Model in vitro do badania transformacji komórkowej przez opryszczkę mięsaka Kaposiego

Ogólnym celem tej procedury jest przygotowanie próbnej próbki dopasowanej pod kątem wieku i pasażu w komórkach śródbłonka zakażonych KSHV, aby umożliwić badanie zmian związanych z KSHV w ekspresji genów komórek gospodarza, w tym zmian napędzających transformację nowotworową w kontekście odpowiednich kontroli. Metoda ta może pomóc w zdefiniowaniu kluczowych zmian patofizjologicznych w biologii komórek gospodarza, które prowadzą do nowotworów związanych z KSHV, identyfikując w ten sposób nowe cele terapeutyczne w celu zapobiegania chorobom lub ich leczenia. Główną zaletą tego systemu jest to, że złośliwa transformacja komórek śródbłonka po zakażeniu KSHV zachodzi szybko i powtarzalnie, co pozwala na badanie wczesnych zdarzeń w procesie onkogennym z komórkami kontrolnymi dopasowanymi pod względem wieku i pasażu.

Chociaż ten model onkogenezy wirusa może dostarczyć informacji na temat rozwoju mięsaka Kaposiego, można go również zastosować do innych typów raka. Ponieważ mięsak Kaposiego jest nowotworem naczyniowym, implikacje tego modelu hodowli komórkowej rozciągają się w kierunku zrozumienia innych procesów chorobowych napędzanych patologiczną angiogenezą. Aby rozpocząć, przygotuj i przefiltruj wysterylizowany bufor TNE zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Następnie przechowuj roztwór w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Hodowla linii komórkowej chłoniaka wysiękowego pierwotnego BCBL-1 z dodatnim wynikiem KSHV i ujemnym wynikiem EBV w kolbie T150 wypełnionej 60 mililitrami pożywki RPMI. Utrzymuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza 5% dwutlenku węgla, aby uzyskać zawiesinę około 1 do 1,2 razy 10 do szóstych komórek na mililitr.

Po osiągnięciu odpowiedniej gęstości podziel komórki na dwie świeże podłoże i dodaj PMA do końcowego stężenia 20 nanogramów na mililitr, aby wywołać produkcję KSHV. Następnie inkubuj kultury przez pięć dni. Po pięciu dniach inkubacji zbierz cząsteczki wirusa, obracając zawiesiny komórek pod ciśnieniem 300 razy g przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Następnie przenieść supernatanty do nowej probówki. Odwirować supernatanty jeszcze raz w temperaturze 2500 razy g w czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut, aby usunąć resztki komórkowe. Teraz, po oczyszczeniu, nałożyć pięć mililitrów 25% roztworu sacharozy w TNE z około 30 mililitrami supernatantu w sześciu probówkach ultrawirówek.

Odwirować zbalansowane probówki pod ciśnieniem 75 000 g przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza w próżni. Po zakończeniu wirowania zdekantować supernatant i osuszyć brzeg każdej probówki, aby usunąć jak najwięcej cieczy. Następnie ponownie zawieś granulowanego wirusa w 150 mikrolitrach buforu TNE i połącz wszystkie próbki.

Mieszaninę należy dokładnie wymieszać i podzielić na 25 mikrolitrowych porcji. Wirus podstawowy należy przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Hodowla pierwotnych ludzkich komórek mikronaczyniowych lub limfatycznych śródbłonka skóry w pożywce EGM w kolbie T75.

Utrzymuj hodowlę komórkową w temperaturze 37 stopni Celsjusza 5% dwutlenku węgla, aż do osiągnięcia około 50% konfluencji. Przed transdukcją komórek śródbłonka należy przeprowadzić hodowlę komórek PA317 LXSN 16E6E7 w kolbie do hodowli komórek T150 wypełnionej 20 mililitrami DMEM w temperaturze 37 stopni Celsjusza 5% dwutlenku węgla. Po osiągnięciu około 90% konfluencji zastąp pożywkę z hodowli komórkowej PA317 16 mililitrami świeżej pożywki i inkubuj komórki przez noc.

Po całonocnej inkubacji zebrać pożywkę z hodowli komórkowej PA317 i oczyścić ją przez odwirowanie w temperaturze 300 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Zastąp pożywkę EGM z 50% zlewającej się hodowli komórek śródbłonka 12 mililitrami oczyszczonej pożywki PA317. Inkubuj komórki przez cztery godziny.

Następnie zastąp sześć mililitrów pożywki PA317 sześcioma mililitrami świeżej pożywki EGM i inkubuj komórki przez noc. Następnie usuń pożywkę z hodowli komórek śródbłonka i nakarm komórki 12 mililitrami świeżego EGM. Kontynuuj inkubację komórek przez dodatkowe 48 godzin.

Aby przeprowadzić subhodowlę komórek śródbłonka, usuń pożywkę i umyj komórki 12 mililitrami PBS bez kationów. Następnie dodaj trzy mililitry komercyjnego roztworu dysocjacji enzymatycznej i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy minuty. Przenieś zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów i odwiruj komórki w temperaturze 300 razy g przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Po granulowaniu ponownie zawiesić komórki w świeżej pożywce EGM i równomiernie podzielić zawiesinę na trzy kolby T75. Dostosuj objętość kultur do 12 mililitrów EGM na kolbę. Następnie dodaj 200 mikrogramów na mililitr G418, aby wybrać transdukowane komórki śródbłonka.

Zbierz transdukowane komórki śródbłonka przez trawienie enzymatyczne, jak pokazano wcześniej. Zawiesić osad komórek śródbłonka w jednym mililitrze pożywki EGM. Następnie wymieszaj pięć mikrolitrów zawiesiny komórkowej z 45 mikrolitrami roztworu błękitu trypanowego i policz żywotne komórki za pomocą hemocytometru.

Wysiewaj 2,5 razy 10 do piątych żywotnych komórek w dwóch mililitrach pożywki EGM na dołek sześciodołkowej płytki. Następnego dnia usuń pożywkę EGM i umyj komórki w każdym dołku trzema mililitrami PBS z wapniem i magnezem. Następnie dodaj dwa mililitry pożywki EBM do każdej studzienki.

Aby zainfekować komórki KSHV, dodaj od pięciu do 20 mikrolitrów zapasu wirusa do każdej studzienki i zakręć płytką, aby wymieszać zawiesiny. Dodaj równą objętość buforu TNE do każdej studzienki zawierającej pozorowane zainfekowane komórki. Po odwirowaniu płytki w temperaturze 400 razy g przez 30 minut w temperaturze pokojowej, inkubować ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 90 minut.

Następnie dodaj dwa mililitry pożywki EGM do każdej studzienki i inkubuj kultury przez noc. Po inkubacji należy usunąć pożywkę EGM z każdej studzienki i zastąpić ją dwoma mililitrami świeżego EGM. Gdy komórki osiągną około 90% konfluencji, zbierz je przez trawienie enzymatyczne, jak pokazano wcześniej.

Połączyć komórki z trzech studzienek w kolbie T75 oznaczonej liczbą całkowitych pasaży w pasażu po zakażeniu. Przed testem lub zamrożeniem należy rozprężyć makiety i zakażone KSHV hodowle komórek śródbłonka, dzieląc je od jednego do trzech na co najmniej dwa dodatkowe przejścia. Przedstawiono tutaj mikroskopijny obraz zlewających się imitacji zakażonych komórek śródbłonka, ukazujący klasyczny wygląd kostki brukowej.

Podział komórkowy w tych komórkach zostaje zahamowany w kontakcie, gdy kultura osiąga zbieg. Komórki śródbłonka zakażone KSHV rozwijają wydłużoną, wrzecionowatą morfologię, przypominającą komórki wrzecionowate mięsaka Kaposiego. W przeciwieństwie do komórek zakażonych pozorami, komórki śródbłonka zakażone KSHV nadal się namnażają, nawet gdy osiągną zbieg, co prowadzi do rozwoju wielowarstwowych ognisk komórkowych.

Po utracie kontaktu z podłożem zainfekowane sztucznie zakażone komórki śródbłonka przechodzą apoptozę śmierci komórki, anoikis, a ponadto nie tworzą kolonii w miękkim agarze . Wręcz przeciwnie, komórki zakażone KSHV są odporne na anoikis i rosnące kolonie, gdy są hodowane w miękkim agarze . Rozwojowi wrzecionowatej morfologii w komórkach śródbłonka zakażonych KSHV towarzyszy ekspresja białka latencji wirusa ORF73 i w mniejszym stopniu czynnika procesowości wirusowej ORF59.

Po zakażeniu KSHV BAC16 znakowanym zielonym białkiem fluorescencyjnym, komórki śródbłonka rozwinęły morfologię w kształcie wrzeciona i wykazują ekspresję GFP, potwierdzając przypadkowy związek między zakażeniem KSHV w obserwowanym fenotypie. Po opracowaniu ten model hodowli komórkowej utorował naukowcom drogę do oceny zmian w mRNA i ekspresji białka komórki gospodarza wywołanych zakażeniem KSHV. W związku z tym zidentyfikowano kluczowe mechanizmy chorobotwórcze leżące u podstaw onkogenezy, w której pośredniczy KSHV, stanowiąc obiecujące cele terapeutyczne.

Nie zapominaj, że KSHV jest środkiem BSL-2 i powinien być traktowany zgodnie z odpowiednimi procedurami i praktykami bezpieczeństwa biologicznego.