Usuwanie biofilmu za pomocą aerozoli dwutlenku węgla bez przedmuchiwania azotem

Ogólnym celem tego eksperymentu jest ocena skuteczności usuwania biofilmu za pomocą aerozoli dwutlenku węgla bez przedmuchiwania azotem. Aerozole z dwutlenkiem węgla mogą być stosowane do usuwania biofilmów wykorzystujących przenoszenie pędu i działanie środków powierzchniowo czynnych na aerozole. Jest to skuteczna i niezawodna metoda usuwania biofilmów w krótkim czasie, a także technika czyszczenia biofilmu w fazie gazowej.

Aby rozpocząć eksperyment, użyj mechanicznie wyciętych trzech wiórów ze stali nierdzewnej o grubości 1 milimetra i czterech pikseli kwadratowych w środku. Następnie należy sekwencyjnie oczyścić wióry z acetonu, metanolu i wody dejonizowanej lub DI. Opłucz wióry płynącą wodą DI przez cztery sekundy, a następnie wysusz frytki za pomocą przepływu azotu przez cztery sekundy.

Odzyskaj zapas Pseudomonas putida KT2440 przechowywany w temperaturze 80 stopni Celsjusza. Rozmrażać kulturę w temperaturze pokojowej przez jedną minutę, gdy wierzchnia warstwa zamrożonego roztworu podstawowego zamieni się w błoto pośniegowe. Zanurz pętlę w stopionej warstwie roztworu podstawowego i rozprowadź bakterie na bulionie Luria lub płytce LB zawierającej 1,5% agaru.

Inkubuj płytkę przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Następnego dnia dodaj 10 mililitrów LB do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Użyj świeżej pętli, aby wybrać pojedynczą kolonię z płytki i zaszczepić LB. Inkubuj bulion w inkubatorze z potrząsaniem.

Podnieś każdy z przygotowanych chipsów pęsetą i zanurz je w 70% etanolu pięć razy na 1-2 sekundy, aby wysterylizować powierzchnię każdego chipsa. Następnie opłucz każdy chip w autoklawowanej wodzie dejonizowanej lub DI. Następnie w LB sekwencyjnie, aby usunąć pozostały etanol.

Umieść frytki na sześciodołkowych płytkach hodowlanych z dwoma frytkami w pięciu mililetach bulionu LB na studzienkę. Następnie rozcieńczyć kulturę bakteryjną, aż stężenie w bulionie LB osiągnie 8 x 10 do ośmiu komórek na mililitr. Zaszczepić każdą studzienkę 50 mikrolitrami rozcieńczonej kultury bakteryjnej.

Następnie inkubuj płytki. Zanurz biofilmowane wióry w 10-milimolowym buforze octanu amonu pięć razy, aby usunąć luźno przyczepione i planktonowe bakterie. Następnie wysusz wióry w komorze bezpieczeństwa biologicznego, w której powietrze przepływa łagodnie.

Natychmiast po wyschnięciu umieść wiór na miejscu załadunku, 20 mililitrów od dyszy dwutlenku węgla wzdłuż osi strumienia. Przechyl oś strumienia pod kątem 40 stopni. Następnie ustaw ciśnienie stagnacji dwutlenku węgla i azotu za pomocą regulatorów ciśnienia gazu.

Nałóż strumień aerozolu na środkową część chipa. Włącz zawór elektromagnetyczny dwutlenku węgla na pięć sekund, a następnie wyłączaj go okresowo na trzy sekundy za pomocą ręcznie sterowanego przełącznika. Jeśli konieczne jest przedmuchiwanie azotem, włącz zawór elektromagnetyczny, aby zapewnić ciągłe dostarczanie azotu.

Po zakończeniu konfiguracji potraktuj wióry aerozolami dwutlenku węgla z przedmuchiwaniem azotem i bez niego i porównaj wióry z różnymi czasami obróbki aerozolowej. Zachować wióry bez obróbki jako kontrole negatywne. Przygotuj jeden mikromolar barwienia kwasem nukleinowym z zielonej fluorescencji w wodzie DI, aby zabarwić komórki bakteryjne na chipach kontrolnych i aerozolowych.

Wlej roztwór barwiący do dołków z wiórami i inkubuj je. Po inkubacji delikatnie spłucz wióry płynącą wodą DI, aby usunąć nadmiar barwnika fluorescencyjnego. Następnie wysusz wióry strumieniem azotu.

Wykonaj obrazy mikroskopowe fluorescencji pięciu losowych pól widzenia dla każdego chipa za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego. Na koniec przejdź do obliczeń. Obrazy mikroskopowe fluorescencji dla 24-godzinnych biofilmów Pseudomonas putida hodowanych poddano działaniu aerozoli dwutlenku węgla przez zero, 16, 40 i 88 sekund bez przedmuchiwania azotem.

Skuteczność usuwania obliczona na podstawie intensywności fluorescencji biofilmów bez przedmuchiwania azotem była wyższa niż skuteczność usuwania przy użyciu przedmuchiwania azotem. Jak widzieliście na tym filmie, trójfazowa technika czyszczenia skutecznie usuwa biofilm w krótkim czasie. Może być stosowany na wielu różnych powierzchniach skażonych biologicznie.