr><td>Ostrze kriostatu</td><td>VWR</td><td>89202-606</td><td></td></tr><tr><td>Opcjonalnie:</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Periflux Laserowy system dopplerowski</td><td>Perimed Periflux</td><td>5000</td><td></td></tr><tr><td>Jednostka monitorująca</td><td>Perimed</td><td>PF 5010 - LDPM</td><td></td></tr></tbody></table>

indukcja udaru niedokrwiennego i reperfuzji niedokrwiennej u myszy przy użyciu techniki niedrożności tętnicy środkowej i wizualizacji obszaru zawału

Induction of Ischemic Stroke and Ischemia-reperfusion in Mice Using the Middle Artery Occlusion Technique and Visualization of Infarct Area

Choroba naczyniowo-mózgowa jest bardzo rozpowszechniona w populacji globalnej i obejmuje kilka rodzajów schorzeń, w tym udar mózgu. Aby zbadać wpływ udaru mózgu na uszkodzenia tkanek i ocenić skuteczność interwencji terapeutycznych, opracowano kilka modeli eksperymentalnych u różnych gatunków. Należą do nich całkowite globalne niedokrwienie mózgu, niepełne globalne niedokrwienie, ogniskowe niedokrwienie mózgu i wieloogniskowe niedokrwienie mózgu. Model opisany w tym protokole opiera się na niedrożności tętnicy środkowej mózgu (MCAO) i jest związany z kategorią ogniskowego niedokrwienia. Technika ta powoduje stałe ogniskowe niedokrwienie w ściśle określonym obszarze półkuli i jest mniej inwazyjna niż inne metody. Opisana procedura jest wykonywana na myszach, biorąc pod uwagę dostępność kilku wariantów genetycznych i dużą liczbę testów standaryzowanych dla myszy, aby pomóc w ocenie behawioralnej i neurodeficytów.

Droga wprowadzania szwu zamykającego jest przedstawiona na Rysunku 1. Szew MCAO należy poprowadzić do miejsca okluzji, rozgałęziając się w ICA. Skuteczna okluzja MCA doprowadzi do uszkodzenia tkanki, widocznego po barwieniu TTC. Rysunek 2 przedstawia obrazy barwienia zwierzęcia z grupy kontrolnej (sham) (Rysunek 2A) oraz zwierzęcia po 60-minutowej ischemii i reperfuzji MCAO (barwienie w 90. minucie lub 24 h po okluzji, Rysunek 2B<...

Opisujemy mysi model udaru wywołanego przez zamknięcie środkowej tętnicy mózgowej za pomocą szwu pokrytego silikonem. Protokół może być stosowany w celu wywołania trwałej okluzji lub tymczasowego niedokrwienia, a następnie reperfuzji.

Indukcja udaru niedokrwiennego i reperfuzji niedokrwiennej u myszy przy użyciu techniki niedrożności tętnicy środkowej i wizualizacji obszaru zawału

Cerebrovascular disease is highly prevalent in the global population and encompasses several types of conditions, including stroke. To study the impact of ...

Ogólnym celem tej procedury chirurgicznej jest oficjalne i niezawodne wywołanie udaru niedokrwiennego przy jednoczesnym pozostawieniu nienaruszonej zewnętrznej tętnicy mózgowej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad udarem, takie jak wpływ leczenia na ciężkość udaru. Główną zaletą tej techniki jest to, że po indukcji udaru zewnętrzna tętnica mózgowa pozostaje dostępna do podania leku bezpośrednio do dotkniętej chorobą półkuli.Umieść mysz znieczuloną izofluranem na przygotowanej powierzchni operacyjnej i dopasuj stożek nosowy, aby podać izofluran zmieszany z tlenem. Upewnij się, że częstość oddechów wynosi około jednego do dwóch oddechów na sekundę bez sapania. Ponadto upewnij się, że zwierzę nie wykazuje reakcji na stymulację wąsów lub odruch pedałowania.Nałóż kroplę lubrykantu okulistycznego na każde oko, używając sterylnego wacika, aby zapobiec ich wysuszeniu podczas zabiegu. Po ogoleniu miejsca nacięcia należy dokładnie zdezynfekować obszar operacji za pomocą 70% etanolu i roztworu na bazie chlorheksydyny. Trzymaj zwierzę na ciepłej powierzchni chirurgicznej pod mikroskopem stereoskopowym.Następnie za pomocą nożyczek chirurgicznych i kleszc

induction-ischemic-stroke-ischemia-reperfusion-mice-using-middle

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Chirurgiczne wywołanie niedokrwiennego uszkodzenia mózgu u szczura jest powszechnie stosowanym modelem w badaniach nad udarem. W niniejszej pracy demonstrujemy indukcję ogniskowego niedokrwienia mózgu poprzez zamknięcie tętnicy środkowej mózgu. Przedstawiono również wizualizację powstałego zawału za pomocą barwienia histologicznego oraz obrazowania rezonansem magnetycznym.

Model ogniskowego niedokrwienia mózgu poprzez endowaskularną okluzję tętnicy środkowej mózgu u szczura za pomocą szwu

Włóknista okluzja tętnicy środkowej mózgu jest powszechnie stosowanym modelem badania udaru niedokrwiennego u myszy.

Modelowanie udaru u myszy – zator tętnicy środkowej mózgu z wykorzystaniem modelu filamentowego

W materiale wideo demonstrujemy metodę wywołania zatoru w środkowej tętnicy mózgowej u dorosłych myszy z wykorzystaniem wewnątrzluminalnego monofilamentu. Pokazujemy również, jak oceniać zakres zawału mózgu za pomocą barwienia chlorkiem 2,3,5-trifenylotetrazolu (TTC).

Myszy model udaru niedokrwiennego wywołanego zamknięciem tętnicy środkowej mózgu

Model intraluminalnego zamknięcia tętnicy środkowej mózgu (MCAO) jest najczęściej stosowanym modelem wśród eksperymentalnych modeli udaru niedokrwiennego. W niniejszym materiale szczegółowo zaprezentujemy cały model z wykorzystaniem laserowej flowmetrii dopplerowskiej oraz przedstawimy reprezentatywne wyniki.

Model wewnątrznaczyniowego zamknięcia tętnicy środkowej mózgu (MCAO) w udarze niedokrwiennym u myszy z prowadzeniem za pomocą laserowej dopplerometrii przepływu

W niniejszej pracy przedstawiono model intraluminalnego zamknięcia tętnicy środkowej mózgu u myszy. Zakres zawału mózgu oceniano za pomocą skali neurologicznej oraz barwienia fioletem krezylowym, który stanowi alternatywę dla barwienia TTC, oferując znaczącą zaletę w postaci możliwości równoległego badania wielu interesujących markerów.

Model mysi wewnątrzluminalnego MCAO: ocena zawału mózgu za pomocą barwienia fioletem krezylu

Aby zrozumieć patofizjologię udaru, ważne jest korzystanie z wiarygodnych modeli. W artykule opisano jeden z najczęściej stosowanych modeli udaru u myszy, określany jako model niedrożności tętnicy środkowej mózgu (MCAo) (określany również jako model włókna śródświetlnego lub szewu) z reperfuzją.

Podejście chirurgiczne do niedrożności tętnicy środkowej mózgu i udaru wywołanego reperfuzją u myszy

Wewnątrzświateł okluzja włókien środkowej tętnicy mózgowej jest najczęściej używanym modelem in vivo eksperymentalnego udaru mózgu u gryzoni. Wykonuje się tutaj alternatywne podejście chirurgiczne umożliwiające naprawę tętnicy szyjnej wspólnej, które umożliwia reperfuzję tętnicy szyjnej wspólnej i pełną reperfuzję do obszaru tętnicy środkowej mózgu.

Niedrożność tętnicy środkowej mózgu umożliwiająca reperfuzję poprzez wspólną naprawę tętnicy szyjnej u myszy

Mysi model niedokrwienia i reperfuzji mózgu został stworzony w celu zbadania patofizjologii udaru. Podwiązujemy dystalnie prawą środkową tętnicę mózgową i prawą tętnicę szyjną wspólną i przywracamy przepływ krwi po 10 lub 40 minutach niedokrwienia.

Mysi model zamknięcia dwóch naczyń niedokrwienia mózgu-reperfuzji

Tutaj opisujemy prostą i powtarzalną metodę, która może wywołać zawał mięśnia sercowego lub uszkodzenie niedokrwienno-reperfuzyjne mięśnia sercowego u myszy poprzez precyzyjne podwiązanie lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej za pomocą mikromanipulacji.

Indukcja zawału mięśnia sercowego i uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego mięśnia sercowego u myszy

Ten protokół opisuje model przejściowego ogniskowego niedokrwienia mózgu u myszy poprzez śródświetlne zamknięcie środkowej tętnicy mózgowej. Dodatkowo przedstawiono przykłady oceny wyników z wykorzystaniem rezonansu magnetycznego i testów behawioralnych.

Przejściowy model niedrożności tętnicy środkowej mózgu

Tutaj prezentujemy protokół do ustalenia modelu dystalnej niedrożności tętnicy środkowej mózgu (dMCAO) poprzez przezczaszkową elektrokoagulację u myszy C57BL/6J i oceny późniejszego zachowania neurologicznego i cech histopatologicznych.

Indukcja ostrego udaru niedokrwiennego u myszy przy użyciu techniki niedrożności dystalnej tętnicy środkowej

Poznaj metodę indukcji udaru niedokrwiennego u myszy poprzez okluzję tętnicy środkowej mózgu z zachowaniem tętnicy zewnętrznej. Technika umożliwia bezpośrednie podawanie leków do półkuli dotkniętej zawałem.

Indukcja udaru niedokrwiennego i reperfuzji niedokrwiennej u myszy przy użyciu techniki niedrożności tętnicy środkowej i wizualizacji obszaru zawału (Wideo) | JoVE Journal

Indukcja udaru niedokrwiennego i reperfuzji niedokrwiennej u myszy przy użyciu techniki niedrożności tętnicy środkowej i wizualizacji obszaru zawału

Przeglądaj więcej filmów