Name: Budowa modeli elementów skończonych w celu zbadania biomechaniki szczęk danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 11 s
Description: Poznaj metodę analizy elementów skończonych do badania biomechaniki szczęk danio pręgowanego. Technika ta symuluje środowisko mechaniczne rozwijających się szczęk, dostarczając wgląd w rozwój szkieletowy i zachowanie komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

LHB został sfinansowany przez Wellcome Trust Dynamic Cell PhD programme; KAR został sfinansowany z grantu MRC MR/L002566/1 (przyznanego EJR i CLH), a CLH został sfinansowany z grantu ARUK 19479. Chcielibyśmy również podziękować ośrodkowi Wolfson Bioimaging za porady dotyczące obrazowania.

Wszystkie kroki w ramach protokołu są zgodne z wytycznymi Uniwersytetu w Bristolu dotyczącymi opieki i dobrostanu zwierząt oraz wytycznymi brytyjskiego Ministerstwa Spraw Wewnętrznych.
1. Wizualizacja anatomii układu mięśniowo-szkieletowego
UWAGA: Aby zobrazować kształt elementów szkieletu, określić ilościowo mięśnie i określić dokładne rozmieszczenie przyczepów mięśniowych, immunostain (sekcja 1.1) łowi w odpowiednim wieku dla miozyny szkieletowej (która ujawnia mięśnie) i kolagenu typu II (do wizualizacji chrząstki). Alternatywnie, wizualizuj anatomię układu mięśniowo-szkieletowego za pomocą transgenicznych fluorescencyjnych linii reporterowych, takich jak kolagen a1 reporter col2a1: mCherry 13,14 do wizualizacji chrząstki i powolny reporter ciężkiego łańcucha miozyny smyhc: GFP 15 do wizualizacji położenia przyczepów mięśniowych (sekcja 1.2).
Alternatywne linie oznaczające chrząstkę i mięśnie mogłyby działać równie dobrze.
<ol>
	<li>Fluorescencyjne barwienie immunologiczne
	<ol>
		<li>Utrwalić larwy w nadmiarze 4% paraformaldehydu (PFA) w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) przez 1 godzinę. Przemyć w PBS z 0,1% Tween 20 (PBT) i odwodnić w 50% metanolu (MeOH) odpowiednio w PBT i 100% MeOH przez 5 minut. 
		Uwaga: PFA jest toksyczny i należy obchodzić się z nim zgodnie z kartą charakterystyki materiału. 
		UWAGA: Larwy można przechowywać w 100% MeOH, dopóki nie będą potrzebne.</li>
		<li>Uwodnić larwy w 50% MeOH w PBT przez 5 min. Myć w PBT przez 5 min.</li>
		<li>Przepuszczać larwy w 0,25% trypsyny w PBT na lodzie przez 5-6 min. Myć w 4x PBT po 5 min każde.</li>
		<li>Blokuj przez 2-3 godziny w 5% surowicy w PBT.</li>
		<li>Inkubować larwy w zalecanym rozcieńczeniu króliczego kolagenu anty-type 2 i mysich przeciwciał anty-miozyny w 5% surowicy w PBT przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: Zalecany zakres rozcieńczeń znajduje się zwykle w karcie charakterystyki przeciwciał. Wybierz przeciwciała, które są hodowane przeciwko różnym gatunkom względem siebie nawzajem i które są również różne dla tkanki.</li>
		<li>Myj larwy 6x przez 15 minut w PBT.</li>
		<li>Blokuj przez 1-2 godziny w 5% surowicy w PBT.</li>
		<li>Inkubować w przeciwciałach drugorzędowych w ciemności. Użyć znakowanych fluorescencyjnie przeciwciał drugorzędowych przeciwko myszom (550) i królikom (488) w odpowiednim rozcieńczeniu w 5% surowicy i PBT dla specyficznego przeciwciała.</li>
		<li>Myj 6X przez 10 minut każdy w PBT i zobrazuj pod mikroskopem konfokalnym 10X tak szybko, jak to możliwe.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowanie geometrii układu mięśniowo-szkieletowego
	<ol>
		<li>Zamontuj larwy brzusznie na szkiełku nakrywkowym w letniej 0,3-0,5% agarozie o niskiej temperaturze topnienia (LMP) w roztworze Danieau 16, 
		UWAGA: Ryby transgeniczne będą musiały zostać uspokojone 0,02% MS222 (metanosulfonian trikainy, pH 7) przed zamontowaniem i podczas obrazowania.</li>
		<li>Wykonaj konfokalne zdjęcie obszaru zainteresowania za pomocą 10-krotnego obiektywu i około 2,5-krotnego zoomu cyfrowego. Przygotuj obrazy kanału zielonego i czerwonego za pomocą laserów 488 nm i 561 nm. Obraz w rozdzielczości 512 x 512 pikseli z odstępem między płaszczyznami z wynoszącym 1,3 μm i średnimi z 3 linii. Powstały stos będzie składał się z około 100 plasterków z.</li>
		<li>Wyeksportuj dane jako serię TIFF. Maksymalne wystające elementy mięśniowe i chrzęstne z larwy danio pręgowanego o wartości 5 dpf przedstawiono na rysunku 1.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Generowanie powierzchni 3D
<ol style="margines po lewej: 40px;">
	<li>Wybierz reprezentatywny zestaw danych dla każdego punktu czasowego przy 3, 4 i 5 dpf (wybierz po wizualizacji wielu próbek).</li>
	<li>Otwórz 3-wymiarowy stos TIFF i wybierz wszystkie kanały w oprogramowaniu do analizy. Kliknij prawym przyciskiem myszy kanał chrząstki i wybierz filtr obrazu i wygładzanie:Gaussowski (Rysunek 2B).</li>
	<li>W widoku projektu kliknij prawym przyciskiem myszy na przefiltrowany obraz i wybierz "segmentacja obrazu", a następnie "edytuj nową etykietę". Utwórz nową etykietę dla każdego materiału, tj. chrząstki i stawu. Wybierz obszar chrząstki na obrazie (rysunek 2C, biały sygnał, fioletowy kontur) za pomocą narzędzia magicznej różdżki. Użyj narzędzia Pędzel, aby usunąć szum z konturów. 
	UWAGA: Jeśli używasz narzędzia magicznej różdżki, kliknij "Wszystkie plasterki".</li>
	<li>Wybierz obszar połączenia za pomocą narzędzia pędzla i przypisz go do komponentu połączenia (Rysunek 2C, niebieski kontur)</li>
	<li>Wygładź wiele plasterków jednocześnie, wybierając segmentację w górnym menu i wygładź etykiety. Kliknij obraz prawym przyciskiem myszy i wybierz opcję generuj powierzchnię, aby utworzyć render powierzchni 3D komponentu (Rysunek 2D).</li>
	<li>Kliknij powierzchnię i zapisz dane jako plik hmascii w celu zaimportowania do oprogramowania do tworzenia siatek.</li>
</ol>
3. Obliczanie sił mięśniowych, które mają być użyte w modelu ES
<ol style="margines po lewej: 40px;">
	<li>Policz liczbę włókien mięśniowych z obrazów konfokalnych transgenicznego danio pręgowanego smyhc:GFP (ryc. 1A, grot strzały, 1C) i zmierz średnicę włókien, aby obliczyć ich pole przekroju poprzecznego (πr2).</li>
	<li>Zidentyfikuj odpowiednią siłę na obszar jednostki mięśniowej z literatury. Wykorzystano maksymalną siłę mięśni generowaną na jednostkę powierzchni dla mięśni szkieletowych larw danio pręgowanego (40 nN/μm2) 17.</li>
	<li>Oblicz siły dla każdej anatomicznej grupy mięśni, mnożąc liczbę włókien i ich powierzchnię przez siłę na jednostkę powierzchni. Patrz tabela 1.</li>
</ol>
4. Generowanie siatki
<ol style="margines po lewej: 40px;">
	<li>Zaimportuj model 3D wygenerowany w sekcji 2 (powyżej) do pakietu oprogramowania zdolnego do wygenerowania siatki elementów skończonych.</li>
	<li>Wygeneruj siatkę 2D powierzchni chrząstki i stawów za pomocą narzędzia do owijania folią termokurczliwą w menu 2D. Wybierz odpowiedni rozmiar elementu. 
	Uwaga: Użyj elementu o rozmiarze od 1,5 do 2,5. W razie potrzeby wygeneruj szereg siatek powierzchniowych 2D o różnych rozmiarach, aby przeprowadzić optymalizację siatki 3D (sekcja 4.4).</li>
	<li>Przeprowadź kontrolę jakości siatki znajdującą się w panelu "2D>Narzędzia>Sprawdź elementy", aby sprawdzić, czy w siatce nie ma zduplikowanych elementów, wstawek i przebić. Ustal kąty dwuścienne za pomocą karty narzędzia w drzewie modelu.</li>
	<li>Wygeneruj siatkę 3D z siatek powierzchniowych 2D o różnych rozmiarach elementów za pomocą podpanelu 3D>Tetramesh. 
	UWAGA: Porównaj wyniki dla różnych rozmiarów siatki i wybierz model ES o najniższym rozmiarze siatki, który zbiega się po dalszych symulacjach i nie wpływa negatywnie na definicję elementu. >Przykład na rysunku 3 zawiera 1,5 miliona czworościennych elementów dla chrząstek dolnej szczęki i miał rozmiar elementu 2D 2,0.</li>
	<li>Przekształć siatkę tak, aby model szczęki był skalowany zgodnie ze stosem konfokalnym, korzystając z podpanelu Geometria>Odległość. 
	UWAGA: Upewnij się, że komponenty chrząstki i stawu są połączone w modelu, eksportując scalony model lub używając ściągów.</li>
</ol>
5. Budowa modelu metodą elementów skończonych
<ol>
	<li>Korzystając z komercyjnego oprogramowania do tworzenia elementów skończonych (ES), utwórz model ES. Korzystając z 3D stosów konfokalnych oznaczonych mięśniami i chrząstkami wygenerowanych w sekcji 1 jako przewodnika, przypisz węzły odpowiadające punktom przyczepu mięśni. Utwórz wektor między dwoma węzłami reprezentującymi początek i przyczep każdego mięśnia (ryc. 3).</li>
	<li>Utwórz kolektor obciążenia typu "historia", aby zastosować "obciążenie C" dla każdego mięśnia. Określ wielkość w niutonach (obliczoną w kroku 3.3) i przypisz skojarzony wektor. Rysunek 3 przedstawia punkty mocowania żuchwy przywodziciela (AM), kątomierza hyoideus (PH) i intermandibularis (IM). 
	UWAGA: W przypadku tych mięśni szczęki maksymalna siła skurczu jest rozkładana między początkiem a przyczepieniem, tak że tylko 50% każdego obciążenia jest przykładane w każdym miejscu.</li>
	<li>Przypisać odpowiednie sprężyste właściwości materiału izotropowego zgodnie z opisem w literaturze. Moduł Younga dla chrząstki i międzystrefy w tym modelu wynosił odpowiednio 1,1 MPa i 0,25 MPa, a współczynnik Poissona wynosił 0,25 dla obu 18,19.</li>
	<li>Utwórz moduł zbierający obciążenia typu "granica", aby zastosować początkowe ograniczenia do modelu. Przejdź do zakładki Analiza>Wiązania i w podpanelu tworzenia wybierz węzły w modelu, które chcesz związać. Wybierz stopnie swobody (DOF), które ograniczają ruch modelu, do najlepszego przybliżenia jego naturalnego zakresu ruchu. 
	UWAGA: Model na rysunku 3 został ograniczony we wszystkich osiach ruchu (DOF: 1, 2, 3 reprezentują odpowiednio x, y i z) na części ceratohyal, aby zakotwiczyć go w przestrzeni w punkcie środkowym modelu oraz na osi y i z w punkcie, w którym podniebienie łączy się z resztą czaszki danio pręgowanego (rysunek 3, Tabela 1). Model musi być ograniczony we wszystkich trzech stopniach swobody w co najmniej jednym węźle.</li>
	<li>Utwórz "Krok obciążenia" dla każdego rodzaju ruchu, który chcesz symulować (tj. otwieranie, zamykanie), w menu analizy i wybierz wszystkie odpowiednie obciążenia (wykonane w sekcji 5.2) i ograniczenia (wykonane w sekcji 5.4), aby zasymulować ten ruch. Wybierz "Statyczny" z menu rozwijanego, gdy się pojawi.</li>
	<li>Eksportuj model wraz z siatką, obciążeniami, wiązaniami i właściwościami materiału w odpowiednim formacie pliku, w tym przypadku w formacie ".inp".</li>
	<li>Załaduj model do oprogramowania do analizy ES. Utwórz i wykonaj zadanie dla modelu przy użyciu modułu Zadanie.</li>
	<li>Analizuj dane wyjściowe pod kątem naprężeń, odkształceń, przemieszczeń itp., które można znaleźć na karcie wyników i w menu wizualizacji (Rysunek 4 i 5).</li>
</ol>
6. Walidacja odległości deformacji szczęk/przemieszczenia
<ol>
	<li>Wybierz transgenicznego danio pręgowanego o wartości 3-6 Tg(Col2a1aBAC:mcherry).</li>
	<li>Lekko znieczulić larwy 0,02% MS222, aż przestaną reagować na dotyk, ale ich serca nadal biją.</li>
	<li>Zamontuj larwy bocznie (w znieczuleniu) na szkiełkach nakrywkowych w letniej 1% agarozie LMP (uzupełnionej w roztworze Danieau).</li>
	<li>Usuń agarozę z okolic głowy i szczęki kleszczami.</li>
	<li>Przepłukać świeży roztwór Danieau (bez MS222) nad głową larwy w celu usunięcia znieczulenia za pomocą pipety Pasteura, aż do wznowienia normalnych ruchów ust.</li>
	<li>Użyj oprogramowania do przechwytywania filmów, aby nagrywać szybkie filmy w jasnym polu ruchów ust. Nagrywaj filmy trwające około minuty z najwyższą liczbą klatek na sekundę lub wystarczającą do nagrania wielu cykli otwierania szczęki.</li>
	<li>Wybierz ramki, które pokazują szczękę otwartą do maksymalnego przemieszczenia. Zmierz odległość między przednim końcem chrząstki Meckla a górną szczęką (końcówką płytki sitowej) w μm.</li>
	<li>Oblicz średnie przemieszczenie z wielu larw ryb.</li>
	<li>Wyodrębnij dane przemieszczenia z modelu. Użyj średniego przemieszczenia obliczonego w 6.8, aby zweryfikować zachowanie przemieszczenia modelu (Rysunek 4). Jeśli model odbiega od oczekiwań, przeprowadź analizę wrażliwości, sekwencyjnie zmieniając właściwości materiału i obciążenia mięśni.</li>
</ol>

<ol><li>Rayfield, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finite+Element+Analysis+and+Understanding+the+Biomechanics+and+Evolution+of+Living+and+Fossil+Organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Earth+Planet.+Sci%22%5BJournal%5D)">Finite Element Analysis and Understanding the Biomechanics and Evolution of Living and Fossil Organisms.</a> Annu. Rev. Earth Planet. Sci. 35, 541-576 (2007).</li>
<li>Rao, S. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRao%2C+SS+%22The+Finite+Element+Method+in+Engineering%3A+Fifth+Edition%22">The Finite Element Method in Engineering: Fifth Edition</a>. , (2010).</li>
<li>Taylor, M., Prendergast, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four+decades+of+finite+element+analysis+of+orthopaedic+devices%3A+Where+are+we+now+and+what+are+the+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Four decades of finite element analysis of orthopaedic devices: Where are we now and what are the opportunities.</a> J Biomech. 48, 767-778 (2015).</li>
<li>Button, D. J., Rayfield, E. J., Barrett, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cranial+biomechanics+underpins+high+sauropod+diversity+in+resource-poor+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Royal+Soc+London+B%3A+Biol+Sci.+281%22%5BJournal%5D)">Cranial biomechanics underpins high sauropod diversity in resource-poor environments.</a> Proc Royal Soc London B: Biol Sci. 281. 281, (2014).</li>
<li>Mammoto, T., Mammoto, A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanobiology+and+developmental+control%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanobiology and developmental control.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 29, 27-61 (2013).</li>
<li>Shwartz, Y., Farkas, Z., Stern, T., Aszodi, A., Zelzer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+contraction+controls+skeletal+morphogenesis+through+regulation+of+chondrocyte+convergent+extension%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+biol%22%5BJournal%5D)">Muscle contraction controls skeletal morphogenesis through regulation of chondrocyte convergent extension.</a> Dev biol. 370, 154-163 (2012).</li>
<li>Rolfe, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+mechanosensitive+genes+during+skeletal+development%3A+alteration+of+genes+associated+with+cytoskeletal+rearrangement+and+cell+signalling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+genomics%22%5BJournal%5D)">Identification of mechanosensitive genes during skeletal development: alteration of genes associated with cytoskeletal rearrangement and cell signalling pathways.</a> BMC genomics. 15, 48(2014).</li>
<li>Roddy, K. A., Kelly, G. M., van Es, M. H., Murphy, P., Prendergast, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+patterns+of+mechanical+stimulation+co-localise+with+growth+and+cell+proliferation+during+morphogenesis+in+the+avian+embryonic+knee+joint%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Dynamic patterns of mechanical stimulation co-localise with growth and cell proliferation during morphogenesis in the avian embryonic knee joint.</a> J Biomech. 44, 143-149 (2011).</li>
<li>Haudenschild, D. R., Chen, J., Steklov, N., Lotz, M. K., D'Lima, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+chondrocyte+actin+cytoskeleton+in+living+three-dimensional+culture%3A+response+to+anabolic+and+catabolic+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+cell+biomech%22%5BJournal%5D)">Characterization of the chondrocyte actin cytoskeleton in living three-dimensional culture: response to anabolic and catabolic stimuli.</a> Mol cell biomech. 6, 135-144 (2009).</li>
<li>Nowlan, N. C., Murphy, P., Prendergast, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dynamic+pattern+of+mechanical+stimulation+promotes+ossification+in+avian+embryonic+long+bones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">A dynamic pattern of mechanical stimulation promotes ossification in avian embryonic long bones.</a> J Biomech. 41, 249-258 (2008).</li>
<li>Giorgi, M., Carriero, A., Shefelbine, S. J., Nowlan, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanobiological+simulations+of+prenatal+joint+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Mechanobiological simulations of prenatal joint morphogenesis.</a> J Biomech. 47, 989-995 (2014).</li>
<li>Heegaard, J. H., Beaupre, G. S., Carter, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanically+modulated+cartilage+growth+may+regulate+joint+surface+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ortho+Res%22%5BJournal%5D)">Mechanically modulated cartilage growth may regulate joint surface morphogenesis.</a> J Ortho Res. 17, 509-517 (1999).</li>
<li>Hammond, C. L., Schulte-Merker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+populations+of+endochondral+osteoblasts+with+differential+sensitivity+to+Hedgehog+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Two populations of endochondral osteoblasts with differential sensitivity to Hedgehog signalling.</a> Development. 136, 3991-4000 (2009).</li>
<li>Mitchell, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+studying+osteoarthritis+genetics+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+cartilage+%2F+OARS%2C+Osteoarth+Res+Soc%22%5BJournal%5D)">New tools for studying osteoarthritis genetics in zebrafish.</a> Osteoarthritis and cartilage / OARS, Osteoarth Res Soc. 21, 269-278 (2013).</li>
<li>Elworthy, S., Hargrave, M., Knight, R., Mebus, K., Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+multiple+slow+myosin+heavy+chain+genes+reveals+a+diversity+of+zebrafish+slow+twitch+muscle+fibres+with+differing+requirements+for+Hedgehog+and+Prdm1+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Expression of multiple slow myosin heavy chain genes reveals a diversity of zebrafish slow twitch muscle fibres with differing requirements for Hedgehog and Prdm1 activity.</a> Development. 135, 2115-2126 (2008).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Danieau%27s+solution+%2830%C3%97%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Prot%22%5BJournal%5D)">Danieau's solution (30×).</a> Cold Spring Harb Prot. , pdb.rec12467 (2011).</li>
<li>Iorga, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromechanical+function+of+myofibrils+isolated+from+skeletal+and+cardiac+muscles+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+physiol%22%5BJournal%5D)">Micromechanical function of myofibrils isolated from skeletal and cardiac muscles of the zebrafish.</a> J Gen physiol. 137, 255-270 (2011).</li>
<li>Tanck, E., Blankevoort, L., Haaijman, A., Burger, E. H., Huiskes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+muscular+activity+on+local+mineralization+patterns+in+metatarsals+of+the+embryonic+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ortho+Res%22%5BJournal%5D)">Influence of muscular activity on local mineralization patterns in metatarsals of the embryonic mouse.</a> J Ortho Res. 18, 613-619 (2000).</li>
<li>Tanck, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanical+consequences+of+mineralization+in+embryonic+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">The mechanical consequences of mineralization in embryonic bone.</a> Bone. 35, 186-190 (2004).</li>
<li>Brunt, L. H., Norton, J. L., Bright, J. A., Rayfield, E. J., Hammond, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finite+element+modelling+predicts+changes+in+joint+shape+and+cell+behaviour+due+to+loss+of+muscle+strain+in+jaw+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Finite element modelling predicts changes in joint shape and cell behaviour due to loss of muscle strain in jaw development.</a> J Biomech. 48, 3112-3122 (2015).</li>
<li>Roddy, K. A., Prendergast, P. J., Murphy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+influences+on+morphogenesis+of+the+knee+joint+revealed+through+morphological%2C+molecular+and+computational+analysis+of+immobilised+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Mechanical influences on morphogenesis of the knee joint revealed through morphological, molecular and computational analysis of immobilised embryos.</a> PloS one. 6, e17526(2011).</li>
<li>Cuff, A. R., Bright, J. A., Rayfield, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+experiments+on+finite+element+models+of+an+ostrich+%28Struthio+camelus%29+cranium%5BTitle%5D)+AND+%22Peer+J%22%5BJournal%5D)">Validation experiments on finite element models of an ostrich (Struthio camelus) cranium.</a> Peer J. 3, 1294(2015).</li>
<li>Schilling, T. F., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Musculoskeletal+patterning+in+the+pharyngeal+segments+of+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Musculoskeletal patterning in the pharyngeal segments of the zebrafish embryo.</a> Development. 124, 2945-2960 (1997).</li>
<li>Dowthwaite, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+underlying+the+movement+requirement+for+synovial+joint+cavitation%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+biol%22%5BJournal%5D)">A mechanism underlying the movement requirement for synovial joint cavitation.</a> Matrix biol. 22, 311-322 (2003).</li>
<li>Nia, H. T., Han, L., Li, Y., Ortiz, C., Grodzinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poroelasticity+of+cartilage+at+the+nanoscale%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Poroelasticity of cartilage at the nanoscale.</a> Biophys J. 101, 2304-2313 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Niektóre dane na rysunkach 3-5 zostały przedrukowane z J.Biomech, 48 (12), Brunt i wsp., Modelowanie elementów skończonych przewiduje zmiany w kształcie stawów i zachowaniu komórek z powodu utraty napięcia mięśni w rozwoju szczęki, 3112-22., 2015, za zgodą Elsevier15.

Modele elementów skończonych wykorzystano do powiązania obszarów elementów szkieletowych, które są poddawane obciążeniu, z tymi, które podlegają tworzeniu kości 10, a także do mapowania obszarów poddanych obciążeniu podczas kostnienia chrzęstnego i morfogenezy stawów 8,12,21. W innych badaniach udało się również zastosować teoretyczne modele wzrostu do replikacji zmian podczas wspólnego rozwoju 11,12. Tutaj pokazujemy protokół budowy modeli FE dla stosunkowo prostego systemu, jakim jest szczęka danio pręgowanego 20. W przeciwieństwie do alternatywnych metod zbierania surowych obrazów do modeli FE, takich jak tomografia komputerowa 22, obrazowanie konfokalne linii transgenicznych lub genesa barwionego immunologicznie pozwala na badanie wielu tkanek. Może zatem dostarczyć bezpośrednich informacji na temat punktów przyczepu mięśni w odniesieniu do chrząstki. Wśród modeli kręgowców danio pręgowany jest szczególnie podatny na manipulacje genetyczne i farmakologiczne. Wygenerowanie modeli FE dla chrząstki twarzoczaszki danio pręgowanego otwiera obecnie możliwość dalszych badań nad wzajemnymi oddziaływaniami między biomechaniką a genetyką w morfogenezie stawów.
Proces tworzenia modelu ES składa się z kilku kluczowych etapów; Pierwszym z nich jest wygenerowanie dokładnego trójwymiarowego odwzorowania systemu. Wymaga to obrazowania w wystarczająco wysokiej rozdzielczości, aby wyraźnie określić granice. Należy pamiętać, że nawet przy obrazowaniu w wysokiej rozdzielczości, aby uzyskać dobrą powierzchnię, może być konieczne wygładzenie niektórych obszarów. Kolejnym krytycznym krokiem jest zdefiniowanie prawidłowego rozmieszczenia obciążenia i prawidłowych wiązań. Niewystarczająco ograniczony model nie zostanie rozwiązany, a nieprawidłowe rozmieszczenie obciążeń spowoduje nieprawidłowy ruch.
Konieczne jest pewne przetwarzanie danych pierwotnych (rysunek 2), ponieważ powierzchnia wygenerowana na podstawie danych pierwotnych byłaby trudna do zasiatkowania (rysunek 2B). Przefiltrowaliśmy dane za pomocą filtra Gaussa (rysunek 2C) i przeprowadziliśmy ręczne wygładzanie krzywych, aby uzyskać zestaw czystych konturów, które można przekształcić w powierzchnię 3D. Zbyt duże wygładzenie może spowodować powstanie "stopionej" powierzchni, która straciła wiele swoich cech. Wybór odpowiedniego rozmiaru elementu jest procesem iteracyjnym, ponieważ wybranie zbyt małego rozmiaru elementu tworzy zbyt dużą siatkę, co jest wymagające obliczeniowo. Jednak wybranie zbyt dużego rozmiaru elementu spowoduje, że siatka nie będzie w stanie oddać prawidłowego kształtu konstrukcji. Właściwa siatka miała najmniejszy rozmiar elementu, który uchwycił prawidłowy kształt szczęki i zbiegał się w prawidłowym roztworze, weryfikowanym za pomocą przemieszczenia szczęki. Może być również konieczna modyfikacja właściwości materiału lub obliczeń obciążenia, aby lepiej naśladować prawidłowe przemieszczenie, ponieważ różne grupy wiekowe i gatunki będą miały zasadniczo różne właściwości.
Ważne jest, aby pamiętać, że zawsze istnieją ograniczenia dotyczące hipotetycznego modelu i założeń przyjętych do uruchomienia modeli ES. W przypadku modelowania tylko jednej lub niewielkiej liczby próbek bardzo ważne jest, aby upewnić się, że wybrano reprezentatywną próbkę, ponieważ istnieje prawdopodobieństwo niewielkich różnic między osobnikami. Ponieważ uwzględniono tylko niektóre elementy żuchwy i mięśnie, model jest uproszczoną wersją układu mięśniowo-szkieletowego danio pręgowanego. W związku z tym konieczne było umiejscowienie ograniczeń w celu uwzględnienia miejsca, w którym modelowane elementy szczęki połączą się z resztą czaszki, a model został sztucznie ograniczony w środku, aby zamocować go w "przestrzeni". To sztuczne ograniczenie nie wpłynęło na interpretację wynikającą z modeli, ponieważ sam ceratohyal nie był analizowany. Włączenie większej ilości struktury twarzoczaszki, zwłaszcza innych mięśni otwierających szczękę, takich jak mostek i przyczepiona chrząstka 23, mogło przyczynić się do powstania modelu, ale ograniczenia obejmują zdolność większych modeli do działania w oprogramowaniu elementów skończonych.
Kolejnym ograniczeniem jest to, że nie modelowaliśmy przyczepu więzadła, chociaż można to osiągnąć poprzez wprowadzenie sprężyn 8. Innym założeniem przyjętym w tym przypadku było to, że model będzie zachowywał się liniowo. Wielkości szczepów na modelach były porównywalne z tymi w opublikowanych modelach i dotyczyły komórek in vitro 10,24, przy czym szczepy miały wartość poniżej +3,500 i powyżej -5,000 μɛ, z wyjątkiem ograniczeń i punktów przyczepu mięśniowego. W związku z tym odkształcenia w odpowiednich regionach modelu uznano za mieszczące się w zakresie akceptowalnym dla modelu liniowego. Chrząstka nie zachowuje się całkowicie jak materiał liniowy i była wcześniej modelowana jako materiał poroelastyczny, co umożliwiło analizę zachowania płynu w modelu 25. Rozmieszczenie punktów przyczepu mięśni w skupisku lokalnych węzłów rozprowadziłoby siły szczytowe i dokładniej reprezentowałoby przyczepienie mięśni dla niektórych mięśni.
Zastosowanie ES pozwala na ocenę odkształceń i naprężeń działających na konstrukcję. Jako technika jest często stosowana w wielu dyscyplinach biologicznych, w tym w ortopedii, paleontologii, a ostatnio w biologii rozwojowej. Tutaj opisujemy, jak zbudować FE dla dolnej szczęki danio pręgowanego. W przyszłości modele te mogą zostać rozszerzone tak, aby obejmowały całą szczękę, w tym podniebienie. Podobne techniki można wykorzystać do modelowania biomechaniki kręgosłupa u ryb, która do tej pory była badana głównie za pomocą środków kinematycznych.

Modelowanie metodą elementów skończonych (FE) to technika inżynierska, która może obliczeniowo obliczać i mapować wielkość i położenie odkształceń działających na konstrukcję 1. Model składa się ze struktury 3D, reprezentowanej przez siatkę "elementów skończonych", a końcowy wynik analizy zależy od wielu czynników, w tym struktury i liczby elementów w siatce, wielkości i położenia obciążeń mechanicznych oraz właściwości materiału. Właściwości materiału opisują pewne aspekty zachowania materiału pod danym typem obciążenia; Moduł Younga (E) opisuje elastyczność materiału, podczas gdy współczynnik Poissona opisuje proporcjonalny spadek szerokości materiału do jego długości, gdy próbka jest rozciągana. Modelowanie ES można wykorzystać do obliczenia różnych zmiennych, w tym przemieszczenia, naprężeń, nacisków i odkształceń działających na model, biorąc pod uwagę unikalne dane wejściowe dotyczące kształtu konstrukcji, położenia i wielkości obciążeń oraz określonych właściwości materiału.
Modelowanie FE jest szeroko stosowane w inżynierii 2 i coraz częściej w zastosowaniach ortopedycznych 3 i paleontologicznych4. Wiadomo, że w rozwoju siły biomechaniczne działają jako bodziec w wielu komórkach do aktywacji odpowiedzi komórkowych 5-8 i jest przydatne do przewidywania zarówno względnych pozycji, jak i wielkości bodźców mechanicznych w rozwijających się układach narządów, jednak obecnie modelowanie FE jest rzadko stosowane do rozwoju danio pręgowanego.
Zarówno chrząstka, jak i kość okazały się materiałami wrażliwymi na mechano. Na przykład stwierdzono, że kompresja in vitro aktywuje szlaki chondrogenne, podczas gdy napięcie jest niezbędne do tworzenia kości 9. Analiza MES (MES) została wykorzystana do modelowania szczepów działających na próbki biologiczne, w tym tych działających na elementy szkieletu podczas tworzenia kości 10. Inne zastosowania rozwojowe obejmują jego zastosowanie do przewidywania kształtu stawu po wystawieniu go na działanie teoretycznych sił biomechanicznych 11,12 oraz do pokazania wzorca szczepów obecnych podczas morfogenezy stawu kolanowego pisklęcia 8.
Ten protokół ma na celu dzielenie się doświadczeniem w generowaniu trójwymiarowych powierzchni, siatek i modeli elementów skończonych z obrazów konfokalnych w celu zrozumienia mechaniki rozwijających się tkanek. Pokazujemy również sposoby walidacji modeli ES poprzez przechwytywanie rzeczywistych informacji o przemieszczeniu stawów in vivo. Podczas gdy używamy szczęki danio pręgowanego jako przykładu, te same techniki można zastosować na każdym małym systemie biologicznym, dla którego informacje 3D na temat struktury układu mięśniowo-szkieletowego można uzyskać za pomocą obrazowania konfokalnego lub wielofotonowego.

<table><tbody><tr><td>Coll2</td><td>Abcam</td><td>ab34712</td><td>Przeciwciało kolagenowe typu II - barwi wszystkie chrząstki</td></tr><tr><td>A4.1025 / MF20</td><td>Badania rozwojowe bank hybrydoma</td><td>A4.1025</td><td>Przeciwciało mysoiny szkieletowej - oznacza wszystkie mięśnie szkieletowe&nbsp;</td></tr><tr><td>Agaroza niskotopliwa</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A9414-5G</td><td>Do montażu zebry</td></tr><tr><td>MS222 (metanosulfonian 3-aminobenzoesanu etylu)</td> <td>Sigma</td><td>E10521-10G</td><td>Do znieczulenia</td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Fisher</td><td>T/3760/48</td><td>przepuszczalność próbki</td></tr><tr><td>Dylight 488 Mysz IgG</td><td>Thermofisher</td><td>35502</td><td>Przeciwciało wtórne</td></tr><tr><td>Dylight 550 IgG</td><td>królika Thermofisher&nbsp;</td><td>84541</td><td>Przeciwciało drugorzędowe</td></tr><tr><td>SP8/SP5 lub SPE konfokalne</td><td>Leica&nbsp;</td><td></td><td>Do obrazowania&nbsp;</td></tr><tr><td>Oprogramowanie LAS Leica do przechwytywania</td><td>Oprogramowanie do obrazowania</td><td>Leica</td><td></td></tr><tr><td>Aviso (wersja 7.0.0)</td>Oprogramowanie do analizy obrazów 3D <td>FEI Visualization Science Group</td><td></td><td>(sekcja 2)</td></tr><tr><td>Hypermesh część pakietu Hyperworks (wersja 10)</td>Oprogramowanie do generowania modeli ES <td>Altair Engineering</td><td></td><td>(sekcja 4-5)</td></tr><tr><td>Abaqus (wersja 6.14)</td>Oprogramowanie do analizy <td>SIMULIA</td><td></td><td>FE (sekcja 5,7-5,8)</td></tr></tbody></table>

budowa modeli elementów skończonych w celu zbadania biomechaniki szczęk danio pręgowanego

Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics

Morfogeneza szkieletu zachodzi poprzez ściśle regulowane zachowania komórek podczas rozwoju; wiele typów komórek zmienia swoje zachowanie w odpowiedzi na obciążenie mechaniczne. Stawy szkieletowe poddawane są dynamicznym obciążeniom mechanicznym. Analiza metodą elementów skończonych (MES) to metoda obliczeniowa, często stosowana w inżynierii, która może przewidzieć, jak materiał lub konstrukcja zareaguje na dane mechaniczne. Dzieląc cały system (w tym przypadku szkielet szczęki danio pręgowanego) na siatkę mniejszych "elementów skończonych", MES można wykorzystać do obliczenia mechanicznej reakcji konstrukcji na obciążenia zewnętrzne. Wyniki można wizualizować na wiele sposobów, w tym jako "mapę cieplną" pokazującą położenie maksymalnych i minimalnych odkształceń głównych (dodatnie odkształcenie główne wskazuje na rozciąganie, a ujemne oznacza ściskanie. Maksimum i minimum odnoszą się do największego i najmniejszego szczepu). Można je wykorzystać do określenia, które obszary szczęki, a tym samym które komórki mogą być narażone na szczególnie wysokie obciążenia rozciągające lub ściskające podczas ruchu szczęki, a zatem mogą być wykorzystywane do identyfikacji zależności między naprężeniami mechanicznymi a zachowaniem komórek. Protokół ten opisuje etapy generowania modeli elementów skończonych na podstawie danych obrazu konfokalnego układu mięśniowo-szkieletowego, używając dolnej szczęki danio pręgowanego jako praktycznego przykładu. Protokół prowadzi czytelnika przez szereg kroków: 1) barwienie elementów układu mięśniowo-szkieletowego, 2) obrazowanie komponentów układu mięśniowo-szkieletowego, 3) budowanie trójwymiarowej (3D) powierzchni, 4) generowanie siatki elementów skończonych, 5) rozwiązywanie MES i wreszcie 6) walidacja wyników przez porównanie z rzeczywistymi przemieszczeniami obserwowanymi w ruchach szczęki ryby.

Barwienie immunocytochemiczne mięśni (Rycina 1A) i chrząstki (Rysunek 1B) lub obrazowanie reporterów transgenicznych (Rycina 1C) umożliwia wizualizację trójwymiarowej struktury żuchwy wraz z powiązaną z nią muskulaturą. Dzięki obrazowaniu o wysokiej rozdzielczości możliwe było stworzenie modelu, który oddaje zarówno trójwymiarowy kształt żuchwy (Rysunek 2) oraz lokalizację i rozmieszczenie obciążeń (Rycina 3). Wykorzystując in vivo przemieszczenia zarejestrowane za pomocą szybkiej wideofilmowani (Rysunek 4) zweryfikowano, że zakres ruchu w modelu mieścił się w granicach realistycznych.
Uruchomione modele FE mogą służyć do wyświetlania szeregu danych, takich jak naprężenia (Ryc. 5A), minimalne i maksymalne odkształcenia główne (Ryc. 5B-K). Wyniki te są trójwymiarowe, dzięki czemu model można powiększyć, aby dostrzec szczegółowe wzorce (Ryc. 5E, 5I), obracać w celu uzyskania odpowiednich widoków (Ryc. 5F, 5G, 5J, 5K) oraz poddawać cyfrowemu przekrojeniu (Ryc. 5E', 5E'', 5I', 5I''), aby pokazać, jak rozkłady naprężeń, odkształceń lub ciśnienia zmieniają się w całym modelu. Możliwe jest również wyodrębnienie z modelu danych ilościowych (nie pokazano). Poprzez weryfikację modelu i zastosowanie najdokładniejszych właściwości materiałowych, obciążeń oraz kształtu siatki, model FE może zostać wykorzystany do określenia najlepszego szacunku środowiska mechanicznego, w jakim znajdują się komórki w danym oknie rozwojowym. Wyniki modelu można bezpośrednio porównać ze zmianami w zachowaniu komórek i ekspresji genów 20.
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna struktury mięśni owada; zielone filamenty aktynowe i czerwony egzoszkielet." src="/files/ftp_upload/54811/54811fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Reprezentatywne obrazy elementów mięśniowo-szkieletowych dolnej szczęki danio pręgowanego w 5 dpf. Reprezentatywne stosy konfokalne dolnej szczęki larw w 5 dpf, wszystkie przedstawione z częścią przednią u góry (A) Immunobarwienie przeciwciałem A4.1025, które barwi całą miozynę szkieletową (B) Immunobarwienie kolagenu typu II, który znakuje całą chrząstkę (C) Stos z żywej larwy wykazującej ekspresję transgenicznych reporterów col2a1:mCherry znakującego chrząstkę (czerwony) oraz smyhc:GFP znakującego mięśnie wolne (zielony). IA: intermandibularis anterior, PH: protractor hyoideus, AM: adductor mandibulae, HI: hyoideus inferior, HI: hyoideus superior, CH: sternohyoideus, MC: chrząstka Meckla, PQ: palatoquadrate, CH: ceratohyal. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Proces obrazowania kości; filtrowana mikroskopia i rekonstrukcja 3D; analiza stawu i chrząstki." src="/files/ftp_upload/54811/54811fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Generowanie powierzchni 3D z danych konfokalnych. Obrazy przedstawiające przejście z danych konfokalnych do powierzchni 3D dla dolnej szczęki danio pręgowanego z powiększeniem obszaru stawu. (A) Surowe dane konfokalne; (B) Zbiór danych po zastosowaniu filtru Gaussa; (C) Filtrowany obrys; (D) Powierzchnia 3D. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat mechaniki pyska; siły statyczne; wektory, szczęki ryby w 5. dniu po zapłodnieniu, siły otwierania/zamykania pyska." src="/files/ftp_upload/54811/54811fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Reprezentatywne siatki przedstawiające ograniczenia i wektory sił. Reprezentatywne siatki dla larwy w 5 dpf podczas (A) zamykania pyska oraz (B) otwierania pyska. Białe kropki oznaczają miejsca, w których model jest ograniczony oraz w których wymiarach (np. x i y lub x, y i z). Białe linie oznaczają położenie mięśni, a wektor siły mięśnia jest wskazany białymi strzałkami. Kolor czerwony oznacza chrząstkę, a żółty strefę przejściową (interzone). Rycina ta została zmodyfikowana na podstawie materiałów uzupełniających opublikowanych wcześniej przez Brunt et al. 15. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wizualizacja przepływu, zmienne c=1,1-6,1, i=0,25-1,0, wykres głębokości z kodowaniem kolorystycznym dla stanów otwartego/zamkniętego." src="/files/ftp_upload/54811/54811fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Badanie wrażliwości. Model EF symulujący przemieszczenie żuchwy u 5-dniowych larw zebrafish (5dpf) dla różnych modułów Younga chrząstki i strefy przejściowej (interzone). Przemieszczenie żuchwy (od pozycji otwartej do zamkniętej w µm) jest zaznaczone na żuchwie; zarejestrowano je przy użyciu klucza kolorystycznego. Każdy model (A-L) posiada inną kombinację właściwości chrząstki (c = 1,1, 3,1 lub 6,1 MPa) lub strefy przejściowej (i = 0,25, 0,5, 0,75 lub 1 MPa). Pozioma czarna strzałka zaznacza wartość przemieszczenia żuchwy na końcówce chrząstki Meckla (reprezentowanej przez pionową czarną strzałkę). M i N kadry z filmów przedstawiające larwy w 5. dniu po zapłodnieniu (dpf) wykazujące minimumt.j. żuchwa zamknięta (M) oraz maksymalną, t. j. pełne otwarcie żuchwy (N) z dwoma nałożonymi (O) - biała linia na O reprezentuje przemieszczenie (od 43 µm). W tym przypadku względne właściwości chrząstki na poziomie 1,1 z interzoną 0,25 (A) najlepiej odpowiadają przemieszczeniom obserwowanym u żywych ryb (O). Panele A-L tej ryciny zostały wcześniej opublikowane w Brunt i wsp. 15. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza odkształceń biomechanicznych, kolorowe schematy modelu elementów skończonych ilustrujące rozkład naprężeń." src="/files/ftp_upload/54811/54811fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Reprezentatywne dane z modeli FE. Symulacja modelem FE wszystkich mięśni zastosowanych u larwy w 5 dpf (A-C). (A) Naprężenia von Misesa (EMaxmin) (B) Minimalne odkształcenie główne (E Min. P, µɛ) (C) Maksymalne odkształcenie główne (E Max. P., µɛ). Symulacja modelem FE maksymalnych i minimalnych odkształceń głównych podczas otwierania szczęki. (D-K): Maksymalne odkształcenie główne (E Max. P., µɛ) w (D) widoku brzuszny szczęki i (E) widoku brzuszny stawu; (E) pokazuje położenie przekrojów proksymalno-dystalnych przez staw chrząstki Meckla i strefę przejściową odpowiednio w (E') i (E''). (F): widok boczny szczęki. (G): widok boczny stawu. (H-K): Minimalne odkształcenie główne (E Min. P, µɛ) w (H) widoku brzuszny szczęki i (I) widoku brzuszny stawu. (I) pokazuje położenie przekrojów proksymalno-dystalnych przez staw chrząstki Meckla i strefę przejściową odpowiednio w (I') i (I''); (J): widok boczny szczęki. (K): widok boczny stawu. Rysunek ten został wcześniej opublikowany w Brunt et al. 15. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Liczba włókien mięśniowych</td>
			<td>Pole powierzchni włókna mięśniowego (µm2)</td>
			<td>Powierzchnia grupy mięśniowej (µm2)</td>
			<td>Siła (N)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 dpf intermandibularis anterior</td>
			<td>5</td>
			<td>23.8</td>
			<td>119</td>
			<td>4,76e-6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protraktor hyoideus w 5. dniu po zapłodnieniu (dpf)</td>
			<td>6</td>
			<td>23.8</td>
			<td>142.8</td>
			<td>5,71e-6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mięsień przywodziciel żuchwy w 5. dniu po zapłodnieniu (dpf)</td>
			<td>9</td>
			<td>23.8</td>
			<td>214.2</td>
			<td>8,57e-6</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Ilościowe oznaczenie mięśni. Obliczone średnie siły mięśni Intermandibularis Anterior, Adductor Mandibulae oraz Protractor Hyoideus w 5 dpf przy zastosowaniu 40 nN/µm2 (wartość na jednostkę powierzchni zaczerpnięta z referencji 17). (Lorga et al., 2011) (n = 3).

Analiza metodą elementów skończonych jest często używanym narzędziem do badania właściwości mechanicznych konstrukcji pod obciążeniem. Tutaj zastosujemy jego zastosowanie do modelowania biomechaniki szczęki danio pręgowanego.

Budowa modeli elementów skończonych w celu zbadania biomechaniki szczęk danio pręgowanego

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical ...

Ogólnym celem tej techniki modelowania jest symulacja środowiska mechanicznego, w którym znajdują się rozwijające się szczęki danio pręgowanego. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu układu mięśniowo-szkieletowego, takie jak: w jaki sposób wzorce obciążeń mechanicznych zmieniają się w czasie? Oraz: w jaki sposób obciążenia te stymulują zachowanie komórek.Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na analizę wzorców ekspresji genów oraz zmian w zachowaniu komórek w kontekście środowiska mechanicznego. Metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat rozwoju szkieletu. Można ją również zastosować do każdej innej struktury biologicznej poddawanej obciążeniom mechanicznym, takiej jak elementy szkieletowe u wyższych kręgowców lub układ sercowo-naczyniowy.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ terminologia i oprogramowanie zakładają wiedzę z zakresu inżynierii. Aby zwizualizować kształt elementów szkieletowych, ilościowo określić masę mięśni oraz zidentyfikować dokładne miejsce przyczepów mięśniowych, należy przeprowadzić barwienie immunocytochemiczne ryby w odpowiednim wieku na miozynę szkieletową i kolagen typu II. W pierwszej kolejności należy utrwalić larwę ryby w 4%paraformaldehydzie i PBS przez jedną godzinę.Następnie wypłucz utrwalacz, wykonując dwa przemycia w roztworze PBT. W kolejnym kroku odwadniaj larwę przez pięć minut w 50% metanolu i PBT, a następnie przez pięć minut w 100% metanolu. Larwy można następnie przechowywać w 100% metanolu do momentu ich użycia.W razie potrzeby rehydratyzować larwę w 50% metanolu i PBT przez pięć minut. Następnie przemyć ją w PBT przez pięć minut. Teraz przeprowadzić permeabilizację larwy za pomocą 0,25% trypsyny i PBT na lodzie przez pięć do sześciu minut.Następnie przemyć larwę w PBT przez pięć minut i powtórzyć płukanie PBT jeszcze trzy razy. Przed aplikacją przeciwciał blokować larwę przez dwie do trzech godzin w 5% serum i PBT. Następnie inkubować larwę w zalecanym rozcieńczeniu przeciwciał króliczych anty-kolagen typu II oraz mysich anty-miozynie z dodatkiem 5% serum i PBT.Inkubację tę należy przeprowadzić przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C. Po naniesieniu przeciwciał pierwszorzędowych larwę należy przemyć w PBT łącznie sześć razy, przez 15 minut podczas każdego płukania. Po przemyciu w PBT należy zastosować blokowanie 5% serum i PBT przez jedną lub dwie godziny.Następnie należy nanieść przeciwciała wtórne, utrzymując od tego momentu preparat w ciemności tak długo, jak to możliwe. Należy użyć znakowanych fluorescencyjnie przeciwciał wtórnych anty-mysich i anty-króliczych w 5% serum i PBT. Po naniesieniu przeciwciał wtórnych larwę należy przemyć w PBT sześć razy, przez 10 minut podczas każdego płukania.Każdą larwę, która została zabarwiona zgodnie z opisem lub wykazuje ekspresję znaczników fluorescencyjnych, można teraz obrazować za pomocą mikroskopu konfokalnego w następujący sposób. Należy wykonać stos obrazów konfokalnych obszaru zainteresowania, korzystając z obiektywu 10x z około 2,5-krotnym zoomem cyfrowym. Kanał zielony i czerwony należy wzbudzić za pomocą lasera o długości fali 488 nm oraz lasera o długości fali 561 nm.Następnie należy wykonać obrazy o rozmiarze 512 na 512 pikseli, stosując odstęp między płaszczyznami z wynoszący 1.3 microns oraz uśredniając trzy linie. Stos ten zostanie wypełniony przez około 100 przekrojów z. Dane należy wyeksportować jako stos obrazów TIFF.Otwórz stos obrazów TIFF i wyświetl wszystkie kanały w odpowiednim oprogramowaniu. Kliknij prawym przyciskiem myszy na kanale chrząstki, wybierz orthoslice i zatwierdź tworzenie. Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy na kanale chrząstki, wybierz Image Processing, Smoothing And Denoising, wybierz filtr obrazu i aktywuj smoothing Gaussian.W widoku projektu kliknij prawym przyciskiem myszy na przefiltrowany obraz, wybierz segmentację obrazu, a następnie edytuj nową etykietę. Utwórz nową etykietę dla każdego materiału, np. chrząstki i stawu. Następnie, korzystając z narzędzia magiczna różdżka z włączoną opcją wszystkich plastrów, zaznacz obszar chrząstki na obrazie i użyj narzędzia pędzel, aby usunąć szumy z konturów.Następnie za pomocą narzędzia pędzla zaznacz region stawu, przypisz go do komponentu stawu i powtórz tę czynność we wszystkich przekrojach stawu. Aby wygładzić wiele warstw jednocześnie, wybierz Segmentation z górnego menu, a następnie wybierz Smooth labels. Następnie, aby wygenerować render 3D powierzchni komponentu, kliknij prawym przyciskiem myszy na obrazie i wybierz Generate Surface.Teraz kliknij na wyrenderowaną powierzchnię i zapisz dane jako plik HMASCII dla oprogramowania do tworzenia siatek. Generowanie siatki 3D jest krytycznym etapem tworzenia dobrego modelu. Należy znaleźć kompromis między siatką, która oddaje rzeczywisty kształt modelowanej struktury, a taką, która nie zawiera zbyt wielu szczegółów mogących wprowadzić problematyczne elementy, na przykład takie o zbyt małych lub zbyt dużych kątach.Aby wygenerować siatkę, zaimportuj model 3D do odpowiedniego pakietu oprogramowania. W celu utworzenia dwuwymiarowej siatki powierzchni chrząstki i stawu użyj narzędzia shrinkwrap w menu 2D. Wybierz rozmiar elementu w przedziale od 1.5 do 2.5.Aby przeprowadzić optymalizację siatki 3D, można utworzyć szereg siatek powierzchniowych o różnych rozmiarach. W celu zapewnienia ciągłości siatki między powierzchnią stawu a chrząstką, wszystkie elementy na granicy muszą dzielić wspólne węzły. Aby to osiągnąć, należy usunąć wewnętrzną powierzchnię stawu, pozostawiając pustą rurkę.Użyj klawisza funkcyjnego F2, aby przejść do skrótu menu Usuwanie elementów (Delete Elements). Wybierz elementy do usunięcia. Dostosuj węzły brzegowe tak, aby odpowiadały powierzchni chrząstki.Użyj kombinacji klawiszy funkcyjnych F2, F3 i F6, aby odpowiednio usuwać, przesuwać węzły oraz tworzyć nowe elementy. Na koniec zduplikuj powierzchnię chrząstki w stawie, korzystając z menu organizowania komponentów kolektora. Użyj klawisza funkcyjnego F2, aby usunąć wszystkie elementy spoza stawu.Następnie przeprowadź kontrolę jakości w panelu Check elements. Sprawdź siatkę pod kątem zdublowanych elementów, wtrąceń oraz penetracji. W przypadku ich wykrycia, wprowadź poprawki za pomocą karty Tools.Sprawdź kąty dwuścienne, korzystając z karty narzędzi dostępnej w opcjach drzewa modelu. Aby wygenerować siatkę 3D z 2D powierzchniowych siatek o różnych rozmiarach elementów, użyj narzędzia Tetramesh. Porównaj różne rozmiary siatek i wybierz model FE o najmniejszym rozmiarze siatki, który zbiega się w kolejnych symulacjach i nie pogarsza definicji szczegółów geometrii.Następnie, korzystając z narzędzia Distance, przekształć siatkę tak, aby model żuchwy był w odpowiedniej skali. Upewnij się, że elementy chrząstki i stawu są połączone w modelu, eksportując model scalony lub stosując wiązania (ties). Następnie przypisz obciążenia, więzy i właściwości materiałowe do modelu FE, aby zasymulować funkcję żuchwy.Kierując się oznakowanymi stosami obrazów konfokalnych, zdefiniuj mięśnie. Najpierw wyznacz węzły odpowiadające punktom przyczepu mięśni. Następnie utwórz wektory między węzłami, które reprezentują początek i koniec każdego mięśnia.Po zdefiniowaniu wszystkich mięśni, utwórz history loadcollector i zastosuj Cload do każdego mięśnia. Określ wartość w niutonach i przypisz powiązany wektor. Następnie przypisz odpowiednie właściwości materiału izotropowego sprężystego, zgodnie z danymi literaturowymi.Następnie należy utworzyć kolektor obciążeń brzegowych (boundary loadcollector) i zastosować w modelu pewne ograniczenia początkowe. Wybierz węzły do ograniczenia, a następnie wybierz współczynnik stopni swobody odpowiadający naturalnemu zakresowi ruchu mięśnia zdefiniowanego przez te węzły. Teraz utwórz krok obciążenia dla każdego rodzaju ruchu, który ma zostać zasymulowany.W menu analizy wybierz wszystkie odpowiednie obciążenia i więzy, aby zasymulować określony ruch. Następnie z menu rozwijanego wybierz opcję statyczna. Po zakończeniu wyeksportuj model w odpowiednim formacie pliku, uwzględniając siatkę, obciążenia, więzy oraz właściwości materiałowe.W tym przypadku wybiera się format INP. Następnie model ładuje się do oprogramowania do analizy MES. Tam tworzy się i uruchamia zadanie dla modelu, a następnie analizuje wyniki pod kątem naprężeń, odkształceń, przemieszczeń i innych parametrów.Wybrać od trzech do sześciu transgenicznych larw zebrafish i lekko znieczulić je 0,02% MS-222, aż przestaną reagować na dotyk, ale ich serca wciąż będą bić. Następnie zamontować larwy bocznie na szkiełkach nakrywkowych w letnim, 1% agarozie o niskiej temperaturze topnienia w roztworze Danieau. Następnie ostrożnie usunąć pęsetą agarozę z okolic głowy i żuchwy.Następnie, używając pipety Pasteura, przepłucz głowę larwy świeżym roztworem Danieau, aby usunąć środek znieczulający. Powtarzaj tę czynność do momentu przywrócenia prawidłowych ruchów otworu gębowego. Następnie wykorzystaj oprogramowanie do przechwytywania obrazu, aby nagrać fluorescencyjne filmy wysokiej prędkości przedstawiające ruchy otworu gębowego.Nagrywaj film z najwyższą częstotliwością klatek tak długo, aż zarejestrujesz wiele cykli otwierania szczęki. Następnie przeanalizuj maksymalne przemieszczenie szczęki. Wybierz klatki, na których szczęka jest otwarta najszerzej, i zmierz odległość między przednią końcówką chrząstki Meckla a górną szczęką.Punkt żuchwy górnej odpowiada czubkowi płytki sitowej. Immunobarwienie mięśni i chrząstek lub obrazowanie reporterów transgenicznych pozwala na wizualizację struktury 3D żuchwy wraz z powiązanym z nią układem mięśniowym. Dzięki obrazowaniu w wysokiej rozdzielczości możliwe było zbudowanie modelu oddającego trójwymiarowy kształt żuchwy.Model uwzględnia obciążenia, których rozmieszczenie i wartość zostały wyprowadzone z obrazów konfokalnych mięśni i chrząstki. Na podstawie tego modelu przetestowano szereg różnych właściwości materiałowych. Wykorzystując przemieszczenia in vivo zaobserwowane za pomocą szybkiej rejestracji wideo, wybrano model, który najlepiej odwzorowuje ten zakres ruchu.Wykorzystując najdokładniejsze dane dotyczące właściwości materiałowych, obciążeń oraz kształtu siatki, model MES został użyty do opracowania najlepszego szacunku środowiska mechanicznego występującego w tym przedziale czasowym. Przykładowo, zmierzono wartości naprężeń. Model można powiększyć, aby dostrzec szczegóły wzoru, a następnie analizować go w przekrojach cyfrowych w celu obserwacji szczegółów we wszystkich wymiarach.Po obejrzeniu tego filmu zdobędą Państwo solidną wiedzę na temat wykorzystania obrazowania konfokalnego do budowy fizjologicznie dokładnego modelu 3D struktury biologicznej poddanej obciążeniu mechanicznemu. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że jest to model liniowo-sprężysty, a chrząstka nie zachowuje się całkowicie jak materiał liniowy. Można uwzględnić inne właściwości materiałowe, takie jak przepuszczalność, jednak może to wymagać dalszych modyfikacji siatki.

building-finite-element-models-to-investigate-zebrafish-jaw

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Wąsik szczękowy danio pręgowanego jest integumentarnym organem zmysłowym zawierającym pochodne ektodermy, mezodermy i grzebienia nerwowego. Co istotne, u osobników dorosłych wąsik ten potrafi zregenerować się po amputacji proksymalnej. Niniejszy film przedstawia rozwój wąsika szczękowego oraz prezentuje protokół chirurgiczny indukcji regeneracji, a następnie proces pobierania, zatapiania i obrazowania preparatów wąsików.

Metody badania wąsika szczękowego danio pręgowanego

Obrazowanie konfokalne w czasie jest potężną techniką przydatną do charakteryzowania rozwoju embrionalnego. W tym miejscu opisujemy metodologię i charakteryzujemy morfogenezę twarzoczaszki w zarodkach typu dzikiego, a także pdgfra, smad5 i zmutowanych smo.

Analiza morfogenezy twarzoczaszki u danio pręgowanego przy użyciu mikroskopii konfokalnej 4D

Zarodek danio pręgowanego jest doskonałym modelem do badań nad biologią rozwojową. Podczas embriogenezy danio pręgowany rozwija się z masą żółtka, co stanowi trójwymiarowe wyzwanie dla obserwacji i analizy próbek. Protokół ten opisuje, w jaki sposób tworzyć dwuwymiarowe preparaty do montażu płaskiego całych próbek zarodków danio pręgowanego barwionych metodą montażu in situ (WISH).

Przygotowanie do obserwacji i analizy próbek zarodków danio pręgowanego wybarwionych metodą hybrydyzacji in situ metodą całego wierzchowca

Danio pręgowany jest doskonałym modelem do badań genetycznych i rozwojowych. Implantacja kulek jest cenną techniką manipulacji tkankami, którą można wykorzystać do badania mechanizmów rozwojowych poprzez wprowadzanie zmian w lokalnych środowiskach komórkowych. Protokół ten opisuje, w jaki sposób przeprowadzić implantację mikrogranulek w zarodku danio pręgowanego.

Implantacja mikrogranulek w zarodku danio pręgowanego

Celem tego protokołu jest zmiana penetracji śmiercionośnych zmutowanych fenotypów szkieletowych u danio pręgowanego poprzez selektywną hodowlę. Śmiertelne mutanty nie mogą być dorosłe do dorosłości i rozmnażane samodzielnie, dlatego ten protokół opisuje metodę śledzenia i selekcji penetracji przez wiele pokoleń za pomocą testów potomstwa.

Przesuwająca się penetracja śmiertelnych mutantów szkieletowych danio pręgowanego za pomocą testów potomstwa

Tutaj opisujemy 3 modele uszkodzeń dorosłego danio pręgowanego i ich łączne stosowanie z leczeniem lekami immunosupresyjnymi. Udzielamy wskazówek w zakresie obrazowania regenerujących się tkanek oraz wykrywania w nich mineralizacji kości.

Modele urazów dorosłych danio pręgowanego w celu zbadania wpływu prednizolonu na regenerację tkanki kostnej

Zmodyfikowaliśmy model spadku masy Marmarou dla dorosłego danio pręgowanego, aby zbadać szeroki zakres patologii po uszkodzeniu mózgu (TBI) i mechanizmy leżące u podstaw późniejszej regeneracji neuronów. Ten model TBI jest skalowalny, indukuje łagodne, umiarkowane lub ciężkie TBI i podsumowuje niejednorodność obrażeń obserwowaną u ludzi.

Skalowalny model do badania skutków obrażeń spowodowanych siłą u dorosłych danio pręgowanych

Ten protokół opisuje zbieranie i wizualizację elasmoidalnych łusek danio pręgowanego podczas regeneracji in vivo. Ponadto przedstawiono hodowlę ex vivo tych łusek do 7 dni po zbiorach.

Regeneracja łusek danio pręgowanego w kulturze łusek toto i ex vivo

Ten protokół oferuje metodę badania dynamiki komórkowej za pomocą prostej techniki hodowli in vitro. Jest to okazja dla badaczy i edukatorów danio pręgowanego do badania procesów komórkowych, takich jak te związane z homeostazą kości i podstawową biologią komórki, poprzez wizualizację jąder fluorescencyjnych i komórek apoptotycznych w łuskach.

Technika hodowli in vitro do badania dynamiki komórkowej w łuskach danio pręgowanego

Opisany tutaj protokół przedstawia prostą i łatwą do wykonania procedurę barwienia i preparowania chrząstek twarzoczaszki u 5-dniowej larwy danio pręgowanego. Może być używany do badania anatomii, kształtu i wielkości tych struktur w różnych warunkach rozwojowych.

Rozwarstwienie tkanek twarzoczaszki danio pręgowanego po zabarwieniu błękitem alcyjskim

Praca ta opisuje protokół do ilościowego określania kształtu chrząstki czaszkowo-twarzowej za pomocą wolnego oprogramowania (tpsDigs2, MorphoJ i PAST) do pomiaru zmian struktury twarzy u larw danio dano.

Morfometryczne analizy kształtu: narzędzie analityczne do kwantyfikacji kształtu czaszkowo-twarzowego u danio pręgowanego

Poznaj metodę analizy elementów skończonych do badania biomechaniki szczęk danio pręgowanego. Technika ta symuluje środowisko mechaniczne rozwijających się szczęk, dostarczając wgląd w rozwój szkieletowy i zachowanie komórek.

Budowa modeli elementów skończonych w celu zbadania biomechaniki szczęk danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów