Name: Model in vitro do badania transformacji komórkowej przez opryszczkę mięsaka Kaposiego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Poznaj model in vitro do badania transformacji komórek śródbłonka przez KSHV. Ta metoda pozwala analizować zmiany ekspresji genów i wczesne zdarzenia onkogenne, identyfikując nowe cele terapeutyczne w mięsaku Kaposiego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez K12 HD068322 (SCM); R01 CA179921 oraz P51 OD011092 (AVM); oraz nagroda 14PRE20320014 od Amerykańskiego Towarzystwa Kardiologicznego (SB).

UWAGA: Wszystkie procedury opisane w tym protokole powinny być wykonywane w warunkach BSL-2.
1. Przygotowanie zapasów KSHV
<ol>
	<li>Przygotować bufor TNE: rozpuścić 292,24 mg EDTA w ddH2O, doprowadzić do 225 ml i dostosować do pH 8. Rozpuścić 605,7 mg Tris w ddH2O, doprowadzić do 225 ml i dostosować do pH 8. Połączyć roztwory EDTA i Tris, dodać 4,38 g NaCl, dostosować końcową objętość do 500 ml, przefiltrować sterylizować i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Hodowla linii komórkowej pierwotnego chłoniaka wysiękowego BCBL-1 z dodatnim i ujemnym wynikiem EBV w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C plus 5% CO2 w RPMI, uzupełnionej 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS) i środkami przeciwdrobnoustrojowymi do około 1 do 1,2 x 106 komórek na ml.</li>
	<li>Aby indukować produkcję KSHV, należy podzielić kultury 1:2 ze świeżą pożywką i dodać 12-mirystynian 13-octanu forbolu (PMA) do końcowego stężenia 20 ng / ml i inkubować kultury przez 5 dni. Alternatywnie należy traktować komórki maślanem sodu (NaB; 0,1 mM) przez 3 dni w celu wywołania litycznej replikacji wirusa.</li>
	<li>Aby zebrać cząsteczki wirusa, należy najpierw odwirować supernatant kultury o sile 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby osadzać komórki i przenieść supernatanty do świeżych probówek.</li>
	<li>W celu dalszego oczyszczenia supernatantu, tak aby uniknąć przenoszenia resztek komórkowych, odwirować przy 2 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Jako alternatywę dla wirowania z dużą prędkością w celu klarowania supernatantów hodowlanych, można przeprowadzić filtrację przez sterylny filtr 0,45 μm. Zaobserwowaliśmy znaczny spadek miana przy użyciu filtracji; Dlatego rutynowo wykonujemy drugi etap wirowania.</li>
	<li>Następnie nałożyć 5 ml 25% roztworu sacharozy w buforze TNE z około 30 ml sklarowanego supernatantu hodowli w 6 probówkach do ultrawirówek.</li>
	<li>Wirować wyważone probówki o sile 75 000 x g przez 2 godziny w temperaturze 4 °C w próżni.</li>
	<li>Zdekantować supernatant do hodowli i osuszyć brzeg każdej probówki, aby usunąć jak najwięcej supernatantu i roztworu sacharozy, a następnie ponownie zawiesić osad wirusa, który może być niewidoczny, w 150 μl buforu TNE.</li>
	<li>Zebrać wszystkie zawieszone wirusy, dobrze wymieszać i zamrozić 25 μl porcji w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
2. Transdukcja EC z genami wirusa brodawczaka E6 i E7
UWAGA: Rutynowo używamy standardowych kolb do hodowli tkanek do hodowli pierwotnego EC. Jednakże, jeżeli uzyskuje się niezadowalający wzrost EC, należy rozważyć użycie komercyjnych kolb hodowlanych.
<ol>
	<li>Hodowla pierwotnego ludzkiego mikronaczyniowego lub limfatycznego EC przez skórę w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37°C plus 5% CO2 w pożywce EC (EGM; zawiera podłoże podstawowe EC [EBM] uzupełnione EGM-2 BulletKit [zawierające FBS, hydrokortyzon, ludzki czynnik wzrostu fibroblastów-B, naczyniowy czynnik wzrostu EC, insulinopodobny czynnik wzrostu-1, kwas askorbinowy, ludzki nabłonkowy czynnik wzrostu, antybiotyki i heparynę]) w kolbie do hodowli komórek T75 do około 50% zbiegu.</li>
	<li>Do transdukcji posadź komórki PA317 LXSN 16E6E724,35 w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37°C plus 5% CO2 w DMEM uzupełnionym 10% FBS i środki przeciwdrobnoustrojowe w kolbie do hodowli komórek T150, aż osiągną około 90% zlewania się. Następnie inkubować przez noc w 16 ml pożywki.</li>
	<li>Sklarować pożywkę PA317 przez odwirowanie przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usunąć EGM z hodowli EC i nałożyć na komórki 12 ml oczyszczonej pożywki PA317 i inkubować przez 4 godziny 
	UWAGA: Odwirowanie 16 ml kondycjonowanej pożywki przy 300 x g przez 5 minut daje zwarty osad, który nie jest zakłócany przez staranne późniejsze usunięcie 12 ml sklarowanego supernatantu. Jeśli jednak przeniesienie komórek PA317 LXSN 16E6E7 do pierwotnych kultur EC jest problemem (linia komórek pakujących szybko przerośnie EC), wówczas można przeprowadzić filtrację kondycjonowanego supernatantu przez filtr 0,45 μm przed transferem.</li>
	<li>Zastąp 6 ml pożywki PA317 świeżym EGM i inkubuj przez noc.</li>
	<li>Ponownie wprowadzić EC 12 ml świeżego NWZ i inkubować przez kolejne 48 godzin.</li>
	<li>W celu subhodowli EC należy usunąć pożywkę i przemyć 12 ml PBS bez kationów, a następnie dodać 3 ml dostępnego w handlu roztworu dysocjacji enzymatycznej (np. TrypLE) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 minuty.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Zawiesić otrzymany osad komórkowy w świeżym NWZ i równomiernie podzielić na 3 kolby T75 o końcowej objętości 12 ml EGM na kolbę.</li>
	<li>Aby wybrać EC transdukowane za pomocą E6 i E7, dodaj G418 do końcowego stężenia 200 μg/ml przez dwa pasaże, po czym transdukowany EC można posiać w celu zakażenia lub zamrozić w ciekłym azocie.</li>
</ol>
3. Zakażenie transdukowanego EC KSHV
<ol>
	<li>W dniu poprzedzającym zakażenie należy pobrać EC przez trawienie enzymatyczne przy użyciu dostępnego w handlu roztworu dysocjacji enzymatycznej, jak opisano powyżej. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml EGM. Użyj 5 μl komórek, aby przygotować rozcieńczenie 1/10 w błękicie trypanowym. Policz żywe komórki za pomocą hemocytometru i zasiaj 2,5 x 105 żywych komórek w 2 ml EGM na dołek w 6 dołkach.</li>
	<li>W dniu zakażenia należy usunąć EGM i przemyć komórki 3 ml PBS z wapniem i magnezem na studzienkę, a następnie dodać 2 ml EBM. 
	UWAGA: Istotne jest, aby podczas infekcji stosować EBM, a nie EGM, ponieważ heparyna zawarta w EGM hamuje wiązanie cząstek wirusa z docelowym EC, a następnie zakażenie.</li>
	<li>Aby zainfekować komórki KSHV, dodaj od 5 do 20 μl zapasu wirusa do każdej studzienki i zawiruj płytkę, aby wymieszać. W przypadku pozorowanych zainfekowanych komórek dodaj równą objętość buforu TNE do każdej studzienki.</li>
	<li>Odwirować płytki o sile 400 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 90 minut.</li>
	<li>Jeśli celem badania jest zbadanie wczesnych zdarzeń wymagających synchronicznej infekcji wirusowej, np. wczesnych zdarzeń w zakażeniu de novo, należy w tym momencie usunąć inokulum wirusa. Opłucz komórki i ponownie nakarm je 2 ml świeżego NWZ. W przeciwnym razie dodaj 2 ml EGM i inkubuj kultury przez noc.</li>
	<li>Ponownie nakarmić komórki 2 ml EGM dzień po zakażeniu, a następnie co drugi dzień.</li>
	<li>Gdy komórki są w około 90% zlewające się, zbierz je przez trawienie enzymatyczne przy użyciu komercyjnego roztworu dysocjacji enzymatycznej, jak opisano powyżej, a następnie połącz komórki z trzech dołków w T75, odnotowując zarówno całkowitą liczbę pasaży, jak i pasaż po infekcji.</li>
	<li>Rozszerz makietę EC zainfekowaną KSHV za pomocą podziałów 1:3 przez co najmniej dwa dodatkowe przejścia, w którym to czasie komórki mogą być używane w eksperymentach lub zamrażane w ciekłym azocie. 
	UWAGA: Podobnie jak w przypadku rozszczepienia EC transdukowanego przez E6 i E7, hodowle podtrzymujące komórek zakażonych makietą i KSHV powinny zostać podzielone przed osiągnięciem konfluencji (~85 do 90%).</li>
</ol>
4. Potwierdzanie zakażenia KSHV za pomocą immunofluorescencji
UWAGA: Wykrycie antygenu jądrowego związanego z opóźnieniem KSHV (LANA-1/ORF73) zapewnia wiarygodną ilościową miarę infekcji. Przeciwciała anty-LANA są dostępne w handlu.
<ol>
	<li>Dzień przed barwieniem umieścić dwie studzienki z makietą lub zakażonym KSHV EC na 24-dołkowej płytce w ilości 1 x 105 komórek na studzienkę w 1 ml EGM i inkubować przez noc.</li>
	<li>Umyj komórki dwukrotnie 500 μl PBS plus wapń i magniseum. Myj się przez 30 s na bujanej platformie.</li>
	<li>W zewnętrznie wentylowanym dygestorii utrwal komórki za pomocą 500 μl 4% paraformaldehydu przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przemyć komórki trzykrotnie 500 μl buforu do przemywania (0,1% Triton X-100 plus 0,02% koziej surowicy w PBS plus kationy).</li>
	<li>Blokuj komórki 500 μl 2% koziej surowicy w buforze do przemywania przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przemyć komórki trzykrotnie 500 μl buforu do płukania.</li>
	<li>Oznaczyć jedną studzienkę EC zakażonego makietą lub KSHV za pomocą 200 μl przeciwciała pierwszorzędowego rozcieńczonego w stosunku 1:100 w buforze do przemywania przez 30 minut w temperaturze pokojowej na kołysce. Pozostałe dwie studzienki inkubować tylko w 200 μl buforu do przemywania (ang. soap buffer).</li>
	<li>Przemyć komórki trzykrotnie 500 μl buforu do płukania.</li>
	<li>Oznaczyć wszystkie cztery studzienki 200 μl przeciwciała wtórnego rozcieńczonego w stosunku 1:100 w buforze do płukania przez 30 minut w temperaturze pokojowej na kołysce.</li>
	<li>Przemyć komórki trzykrotnie 500 μl buforu do płukania.</li>
	<li>Do każdej studzienki nanieść 20 μl podłoża montażowego zawierającego DAPI i szkiełko nakrywkowe i ocenić barwienie za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego.</li>
	<li>Określ procent infekcji komórek zakażonych KSHV, licząc liczbę jąder LANA-dodatnich w co najmniej 200 komórkach. Zakażenie rekombinowanym KSHV-Bac16 można również monitorować poprzez obserwację kultur pod kątem ekspresji GFP.</li>
</ol>

Onkogeneza jest wieloetapowym procesem, który omija ważne zabezpieczenia w organizmie36. Ponieważ zmiany KS występują w spektrum przewlekłego stanu zapalnego do prawdziwych mięsaków, wyjaśnienie pewnych procesów patofizjologicznych, w których pośredniczy KSHV, wymaga przeprowadzenia pewnych badań na modelach hodowli komórkowych, które wspierają transformację9. Należy zauważyć, że utrata zahamowania kontaktu i wzrost zależny od zakotwiczenia, fenotypy wskazujące na transform...

Mięsak Kaposiego (KS) to wieloogniskowy nowotwór angioproliferacyjny atakujący miejsca skórne, śluzówkowe i trzewne, który rozwija się najczęściej w warunkach zaawansowanej supresji immunologicznej1. Opisano cztery formy epidemiologiczne: klasyczną, powolną formę, która zwykle dotyka osoby starsze o pochodzeniu śródziemnomorskim i bliskowschodnim; jatrogenne, wynikające z leczenia lekami immunosupresyjnymi po przeszczepieniu narządu; epidemia, rak definiujący AIDS; i endemiczny, niezależna od HIV forma powszechna u dzieci w endemicznych regionach Afryki. Wraz z pojawieniem się skutecznych skojarzonych leków antyretrowirusowych stosowanych w leczeniu HIV, epidemia KS jest znacznie rzadziej diagnozowana w krajach rozwijających się. Jednak klinicznie agresywne formy endemiczne i epidemiczne pozostają jednymi z najczęściej diagnozowanych nowotworów w wielu krajach afrykańskich2,3,4. Dlatego identyfikacja skutecznych leków ukierunkowanych na patogenezę w leczeniu KS jest priorytetem badawczym.
Histologicznie, zmiany KS charakteryzują się rozległą, ale nieprawidłową neowaskularyzacją, w wyniku której wrzecionowate komórki pochodzenia EC tworzą nieciągłe sieci naczyniowe5. Te nieprawidłowe naczynia ("szczeliny naczyniowe") umożliwiają wynaczynienie erytrocytów, które nadają zmianom charakterystyczny kolor. Dodatkowo zmiany zawierają liczne leukocyty, które charakteryzują przewlekły stan zapalny (tj. limfocyty, makrofagi i komórki plazmatyczne). Opisano regresję zmian KS po rekonstytucji immunologicznej, co sugeruje, że KS ma cechy zarówno zmiany hiperproliferacyjnej, jak i prawdziwego nowotworu6,7,8,9.
wirus opryszczki KS (KSHV), czynnik sprawczy KS, został zidentyfikowany w 199410. Od tego czasu opracowano wiele modeli hodowli komórkowych in vitro, aby umożliwić badania patogenezy, w tym komórek eksplantowanych z materiału biopsji guza i EC pierwotnego lub eksprymującego telomerazy zakażonego KSHV in vitro11,12,13,14,15,16,17,18. Żaden z obecnie dostępnych modeli nie podsumowuje w pełni mikrośrodowiska guza KS, ale wszystkie wniosły cenną wiedzę do naszego zrozumienia patobiologii zakażenia KSHV. W przeciwieństwie do innego znanego rakotwórczego ludzkiego wirusa opryszczki wirusa Epsteina-Barr (EBV), KSHV nie przekształca łatwo komórek w hodowli po zakażeniu de novo19,20,21,22. Jednak to ograniczenie zostało przezwyciężone przez transdukcję pierwotnego ludzkiego EC o mieszanym pochodzeniu mikronaczyniowym lub limfatycznym z genami E6 i E7 z wirusa brodawczaka ludzkiego typu 16 przed zakażeniem KSHV23,24. Ekspresja tych egzogennych onkogenów radykalnie zwiększa potencjał transformacyjny KSHV in vitro, częściowo poprzez dalsze hamowanie białka siatkówczaka i p5323,24. Ta metoda transdukcji EC pozwoliła wielu laboratoriom zidentyfikować kluczowe zmiany w ekspresji genów komórek gospodarza, które są indukowane przez zakażenie KSHV i które wydają się ułatwiać przeżycie i proliferację komórek KS25,26,27,28,29,30,31,32. Opisane tutaj protokoły są proste i wysoce powtarzalne, a ich wynikiem będzie generowanie dopasowanych do wieku i pasaży kontrolnych EC zakażonych KSHV oraz prób zakażenia, które mogą być hodowane znacznie dłużej niż komórki pierwotne i pozwolą na badanie mechanizmów onkogennych stosowanych przez KSHV. Chociaż protokół zawiera metodę produkcji dzikiego typu KSHV z pierwotnej linii komórkowej chłoniaka wysiękowego BCBL-1, unieśmiertelnione E6/E7 EC są również wysoce podatne na zakażenie rekombinowanym KSHV-BAC1630. Protokoły przygotowania BAC16 są opisane w innym miejscu33,34.

<table><tbody><tr><td>Komórki BCBL-1</td><td>Program odczynników NIH AIDS</td><td>3233</td><td></td></tr><tr><td>Komórki PA317</td><td>ATCC</td><td>CRL-2203</td><td></td></tr><tr><td>Noworodkowe komórki mikronaczyniowe śródbłonka skóry</td><td>Lonza</td><td>CC-2505</td><td></td></tr><tr><td>EBM-2 Podłoże podstawowe</td><td>Lonza</td><td>CC-3156</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>anty-KSHV LANA/ORF 73</td><td>Zaawansowany Biotechnologies</td><td>13-210-100</td><td></td></tr><tr><td>TrypLETMExpress, bez czerwieni fenolowej</td><td>ThermoFisher</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS z wapniem i magnezem</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

model in vitro do badania transformacji komórkowej przez opryszczkę mięsaka kaposiego

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Mięsak Kaposiego (KS) to nietypowy nowotwór złożony z proliferujących komórek wrzecionowatych, który jest inicjowany przez zakażenie komórek śródbłonka (EC) KSHV i rozwija się najczęściej w warunkach immunosupresji. Pomimo dziesięcioleci badań, optymalne leczenie KS pozostaje słabo zdefiniowane, a wyniki kliniczne są szczególnie niekorzystne w warunkach ograniczonych zasobów. Zmiany KS są napędzane przez patologiczną angiogenezę, przewlekły stan zapalny i onkogenezę, a w celu zbadania tych procesów opracowano różne modele hodowli komórkowych in vitro. KS powstaje z zakażonych KSHV komórek pochodzenia śródbłonkowego, więc komórki linii EC stanowią najbardziej odpowiednie substytuty prekursora komórek wrzecionowatych in vitro. Jednak ze względu na ograniczoną długość życia in vitro, a mechanizmy onkogenne wykorzystywane przez KSHV są mniej wydajne niż w przypadku innych wirusów rakotwórczych, trudno było ocenić procesy transformacji w EC pierwotnym lub unieśmiertelnionym telomerazą. W związku z tym opracowano nowatorski model hodowli oparty na EC, który łatwo wspiera transformację po zakażeniu KSHV. Ektopowa ekspresja genów E6 i E7 wirusa brodawczaka ludzkiego typu 16 pozwala na rozszerzoną hodowlę EC zakażonego KSHV w zależności od wieku i pasażu oraz wspiera rozwój prawdziwie przekształconego (tj. rakotwórczego) fenotypu w zakażonych kulturach komórkowych. Ten elastyczny i wysoce powtarzalny model KS ułatwił odkrycie kilku podstawowych szlaków sygnałowych o dużym potencjale przełożenia na warunki kliniczne.

Morfologię pierwotnych EC klasycznie opisuje się jako „brukową” i nie ulega ona zmianie po ekspresji genów E6 i E7 wirusa papilnomaty (Rysunek 1A). Sama ekspresja genów E6 i E7 nie indukuje fenotypu transformowanego; w związku z tym komórki są podatne na inhibicję kontaktową i przestają się dzielić po osiągnięciu konfluencji w hodowli. Komórki te będą jednak proliferować i ponownie odrosną do konfluencji po trypsynizacji i przesianiu przy niższej gęstości, co pozwala na u...

Mięsak Kaposiego (KS) to nowotwór wywołany przez zakażenie wirusem onkogennym ludzkim herpeswirusem-8/herpeswirusem KS (HHV-8/KSHV). Opisany tutaj model hodowli komórek śródbłonka jest wyjątkowo odpowiedni do badania mechanizmów, za pomocą których KSHV przekształca komórki gospodarza.

Model in vitro do badania transformacji komórkowej przez opryszczkę mięsaka Kaposiego

Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and ...

Ogólnym celem tej procedury jest przygotowanie próbnej próbki dopasowanej pod kątem wieku i pasażu w komórkach śródbłonka zakażonych KSHV, aby umożliwić badanie zmian związanych z KSHV w ekspresji genów komórek gospodarza, w tym zmian napędzających transformację nowotworową w kontekście odpowiednich kontroli. Metoda ta może pomóc w zdefiniowaniu kluczowych zmian patofizjologicznych w biologii komórek gospodarza, które prowadzą do nowotworów związanych z KSHV, identyfikując w ten sposób nowe cele terapeutyczne w celu zapobiegania chorobom lub ich leczenia. Główną zaletą tego systemu jest to, że złośliwa transformacja komórek śródbłonka po zakażeniu KSHV zachodzi szybko i powtarzalnie, co pozwala na badanie wczesnych zdarzeń w procesie onkogennym z komórkami kontrolnymi dopasowanymi pod względem wieku i pasażu.Chociaż ten model onkogenezy wirusa może dostarczyć informacji na temat rozwoju mięsaka Kaposiego, można go również zastosować do innych typów raka. Ponieważ mięsak Kaposiego jest nowotworem naczyniowym, implikacje tego modelu hodowli komórkowej rozciągają się w kierunku zrozumienia innych procesów chorobowych napędzanych patologiczną angiogenezą. Aby rozpocząć, przygotuj i przefiltruj wysterylizowany bufor TNE zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Następnie przechowuj roztwór w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Hodowla linii komórkowej chłoniaka wysiękowego pierwotnego BCBL-1 z dodatnim wynikiem KSHV i ujemnym wynikiem EBV w kolbie T150 wypełnionej 60 mililitrami pożywki RPMI. Utrzymuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza 5% dwutlenku węgla, aby uzyskać zawiesinę około 1 do 1,2 razy 10 do szóstych komórek na mililitr.Po osiągnięciu odpowiedniej gęstości podziel komórki na dwie świeże podłoże i dodaj PMA do końcowego stężenia 20 nanogramów na mililitr, aby wywołać produkcję KSHV. Następnie inkubuj kultury przez pięć dni. Po pięciu dniach inkubacji zbierz cząsteczki wirusa, obracając zawiesiny komórek pod ciśnieniem 300 razy g przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Następnie przenieść supernatanty do nowej probówki. Odwirować supernatanty jeszcze raz w temperaturze 2500 razy g w czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut, aby usunąć resztki komórkowe. Teraz, po oczyszczeniu, nałożyć pięć mililitrów 25% roztworu sacharozy w TNE z około 30 mililitrami supernatantu w sześciu probówkach ultrawirówek.Odwirować zbalansowane probówki pod ciśnieniem 75 000 g przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza w próżni. Po zakończeniu wirowania zdekantować supernatant i osuszyć brzeg każdej probówki, aby usunąć jak najwięcej cieczy. Następnie ponownie zawieś granulowanego wirusa w 150 mikrolitrach buforu TNE i połącz wszystkie próbki.Mieszaninę należy dokładnie wymieszać i podzielić na 25 mikrolitrowych porcji. Wirus podstawowy należy przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Hodowla pierwotnych ludzkich komórek mikronaczyniowych lub limfatycznych śródbłonka skóry w pożywce EGM w kolbie T75.Utrzymuj hodowlę komórkową w temperaturze 37 stopni Celsjusza 5% dwutlenku węgla, aż do osiągnięcia około 50% konfluencji. Przed transdukcją komórek śródbłonka należy przeprowadzić hodowlę komórek PA317 LXSN 16E6E7 w kolbie do hodowli komórek T150 wypełnionej 20 mililitrami DMEM w temperaturze 37 stopni Celsjusza 5% dwutlenku węgla. Po osiągnięciu około 90% konfluencji zastąp pożywkę z hodowli komórkowej PA317 16 mililitrami świeżej pożywki i inkubuj komórki przez noc.Po całonocnej inkubacji zebrać pożywkę z hodowli komórkowej PA317 i oczyścić ją przez odwirowanie w temperaturze 300 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Zastąp pożywkę EGM z 50% zlewającej się hodowli komórek śródbłonka 12 mililitrami oczyszczonej pożywki PA317. Inkubuj komórki przez cztery godziny.Następnie zastąp sześć mililitrów pożywki PA317 sześcioma mililitrami świeżej pożywki EGM i inkubuj komórki przez noc. Następnie usuń pożywkę z hodowli komórek śródbłonka i nakarm komórki 12 mililitrami świeżego EGM. Kontynuuj inkubację komórek przez dodatkowe 48 godzin.Aby przeprowadzić subhodowlę komórek śródbłonka, usuń pożywkę i umyj komórki 12 mililitrami PBS bez kationów. Następnie dodaj trzy mililitry komercyjnego roztworu dysocjacji enzymatycznej i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy minuty. Przenieś zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów i odwiruj komórki w temperaturze 300 razy g przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Po granulowaniu ponownie zawiesić komórki w świeżej pożywce EGM i równomiernie podzielić zawiesinę na trzy kolby T75. Dostosuj objętość kultur do 12 mililitrów EGM na kolbę. Następnie dodaj 200 mikrogramów na mililitr G418, aby wybrać transdukowane komórki śródbłonka.Zbierz transdukowane komórki śródbłonka przez trawienie enzymatyczne, jak pokazano wcześniej. Zawiesić osad komórek śródbłonka w jednym mililitrze pożywki EGM. Następnie wymieszaj pięć mikrolitrów zawiesiny komórkowej z 45 mikrolitrami roztworu błękitu trypanowego i policz żywotne komórki za pomocą hemocytometru.Wysiewaj 2,5 razy 10 do piątych żywotnych komórek w dwóch mililitrach pożywki EGM na dołek sześciodołkowej płytki. Następnego dnia usuń pożywkę EGM i umyj komórki w każdym dołku trzema mililitrami PBS z wapniem i magnezem. Następnie dodaj dwa mililitry pożywki EBM do każdej studzienki.Aby zainfekować komórki KSHV, dodaj od pięciu do 20 mikrolitrów zapasu wirusa do każdej studzienki i zakręć płytką, aby wymieszać zawiesiny. Dodaj równą objętość buforu TNE do każdej studzienki zawierającej pozorowane zainfekowane komórki. Po odwirowaniu płytki w temperaturze 400 razy g przez 30 minut w temperaturze pokojowej, inkubować ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 90 minut.Następnie dodaj dwa mililitry pożywki EGM do każdej studzienki i inkubuj kultury przez noc. Po inkubacji należy usunąć pożywkę EGM z każdej studzienki i zastąpić ją dwoma mililitrami świeżego EGM. Gdy komórki osiągną około 90% konfluencji, zbierz je przez trawienie enzymatyczne, jak pokazano wcześniej.Połączyć komórki z trzech studzienek w kolbie T75 oznaczonej liczbą całkowitych pasaży w pasażu po zakażeniu. Przed testem lub zamrożeniem należy rozprężyć makiety i zakażone KSHV hodowle komórek śródbłonka, dzieląc je od jednego do trzech na co najmniej dwa dodatkowe przejścia. Przedstawiono tutaj mikroskopijny obraz zlewających się imitacji zakażonych komórek śródbłonka, ukazujący klasyczny wygląd kostki brukowej.Podział komórkowy w tych komórkach zostaje zahamowany w kontakcie, gdy kultura osiąga zbieg. Komórki śródbłonka zakażone KSHV rozwijają wydłużoną, wrzecionowatą morfologię, przypominającą komórki wrzecionowate mięsaka Kaposiego. W przeciwieństwie do komórek zakażonych pozorami, komórki śródbłonka zakażone KSHV nadal się namnażają, nawet gdy osiągną zbieg, co prowadzi do rozwoju wielowarstwowych ognisk komórkowych.Po utracie kontaktu z podłożem zainfekowane sztucznie zakażone komórki śródbłonka przechodzą apoptozę śmierci komórki, anoikis, a ponadto nie tworzą kolonii w miękkim agarze . Wręcz przeciwnie, komórki zakażone KSHV są odporne na anoikis i rosnące kolonie, gdy są hodowane w miękkim agarze . Rozwojowi wrzecionowatej morfologii w komórkach śródbłonka zakażonych KSHV towarzyszy ekspresja białka latencji wirusa ORF73 i w mniejszym stopniu czynnika procesowości wirusowej ORF59.Po zakażeniu KSHV BAC16 znakowanym zielonym białkiem fluorescencyjnym, komórki śródbłonka rozwinęły morfologię w kształcie wrzeciona i wykazują ekspresję GFP, potwierdzając przypadkowy związek między zakażeniem KSHV w obserwowanym fenotypie. Po opracowaniu ten model hodowli komórkowej utorował naukowcom drogę do oceny zmian w mRNA i ekspresji białka komórki gospodarza wywołanych zakażeniem KSHV. W związku z tym zidentyfikowano kluczowe mechanizmy chorobotwórcze leżące u podstaw onkogenezy, w której pośredniczy KSHV, stanowiąc obiecujące cele terapeutyczne.Nie zapominaj, że KSHV jest środkiem BSL-2 i powinien być traktowany zgodnie z odpowiednimi procedurami i praktykami bezpieczeństwa biologicznego.

an-vitro-model-for-studying-cellular-transformation-kaposi-sarcoma

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejsza technika przedstawia efektywny sposób przygotowania defekcyjnych replikacyjnie zapasów retrowirusów kodujących ludzki onkogen, które następnie wykorzystano do indukowania choroby mieloproliferacyjnej w modelu mysim.

Produkcja retrowirusa z defektem replikacyjnym poprzez przejściową transfekcję komórek 293T

Czynniki komórek gospodarza odgrywają krytyczną rolę w powstawaniu i utrzymywaniu się mięsaka Kaposiego (KS). Opisujemy metody identyfikacji czynników komórek gospodarza, które uległy zmianie w zakażonych KSHV komórkach DMVEC oraz w tkance nowotworowej KS. Geny komórkowe zmodyfikowane przez wirusa będą służyć jako potencjalne cele dla nowych terapii.

Identyfikacja genów o zaburzonej ekspresji indukowanych przez wirusa herpes związany z mięsakiem Kaposiego (KSHV)

Opisujemy protokół służący do identyfikacji kluczowych ról cząsteczek sygnałowych gospodarza w litycznej replikacji modelowego herpeswirusa, gamma herpeswirusa 68 (γHV68). Wykorzystując genetycznie zmodyfikowane szczepy myszy oraz fibroblasty zarodkowe do litycznej replikacji γHV68, protokół ten umożliwia zarówno charakterystykę fenotypową, jak i analizę molekularną oddziaływań wirus-gospodarz podczas litycznej replikacji wirusa.

Analiza oddziaływań gospodarz-wirus podczas litycznej replikacji modelowego herpeswirusa

Opisano metodę obserwacji pojedynczych cząsteczek DNA w żywych komórkach. Technika ta opiera się na wiązaniu białka represora lac znakowanego fluorescencyjnie do miejsc wiążących wprowadzonych do badanego DNA. Metodę tę można dostosować do śledzenia wielu rekombinowanych cząsteczek DNA w żywych komórkach w czasie.

Monitorowanie replikacji plazmidów w żywych komórkach ssaków na przestrzeni wielu pokoleń za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Opisujemy protokół pomiaru produkcji cytokin przeciwwirusowych u myszy zakażonych modelowym herpeswirusem, mysim gamma herpesvirus 68 (γHV68), który jest blisko spokrewniony z ludzkim wirusem opryszczki Kaposiego (KSHV) i wirusem Epsteina-Barr (EBV). Wykorzystując genetycznie zmodyfikowane szczepy myszy i mysie fibroblasty embrionalne (MEF), oceniliśmy produkcję cytokin przeciwwirusowych zarówno in vivo, jak i ex vivo. "Odtwarzając" ekspresję wrodzonych składników odpornościowych w...

Analiza wrodzonej sygnalizacji immunologicznej w unikaniu produkcji cytokin przez wirusa

Ustaliliśmy protokół fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ do wykrywania trwałego genomu wirusa DNA w sekcjach tkanek modeli zwierzęcych. Protokół ten umożliwia badanie procesu infekcji poprzez kodetekcję genomu wirusa, jego produktów RNA oraz białek wirusowych lub komórkowych w obrębie pojedynczych komórek.

Wykrywanie genomu i transkryptów przetrwałego wirusa DNA w tkankach neuronalnych za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ połączonej z barwieniem immunologicznym

Fenotypowo dzikie astrocyty i nerwowe komórki macierzyste pobrane od myszy zmodyfikowanych za pomocą floksowanych, warunkowo onkogennych alleli i przekształconych za pomocą wirusowej rekombinacji za pośrednictwem Cre mogą być używane do modelowania patogenezy gwiaździaka in vitro i in vivo poprzez ortotopowe wstrzykiwanie przekształconych komórek do mózgów syngenetycznych, immunologicznie kompetentnych rodzeństwa z miotu.

Modelowanie patogenezy gwiaździaka in vitro i in vivo przy użyciu astrocytów korowych lub nerwowych komórek macierzystych od warunkowych, genetycznie zmodyfikowanych myszy

Opisujemy protokół wykorzystujący fluorescencyjną hybrydyzację in situ (FISH) do wizualizacji wielu herpeswirusowych RNA w litycznych infekowanych komórkach ludzkich, zarówno w zawiesinie, jak i w adherentach. Protokół ten obejmuje kwantyfikację fluorescencji wytwarzającą stosunek nukleocytoplazmatyczny i może być rozszerzony o jednoczesną wizualizację białek gospodarza i wirusa za pomocą immunofluorescencji (IF).

Ilościowa fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) i immunofluorescencja (IF) specyficznych produktów genowych w komórkach zakażonych KSHV

Ten protokół opisuje stworzenie mysiego modelu z guzem do monitorowania progresji guza i angiogenezy w czasie rzeczywistym za pomocą podwójnego obrazowania bioluminescencyjnego.

Podwójne obrazowanie bioluminescencyjne progresji guza i angiogenezy

Ten protokół dostarcza eksperymentalnych narzędzi in vitro do oceny transformacji ludzkich komórek sutkowych. Opisano szczegółowe kroki monitorowania tempa proliferacji komórek, zdolności wzrostu niezależnej od zakotwiczenia i dystrybucji linii komórkowych w kulturach 3D z macierzą błony podstawnej.

Ocena in vitro transformacji onkogennej w ludzkich komórkach nabłonka sutka

Protokół ten opisuje system in vitro do modelowania de novo litycznego zakażenia wirusem opryszczki związanego z mięsakiem Kaposiego przy użyciu wirionów pochodzących z BAC16. Metoda umożliwia badanie wczesnej replikacji i rozprzestrzeniania się wirusa. Produkcja wirusa zakaźnego jest określana ilościowo za pomocą testów jednostek zakaźnych opartych na GFP i PCR w czasie rzeczywistym enkapsydowanych genomów wirusowych.

Ustalenie i kwantyfikacja zakażenia litycznego de novo wirusem opryszczki związanym z mięsakiem Kaposiego

Poznaj model in vitro do badania transformacji komórek śródbłonka przez KSHV. Ta metoda pozwala analizować zmiany ekspresji genów i wczesne zdarzenia onkogenne, identyfikując nowe cele terapeutyczne w mięsaku Kaposiego.

Model in vitro do badania transformacji komórkowej przez opryszczkę mięsaka Kaposiego

Przeglądaj więcej filmów