Name: Wytwarzanie mysich przeciwciał monoklonalnych za pomocą technologii Hybridoma (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Poznaj metodę wytwarzania przeciwciał monoklonalnych za pomocą technologii hybridoma. Protokół obejmuje immunizację myszy, fuzję komórek śledziony z komórkami myeloma oraz selekcję produkujących przeciwciała linii komórkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy dziękują Niemieckiemu Federalnemu Ministerstwu Edukacji i Badań (BMBF, Grant No: 03IPT7030X, 03IPT703A, and 03IP703) za finansowanie naszych projektów, "Sztuczne reakcje immunologiczne", "Przeciwciała wielbłądowate" i "Technologie przeciwciał." Dziękujemy prof. Burkhardowi Micheelowi za korektę manuskryptu i pomocne uwagi.

Myszy Balb/c lub NMRI (Mus musculus) z naszej kolonii hodowlanej na Uniwersytecie w Poczdamie (Poczdam, Niemcy) zostały wykorzystane do produkcji przeciwciał monoklonalnych. Praca na zwierzętach została przeprowadzona zgodnie z odpowiednimi wytycznymi krajowymi i międzynarodowymi. Badanie zostało zatwierdzone przez Ministerstwo Środowiska, Zdrowia i Ochrony Konsumentów Brandenburgii (numer referencyjny V3-2347-A16-4-2012).
1. Przygotowanie immunokoniugatów
<ol>
	<li>Do sprzężenia antygenu z nośnikiem należy stosować standardowe protokoły sprzęgania za pośrednictwem grup amino-, karboksylowych lub sulfo, takich jak aldehyd glutarowy, N-(3-dimetyloaminopropylo)-N-etylokarbodimid (EDC) lub ester sukcynimidu N-[y-maleimidobutyryloksy]sukcynimidu (sulfo-GMBS).</li>
	<li>Do sprzężenia (np. z aldehydem glutarowym)13 należy użyć docelowego białka lub peptydu i nośnika (albuminy jaja kurzego, albuminy surowicy bydlęcej lub hemocyjaniny skałoczepnej przez dziurkę od klucza) w stosunku 1:1. Rozcieńczyć białko docelowe lub peptyd w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i białko nośnikowe w buforze 50 mM NaHCO3. Dostosuj objętość i stężenie do ilości niezbędnej do szczepień.
	<ol>
		<li>Wymieszaj oba roztwory i dodaj 1,25% aldehydu glutarowego. Wymieszać i inkubować próbkę przez 4 godziny w temperaturze pokojowej (RT). Aby wybrać komórki hybrydoma, wykonaj ten sam immunokoniugat, ale z innym nośnikiem, aby uniknąć wyboru niespecyficznych spoiw nośnika.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Próbkę sprzęgającą należy dializować metodą szybkiej dializy z użyciem dostępnej w handlu żywicy gruboziarnistej (np. Sephadex G25).
	<ol>
		<li>Przedziurawić dno fiolki reakcyjnej o pojemności 1,5 ml wydrążoną igłą i umieścić ją w probówce o pojemności 15 ml. Umieść watę szklaną na dnie w celu uszczelnienia i przykryj ją 300 mg gruboziarnistej żywicy (do znaku kalibracji 0,5 ml).</li>
		<li>Ostrożnie wsyp 1 ml PBS kroplami do probówki reakcyjnej o pojemności 1,5 ml i upewnij się, że wata szklana nadal uszczelnia perforację. Pozwól gruboziarnistej żywicy spęcznieć i odwiruj kolumnę przy 500 x g przez 2 minuty. Jedna taka kolumna może być używana do dializowania 200 μl próbki sprzęgającej. W przypadku większych woluminów utwórz więcej kolumn.</li>
		<li>Wymień rurkę i upuść roztwór sprzęgający na spęczniałą gruboziarnistą żywicę. Ponownie odwirować przy 500 x g przez 2 min. Wyjąć eluent z probówki i użyć go do immunizacji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Uodpornienie zwierząt
<ol>
	<li>Wybierz dwie lub trzy 6- do 12-tygodniowe myszy Balb/c do szczepienia.</li>
	<li>Dla jednego zwierzęcia należy przygotować 150 - 200 μg immunokoniugatu w 200 μl PBS i wymieszać go ze 100 μl kompletnego adiuwanta Freunda (CFA). Wymieszaj roztwór 3 razy za pomocą krótkiej i cienkiej igły (o średnicy 0,6 mm) na strzykawce o pojemności 1 ml. Roztwór wstrzyknąć dootrzewnowo myszy.</li>
	<li>Podać zastrzyk przypominający 6 tygodni później z taką samą ilością immunokoniugatu, ale bez CFA. Pobrać krew 7 dni później (z zatoki zaoczodołowej) i przygotować surowicę, inkubując krew przez 3 - 4 godziny w temperaturze pokojowej (RT).
	<ol>
		<li>Odwirować mieszaninę przy 3 000 x g przez 5 minut. Pobrać supernatant surowicy i przenieść go do nowej probówki. Przechowywać w temperaturze -20 °C. Wyrzucić granulkę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeanalizować surowice za pomocą testu ELISA, zgodnie z opisem w kroku 3. Do fuzji wybierz mysz z najwyższym mianem surowicy.</li>
	<li>Przygotowując się do fuzji komórek, należy wstrzyknąć mysz 150 - 200 μg immunokoniugatu w 300 μl PBS bez adiuwanta zaledwie 4 dni przed fuzją.</li>
</ol>
3. TEST ELISA
<ol>
	<li>Przygotować roztwór antygenu o stężeniu 5 μg/ml w PBS i przenieść 50 μl do każdej studzienki ELISA na 96-dołkowej płytce.</li>
	<li>Inkubować płytkę przez 2 godziny w temperaturze 37 °C lub przez noc w temperaturze 4 °C w wilgotnej komorze.</li>
	<li>Umyj talerz 3 razy wodą z kranu. Zatkać studzienki 80 μl PBS/5% noworodkowej surowicy cielęcej (NCS) na studzienkę przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze. Przygotować rozcieńczenia surowicy w skali 1:5, zaczynając od 1:50. Do analizy hodowli komórkowej należy użyć nierozcieńczonego supernatantu hodowlanego.</li>
	<li>Umyj talerz 3 razy wodą z kranu. Pobrać pipetę od 50 μl próbki do dołka i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze. Przygotować drugorzędowy roztwór przeciwciała w rozcieńczeniu 1:5 000 koziego przeciwciała anty-mysiego IgG sprzężonego z peroksydazą chrzanową (HRP).</li>
	<li>Umyć płytkę 3 razy wodą z kranu i dodać 50 μl roztworu przeciwciał wtórnych do dołka. Inkubować przez 45 minut w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze.</li>
	<li>Przygotuj świeży roztwór podłoża. Przygotować roztwory podstawowe 0,1 M NaH2PO4 i 0,1% nadtlenku wodoru. Weź 5 części NaH2PO4, 4 części nadtlenku wodoru i 1 część tetrametylobenzydyny na świeży roztwór substratu.
	<ol>
		<li>Umyj talerz 10 razy wodą z kranu. Pobrać pipetą 50 μl świeżego roztworu substratu do studzienek i inkubować przez 5 - 10 minut w ciemności.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zatrzymać reakcję za pomocą 50 μl 1 M H2SO4 na studzienkę. Za pomocą czytnika płytek zmierzyć gęstość optyczną przy 450 nm przy referencyjnej długości fali przy 630 nm.</li>
</ol>
4. Przygotowanie hodowli komórek szpiczaka
<ol>
	<li>Od teraz wszystkie prace wykonuj w sterylnych warunkach.</li>
	<li>Przygotuj świeżą pożywkę hodowlaną do hodowli komórek. Uzupełnij 500 ml RPMI1640 10% płodową surowicą cielęcą (50 ml), 2 mM L-glutaminy (5 ml) i 50 μM merkaptoetanolem (5 ml). Zastąp glutaminę co 7 dni.</li>
	<li>Rozmrozić fiolkę z mysimi komórkami SP2/0 w ciepłej wodzie. Przenieść roztwór komórek do 10 ml świeżej pożywki hodowlanej i odwirować przez 10 minut przy 200 x g. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml świeżej pożywki hodowlanej.</li>
	<li>Przenieść komórki do kolby o średnicy 25cm2 i inkubować je w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w inkubatorze. Rozwiń komórki do dwóch kolb o długości75 m 2 przed fuzją. Zachowaj podwielokrotności do długotrwałego przechowywania, zgodnie z opisem w kroku 7.</li>
</ol>
5. Przygotowanie komórek zasilających
<ol>
	<li>Poświęć 12-tygodniową mysz NMRI (zgodnie z wytycznymi krajowymi i instytucjonalnymi; np. przez wdychanie CO2 ). Usuń sierść i oczyść brzuch 70% etanolem.</li>
	<li>Wstrzyknij 5 ml lodowatej pożywki RPMI do brzucha, masuj brzuch pęsetą i odessaj zawiesinę komórek zasilających. Umieść komórki w pustej probówce o pojemności 50 ml. Wykonaj ten krok jeszcze raz. Należy pobrać od 7 do 10 ml zawiesiny ogniwa zasilającego.</li>
	<li>Przygotuj 100-mililitrową zawiesinę komórek zasilających, dodając 90 ml pełnej pożywki do hodowli komórkowych (RPMI 1640, 10% płodowej surowicy cielęcej, 2 mM glutaminy i 50 μM merkaptoetanolu). Wymieszać i przenieść 100 μl/basenik do 10 x 96-dołkowych płytek do hodowli komórkowych. Inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w inkubatorze.</li>
</ol>
6. Fuzja komórek
<ol>
	<li>Uodpornioną mysz należy złożyć w ofierze przez zwichnięcie szyjki macicy lub wdychanie CO2 i wyciąć śledzionę14. Pobrać dodatkową krew z serca i przygotować surowicę, jak opisano w kroku 2.3, jako kontrolę dodatnią w teście ELISA.</li>
	<li>Przygotować zawiesinę komórek śledziony, przeciskając śledzionę przez sitko komórkowe. Wypełnij do 20 ml pełnokomórkową pożywką do hodowli komórkowych. Zebrać komórki do probówek o pojemności 50 ml przez odwirowanie (200 x g, 10 minut i 4 °C). Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Przepłukać kolbę hodowli komórkowej i pobrać komórki szpiczaka przez odwirowanie (200 x g, 10 minut i 4 °C) i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Ponownie zawiesić osady komórkowe w 20 ml zrównoważonego buforu solnego (BSS) (125 mM NaCl, 5 mM KCl, 4 mM CaCl2, 2,5 mM MgCl2 i 5 mM Tris-HCl; pH 7,4) i ponownie odwirować. Powtórz kroki prania trzy razy.</li>
	<li>Aby dostosować stosunek komórek splenocytów do szpiczaka, należy policzyć komórki po drugim etapie mycia, najpierw ponownie zawieszając osad w 1 ml buforu BSS. Wykonać rozcieńczenie w stosunku 1:10 i przenieść 10 μl do komory do liczenia komórek. Policz komórki i określ stężenie komórek w 1 ml.</li>
	<li>Dostosuj liczbę komórek w buforze BSS do trzyczęściowych splenocytów i jednoczęściowych komórek szpiczaka w 1 ml końcowej objętości. Pobrać 200 μl zawiesiny komórkowej i wymieszać ją z 200 μl PEG8000 (1 g w 4 ml buforu BSS). Przenieść 400 μl do kuwety elektroporacyjnej o średnicy 2 mm i ustawić impuls (600 - 650 V i 25 ms).
	<ol>
		<li>Po impulsie inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez 3 minuty w kuwecie. Usuń komórki i umieść je kroplami w kolbie Erlenmeyera ze 100 ml pożywki HAT (RPMI 1640, 10% FCS, 2 mM glutaminy, 50 μM merkaptoetanolu, 100 μM hipoksantyny, 5,8 μM azaseryny i 16 μM tymidyny).</li>
		<li>Powtórz fuzję 4 razy, aż do wyczerpania 1 ml partii. Inkubować kolbę Erlenmeyera przez 3 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w inkubatorze.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ponownie uzupełnij zawiesinę komórkową hipoksantyną, azaseryną i tymidyną przed posiewem komórek na warstwie zasilającej. Dodać 100 μl zawiesiny komórek na studzienkę do płytek warstwy zasilającej i inkubować płytki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 (w inkubatorze). Końcowe stężenie w studni powinno wynosić 100 μM hipoksantyny, 5,8 μM azaseryny i 16 μM tymidyny.</li>
	<li>Wykonaj analizę mikroskopową (powiększenie: soczewka obiektywu 10X, okular 10X) pod kątem wzrostu klonalnego w każdym dołku płytki po 7 dniach, aby określić, czy dołki są mono- czy poliklonalne. Komórki monoklonalne to jedno skupisko komórek, które pochodzą z jednej komórki. Komórki poliklonalne to wiele skupisk komórek w jednym dołku. Zmień całe podłoże po 7 dniach i ponownie inkubuj przez 7 dni w pożywce HAT.</li>
	<li>Zmień pożywkę HAT i hoduj komórki w pożywce do hodowli pełnokomórkowych. Użyć supernatantu do przeprowadzenia testu ELISA, zgodnie z opisem w kroku 3. Dodatnie komórki hybrydoma muszą być namnażane na 24-dołkowych płytkach zgodnie z testami na wytwarzanie specyficznych przeciwciał. Jeśli komórki są poliklonalne, należy przeprowadzić ograniczone rozcieńczenie (opisane w kroku 8).</li>
</ol>
7. Kriokonserwacja hybrydomy
<ol>
	<li>Kriokonserwacja dodatnich hybrydomów mono- i poliklonalnych do długotrwałego przechowywania. Zebrać komórki z 24-dołkowej płytki o zbiegu > 60% przez odwirowanie (200 x g, 10 min i 4 °C).</li>
	<li>Zawiesić osad w 500 μl pełnej pożywki do hodowli komórkowych i przenieść go do krioprobówki. Dodaj 500 μl pożywki do zamrażania (RPMI 1640, 20% FCS i 15% dimetylosulfotlenku), wymieszaj i włóż do styropianowego pudełka lub specjalnego pudełka do zamrażania. Przechowywać w temperaturze -80 °C przez 3 dni. Po 3 dniach krioprobówkę można przenieść do ciekłego azotu w celu długotrwałego przechowywania.</li>
</ol>
8. Ograniczanie rozcieńczania hybrydomy poliklonalnej
<ol>
	<li>Wykonaj kulturę warstwy zasilającej, zgodnie z opisem w kroku 5. Zebrać dodatnie komórki poliklonalne, jak opisano w kroku 7.1. Policz komórki, jak opisano w kroku 6.5, i dostosuj liczbę komórek do 10 komórek/ml, z końcową objętością 10 ml dla płytki 96-dołkowej. Dodać 100 μl/studzienkę na warstwę podajnika.</li>
	<li>Inkubować przez 7 dni w temperaturze 37 °C i analizować wzrost klonu pod mikroskopem (powiększenie: soczewka obiektywu 10X, okular 10X). Wykonać test ELISA supernatantu hodowli, jak opisano w kroku 3, i zidentyfikować odpowiednie hybrydomy monoklonalne do hodowli masowej.</li>
</ol>
9. Masowa hodowla i oczyszczanie przeciwciał monoklonalnych
<ol>
	<li>Przenieść hybrydomy monoklonalne z odpowiednimi sygnałami ELISA do kolb o długości25 cm2 lub 75cm2 i zebrać do 500 ml supernatantu hodowli. Testuj kulturę co tydzień pod kątem specyficznej produkcji przeciwciał i zachowaj 3-5 porcji na hybrydomę do długotrwałego przechowywania, jak opisano w kroku 7.</li>
	<li>Odwirować supernatant kultury w temperaturze 4 900 x g i temperaturze 4 °C przez 15 minut i przefiltrować go przez filtr 0,45 μm. Zmieszać supernatant z buforem wiążącym (4 M NaCl i 2 M glicyny NaOH, pH 8,9) w stosunku 3:1.</li>
	<li>Przygotować kolumnę z białkiem A, przemłukując ją buforem płuczącym (rozcieńczyć bufor wiążący w stosunku 1:3 wdH2O). Przepuścić supernatant z kroku 9.2 przez kolumnę i zebrać przepływ. Zemtruj związane przeciwciało 0,1 M cytrynianem o pH 3,5 i natychmiast zneutralizuj pH za pomocą 500 μl Tris-HCl, pH 9,0.</li>
	<li>Scharakteryzuj eluowane przeciwciało za pomocą SDS-PAGE, Western Blot i ELISA, a następnie zwaliduj je do końcowego zastosowania.
	<ol>
		<li>W przypadku SDS PAGE weź 3 - 5 μg oczyszczonego roztworu przeciwciał na linię (próbka 20 μl), dodaj 5 μl 4x buforu ładującego próbkę SDS (8% SDS, 20% 2-merkaptoetanolu, 40% gliceryny i 0,015% bromofenolu, zredukowanego) i podgrzewaj sondy w temperaturze 95 °C przez 5 min. Jako kontrolę należy użyć tej samej próbki z oczyszczonym przeciwciałem o tym samym izotypie, ale o nieistotnej swoistości.</li>
		<li>Załaduj próbki na 12,5% żel SDS, umieść 5 μl niebarwionej drabinki białkowej na dodatkowym torze i oddziel je za pomocą elektroforezy. Zabarwić żel środkiem Coomassie Brilliant Blue i udokumentować wyniki. Podstawowy protokół SDS został opracowany przez Laemmli w 1970 roku15.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Köhler, G., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continous+cultures+of+fused+cells+secreting+antibody+of+predefined+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Continous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.</a> Nature. 7 (256), 495-497 (1975).</li>
<li>Hanack, K., Messerschmidt, K., Listek, M. Antibodies and Selection. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHanack%2C+K+%22Protein+Targeting+Compounds%22">Protein Targeting Compounds</a>. Böldicke, T. , Springer Verlag. Berlin Heidelberg. 11-22 (2015).</li>
<li>Walsh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biopharmaceutical+benchmarks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Biopharmaceutical benchmarks.</a> Nat Biotechnol. 32 (10), 992-1000 (2014).</li>
<li>Pauly, D., Hanack, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+avoid+pitfalls+in+antibody+use%5BTitle%5D)+AND+%22F1000+Res%22%5BJournal%5D)">How to avoid pitfalls in antibody use.</a> F1000 Res. 7 (4), 691-698 (2015).</li>
<li>Bradbury, A., Plückthun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducibility%3A+Standardize+antibodies+used+in+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reproducibility: Standardize antibodies used in research.</a> Nature. 5 (518), 27-29 (2015).</li>
<li>Polakiewicz, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies%3A+The+solution+is+validation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Antibodies: The solution is validation.</a> Nature. 26 (518), 483(2015).</li>
<li>Baker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+anarchy%3A+A+call+to+order%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Antibody anarchy: A call to order.</a> Nature. 26 (527), 545-551 (2015).</li>
<li>Smith, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filamentous+fusion+phage%3A+novel+expression+vectors+that+display+cloned+antigens+on+the+virion+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface.</a> Science. 228 (4705), 1315-1317 (1985).</li>
<li>Kearney, J. F., Radbruch, A., Liesegang, B., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+mouse+myeloma+cell+line+that+has+lost+immunoglobulin+expression+but+permits+the+construction+of+antibody-secreting+hybrid+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">A new mouse myeloma cell line that has lost immunoglobulin expression but permits the construction of antibody-secreting hybrid cell lines.</a> J Immunol. 123 (4), 1548-1550 (1979).</li>
<li>Shulman, M., Wilde, C. D., Köhler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+better+cell+line+for+making+hybridomas+secreting+specific+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A better cell line for making hybridomas secreting specific antibodies.</a> Nature. 16 (276), 269-270 (1978).</li>
<li>Stoicheva, N. G., Hui, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrically+induced+fusion+of+mammalian+cells+in+the+presence+of+polyethylene+glycol%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Electrically induced fusion of mammalian cells in the presence of polyethylene glycol.</a> J Membr Biol. 141 (2), 177-182 (1994).</li>
<li>Osterhaus, A. D., Uytdehaag, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+developments+in+hybridoma+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Tijdschr+Diergeneeskd%22%5BJournal%5D)">Current developments in hybridoma technology.</a> Tijdschr Diergeneeskd. 15 (110), 835-839 (1985).</li>
<li>Migneault, I., Dartiguenave, C., Bertrand, M. J., Waldron, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutaraldehyde%3A+behavior+in+aqueous+solution%2C+reaction+with+proteins%2C+and+application+to+enzyme+crosslinking%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Glutaraldehyde: behavior in aqueous solution, reaction with proteins, and application to enzyme crosslinking.</a> Biotechniques. 37 (5), 798-802 (2004).</li>
<li>Vitetta, E. S., Baur, S., Uhr, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Surface+Immunoglobulin+II.+Isolation+and+characterization+of+immunoglobulin+from+mouse+splenic+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Cell Surface Immunoglobulin II. Isolation and characterization of immunoglobulin from mouse splenic lymphocytes.</a> Journal of experimental medicine. 134, 242-264 (1971).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Browne, S. M., Al-Rubeai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+methods+for+high-producing+mammalian+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Selection methods for high-producing mammalian cell lines.</a> Trends Biotechnol. 25 (9), 425-432 (2007).</li>
<li>Holmes, P., Al-Rubeai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+cell+line+development+by+a+high+throughput+affinity+capture+surface+display+technique+to+select+for+high+secretors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved cell line development by a high throughput affinity capture surface display technique to select for high secretors.</a> J Immunol Methods. 19 (230), 141-147 (1999).</li>
<li>Weaver, J. C., McGrath, P., Adams, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gel+microdrop+technology+for+rapid+isolation+of+rare+and+high+producer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Gel microdrop technology for rapid isolation of rare and high producer cells.</a> Nat Med. 3 (5), 583-585 (1997).</li>
<li>Messerschmidt, K., Hempel, S., Holzlöhner, P., Ulrich, R. G., Wagner, D., Heilmann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IgA+antibody+production+by+intrarectal+immunization+of+mice+using+recombinant+major+capsid+protein+of+hamster+polyomavirus%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Microbiol+Immunol%22%5BJournal%5D)">IgA antibody production by intrarectal immunization of mice using recombinant major capsid protein of hamster polyomavirus.</a> Eur J Microbiol Immunol. 2 (3), 231-238 (2012).</li>
<li>Listek, M., Micheel, B., Hanack, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomolek%C3%BCle+freisetzende+zelle+und+deren+selektion+mittels+eines+oberfl%C3%A4chenproteins%5BTitle%5D)+AND+%22neweramabs+GmbH%22%5BJournal%5D)">Biomoleküle freisetzende zelle und deren selektion mittels eines oberflächenproteins.</a> neweramabs GmbH. , PCT/DE2014/000205 (2014).</li>
</ol>

Autorki Pamela Holzlöhner i Katja Hanack są współzałożycielkami new/era/mabs GmbH, firmy oferującej niestandardową generację przeciwciał monoklonalnych.

Wytwarzanie przeciwciał monoklonalnych za pomocą technologii hybrydoma wymaga intensywnej i szczegółowej analizy epitopów, zwłaszcza w odniesieniu do końcowego zastosowania, kiedy przeciwciało powinno rozpoznać cel. Jest to często niedoceniane przez użytkowników i prowadzi do powstania przeciwciał o słabych wynikach. Proces fuzji jest zawsze losowy, co oznacza, że wynik określonych hybrydomów jest w dużym stopniu zależny od proporcji komórek i żywotności w tym momencie. Po ograniczonym rozcieńczeniu komórki są bardzo nie...

Technologia hybrydoma przedstawiona w tym protokole została po raz pierwszy opisana przez Köhlera i Milsteina1 w 1975 roku i, poza pewnymi ulepszeniami technicznymi, główna procedura nie zmieniła się dramatycznie w ciągu ostatnich 40 lat2. Celem tego protokołu jest wyjaśnienie bardziej odpowiedniej strategii szczepień, standardowej metody wytwarzania przeciwciał monoklonalnych oraz przykładu metody walidacji (ELISA).
Przeciwciała są niesamowitymi narzędziami i przyczyniają się do szerokiego zakresu podejść technologicznych, takich jak cytometria przepływowa, magnetyczne sortowanie komórek czy immunofluorescencja, a także do diagnostycznych i terapeutycznych opcji monitorowania i leczenia chorób3. O komercyjnej dostępności przeciwciał monoklonalnych dla pożądanych celów świadczy obecność ponad 24 różnych internetowych baz danych z niemal niezliczonymi ilościami przeciwciał lub produktów związanych z przeciwciałami4. W 2015 r. cząsteczki przeciwciał były przedmiotem międzynarodowej dyskusji5-7 ze względu na poważne problemy z prawidłową walidacją i charakterystyką dostępnych na rynku przeciwciał.
Znalezienie specyficznych przeciwciał dla docelowego antygenu może być trudne i kosztowne, a często nie mają one potrzebnego powinowactwa ani swoistości. Chociaż wytwarzanie przeciwciała jest nadal czasochłonne i wymaga wykwalifikowanego personelu do opracowania i walidacji przeciwciała, indywidualne wytwarzanie przeciwciała może być lepsze niż jego zakup.
Ze względu na fakt, że produkcja przeciwciał jest czasochłonna i wymaga doświadczenia, opracowano alternatywne metody produkcji cząsteczek wiążących, aby przezwyciężyć te problemy. Najczęściej stosowaną metodą alternatywną jest rekombinowana produkcja przeciwciał jednołańcuchowych za pomocą wyświetlacza fagowego. Geny zmiennego regionu wiązania są ekstrahowane z komórek i łączone z białkiem otoczkowym faga. Pojedynczy łańcuch jest następnie wyrażany na powierzchni bakteriofaga i przesiewany w kilku etapach panoramowania8. Produkcja przeciwciał jednołańcuchowych jest nieco szybsza, ale wymaga również wykwalifikowanego eksperymentatora. Wadą niektórych rekombinowanych przeciwciał jednołańcuchowych jest słaba stabilność i brak przydatności do diagnostyki in vitro. W większości testów diagnostycznych do wykrycia niezbędny jest receptor Fc, który następnie należy dodać do rekombinowanego przeciwciała jednołańcuchowego. Ponownie, jest to czasochłonne i jeszcze bardziej złożone niż technika hybrydoma. W diagnostyce in vitro wykazano, że najlepszym wyborem są pełnowymiarowe przeciwciała monoklonalne myszy i królików.
Przed rozpoczęciem pracy w laboratorium musi zostać wykonany jeden z głównych etapów w tworzeniu przeciwciał monoklonalnych: projekt immunokoniugatu. Pytania, na które należy odpowiedzieć, to: Jaki jest fizyczny skład celu w końcowej aplikacji i jakie matryce są obecne? Jakie stężenie będzie miał cel w aplikacji? Jaka jest ostateczna aplikacja i jakie wymagania musi spełniać przeciwciało?
Zawsze bierz pod uwagę, że jeśli używany jest liniowy fragment peptydu, musi on być również liniowy w końcowym epitopie w wybranym celu; w przeciwnym razie przeciwciało nie będzie się wiązać. Oczywiście, niezależnie od metody przesiewowej, przeciwciała mogą być wybierane do rozpoznawania różnych formatów antygenowych w różnych zastosowaniach, ale musi to być bardzo dokładnie zweryfikowane. To są powody, dla których rozwój i walidacja przeciwciał są tak ambitnymi procesami.
Wybór formatu antygenowego do immunizacji ma fundamentalne znaczenie dla rozwoju przeciwciał i decyduje o sukcesie lub porażce tego procesu. Gdy myszy wyrażają odpowiednie miano przeciwciał, komórki śledziony są izolowane i łączone z komórkami szpiczaka. Najczęstszymi liniami komórkowymi szpiczaka do rozwoju mysich przeciwciał monoklonalnych są X63-Ag 8,6539 i Sp2/0-Ag 1410 ze szczepu myszy Balb/c. Komórki wywodzą się ze złośliwego chłoniaka z komórek B i zostały wyselekcjonowane, ponieważ nie wydzielają żadnego z własnych ciężkich lub lekkich łańcuchów. Komórki można dostosować do proporcji od 1:10 do 10:1 (splenocyty kontra komórki szpiczaka). W tym protokole ogniwa zostały przystosowane do proporcji 3:1 i stopione za pomocą glikolu polietylenowego (PEG) i elektrooporowości, zgodnie ze Stoichevą i Hui11.
Fuzja komórek B i komórek szpiczaka jest procesem losowym. W związku z tym można by wygenerować hybrydy dwóch limfocytów B lub dwóch komórek szpiczaka, ale te hybrydy nie byłyby w stanie przetrwać przez długi czas w hodowli. Komórki poddawane są selekcji hipoksantyny, aminopteryny i tymidyny (HAT), dzięki której tylko połączone komórki hybrydoma mogą przetrwać ze względu na możliwość wykorzystania szlaku syntezy pirymidyny de novo. Do wytworzenia przeciwciał monoklonalnych konieczne jest uzyskanie linii komórkowej pochodzącej z jednej komórki macierzystej. Monoklonalność jest zapewniona poprzez ograniczenie technik rozcieńczania i mikroskopowej analizy wzrostu komórek. Supernatanty z hodowli hybrydoma są badane pod kątem produkcji specyficznych przeciwciał, głównie za pomocą testu ELISA lub cytometrii przepływowej, a następnie wybierane są najlepsze spoiwa. Po masowej hodowli i oczyszczeniu cząsteczka przeciwciała może być ostatecznie scharakteryzowana i zwalidowana pod kątem pożądanego zastosowania.

<table><tbody><tr><td>aldehyd glutarowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>N-(3-dimetyloaminopropylo)-N-etylokarbodimid (EDC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>39391-10ML</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-GMBS</td><td>Perbio Science Germany</td><td>22324</td><td></td></tr><tr><td>albumina jaja kurzego</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5503</td><td></td></tr><tr><td>albumina surowicy bydlęcej</td><td></td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>dziurka od klucza hemocyjanina</td><td>skałoczep Sigma Aldrich</td><td>H8283</td><td></td></tr><tr><td>Probówki Falcon 15 ml</td> Fiolki reakcyjne <td>Biochrom GmbH</td><td>P91015</td><td></td></tr><tr><td>, 1,5 ml</td><td>Carl Roth GmbH & C0.KG</td><td>CNT2.1</td><td></td></tr><tr><td>pusta igła</td><td>Carl Roth GmbH & C0.KG</td><td>C724.1</td><td></td></tr><tr><td>wełna szklana</td><td>Carl Roth GmbH & C0.KG</td><td>6574.1</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G25 gruboziarnisty</td><td>Sigma Aldrich</td><td>GE-17-0034-02</td><td></td></tr><tr><td>Freund&acute; s adiuwant, kompletne</td> płytki ELISA <td>Sigma Aldrich</td><td>F5881-10ML</td><td></td></tr><tr><td>, 96 dołków</td><td>Greiner bio-one</td><td>655101</td><td></td></tr><tr><td>surowica dla noworodków cielęcych</td><td>Biochrom GmbH</td><td>S1025</td><td></td></tr><tr><td>TipOne Tips 1,000 &micro; L</td><td>Starlab</td><td>S1111-2021</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet 200 i mikro; L</td><td>Greiner bio-one</td><td>739291</td><td></td></tr><tr><td>sprzężone z HRP kozie przeciwciało anty-mysie IgG</td><td>Dianova</td><td>115-035-003</td><td></td></tr><tr><td>tetrametylobenzydyna</td><td>Carl Roth GmbH & C0.KG</td><td>6350.2</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdihydrogenphosphat</td><td>Carl Roth GmbH & C0.KG</td><td>K300.2</td><td></td></tr><tr><td>nadtlenek/mocznik</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>kwas siarkowy</td><td>Carl Roth GmbH & C0.KG</td><td>4623.3</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life technologies GmbH</td><td>31870074</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Carl Roth GmbH & C0.KG</td><td>HN08.2</td><td></td></tr><tr><td>beta-merkaptoetanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>płodowa surowica cielęca</td><td>Invitrogen</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>TC-flask 25 cm2</td><td>Peske GmbH</td><td>86-V025</td><td></td></tr><tr><td>Kolba TC 75 cm2</td><td>Peske GmbH</td><td>86-V075</td><td></td></tr><tr><td>etanol, 96%</td><td>Carl Roth GmbH & C0.KG</td><td>Sitko do komórek P075.1</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR international</td><td>734-0002</td><td></td></tr><tr><td>Probówki Falcon 50 mL</td><td>Biochrom GmbH</td><td>P91050</td><td></td></tr><tr><td>PEG 8000</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1546605</td><td></td></tr><tr><td>Kuweta do elektroporacji, 2 mm</td><td>Biodeal Handelsvertretung Edelmann e.K.</td><td>EKL2,25</td><td></td></tr><tr><td>hipoksantyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H9636-25G</td><td></td></tr><tr><td>azaseryna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4142</td><td></td></tr><tr><td>tymidyna</td><td>USB Europa GmbH</td><td>22305 1 GM</td><td></td></tr><tr><td>TC-plates 96 well</td><td>Biochrom GmbH</td><td>P92696</td><td></td></tr><tr><td>TC-plates 24-dołkowe</td><td>Biochrom GmbH</td><td>P92424</td><td></td></tr><tr><td>krioprobówki, 1 mL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V7384-1CS</td><td></td></tr><tr><td>dimetylosulfotlenek</td><td>Carl Roth GmbH & C0.KG</td><td>4720.1</td><td></td></tr><tr><td>białko A sefaroza</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3391-1G</td><td></td></tr><tr><td>SDS bufor do ładowania próbki, Roti-Load 1</td><td>Carl Roth GmbH & C0.KG</td><td>K929.1</td><td></td></tr><tr><td>niebarwiona drabinka białkowa</td><td>BioRad Laboratories</td><td>161-0363</td><td></td></tr><tr><td>comassie brilliant niebieski R-250</td><td>BioRad Laboratories</td><td>161-0406</td><td></td></tr></tbody></table>

wytwarzanie mysich przeciwciał monoklonalnych za pomocą technologii hybridoma

Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridoma Technology

Przeciwciała monoklonalne są uniwersalnymi cząsteczkami wiążącymi i są szeroko stosowane w biomedycynie i badaniach. Niemniej jednak wytwarzanie tych cząsteczek wiążących jest czasochłonne i pracochłonne ze względu na skomplikowaną obsługę i brak alternatyw. Celem tego protokołu jest zapewnienie jednej standardowej metody wytwarzania przeciwciał monoklonalnych przy użyciu technologii hybrydoma. Technologia ta łączy w sobie dwa etapy. Krok 1 to odpowiednie uodpornienie zwierzęcia, a krok 2 to fuzja limfocytów B z nieśmiertelnymi komórkami szpiczaka w celu wytworzenia hybryd posiadających obie funkcje rodzicielskie, takie jak produkcja cząsteczek przeciwciał i nieśmiertelność. Wygenerowane komórki hybrydoma zostały następnie ponownie odlonowane i rozcieńczone w celu uzyskania stabilnych kultur komórek monoklonalnych wydzielających pożądane przeciwciało monoklonalne w supernatancie hodowli. Supernatanty przetestowano w testach immunoenzymatycznych (ELISA) pod kątem swoistości antygenowej. Po doborze odpowiednich klonów komórkowych, komórki zostały przeniesione do masowej hodowli w celu wytworzenia pożądanej cząsteczki przeciwciała w dużych ilościach. Oczyszczanie przeciwciał jest rutynowo przeprowadzane za pomocą chromatografii powinowactwa. Po oczyszczeniu cząsteczka przeciwciała może zostać scharakteryzowana i zwalidowana do końcowego zastosowania testowego. Cały proces trwa od 8 do 12 miesięcy rozwoju i istnieje duże ryzyko, że przeciwciało nie zadziała w pożądanym systemie testowym.

Rysunek 1 przedstawia przykład miana surowicy specyficznej dla antygenu po jednej immunizacji przeprowadzonej w laboratorium. Na tym rysunku surowice immunologiczne A i B miareczkowano w zakresie od 1:50 do 1:5 000 000 w porównaniu do surowicy myszy naiwnej. Antygen naniesiono na fazę stałą, a swoiste przeciwciała wykryto za pomocą przeciwciała koziego anty-mysiego Ig sprzężonego z POD. Obie surowice myszy immunizowanych wykazały znacznie wyższe miano specyficzne dla anty...

Przedstawiono zoptymalizowany protokół generowania przeciwciał monoklonalnych opartych na technologii hybrydomy. Myszy uodporniono immunokoniugatem. Komórki śledziony zostały połączone za pomocą PEG i impulsu elektrycznego z nieśmiertelnymi komórkami szpiczaka. Komórki hybrydoma wytwarzające przeciwciała wybrano za pomocą HAT i badania przesiewowego ELISA swoistego dla antygenu.

Wytwarzanie mysich przeciwciał monoklonalnych za pomocą technologii Hybridoma

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wytworzenie linii komórkowych hybrydomy produkujących przeciwciała do biotechnologicznej produkcji przeciwciał monoklonalnych. Metodę tę można wykorzystać do wytworzenia specyficznych ligandów służących do detekcji i wizualizacji biomolekuł oraz do opracowania skutecznych systemów detekcyjnych, takich jak ELISA, cytometria przepływowa czy magnetyczna separacja komórek. Główną zaletą tej techniki jest ułatwienie generowania linii komórkowych produkujących przeciwciała monoklonalne o zdefiniowanej specyficzności i zapewnienie ich ciągłej dostępności.Aby przygotować komórki szpiczaka, rozmrozić fiolkę z mysimi komórkami SP2/0 w ciepłej wodzie. Następnie przenieść komórki do 10 mL pożywki hodowlanej i zebrać je poprzez wirowanie. Osad zawiesić ponownie w 10 mL świeżej pożywki hodowlanej i wysiać komórki do kolby o powierzchni 25 cm² w celu inkubacji w temperaturze 37 °C i 5% CO2, zachowując alikwoty komórek do długoterminowego przechowywania po odpowiedniej liczbie pasażów.Aby przygotować komórki karmione, należy usunąć sierść z 12-tygodniowej myszy NMRI i zdezynfekować brzuch 70% ethanol. Następnie do jamy brzusznej wstrzykuje się 5 mL lodowateg

generation-of-murine-monoclonal-antibodies-by-hybridoma-technology

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film demonstruje metodę generowania przeciwciał z komórek ssaków poprzez wprowadzenie wektorów plazmidowych z ciężkimi i lekkimi genami łańcuchowymi. Wektory te oddziałują z polietyleneniną i wnikają do komórek, tworząc polipleksy; Później są one przekształcane w pojedyncze białka i składane w kompletne przeciwciała, które są wydzielane do podłoża zewnątrzkomórkowego.

Wytwarzanie rekombinowanych przeciwciał monoklonalnych z kultur komórkowych ssaków

Ten film demonstruje test do produkcji przeciwciał monoklonalnych przeciwko aminopeptydazie N (APN) świni, metallopeptydazie związanej z błoną, przy użyciu tradycyjnej technologii hybrydoma. Po uodpornieniu myszy APN, komórki śledziony są zbierane i łączone z nieśmiertelnymi komórkami szpiczaka w celu wytworzenia hybrydomaków. Hybrydomy są następnie selekcjonowane i proliferowane przy użyciu pożywki HAT (hipoksantyna-aminopteryna-tymidyna) w celu wytworzenia przeciwciał monoklonalnych...

Technologia Hybridoma do wytwarzania przeciwciał monoklonalnych przeciwko metallopeptydazie

Film demonstruje technikę generowania przeciwciał monoklonalnych z limfocytów B specyficznych dla antygenu. Eukariotyczne wektory ekspresyjne kodujące ciężkie i lekkie łańcuchy przeciwciał, sklonowane z izolowanych komórek B specyficznych dla antygenu, wprowadza się do komórek ssaków za pomocą polipleksów. Po wejściu do komórek wektory te ulegają translacji, a powstałe peptydy o ciężkich i lekkich łańcuchach łączą się w przeciwciała, które są następnie wydzielane przez komórki.

Technika wytwarzania przeciwciał monoklonalnych z limfocytów B specyficznych dla antygenu

Synteza ludzkich przeciwciał monoklonalnych jest pierwszym krokiem w badaniach mających na celu rozwikłanie patofizjologicznych mechanizmów odpowiedzi immunologicznej za pośrednictwem autoprzeciwciał. Opracowaliśmy protokół wytwarzania rekombinowanych przeciwciał monoklonalnych ludzkiej immunoglobuliny G (IgG) z komórek B posortowanych krwią, w tym izolację komórek B, klonowanie przeciwciał i syntezę in vitro.

Wytwarzanie rekombinowanych ludzkich przeciwciał monoklonalnych IgG z unieśmiertelnionych sortowanych komórek B

Opisujemy metodę produkcji ludzkich przeciwciał specyficznych dla interesującego nas antygenu, zaczynając od rzadkich limfocytów B krążących w ludzkiej krwi. Wytwarzanie tych naturalnych przeciwciał jest wydajne i szybkie, a uzyskane przeciwciała mogą rozróżniać wysoce spokrewnione antygeny.

Wytwarzanie dyskryminujących ludzkich przeciwciał monoklonalnych z rzadkich limfocytów B specyficznych dla antygenu B krążących we krwi

Ten artykuł zawiera szczegółowy protokół przygotowania i oceny przeciwciał monoklonalnych przeciwko naturalnym produktom do wykorzystania w różnych testach immunologicznych. Procedura ta obejmuje immunizację, fuzję komórek, pośredni kompetycyjny test ELISA do dodatniego badania przesiewowego klonów oraz przygotowanie hybrydoma monoklonalnego. Podano również specyfikacje dotyczące charakterystyki przeciwciał za pomocą analiz MALDI-TOF-MS i ELISA.

Wytwarzanie przeciwciał monoklonalnych przeciwko produktom naturalnym

Białko rekombinowanego przeciwciała wyrażone w komórkach pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO oraz przeciwciała monoklonalne wytworzone przy użyciu tradycyjnej technologii hybrydoma mogą rozpoznawać i wiązać się z białkiem N (APN) aminopeptydazy świni.

Wytwarzanie przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko aminopeptydazie N w nabłonku błony śluzowej jelit świń

Do badania patogenezy Hc wykorzystano myszy C57BL/6, które stanowią najlepszy model. Badamy potencjalne korzyści z odporności humoralnej przeciwko temu grzybowi i wytworzyliśmy kilka przeciwciał monoklonalnych (mAbs) [przeciwko histonie H2B oraz białku szoku termicznego 60kDa], których skuteczność ochronną przetestowano po podaniu domięśniowym.

Pasywna administracja przeciwciał monoklonalnych przeciwko H. capsulatum oraz innym patogenom grzybiczym

Komórki dendrytyczne pobierają antygeny i migrują w stronę organów odpornościowych, aby zaprezentować przetworzone antygeny limfocytom T. Markowanie nanokryształami Qdot zapewnia długotrwały i stabilny sygnał fluorescencyjny. Umożliwia to śledzenie komórek dendrytycznych w różnych organach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Generowanie i znakowanie nanocząsteczkami kropek kwantowych komórek dendrytycznych pochodzących z szpiku kostnego myszy na potrzeby badań śledzących

Niniejszy protokół opisuje w szczególności ekstrakcję całkowitego IgY z żółtka jaja za pomocą precypitacji glikolem polietylenowym i przekazuje ogólne informacje na temat technologii IgY.

Technologia IgY: Wyodrębnianie przeciwciał kurzych z żółtka jaja poprzez wytrącanie glikolem polietylenowym (PEG)

Poznaj metodę wytwarzania przeciwciał monoklonalnych za pomocą technologii hybridoma. Protokół obejmuje immunizację myszy, fuzję komórek śledziony z komórkami myeloma oraz selekcję produkujących przeciwciała linii komórkowych.

Wytwarzanie mysich przeciwciał monoklonalnych za pomocą technologii Hybridoma

Przeglądaj więcej filmów