Indukcja udaru niedokrwiennego i reperfuzji niedokrwiennej u myszy przy użyciu techniki niedrożności tętnicy środkowej i wizualizacji obszaru zawału

Ogólnym celem tej procedury chirurgicznej jest oficjalne i niezawodne wywołanie udaru niedokrwiennego przy jednoczesnym pozostawieniu nienaruszonej zewnętrznej tętnicy mózgowej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad udarem, takie jak wpływ leczenia na ciężkość udaru. Główną zaletą tej techniki jest to, że po indukcji udaru zewnętrzna tętnica mózgowa pozostaje dostępna do podania leku bezpośrednio do dotkniętej chorobą półkuli.

Umieść mysz znieczuloną izofluranem na przygotowanej powierzchni operacyjnej i dopasuj stożek nosowy, aby podać izofluran zmieszany z tlenem. Upewnij się, że częstość oddechów wynosi około jednego do dwóch oddechów na sekundę bez sapania. Ponadto upewnij się, że zwierzę nie wykazuje reakcji na stymulację wąsów lub odruch pedałowania.

Nałóż kroplę lubrykantu okulistycznego na każde oko, używając sterylnego wacika, aby zapobiec ich wysuszeniu podczas zabiegu. Po ogoleniu miejsca nacięcia należy dokładnie zdezynfekować obszar operacji za pomocą 70% etanolu i roztworu na bazie chlorheksydyny. Trzymaj zwierzę na ciepłej powierzchni chirurgicznej pod mikroskopem stereoskopowym.

Następnie za pomocą nożyczek chirurgicznych i kleszczy wykonaj płytkie nacięcie linii środkowej szyi od góry mostka do poniżej żuchwy. Za pomocą kleszczy ostrożnie oddziel tkankę tłuszczową i łączną, aby odsłonić tchawicę. Tkanki powinny łatwo i naturalnie rozdzielać się na obie strony.

Następnie umieść poduszkę lub inny okrągły przedmiot o średnicy około 0,5 centymetra pod tylną częścią szyi, aby przedłużyć szyję i dodatkowo odsłonić obszar do operacji. Otwórz nacięcie za pomocą zwijacza tkanek lub haczyków. Następnie po lewej stronie tchawicy ostrożnie rozsuń tkankę łączną, aby odsłonić lewą tętnicę szyjną wspólną bez uszkadzania pobliskich nerwów i głównych żył.

Następnie włóż zakrzywione kleszcze pod CCA, aby przebić tkankę łączną, a następnie powoli pozwól im się otworzyć, aby uwolnić CCA. Odłącz CCA od leżącej poniżej tkanki i odsłoń górne rozgałęzienie tętnicy mózgowej wewnętrznej i tętnicy mózgowej zewnętrznej. Po odsłonięciu CCA włóż trzy segmenty nylonowego szwu pod CCA.

Upewnij się, że CCA nie jest skręcone, ponieważ drastycznie skomplikowałoby to wprowadzenie szwu. Następnie w najniższym możliwym punkcie zamknij dolny szew za pomocą stałego węzła. Zawiąż górny szew tuż pod rozgałęzieniem ICA i ECA za pomocą zdejmowanego węzła ślizgowego.

Następnie zawiąż środkowy szew za pomocą zdejmowanego węzła ślizgowego, ale trzymaj go szeroko otwartym. Następnie, za pomocą nożyczek sprężynowych do mikropreparacji, utwórz 0,2 milimetra w CCA między dolnymi i środkowymi szwami bliżej dolnego szwu. Za pomocą kleszczy włóż szew MCAO do nacięcia CCA, kierując go w kierunku górnego szwu.

Następnie delikatnie zaciśnij węzeł ślizgowy środkowego szwu na CCA, tak aby ograniczał przepływ krwi wokół szwu MCAO, ale był na tyle luźny, aby szew MCAO mógł się swobodnie poruszać. Teraz ostrożnie odpiąć górny szew, upewniając się, że szew MCAO nie wyślizguje się. Włóż szew MCAO na kilka milimetrów do ICA, a następnie ponownie zamknij górny szew węzłem ślizgowym, tak jak poprzednio.

Następnie poprowadź szew MCAO do obszaru okluzji, najpierw kierując go do ICA za ECA, a następnie upewniając się, że szew pozostaje w ICA, omijając tętnicę skrzydłowo-pachniową. Wprowadzenie jest udane, jeśli przepływ krwi z nacięcia CCA jest niewielki i jeśli srebrny dziewięciomilimetrowy znak znajduje się między nacięciem CCA a rozwidleniem ICA i ECA. Po udanej okluzji mocno zawiąż środkowy i górny szew, a następnie wsuń szwy w obszar nacięcia.

Po wyjęciu retraktora lub haczyków na chusteczki i poduszki należy oczyścić obszar szwu za pomocą sterylnego soli fizjologicznej na waciku. Następnie zamknij skórę nylonowym szwem. Umieść mysz w czystej klatce umieszczonej na podgrzewanej podkładce, aby zapobiec hipotermii i umożliwić ad libitum dostęp do wody i zmiękczonego jedzenia.

Monitoruj zwierzę pod kątem oznak udaru przez co najmniej pięć do 10 minut. W zależności od protokołu reperfuzji niedokrwiennej, szew MCAO należy pozostawić na miejscu od 30 minut do 120 minut lub dłużej. Po znieczuleniu zwierzęcia jak poprzednio i usunięciu szwów zamykających ranę, użyj kleszczy i separatorów tkankowych, aby ponownie otworzyć nacięcie i odsłonić CCA.

Następnie ostrożnie zdejmij górny szew i delikatnie pociągnij za szew MCAO, aż część pokryta silikonem znajdzie się na środkowym węźle. Powtórz szew górnego węzła, aby zapobiec przepływowi krwi przez szew MCAO. Następnie ostrożnie rozwiąż środkowy węzeł i przeciągnij szew MCAO poza górny węzeł, trzymając go wewnątrz CCA.

Szczelnie zamknij górny węzeł, aby zablokować przepływ krwi w tętnicy. Następnie całkowicie wyciągnij szew MCAO i szczelnie zamknij środkowy węzeł. Zamknąć ranę i przeprowadzić opiekę pooperacyjną jak poprzednio.

Ten schemat pokazuje obszar okluzji, który wynika z procedury pokazanej na tym filmie w kolorze niebieskim. Obszar operacyjny znajduje się w dolnej części figury, na co wskazuje owalny kształt, a umieszczenie szwów jest oznaczone czarnymi liniami. Poniższe zdjęcia pokazują pozycję TTC sekcji mózgu.

Ten obraz przedstawia typowe barwienie po pozorowanym wstawieniu. Obraz jest reprezentatywny dla uszkodzenia tkanek spowodowanego przez 60-minutowy MCAO, po którym następuje 90-minutowa reperfuzja. Większe uszkodzenie tkanek obserwuje się po 24 godzinach od reperfuzji, po 60-minutowym MCAO.

Barwienie immunofluorescencyjne markera neuronalnego MAP2 pozwala na wyraźną wizualizację utraty neuronów po 60 minutach okluzji, a następnie 23 godzinach reperfuzji na obrazie po prawej stronie. Astroglejoza jest widoczna po barwieniu immunofluorescencyjnym GFAP. Na zdjęciu po prawej stronie astroglej jest skoncentrowany w obszarze przylegającym do uszkodzenia tkanki w mózgu reperfuzyjnym niedokrwiennym, podczas gdy rozproszony wzór barwienia jest widoczny w kontroli operowanej wstydem.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby monitorować samopoczucie zwierząt i czas okluzji. Po tej procedurze można wykonać inne techniki, takie jak analiza dziwnego zachowania i immunofluorescencja, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące uszkodzenia tkanki i regeneracji.