Name: Pomiar różnicowo metylowanych gatunków INS DNA w próbkach surowicy ludzkiej jako biomarker śmierci β komórki wyspy trzustkowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Poznaj metodę pomiaru różnicowo metylowanego DNA INS w surowicy ludzkiej jako biomarkera śmierci komórek β. Technika cyfrowego PCR umożliwia wykrywanie wczesnej fazy cukrzycy typu 1.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health grant UC4 DK104166 (dla RGM). Pragniemy podziękować za pomoc Indiana Diabetes Research Center Translation Core wspieraną przez National Institutes of Health grant P30 DK097512.

Oświadczenie etyczne: Protokoły zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną Uniwersytetu Indiana. Rodzice badanych wyrazili pisemną świadomą zgodę, a dzieci w wieku powyżej 7 lat wyraziły zgodę na ich udział.
1. Przetwarzanie surowicy
UWAGA: Opisany test został rygorystycznie przetestowany przy użyciu ludzkiej surowicy wyizolowanej w następujący sposób.
<ol>
	<li>Zbierz krew do jednej czerwonej górnej (bez dodatków; niepowlekanej) probówki do pobierania krwi.</li>
	<li>Pozostaw w temperaturze pokojowej na 30 minut, aby mógł uformować się skrzep.</li>
	<li>Probówka wirówkowa o masie 2 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Przenieść supernatant (surowicę) do nowej probówki przeznaczonej do przechowywania surowicy (polipropylenowe rurki zakręcane, wielkość zależna od próbek).</li>
	<li>Przechowywać próbki w temperaturze -80 °C do czasu, gdy będą gotowe do izolacji DNA.</li>
</ol>
2. Ekstrakcja DNA z surowicy
UWAGA: DNA ekstrahuje się za pomocą zestawu do ekstrakcji DNA przy użyciu 50 μl surowicy (zalecane), zgodnie z protokołem producenta z pewnymi modyfikacjami.
<ol>
	<li>Przygotować 200 μl buforu do lizy + 1 μl poli(A) (5 μg) na próbkę w probówce do mikrowirówki. Wiruj przez 15 sekund. Odłóż na bok do kroku 2.3.</li>
	<li>Pobrać próbki surowicy z zamrażarki o temperaturze -80 ºC i rozmrozić w temperaturze pokojowej. Doprowadzić objętość próbki surowicy do całkowitej objętości 200 μl za pomocą soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS, z chlorkiem wapnia i chlorkiem magnezu).</li>
	<li>Poddać próbkę lizie, dodając do próbki 20 μl proteazy (1,4 jednostki Ansona/ml), a następnie 200 μl mieszaniny buforu do lizy/poliA (z kroku 2.2) i wirować przez 8 sekund. Inkubować próbkę w temperaturze 56 °C przez 10 minut, a następnie krótko wirować przez 7 sekund z maksymalną prędkością w mikrowirówce (>10 000 x g).</li>
	<li>Wytrącić DNA, dodając 230 μl 100% etanolu do próbki i wirować przez 8 sekund. Krótko wirować przez 7 sekund z maksymalną prędkością (>10 000 x g).</li>
	<li>Nałożyć DNA na kolumnę wirową, dodając mieszaninę próbek o objętości 600 μl do mini kolumny wirowej. Wirować przy 6 000 x g przez 1 min. Wyrzuć przepływ i umieść kolumnę w czystej probówce.</li>
	<li>Przepłukać DNA, dodając do kolumny 500 μl buforu płuczącego 1. Wirować przy 6 000 x g przez 1 min. Wyrzuć przepływ i umieść kolumnę w czystej probówce. Dodać 500 μl buforu płuczącego 2 do kolumny i wirować z maksymalną prędkością (>10 000 x g) przez 3 minuty. Umieścić kolumnę w nowej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i ponownie wirować na najwyższych obrotach przez 1 minutę.</li>
	<li>Eluować DNA, umieszczając kolumnę w nowej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i dodając 60 μl buforu elucyjnego bezpośrednio na filtrze. Ważne jest, aby przełączać końcówki między próbkami, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut, następnie odwirowywać przy 6 000 x g przez 1 minutę. Dodać kolejne 60 μl buforu elucyjnego i odwirowywać przy 6 000 x g przez 1 min. </li>
	<li>Przechowywać DNA w temperaturze -20 ºC do późniejszego użycia lub natychmiast przystąpić do konwersji wodorosiarczynu.</li>
</ol>
3. Konwersja wodorosiarczynu
UWAGA: Konwersja wodorosiarczynu odbywa się przy użyciu zestawu do konwersji wodorosiarczynu, zgodnie z protokołem producenta z pewnymi modyfikacjami.
<ol>
	<li>Aby przekształcić niemetylowane cytozyny w uracyle, dodaj 130 μl odczynnika konwersji wodorosiarczynu do 20 μl DNA z kroku 2.7 w probówce PCR (pojedyncza probówka PCR 0,2 ml lub 8-paskowa probówka PCR). Zachowaj pozostałe 40 μl DNA do wykorzystania w przyszłości lub użyj w replikowanych reakcjach. Wymieszaj 20 razy, pipetując w górę i w dół, a następnie krótko odwiruj, aby upewnić się, że żadne krople nie znajdują się po bokach lub pokrywie. Inkubować w łaźni wodnej lub termocyklerze w następujący sposób: 98 °C przez 8 min, 54 °C przez 60 min, 4 °C przez 5 min.
	<ol>
		<li>Przejdź do kroku 3.2 lub przechowuj w temperaturze 4 °C do 20 godzin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 600 μl buforu wiążącego do wirowania kolumny i umieścić kolumnę w dołączonej probówce zbiorczej. Nałóż wodorosiarczynowe DNA do kolumny i wymieszaj, pipetując w górę i w dół 10 razy. Wirować z maksymalną prędkością (>10 000 x g) przez 30 sek.</li>
	<li>Przepłukać DNA, dodając 100 μl buforu płuczącego do kolumny i odwirować z maksymalną prędkością (>10 000 x g) przez 30 sekund.</li>
	<li>Przeprowadzić odsulfonowanie w celu usunięcia grupy sulfonianowej w celu sfinalizowania konwersji niemetylowanych cytozyn do uracylu poprzez dodanie 200 μl buforu odsulfonacyjnego do kolumny. Odstawić w temperaturze pokojowej na 20 minut, a następnie odwirować z maksymalną prędkością (>10 000 x g) przez 30 sekund.</li>
	<li>Przepłukać DNA, dodając 200 μl buforu płuczącego do kolumny i wirować z pełną prędkością przez 30 sekund. Odrzucić przepływ i powtórzyć ten etap płukania.</li>
	<li>Umieścić kolumnę w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Eluować DNA, dodając 10 μl buforu elucyjnego bezpośrednio do filtra kolumnowego. Inkubować przez 1 minutę. Wirować przez 30 s z pełną prędkością, aby wymyć DNA. Ilościowe określenie odzyskanego DNA za pomocą spektrofotometrii przy A260. 
	UWAGA: DNA wykryte za pomocą spektrofotometrii reprezentuje przede wszystkim nośnik poliA DNA, który został dodany w kroku 2.3 powyżej. Zazwyczaj odzysk poliA wynosi ≥85% wsadu (>4,25 μg).</li>
	<li>Przechowuj DNA w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będzie ono gotowe do przeprowadzenia cyfrowego PCR.</li>
</ol>
4. Multipleksowy cyfrowy PCR
<ol>
	<li>Sporządzić mieszankę wzorcową z wystarczającą ilością roztworu dla każdej próbki i kontroli. Zawierać co najmniej jedną próbkę zawierającą wodę (kontrola ujemna), jedną próbkę plazmidu zawierającą niemetylowany INS (1 pg, kontrola pozytywna), jedną próbkę plazmidu zawierającą metylowany INS (1 pg, kontrola dodatnia) i jedną próbkę zawierającą mieszaninę plazmidów w stosunku 1:1.
	<ol>
		<li>Aby przygotować główną mieszaninę PCR, dodaj 12,5 μl na reakcję buforu PCR (np. 125 μl na 10 próbek), 1,25 μl na mieszaninę startera reakcyjnego i sondy (np. 12,5 μl na 10 próbek), 8,25 μl na wodę reakcyjną (np. 82,5 μl na 10 próbek), 0,5 μl na enzym reakcyjny EcoR1 (np. 5 μl na 10 próbek). 
		UWAGA: Użyte tutaj startery i sondy są następujące: Forward Primer: 5'-GGAAATTGTAGTAGTTTTAGTTTTTTTATTTGT-3'; Podkład odwrotny: 5'-AAAACCCATCTCCCCTACCTATCA-3'; Sonda FAM: FAM-5'-ACCCCTACCACCACCTAAC-3'-MGB; Sonda VIC: VIC-5'-ACCCCTACCGCCTAAC-3'-MGB.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustawić reakcję multipleksową PCR na 96-dołkowej płytce. Do każdego dołka dodać 19,5 μl mieszanki wzorcowej. Dodać 2,5 μl próbki DNA przekształconej w wodorosiarczyn do każdej odpowiedniej studzienki (zachowaj pozostałe 7,5 μl DNA przekształconego w wodorosiarczyn lub użyj w powtórzonych reakcjach). Mieszać przez kilkakrotne pipetowanie w górę i w dół. 
	UWAGA: Wszystkie 8 studzienek w rzędzie musi zawierać kontrolę próbki lub buforu.</li>
	<li>Uszczelnić uszczelką foliową za pomocą zgrzewarki płytowej i odwirować w wirówce płytkowej, aż po bokach studzienek nie będzie płynu.</li>
	<li>Skonfiguruj automatyczny generator kropel na ekranie dotykowym. 
	UWAGA: Wszystkie 8 studzienek we wkładzie musi zawierać kontrolę próbki lub buforu.
	<ol>
		<li>Ustaw liczbę używanych rzędów, dotykając rzędów, do których ładowane są próbki, na płytce 96-dołkowej z kroku 4.2 i podświetl wiersz na niebiesko, aby wskazać aktywny wiersz.</li>
		<li>Materiały eksploatacyjne należy ładować od tyłu do przodu, aby uniknąć zanieczyszczenia. Aby rozpocząć, dodaj wkładki wzdłuż tylnego rzędu instrumentu. Załaduj końcówki do środkowego rzędu instrumentu. 
		UWAGA: Wkłady mogą pasować do uchwytów tylko we właściwej orientacji.</li>
		<li>Umieść 96-dołkową płytkę w instrumencie. Wyjmij zimny blok z zamrażarki o temperaturze -20 °C i umieść w nim nową 96-dołkową płytkę z listwą w osłonie. Umieść go wewnątrz instrumentu obok próbki załadowanej płytką 96-dołkową.</li>
		<li>Dodaj olej do dozownika z przodu instrumentu. Wybierz rodzaj oleju na ekranie dotykowym.</li>
		<li>Dotknij niebieskiego przycisku start, aby rozpocząć bieg. Potwierdź konfigurację płyty i dotknij przycisku uruchamiania uruchamiania, aby rozpocząć.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po zakończeniu usuń 96-dołkową płytkę, która zawiera nowo powstałe kropelki i uszczelnij uszczelką foliową za pomocą zgrzewarki do płytek.</li>
	<li>Wykonaj PCR10 na termocyklerze przy użyciu następującego programu: 95 °C przez 10:00 min; 40 cykli w godzinach: 94 °C przez 00:30 min, 57,5 °C przez 01:00 min; 98 °C przez 10:00 min; 12 °C przez 10 min lub do 24 godzin.</li>
	<li>Umieść płytkę na czytniku kropelkowym i ustaw czytnik.
	<ol>
		<li>Kliknij kartę ustawień. Otwórz nowy szablon, klikając szablon > nowy. Wprowadź nazwę pliku.</li>
		<li>Użyj edytora studni, aby ustawić parametry dla każdej próbki. Nadaj każdej próbce unikalną nazwę, ustaw eksperyment na wykrywanie rzadkich zdarzeń (R-RED) i ustaw miks główny na miks użyty w kroku 4.1.</li>
		<li>Nadaj Celowi 1 nazwę (tj. niemetylowany) i ustaw Cel 1 jako nieznany (U). Nadaj Celowi 2 nazwę (tj. Metylowany) i ustaw Cel 2 jako odniesienie (R).</li>
		<li>Kliknij kartę Uruchom, aby rozpocząć uruchamianie. W oknie opcji uruchamiania wybierz chemię detekcji (FAM/VIC).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Analiza danych
<ol>
	<li>Otwórz wyniki w zakładce analizy i przeanalizuj za pomocą wykresu 2D opartego na kontrolach pozytywnych (patrz rysunek 1).</li>
	<li>Eksport pliku CSV wygenerowanego przez czytnik kropelkowy do programu do arkuszy kalkulacyjnych w celu analizy danych.</li>
	<li>Aby wygenerować "kopie na μl" surowicy, należy użyć wzoru: (stężenie*250)/(objętość surowicy użytej do izolacji DNA w μl). 6 
	UWAGA: Dane są zwykle konwertowane na log10, gdy są pozyskiwane z ludzkiej surowicy, aby zapewnić normalny rozkład. Alternatywnie dane można wykreślić w skali logarytmicznej10 i przeanalizować za pomocą statystyk nieparametrycznych.</li>
</ol>
<style type="text/css">p.p1 {margin: 0.0px 0.0px 0.0px; font: 16.0px 'Times New Roman'}
span.s1 {czcionka: 16.0px Calibri}
</style>

<ol><li>Lehuen, A., Diana, J., Zaccone, P., Cooke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cell+crosstalk+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune cell crosstalk in type 1 diabetes.</a> Nat. Rev. Immunol. 10 (7), 501-513 (2010).</li>
<li>Sherry, N. A., Tsai, E. B., Herold, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+history+of+beta-cell+function+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Natural history of beta-cell function in type 1 diabetes.</a> Diabetes. 54, Suppl 2 32-39 (2005).</li>
<li>Maganti, A., Evans-Molina, C., Mirmira, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+immunobiology+to+%CE%B2-cell+biology%3A+the+changing+perspective+on+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">From immunobiology to β-cell biology: the changing perspective on type 1 diabetes.</a> Islets. 6 (2), 28778(2014).</li>
<li>Matthews, J. B., Staeva, T. P., Bernstein, P. L., Peakman, M., von Herrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ITN-JDRF+Type+1+Diabetes+Combination+Therapy+Assessment+Group+Developing+combination+immunotherapies+for+type+1+diabetes%3A+recommendations+from+the+ITN-JDRF+Type+1+Diabetes+Combination+Therapy+Assessment+Group%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">ITN-JDRF Type 1 Diabetes Combination Therapy Assessment Group Developing combination immunotherapies for type 1 diabetes: recommendations from the ITN-JDRF Type 1 Diabetes Combination Therapy Assessment Group.</a> Clin. Exp. Immunol. 160 (2), 176-184 (2010).</li>
<li>Human Islet Research Network | HIRN. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://hirnetwork.org/">https://hirnetwork.org/</a> (2016).</li>
<li>Fisher, M. M., Watkins, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevations+in+Circulating+Methylated+and+Unmethylated+Preproinsulin+DNA+in+New-Onset+Type+1+Diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Elevations in Circulating Methylated and Unmethylated Preproinsulin DNA in New-Onset Type 1 Diabetes.</a> Diabetes. 64 (11), 3867-3872 (2015).</li>
<li>Husseiny, M. I., Kaye, A., Zebadua, E., Kandeel, F., Ferreri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-Specific+Methylation+of+Human+Insulin+Gene+and+PCR+Assay+for+Monitoring+Beta+Cell+Death%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Tissue-Specific Methylation of Human Insulin Gene and PCR Assay for Monitoring Beta Cell Death.</a> PLoS ONE. 9 (4), 94591(2014).</li>
<li>Herold, K. C., Usmani-Brown, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2+cell+death+and+dysfunction+during+type+1+diabetes+development+in+at-risk+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">β cell death and dysfunction during type 1 diabetes development in at-risk individuals.</a> J. Clin. Invest. 125 (3), 1163-1173 (2015).</li>
<li>Lehmann-Werman, R., Neiman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+tissue-specific+cell+death+using+methylation+patterns+of+circulating+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Identification of tissue-specific cell death using methylation patterns of circulating DNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 113 (13), 1826-1834 (2016).</li>
<li>Saiki, R. K., Gelfand, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer-directed+enzymatic+amplification+of+DNA+with+a+thermostable+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase.</a> Science. 239 (4839), 487-491 (1988).</li>
<li>Kuroda, A., Rauch, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+gene+expression+is+regulated+by+DNA+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Insulin gene expression is regulated by DNA methylation.</a> PloS One. 4 (9), 6953(2009).</li>
<li>Akirav, E. M., Lebastchi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+%CE%B2+cell+death+in+diabetes+using+differentially+methylated+circulating+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Detection of β cell death in diabetes using differentially methylated circulating DNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (47), 19018-19023 (2011).</li>
<li>Fisher, M. M., Perez Chumbiauca, C. N., Mather, K. J., Mirmira, R. G., Tersey, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+islet+%CE%B2-cell+death+in+vivo+by+multiplex+PCR+analysis+of+differentially+methylated+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Detection of islet β-cell death in vivo by multiplex PCR analysis of differentially methylated DNA.</a> Endocrinology. 154 (9), 3476-3481 (2013).</li>
<li>Patterson, K., Molloy, L., Qu, W., Clark, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation%3A+bisulphite+modification+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">DNA methylation: bisulphite modification and analysis.</a> J. Vis. Exp. (56), (2011).</li>
<li>Derks, S., Lentjes, M. H. F. M., Hellebrekers, D. M. E. I., de Bruïne, A. P., Herman, J. G., van Engeland, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylation-specific+PCR+unraveled%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Methylation-specific PCR unraveled.</a> Cell. Oncol. 26 (5-6), 291-299 (2004).</li>
<li>Husseiny, M. I., Kuroda, A., Kaye, A. N., Nair, I., Kandeel, F., Ferreri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+quantitative+methylation-specific+polymerase+chain+reaction+method+for+monitoring+beta+cell+death+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Development of a quantitative methylation-specific polymerase chain reaction method for monitoring beta cell death in type 1 diabetes.</a> PloS One. 7 (10), 47942(2012).</li>
<li>Hindson, B. J., Ness, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+Droplet+Digital+PCR+System+for+Absolute+Quantitation+of+DNA+Copy+Number%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number.</a> Anal. Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).</li>
<li>Sozzi, G., Roz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+prolonged+storage+of+whole+plasma+or+isolated+plasma+DNA+on+the+results+of+circulating+DNA+quantification+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Effects of prolonged storage of whole plasma or isolated plasma DNA on the results of circulating DNA quantification assays.</a> J. Natl. Cancer Inst. 97 (24), 1848-1850 (2005).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Metylacja cytozyn przez metylotransferazy DNA pozwala na epigenetyczną kontrolę transkrypcji w wielu genach. Gen INS u ludzi ulega ekspresji prawie wyłącznie w komórkach β wysp trzustkowych i wydaje się, że istnieje korelacja między częstością metylacji cytozyn w genie INS a wyciszeniem jego transkrypcji11. W związku z tym większość typów komórek wykazuje znacznie wyższe częstotliwości metylacji genu INS przy różnych cytozynach w porównaniu z komórkamiβ 11-13<su...

Cukrzyca typu 1 (T1D) jest chorobą autoimmunologiczną, która charakteryzuje się niszczeniem komórek β wysp trzustkowych produkujących insulinę przez autoreaktywne limfocyty T1. Rozpoznanie cukrzycy typu 1 jest zwykle stawiane na podstawie pomiaru hiperglikemii (stężenie glukozy we krwi > 200 mg/dl) u szczupłej, młodej osoby, u której może występować kwasica ketonowa jako dowód niedoboru insuliny. W momencie rozpoznania cukrzycy typu 1 istnieją dowody na znaczną utratę funkcji i masy komórek β (od 50 do 90%)2. W badaniach klinicznych kilka leków immunomodulujących, które zostały wprowadzone w momencie diagnozy, spowodowało stabilizację funkcji komórek β (i przypuszczalnie masy), ale żaden z nich nie spowodował klinicznej remisji choroby, co wzbudziło zapotrzebowanie na opracowanie biomarkerów do wcześniejszego wykrywania choroby i długotrwałego śledzenia skuteczności terapii skojarzonych3,4. Wysiłki międzynarodowych konsorcjów, takich jak Konsorcjum Sieci Badawczej Ludzkich Wysepek przy National Institutes of Heath5, podkreśliły potrzebę opracowania biomarkerów, które koncentrują się na stresie β komórkach i śmierci w cukrzycy typu 1.
Zgodnie z tymi wysiłkami, nasza grupa i inni opracowali ostatnio testy biomarkerów, które mierzą krążące, epigenetycznie zmodyfikowane fragmenty DNA, które powstają głównie w wyniku umierania β komórkach 6-9. We wszystkich opublikowanych do tej pory testach skupiono się na ilościowym określeniu ludzkiego genu kodującego preproinsulinę (INS), który wykazuje większy stopień niemetylowanych miejsc CpG w regionach kodujących i promotorowych w porównaniu z innymi typami komórek. Przypuszczano, że uwolnienie niemetylowanych fragmentów DNA INS wynika głównie z obumierania (nekrotycznych, apoptotycznych) komórek β. Nasze ostatnie badania wykazały, że u młodzieży w nowo rozpoznanym cukrzycowym T1D zaobserwowano wzrost zarówno niemetylowanego, jak i metylowanego DNA INS w pozycji -69 pz (w stosunku do miejsca rozpoczęcia transkrypcji) i razem służyły jako specyficzne biomarkery dla tej populacji6. Te testy biomarkerów obejmują izolację bezkomórkowego DNA z surowicy lub osocza przy użyciu komercyjnych zestawów do spinania, a następnie konwersję wodorosiarczynową wyizolowanego DNA (w celu przekształcenia niemetylowanych cytozyn w uracyl, pozostawiając nienaruszone metylowane cytozyny).
W tym raporcie opisujemy techniczne aspekty pobierania próbek surowicy, izolacji bezkomórkowego DNA z surowicy, konwersji wodorosiarczynu oraz wydajności kropelkowego cyfrowego PCR (odtąd cyfrowego PCR) dla różnicowo metylowanego DNA INS.

<table><tbody><tr><td>Odkurzacz Red Top&nbsp;</td><td>Beckon Dickinson</td><td>366441</td><td>bez dodatków, niepowlekane wnętrze, 10 ml</td></tr><tr><td>Cryovial Tube</td><td>Simport</td><td>T310-3A</td><td>polipropylen, rurka z nakrętką, dowolny rozmiar</td></tr><tr><td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>51106</td><td></td></tr><tr><td>Poly(A)</td><td>Sigma</td><td>P9403</td><td>nielubiany w buforze TE (10 mM Tris-Cl pH 8,0 + 1 mM EDTA) do 5 &mikro; g/&mikro; l&nbsp;</td></tr><tr><td>Etanol absolutny (200 proof)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-500</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (z CaCl2 i MgCl2)</td><td>Sigma</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>0,2 ml 8-paskowe probówki PCR</td><td>MidSci</td><td>AVST</td><td></td></tr><tr><td>8-paskowe nakrętki, kopułka</td><td>MidSci</td><td>AVSTC-N</td><td></td></tr><tr><td>EZ DNA Metylacja-Lightning Kit</td><td>Zymo</td><td>D5031</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR Supermix do sond (bez dUTP)</td><td></td>Kontrola bufora 1863024 <td></td><td>Biorad</td></tr> do <tr><td>sond</td><td>Biorad</td><td>1863052</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki niemetylowany/metylowany starter/sonda mix</td><td>Life Technologies</td><td>AH21BH1</td><td></td></tr><tr><td>EcoR1</td><td>New England Biolabs</td><td>R0101L</td><td></td></tr><tr><td>twin.tec PCR Plate 96, półspódniczka</td><td>Eppendorf</td><td>951020346</td><td></td></tr><tr><td>Zgrzewany foliowy do przekłuwania</td><td>Biorad</td><td>1814040</td><td></td></tr><tr><td>PX1 Zgrzewarka do płytek PCR</td><td>Biorad</td><td>1814000</td><td></td></tr><tr><td>QX200 AutoDG Droplet Cyfrowy system PCR</td><td>Biorad</td><td>1864101</td><td></td></tr><tr><td>Automatyczny olej do generowania kropel do sond</td><td>Biorad</td><td>186-4110</td><td></td></tr><tr><td>DG32 Kartridż do automatycznego generatora kropel</td><td>Biorad</td><td>186-4108</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do automatycznego generatora kropel</td><td>Biorad</td><td>186-4120</td><td></td></tr><tr><td>Pojemniki na końcówki do automatycznych kropel</td><td>Biorad</td><td>186-4125</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Termocykler dotykowy</td><td>Biorad</td><td>1851197</td><td></td></tr><tr><td>QX200 Czytnik kropel</td><td>Biorad</td><td>186-4003</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik kropel ddPCR Oil</td><td>Biorad</td><td>186-3004</td><td></td></tr></tbody></table>

pomiar różnicowo metylowanych gatunków ins dna w próbkach surowicy ludzkiej jako biomarker śmierci β komórki wyspy trzustkowej

Measurement of Differentially Methylated INS DNA Species in Human Serum Samples as a Biomarker of Islet &#946; Cell Death

Uważa się, że śmierć komórek β wysp trzustkowych leży u podstaw patogenezy praktycznie wszystkich form cukrzycy i poprzedza rozwój hiperglikemii, zwłaszcza w cukrzycy typu 1. Opracowanie czułych i wiarygodnych biomarkerów śmierci komórek β może pozwolić na wczesną interwencję terapeutyczną w celu zapobieżenia lub opóźnienia rozwoju cukrzycy. Ostatnio kilka grup, w tym nasza, doniosło, że bezkomórkowe, różnicowo metylowane DNA kodujące preproinsulinę (INS) w krążeniu jest skorelowane ze śmiercią komórek β w cukrzycy typu 1 i cukrzycy typu 1 o nowym początku. Tutaj przedstawiamy protokół krok po kroku wykorzystujący cyfrowy PCR do pomiaru bezkomórkowego DNA INS, które jest różnie metylowane w cytozynie w pozycji -69 pz (w stosunku do miejsca rozpoczęcia transkrypcji). Pokazujemy, że test może rozróżnić metylowaną i niemetylowaną cytozynę w pozycji -69 pz, jest liniowy w kilku rzędach wielkości, zapewnia bezwzględną ilościowość liczby kopii DNA i może być stosowany do próbek ludzkiej surowicy od osób z nowo rozpoznaną cukrzycą typu 1 i kontrolnych wolnych od choroby. Opisany tutaj protokół może być dostosowany do dowolnego gatunku DNA, dla którego pożądane jest wykrycie różnie metylowanych cytozyn, czy to z krążenia, czy z izolowanych komórek i tkanek, i może zapewnić bezwzględną ocenę ilościową fragmentów DNA.

Aby odpowiednio interpretować dane, w każdym przebiegu cyfrowego PCR stosujemy kontrole plazmidowe dla niezmetylowanego oraz zmetylowanego docelowego DNA INS . Kontrole te zapewniają wyraźne rozróżnienie sygnałów odpowiadających zmetylowanemu i niezmetylowanemu DNA. Rysunek 1 przedstawia dwuwymiarowe wykresy rozrzutu dla kropli w przypadku kontroli plazmidowych zawierających konwertowane w procesie bisulfitowania niezmetylowane DNA INS (Rysunek ...

Śmierć komórek β wysepek poprzedza rozwój cukrzycy typu 1, a wykrycie tego procesu może pozwolić na wczesną interwencję terapeutyczną. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy opis, w jaki sposób mierzyć różnicowo metylowane gatunki INS DNA w ludzkiej surowicy jako biomarker śmierci komórek β.

Pomiar różnicowo metylowanych gatunków INS DNA w próbkach surowicy ludzkiej jako biomarker śmierci β komórki wyspy trzustkowej

The death of islet &#946; cells is thought to underlie the pathogenesis of virtually all forms of diabetes and to precede the development of frank ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest pomiar różnicowo zmetylowanych form DNA preproinsuliny w ludzkim surowicy jako biomarkera śmierci komórek beta. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie cukrzycy, takie jak: czy śmierć komórek beta następuje w danym punkcie czasowym podczas rozwoju cukrzycy typu pierwszego? Główną zaletą tej techniki jest to, że dzięki zastosowaniu cyfrowej PCR możemy określić skalę śmierci komórek beta w bardzo małych ilościach surowicy.Po pobraniu surowicy z ludzkich próbek krwi zgodnie z protokołem tekstowym, przygotować w probówce do mikrowirówki 200 µL buforu lizującego i 1 µL poly(A) na każdą próbkę. Mieszanie w wirówce Vortex prowadzić przez 15 sekund. Wyjąć próbki surowicy z zamrażarki ustawionej na -80 °C i rozmrozić je w temperaturze pokojowej.Następnie, za pomocą PBS doprowadź objętość próbki surowicy do 200 µl. Poddaj próbki lizie, dodając 20 µl proteazy oraz 200 µl buforu do lizy poly(A)mix. Mieszaj próbki w wirówce typu vortex przez osiem sekund, a następnie inkubuj je w temperaturze 56 °C przez 10 minut.Następnie wirować probówki z maksymalną prędkością przez siedem sekund. Wytrącić DNA, dodając do próbek 230 µL 100% etanolu, a następnie mieszać probówki na wirówce vortex przez osiem sekund. Następnie ponownie wirować probówki z maksymalną prędkością przez siedem sekund.Następnie nanieś 600 µL mieszanin próbek na kolumny wirowkowe i wiruj kolumny z prędkością 6000 ×g przez jedną minutę. Odrzuć filtrat i umieść kolumny w czystych probówkach. Dodaj do kolumn 500 µL buforu płuczącego 1 i wiruj próbki z prędkością 6000 ×g przez jedną minutę.Następnie odrzuć frakcję przepływową i umieść kolumny w czystych probówkach. Dodaj do kolumn 500 µL buforu płuczącego dwa i wiruj je z maksymalną prędkością przez trzy minuty. Następnie umieść kolumny w nowych probówkach do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL i wiruj je ponownie przez jedną minutę.Aby eluować DNA, należy umieścić kolumny w nowych probówkach do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml i dodać 60 µl buforu elucyjnego bezpośrednio na filtry. Po inkubacji kolumn w temperaturze pokojowej przez pięć minut, próbki należy odwirować przy 6000 ×g przez jedną minutę. Kolumnę należy usunąć, a próbki przechowywać do momentu rozpoczęcia konwersji bisulfitowej.Aby przekształcić niezmetylowane cytozyny w uracyle, należy dodać 130 µL odczynnika do konwersji pirosiarczynowej do 20 µL DNA w probówkach do PCR. Próbki należy wymieszać 20-krotnie poprzez pipetowanie w górę i w dół, a następnie krótko odwirować probówki, aby upewnić się, że na ściankach lub zakrętce nie pozostały krople. Próbki inkubuje się w łaźni wodnej lub termocyklerze, zgodnie z instrukcją przedstawioną w materiale.Umieścić kolumny w dołączonych probówkach zbiorczych i dodać 600 µL buforu wiążącego do kolumn wirówkowych. Nanieść DNA poddane bisulfitowaniu na kolumny i wymieszać, pipetując w górę i w dół 10 razy. Następnie próbki wirować z maksymalną prędkością przez 30 sekund i odrzucić filtrat.Następnie należy dodać 100 µL buforu do płukania do kolumny i wirować przez 30 sekund. Następnie, aby usunąć grupy sulfinowe i sfinalizować konwersję niezmetylowanych cytozyn do uracylu, należy dodać do kolumn 200 µL buforu do desulfinacji. Po pozostawieniu próbek w temperaturze pokojowej przez 20 minut, kolumny należy wirować przez 30 sekund.Przemyj DNA, dodając 200 µL buforu do przemywania do kolumn, a następnie wiruj je przez 30 sekund. Następnie odrzuć filtrat i powtórz etap przemywania. Umieść kolumny w probówkach do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml i eluuj DNA, dodając 10 µL buforu do elucji bezpośrednio na filtry kolumn.Inkubować próbki przez jedną minutę, a następnie wirować przez 30 sekund w celu elucji DNA. Kolumny należy usunąć, a próbki przechowywać. Ilość odzyskanego DNA należy określić metodą spektrofotometryczną przy absorbancji 260 nanometrów.Przygotować mieszaninę główną (master mix) w ilości wystarczającej dla każdej próbki i kontroli. Należy uwzględnić co najmniej jedną próbkę zawierającą wodę, jedną próbkę plazmidu zawierającego niezmetylowaną insulinę oraz jedną próbkę zawierającą mieszaninę plazmidów w stosunku jeden do jednego. Reakcje multiplex PCR przygotować na płytce 96-dołkowej, rozpoczynając od dodania 19,5 µL mieszaniny głównej do każdego dołka.Do odpowiednich dołków dodaj 2,5 µL próbki DNA przekształconego metodą konwersji pirosiarczynowej. Następnie wymieszaj zawartość dołków, pipetując ciecz kilka razy w górę i w dół. Użyj folii i uszczelniacza do płytek, aby zamknąć płytkę, a następnie wiruj ją w wirówce do płytek, aż na ściankach dołków nie będzie widocznej cieczy.Aby skonfigurować automatyczny generator kropel na ekranie dotykowym, ustaw liczbę używanych rzędów, dotykając rzędów, w których próbki zostały załadowane do dołków płytki. Aby uniknąć kontaminacji, ładuj materiały eksploatacyjne od tyłu do przodu, zaczynając od kartridży wzdłuż tylnego rzędu urządzenia. Następnie załaduj końcówki do rzędu środkowego.Następnie umieść płytkę 96-dołkową w urządzeniu. Następnie, po wyjęciu bloku chłodzącego z zamrażarki o temperaturze -20 °C, włóż do niego nową 96-dołkową płytkę z obramowaniem. Wsuń blok z płytką do urządzenia, obok płytki z próbkami.Nalej olej do dozownika znajdującego się przed instrumentem i wybierz rodzaj oleju na ekranie dotykowym. Naciśnij niebieski przycisk Start, aby rozpocząć proces. Następnie potwierdź konfigurację płytki i naciśnij przycisk Start Run, aby przejść do analizy.Po zakończeniu cyklu wyjmij płytkę 96-dołkową zawierającą nowo utworzone kropelki i zabezpiecz ją folią za pomocą uszczelniacza do płytek. Następnie przeprowadź reakcję PCR w termocyklerze, korzystając z poniższego programu. Umieść płytkę w czytniku kropelek i skonfiguruj urządzenie, klikając kartę Setup.Następnie otwórz nowy szablon, klikając Template New. Użyj edytora dołków, aby ustawić parametry dla każdej próbki. Nadaj każdej próbce unikalną nazwę.Ustaw eksperyment na Rare Event Detection i wybierz master mix użyty do przygotowania reakcji. Nadaj Target 1 nazwę, np. Unmethylated, i ustaw Target 1 jako unknown (U). Nadaj Target 2 nazwę, np. Methylated, i ustaw Target 2 jako reference (R). Kliknij zakładkę Run, aby rozpocząć pomiar, i wpisz nazwę pliku. Następnie w oknie Run Options wybierz chemię detekcyjną.Aby przeanalizować dane, otwórz wyniki w karcie Analyze i użyj wykresu 2D opartego na kontrolach pozytywnych do analizy danych. Rysunek ten przedstawia dwuwymiarowe wykresy rozproszenia odpowiadające kroplom dla kontroli plazmidowych, zawierających DNA insuliny po konwersji bisulfitowej niezmetylowane, DNA insuliny zmetylowane oraz mieszaninę obu plazmidów w stosunku jeden do jednego. Należy zauważyć, że na tym panelu występuje niewielkie przesunięcie kropli pozytywnych dla FAM w stronę kanału VIC, co wskazuje na sondę dla zmetylowanego DNA insuliny.Podobnie, w kanale FAM występuje bardzo niewielkie przesunięcie kropli dodatnich dla VIC, co wskazuje na reaktywność krzyżową sondy dla DNA niezmetylowanego z DNA zmetylowanym. Aby wykazać liniowość starterów, w reakcjach PCR zastosowano mieszaniny dwóch plazmidów w zakresach obejmujących kilka rzędów wielkości. Jak pokazano tutaj, zmienne stężenia jednego plazmidu mogą być wykrywane liniowo w obecności stałej ilości drugiego plazmidu.Na tej rycinie przeanalizowano próbki pobrane od czterech osób z nowo zdiagnozowaną cukrzycą typu 1 oraz cztery próbki kontrolne od osób bez cukrzycy typu 1. Dane wykazują, że osoby z cukrzycą typu 1 wykazują podwyższone poziomy zarówno niezmetylowanego, jak i zmetylowanego DNA insuliny w porównaniu z grupą kontrolną, co wykazano wcześniej. Po opanowaniu techniki, przy jej prawidłowym przeprowadzeniu, analiza 30 próbek może zająć osiem godzin.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby unikać kontaminacji na wszystkich etapach. Po opracowaniu ta technika utorowała drogę badaczom w dziedzinie cukrzycy do zbadania możliwości wykorzystania tej metody jako biomarkera rozwoju cukrzycy typu pierwszego. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak określić stopień obumierania komórek beta poprzez pomiar niezmetylowanej i zmetylowanej preproinsuliny w wolnokomórkowym DNA z ludzkiej surowicy.Należy pamiętać, że praca z buforami do ekstrakcji DNA może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak noszenie rękawiczek i fartucha laboratoryjnego oraz unikanie stosowania środków dezynfekujących zawierających wybielacz.

measurement-differentially-methylated-ins-dna-species-human-serum

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Testy limfocytotoksyczności komórkowej (CML) mogą być wykorzystywane do badania odpowiedzi autoreaktywnych oraz mechanizmów śmierci komórek in vitro. Jednak dzięki zastosowaniu technik obrazowania konfokalnego żywych komórek z użyciem barwników fluorescencyjnych, typ i kinetyka śmierci komórkowej, a także wykorzystywane szlaki, mogą być badane w znacznie większych szczegółach.

Metody oceny śmierci komórek beta pośredniczonej przez cytotoksyczne limfocyty T

Ten film prezentuje wykrywanie autoprzeciwciał wysp trzustkowych w ludzkiej surowicy. Przeciwciała w surowicy łączą antygen sprzężony rutenem z biotynylowanym antygenem wychwytującym, tworząc kompleksy, które są wykrywane za pomocą pomiarów elektrochemiluminescencyjnych.

Wykrywanie ludzkich autoprzeciwciał wysp trzustkowych za pomocą testu elektrochemiluminescencyjnego

Mikrodysekcja laserowa to technika, która pozwala na odzyskanie wybranych komórek z niewielkich ilości miąższu. W tym miejscu opisujemy protokół pozyskiwania ludzkich wysp trzustkowych z próbek chirurgicznych do wykorzystania w badaniach transkryptomicznych. Nasz protokół poprawia wewnętrzną autofluorescencję ludzkich komórek beta, ułatwiając w ten sposób ich pobieranie.

Ulepszony protokół mikrodysekcji laserowej ludzkich wysp trzustkowych z próbek chirurgicznych

Prezentujemy tutaj protokół izolacji wysp trzustkowych z mysiego modelu cukrzycy typu 2, Leprdb oraz szczegóły testu żywych komórek do pomiaru wydzielania insuliny z nienaruszonych wysp trzustkowych, który wykorzystuje mikroskopię 2-fotonową.

Mysi model cukrzycy typu 2 Leprdb: izolacja wysp trzustkowych i obrazowanie 2-fotonowe żywych komórek nienaruszonych wysp trzustkowych

Tutaj przedstawiliśmy metody wykrywania autoprzeciwciał ludzkich wysp trzustkowych za pomocą testów elektrochemiluminescencyjnych (ECL). Protokół, stosowany do przewidywania cukrzycy typu 1, może być rozszerzony o wykrywanie autoprzeciwciał przeciwko innym chorobom autoimmunologicznym.

Testy elektrochemiluminescencyjne dla autoprzeciwciał ludzkich wysp trzustkowych

Badania ex vivo wysp trzustkowych są ważne dla badań nad cukrzycą. Istniejące techniki badania hodowanych wysepek w ich natywnej architekturze trójwymiarowej są czasochłonne, nieefektywne i rzadko stosowane. W pracy opisano nową, prostą i wydajną metodę generowania wysokiej jakości skrawków parafinowych całych hodowanych wysepek.

Osadzanie wysp trzustkowych w skrawkach parafinowych

Tutaj prezentujemy protokół do generowania wysokiej jakości, wielkoskalowych danych transkryptomu pojedynczych komórek z izolowanych ludzkich wysp trzustkowych przy użyciu technologii sekwencjonowania mikroprzepływowego jednokomórkowego RNA opartej na kropelkach.

Sekwencjonowanie i analiza RNA pojedynczych komórek ludzkich wysp trzustkowych

To badanie wykorzystuje wielobarwne markery fluorescencji śmierci komórki i apoptozy w połączeniu z mikroskopią konfokalną do oceny apoptozy wywołanej cytokinami i śmierci specyficznej dla komórek β w wyspach trzustkowych. Ujawnia przestrzenne i czasowe zmiany w śmierci komórki i apoptozie w odpowiedzi na bodźce zewnątrzkomórkowe.

Leczenie izolowanych wysp trzustkowych i pomiar apoptozy

Tutaj opisujemy ustawienia do równoległego monitorowania bioluminescencji okołodobowej i aktywności wydzielniczej ludzkich komórek wysp trzustkowych i pierwotnych miotub. W tym celu zastosowaliśmy dostarczanie genu lentiwirusowego za pomocą reportera zegara rdzeniowego lucyferazy, a następnie synchronizację in vitro i zbieranie pożywki odpływowej przez ciągłą peryfuzję komórek.

Równoległy pomiar ekspresji genów zegara okołodobowego i wydzielania hormonów w pierwotnych hodowlach komórkowych człowieka

Opisujemy tutaj stosunkowo szybkie i proste podejście do mapowania czasu replikacji ssaków w całym genomie, od izolacji komórki do podstawowej analizy wyników sekwencjonowania. Mapa genomiczna reprezentatywnego programu replikacji zostanie dostarczona zgodnie z protokołem.

Określenie czasu replikacji ssaków w całym genomie za pomocą pomiaru zawartości DNA

Poznaj metodę pomiaru różnicowo metylowanego DNA INS w surowicy ludzkiej jako biomarkera śmierci komórek β. Technika cyfrowego PCR umożliwia wykrywanie wczesnej fazy cukrzycy typu 1.

Pomiar różnicowo metylowanych gatunków INS DNA w próbkach surowicy ludzkiej jako biomarker śmierci β komórki wyspy trzustkowej

Przeglądaj więcej filmów