Name: Ekspandowanie nanowzorzystych substratów przy użyciu techniki ściegu do nanotopograficznej modulacji zachowania komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Naucz się tworzyć nanowzorzyste substraty metodą ściegu do badania modulacji zachowania komórek przez nanotopografię. Prosta i ekonomiczna technika umożliwia analizę fenotypu komórkowego oraz ekspresji białek adhezji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez NSF CBET 1227766, NSF CBET 1511759 i Byars-Tarnay Endowment. Z wdzięcznością dziękujemy za korzystanie ze Wspólnych Obiektów Badawczych Uniwersytetu Zachodniej Wirginii, które są częściowo wspierane przez NSF EPS-1003907.

1. Replikacja form PDMS z formy EBL
<ol>
	<li>Wyprodukuj formę silikonową29
	<ol>
		<li>Wirować 200 μl roztworu polimetakrylanu metylu (PMMA) na podłożu krzemowym (Si) o grubości 1 × 1 cm z prędkością 2 500 obr./min przez 1 minutę, aby utworzyć cienką warstwę.</li>
		<li>Piec folię PMMA na podłożu Si w temperaturze 180 °C przez 2 minuty.</li>
		<li>Napisz zaprojektowany nanowzór na folii PMMA za pomocą skupionej wiązki elektronów w dawce obszarowej 300 μC/cm2.</li>
		<li>Rozwijaj nanowzorzec PMMA w wywoływaczu przez 80 sekund.</li>
		<li>Osadzać nanowzór PMMA warstwą niklu o grubości 50 nm za pomocą parownika wiązki elektronicznej przy napięciu wyjściowym 10 kV, prądzie emisji 0,5 mA i szybkości stapiania 0,5 A/sek.</li>
		<li>Zdjąć część z PMMA w 20 ml zmywaczu o temperaturze 80 °C na 20 minut.</li>
		<li>Reaktywne wytrawianie jonowe (RIE) nanowzoru w podłożu Si, aby uzyskać formę Si o pożądanej głębokości. 
		UWAGA: Mieszanina gazów tetrafluorometanu (CF4)/tlenu (O2) (90%/10%) przy mocy plazmy sprzężonej indukcyjnie (ICP) 400 W i mocy RIE 150 W służy do wytrawiania podłoża Si na głębokość 560 nm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Silanizuj pleśń Si
	<ol>
		<li>Umieścić szklane szkiełko nakrywkowe i formę Si na szalce Petriego PS o średnicy 100 mm i przenieść je do szklanego eksykatora umieszczonego w dygestorium.</li>
		<li>Upuść 10 μl 1H,1H,2H,2H-perfluorooktylotrichlorosilanu na szkiełko nakrywkowe. 
		Uwaga: 1H,1H,2H,2H-Perfluorooktylotrichlorosilan może powodować działanie na skórę i poważne uszkodzenie oczu. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE).</li>
		<li>Przykryj częściowo szalkę Petriego.</li>
		<li>Utrzymuj eksykator w próżni przez 5 godzin w dygestorium, aby zakończyć silanizację formy Si.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie prepolimeru PDMS
	<ol>
		<li>Odważyć 10 g żywicy PDMS i 1,05 g utwardzacza w jednorazowej łódce wagowej.</li>
		<li>Dokładnie wymieszaj prepolimer PDMS za pomocą plastikowej łyżki.</li>
		<li>Odgazować prepolimer PDMS w plastikowym eksykatorze pod próżnią przez około 20 minut, aż do uzyskania klarownej mieszaniny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Replikowanie form PDMS
	<ol>
		<li>Umieść silanizowaną formę Si na szalce Petriego o średnicy 60 mm.</li>
		<li>Wlej prepolimer PDMS na formę Si na szalce Petriego.</li>
		<li>Umieść szalkę Petriego w plastikowym eksykatorze i odgazowuj przez około 10 minut, aż wszystkie pęcherzyki znikną.</li>
		<li>Przenieść szalkę Petriego na płytkę grzejną i utwardzić prepolimer PDMS w temperaturze 70 °C przez 4 godziny.</li>
		<li>Ostrożnie oderwij formę PDMS od formy Si za pomocą pęsety. 
		UWAGA: Formy PDMS można przechowywać w warunkach otoczenia do jednego tygodnia. Po utwardzeniu w formach PDMS30 znajdują się pewne nieusieciowane cząsteczki żywicy PDMS i resztkowy utwardzacz. Cząsteczki o niskiej masie cząsteczkowej będą z czasem stopniowo dyfundować i gromadzić się na powierzchni. Ma to wpływ na właściwości topograficzne i mechaniczne powierzchni PDMS31. Dyfuzja nie jest znacząca w ciągu jednego tygodnia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Zszywanie form PDMS w dużą, pojedynczą formę
<ol>
	<li>Przygotuj wiele form PDMS, powtarzając Krok 1.4. 
	UWAGA: Za każdym razem waż tę samą ilość mieszaniny PDMS, aby uzyskać formy PDMS o tej samej grubości.</li>
	<li>Określ orientację anizotropowych nanowzorów PDMS, takich jak nanosiatki, pod mikroskopem optycznym i zaznacz ją na odwrocie form PDMS za pomocą markera. 
	UWAGA: Nie jest konieczne oznaczanie orientacji izotropowej nanotopografii, takiej jak nanofilary.</li>
	<li>Oczyść podłoże Si etanolem w dygestoriach i osusz je sprężonym powietrzem.</li>
	<li>Odetnij niewzorzyste obszary każdej formy PDMS za pomocą ostrza. 
	UWAGA: W przypadku form PDMS, które zostaną umieszczone na obrzeżach zszytej formy, należy odciąć tylko niewzorzyste obszary stykające się z innymi.</li>
	<li>Umieść przyciętą formę PDMS z nanowzorem skierowaną w dół po lustrzanej stronie podłoża Si, a następnie wyrównaj inne formy blisko, ale nie dotykając otaczających form.</li>
	<li>Przygotuj warstwę kleju PDMS
	<ol>
		<li>Odlać 1 g odgazowanego prepolimeru PDMS (stosunek żywicy PDMS do utwardzacza: 10:1,05) na czystym szkiełku podstawowym (7,5 cm × 2,5 cm), aby utworzyć warstwę o grubości 0,5 mm.</li>
		<li>Piecz warstwę PDMS w temperaturze 100 °C na płycie grzejnej przez 3-5 minut. Użyj igły, aby dotknąć warstwy i upewnić się, że warstwa jest częściowo, ale nie całkowicie, utwardzona. 
		UWAGA: Częściowo utwardzony PDMS nie może płynąć jak nieutwardzony prepolimer PDMS, ale jest lepki w porównaniu z utwardzonym PDMS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść warstwę PDMS na odwrocie wyrównanych form PDMS i szybko odwróć ten zespół i przenieś go na płytę grzejną.</li>
	<li>Zastosuj siłę ściskającą (5 kPa) za pomocą metalowego klocka na górze zespołu, aby zapewnić dobry kontakt między warstwą kleju PDMS a tylną stroną form PDMS i utwardź warstwę kleju PDMS w temperaturze 100 °C przez 1 godz. 
	UWAGA: Ostrożnie wyreguluj położenie metalowego bloku, aby uniknąć przechylenia zespołu.</li>
	<li>Usuń metalowy blok i oderwij pojedynczą, zszytą formę PDMS od podłoża Si.</li>
</ol>
3. Generowanie formy wzorcowej na podłożach PS
Uwaga: Zszywana forma PDMS unieruchomiona na szkiełku podstawowym może być wykorzystana do wygenerowania formy wzorcowej na płycie PS lub cienkiej folii PS, z której można wytworzyć robocze podłoża nanowzorzyste.
<ol>
	<li>Generowanie formy wzorcowej na płycie PS
	<ol>
		<li>Przygotuj płytę PS
		<ol>
			<li>Suszyć granulki PS w piecu próżniowym w temperaturze 80 °C przez dwa dni.</li>
			<li>Rozgrzej prasę w temperaturze 230 °C.</li>
			<li>Zamontuj aluminiową płytę, arkusz politetrafluoroetylenu (PTFE) i aluminiową przekładkę w kolejności od dołu do góry.</li>
			<li>Załaduj pellet 3,5 g PS do aluminiowej przekładki z kwadratowym otworem 3 cm (dł.) × 3 cm (szer.) × 0,3 cm (wys. 
			UWAGA: Przekładka jest o około 0,1 cm grubsza niż formy PDMS, a zatem końcowe nanowzorzyste podłoże PS ma grubość około 0,1 cm.</li>
			<li>Umieść kolejny arkusz PTFE, a następnie kolejną aluminiową płytkę na aluminiowej przekładce.</li>
			<li>Umieść zespół w prasie.</li>
			<li>Podgrzewaj granulki PS w temperaturze 230 °C przez 30 minut.</li>
			<li>Wywierać nacisk ściskający (0,1 MPa) na zespół przez 5 minut.</li>
			<li>Zwolnij ciśnienie, a następnie ponownie zastosuj ciśnienie ściskające 0,5 MPa na zespół.</li>
			<li>Powtórzyć krok 3.1.1.9 ze wzrostem ciśnienia o 0,5 MPa, aż do osiągnięcia pożądanego ciśnienia 1,5 MPa.</li>
			<li>Wyłączyć grzałkę prasy i schłodzić ją poniżej 70 °C przy stałym ciśnieniu 1,5 MPa.</li>
			<li>Wyjmij zespół i przechowuj płytkę PS w piecu próżniowym w temperaturze 80 °C, aby zapobiec ponownemu przedostawaniu się wilgoci do płyty PS.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Nanonadrukuj zszytą formę PDMS na płycie PS
		<ol>
			<li>Umieść płytkę PS w aluminiowym zestawie dystansowym na 3-calowym waflu Si. 
			UWAGA: Wewnętrzne wymiary podkładki dystansowej są takie same jak wymiary płyty PS, więc płytka PS pasuje bezpośrednio do podkładki dystansowej.</li>
			<li>Podgrzej płytę PS na płycie grzejnej w temperaturze 250 °C przez 30 minut.</li>
			<li>Połóż zszytą formę PDMS z nanowzorami zadrukowaną do dołu na stopionej płytce PS. 
			UWAGA: Jedna strona formy PDMS najpierw styka się z powierzchnią płyty PS, a druga strona jest stopniowo opuszczana w kontakcie z powierzchnią PS, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza na interfejsie. 
			Ostrzeżenie: Powierzchnia płyty grzejnej jest gorąca. Nosić rękawice termiczne podczas procesu nanoimprintingu.</li>
			<li>Umieść aluminiową płytkę na szklanym szkiełku zszytej formy PDMS.</li>
			<li>Zastosuj ciśnienie ściskające (12,5 kPa) za pomocą metalowych klocków na płycie aluminiowej i odczekaj 3 min. 
			UWAGA: Upewnij się, że aluminiowa płyta nie jest przechylona.</li>
			<li>Podnieś i wymień metalowy blok z aluminiowej płyty i zwiększ ciśnienie ściskania do 25 kPa.</li>
			<li>Powtórzyć krok 3.1.2.6 przy ciśnieniu zwiększonym do 50 kPa. 
			UWAGA: Ten krok ma na celu usunięcie powietrza uwięzionego między formą PDMS a płytą PS.</li>
			<li>Utrzymuj temperaturę płyty grzejnej między 240 a 250 °C pod stałym ciśnieniem 50 kPa przez 15 minut.</li>
			<li>Wyłącz płytę grzejną i ostudź całą konfigurację. 
			UWAGA: Wentylator może być użyty do przyspieszenia procesu chłodzenia.</li>
			<li>Usuń metalowe klocki, gdy temperatura spadnie poniżej 50 °C i ostrożnie oderwij zszytą formę PDMS od płyty PS. 
			UWAGA: Substrat PS ma odwrócone nanowzorce i może być używany jako forma wzorcowa do produkcji działających podłoży PDMS.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wygeneruj formę wzorcową na cienkiej folii PS
	<ol>
		<li>Przygotuj cienką folię PS
		<ol>
			<li>Rozpuścić 1 g PS w 10 ml toluenu pod wyciągiem. 
			Uwaga: Toluen może powodować podrażnienie skóry i poważne uszkodzenie oczu, a także może powodować uszkodzenie narządów poprzez długotrwałe lub powtarzające się narażenie. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej.</li>
			<li>Wirować 1 ml roztworu PS na 2-calowej płytce z prędkością 2,500 obr./min przez 1 minutę, aby utworzyć cienką warstwę PS o grubości ~1 μm.</li>
			<li>Odparuj toluen z folii, umieszczając folię PS na płytce Si w dygestoriach na 3 dni.</li>
			<li>Cienką warstwę PS wyżarzać w piecu próżniowym w temperaturze 80 °C przez noc.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Nanonadruk formy PDMS na cienkiej folii PS
		<ol>
			<li>Umieść zszytą formę PDMS z nanotopografią zadrukowaną do dołu na cienkiej folii PS, która jest ustawiona na płycie grzejnej.</li>
			<li>Zastosuj nacisk ściskający 12 kPa na formę PDMS za pomocą metalowych bloków po szklanej stronie formy PDMS.</li>
			<li>Zwiększyć temperaturę płyty grzejnej do 180 °C i utrzymywać ją przez 15 min. 
			Uwaga: Stopiony film PS może pełnić funkcję smaru. Zwróć uwagę, aby metalowe klocki nie zsuwały się.</li>
			<li>Wyłącz płytę grzejną i ostudź całą konfigurację. 
			UWAGA: Wentylator może być użyty do przyspieszenia procesu chłodzenia.</li>
			<li>Usuń metalowe klocki, gdy temperatura spadnie poniżej 50 °C i ostrożnie oderwij zszytą formę PDMS od folii PS. 
			UWAGA: Nanowzorzysta folia PS posłuży jako forma wzorcowa do produkcji działających podłoży PDMS.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Nanotopograficzna modulacja zachowania komórek
Uwaga: Ludzkie komórki nabłonkowe są hodowane na reprezentatywnych nanotopografiach w celu wykazania nanotopograficznej modulacji rozprzestrzeniania się komórek.
<ol>
	<li>Odlewane podłoża robocze PDMS z formy głównej wygenerowanej z kroku 3.1 lub 3.2, w zależności od zastosowania.</li>
	<li>Za pomocą wydrążonego stalowego stempla łukowego pokrój nanowzorzyste podłoża PDMS na krążki, aby pasowały do konfiguracji określonej płytki wielodołkowej (np. płytki 24-dołkowej).</li>
	<li>Użyj pęsety, aby umieścić krążki PDMS w dołkach płytki wielodołkowej.</li>
	<li>Sterylizuj podłoża PDMS przy użyciu 70% etanolu, a następnie ekspozycji na promieniowanie UV, każdy przez 30 minut.</li>
	<li>Umyj podłoża PDMS 1x sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) trzy razy.</li>
	<li>Pokryj substraty PDMS białkiem macierzy zewnątrzkomórkowej (tj. 20 μg/ml fibronektyny) przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przepłukać podłoża PDMS trzykrotnie sterylnym PBS, każdy przez 5 minut.</li>
	<li>Zawiesić ludzką komórkę raka płuc A549 w zmodyfikowanym pożywce orła firmy Dulbecco z 10% płodową surowicą bydlęcą i policzyć komórki za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>Na podłożach PDMS należy umieścić komórki o gęstości wysiewu 2 000 komórek/cm2 i hodować je w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5%CO2 przez jeden dzień.</li>
	<li>Umyj komórki trzykrotnie PBS.</li>
	<li>Utrwal komórki w mieszaninie 4% paraformaldehydu i 2% aldehydu glutarowego w PBS przez 4 godziny i odwodnij komórki za pomocą suszarki do punktu krytycznego CO2 do skanowania elektronicznej obserwacji mikroskopowej29, 
	Uwaga: Paraformaldehyd i aldehyd glutarowy mogą powodować poważne oparzenia skóry i uszkodzenie oczu. Pracuj w kapturze chemicznym i noś odpowiednie środki ochrony osobistej.</li>
</ol>

<ol><li>Silva, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+differentiation+of+neural+progenitor+cells+by+high-epitope+density+nanofibers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Selective differentiation of neural progenitor cells by high-epitope density nanofibers.</a> Science. 303 (5662), 1352-1355 (2004).</li>
<li>Yim, E. K. F., Pang, S. W., Leong, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+Nanostructures+Inducing+Differentiation+of+Human+Mesenchymal+Stem+Cells+into+Neuronal+Lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Synthetic Nanostructures Inducing Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Neuronal Lineage.</a> Exp. Cell Res. 313 (9), 1820-1829 (2007).</li>
<li>Dalby, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Control+of+Human+Mesenchymal+Cell+Differentiation+Using+Nanoscale+Symmetry+and+Disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">The Control of Human Mesenchymal Cell Differentiation Using Nanoscale Symmetry and Disorder.</a> Nat. Mater. 6 (12), 997-1003 (2007).</li>
<li>Oh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cell+Fate+Dictated+Solely+by+Altered+Nanotube+Dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Stem Cell Fate Dictated Solely by Altered Nanotube Dimension.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (7), 2130-2135 (2009).</li>
<li>Brunetti, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+Sense+Nanoscale+Roughness+with+Nanometer+Sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Neurons Sense Nanoscale Roughness with Nanometer Sensitivity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107 (14), 6264-6269 (2010).</li>
<li>McMurray, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+Surfaces+for+the+Long-term+Maintenance+of+Mesenchymal+Stem+Cell+Phenotype+and+Multipotency%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Nanoscale Surfaces for the Long-term Maintenance of Mesenchymal Stem Cell Phenotype and Multipotency.</a> Nat. Mater. 10 (8), 637-644 (2011).</li>
<li>Yim, E. K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanopattern-induced+changes+in+morphology+and+motility+of+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Nanopattern-induced changes in morphology and motility of smooth muscle cells.</a> Biomaterials. 26 (26), 5405-5413 (2005).</li>
<li>Gerecht, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Effect+of+Actin+Disrupting+Agents+on+Contact+Guidance+of+Human+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The Effect of Actin Disrupting Agents on Contact Guidance of Human Embryonic Stem Cells.</a> Biomaterials. 28 (28), 4068-4077 (2007).</li>
<li>Bettinger, C. J., Zhang, Z., Gerecht, S., Borenstein, J. T., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+in+vitro+Capillary+Tube+Formation+by+Substrate+Nanotopography%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Enhancement of in vitro Capillary Tube Formation by Substrate Nanotopography.</a> Adv. Mater. 20 (1), 99-103 (2008).</li>
<li>Thakar, R. G., Ho, F., Huang, N. F., Liepmann, D., Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+vascular+smooth+muscle+cells+by+micropatterning%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Regulation of vascular smooth muscle cells by micropatterning.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 307 (4), 883-890 (2003).</li>
<li>Lee, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+selective+neurons+on+nanoscale+ridge%2Fgroove+pattern+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Direct differentiation of human embryonic stem cells into selective neurons on nanoscale ridge/groove pattern arrays.</a> Biomaterials. 31 (15), 4360-4366 (2010).</li>
<li>Moe, A. A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+with+micro-+and+nano-topographies+enables+identification+of+the+optimal+topography+for+directing+the+differentiation+of+primary+murine+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Microarray with micro- and nano-topographies enables identification of the optimal topography for directing the differentiation of primary murine neural progenitor cells.</a> Small. 8 (19), 3050-3061 (2012).</li>
<li>Dang, J. M., Leong, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myogenic+induction+of+aligned+mesenchymal+stem+cell+sheets+by+culture+on+thermally+responsive+electrospun+nanofibers%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Myogenic induction of aligned mesenchymal stem cell sheets by culture on thermally responsive electrospun nanofibers.</a> Adv. Mater. 19 (19), 2775-2779 (2007).</li>
<li>Dasgupta, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+co-reduction+approach+to+vary+size+of+silver+nanoparticle%3A+its+microbial+and+cellular+toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Pollut.+Res%22%5BJournal%5D)">Thermal co-reduction approach to vary size of silver nanoparticle: its microbial and cellular toxicology.</a> Environ. Sci. Pollut. Res. 23 (5), 4149-4163 (2016).</li>
<li>Ranjan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microwave-irradiation-assisted+hybrid+chemical+approach+for+titanium+dioxide+nanoparticle+synthesis%3A+microbial+and+cytotoxicological+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Pollut.+Res%22%5BJournal%5D)">Microwave-irradiation-assisted hybrid chemical approach for titanium dioxide nanoparticle synthesis: microbial and cytotoxicological evaluation.</a> Environ. Sci. Pollut. Res. 23 (12), 12287-12302 (2016).</li>
<li>Deckman, H. W., Dunsmuir, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Natural lithography.</a> Appl. Phys. Lett. 41 (4), 377-379 (1982).</li>
<li>Dalby, M. J., Riehle, M. O., Johnstone, H., Affrossman, S., Curtis, A. S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+Reaction+of+Endothelial+Cells+to+Polymer+Demixed+Nanotopography%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">In vitro Reaction of Endothelial Cells to Polymer Demixed Nanotopography.</a> Biomaterials. 23 (14), 2945-2954 (2002).</li>
<li>Gates, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+approaches+to+nanofabrication%3A+molding%2C+printing%2C+and+other+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">New approaches to nanofabrication: molding, printing, and other techniques.</a> Chem. Rev. 105 (4), 1171-1196 (2005).</li>
<li>Yin, Y., Lu, Y., Gates, B., Xia, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Template-Assisted+Self-Assembly%3A+A+Practical+Route+to+Complex+Aggregates+of+Monodispersed+Colloids+with+Well-Defined+Sizes%2C+Shapes%2C+and+Structures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Template-Assisted Self-Assembly: A Practical Route to Complex Aggregates of Monodispersed Colloids with Well-Defined Sizes, Shapes, and Structures.</a> J. Am. Chem. Soc. 123 (36), 8718-8729 (2001).</li>
<li>Tada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+Self-Assembly+of+Diblock+Copolymer+Thin+Films+on+Chemically-Patterned+Substrates+for+Defect-Free+Nano-Patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Directed Self-Assembly of Diblock Copolymer Thin Films on Chemically-Patterned Substrates for Defect-Free Nano-Patterning.</a> Macromolecules. 41 (23), 9267-9276 (2008).</li>
<li>Cheng, J. Y., Rettner, C. T., Sanders, D. P., Kim, H. C., Hinsberg, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dense+self-assembly+on+sparse+chemical+patterns%3A+rectifying+and+multiplying+lithographic+patterns+using+block+copolymers%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Dense self-assembly on sparse chemical patterns: rectifying and multiplying lithographic patterns using block copolymers.</a> Adv. Mater. 20 (16), 3155-3158 (2008).</li>
<li>Colburn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Step+and+flash+imprint+lithography%3A+a+new+approach+to+high-resolution+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+SPIE%22%5BJournal%5D)">Step and flash imprint lithography: a new approach to high-resolution patterning.</a> Proc. SPIE. 3676 ((Pt. 1, Emerging Lithographic Technologies III)), 379-389 (1999).</li>
<li>Ahn, S. H., Guo, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+roll-to-roll+nanoimprint+lithography+on+flexible+plastic+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">High-speed roll-to-roll nanoimprint lithography on flexible plastic substrates.</a> Adv. Mater. 20 (11), 2044-2049 (2008).</li>
<li>Vieu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+beam+lithography%3A+resolution+limits+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Surf.+Sci%22%5BJournal%5D)">Electron beam lithography: resolution limits and applications.</a> Appl. Surf. Sci. 164, 111-117 (2000).</li>
<li>Nagase, T., Gamo, K., Kubota, T., Mashiko, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+fabrication+of+nano-gap+electrodes+by+focused+ion+beam+etching%5BTitle%5D)+AND+%22Thin+Solid+Films%22%5BJournal%5D)">Direct fabrication of nano-gap electrodes by focused ion beam etching.</a> Thin Solid Films. 499 (1-2), 279-284 (2006).</li>
<li>Juodkazis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+lithography+of+nanorods+in+SU-8+photoresist%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Two-photon lithography of nanorods in SU-8 photoresist.</a> Nanotechnology. 16 (6), 846(2005).</li>
<li>Yang, Y., Leong, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+surfacing+for+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip.+Rev.+Nanomed.+Nanobiotechnol%22%5BJournal%5D)">Nanoscale surfacing for regenerative medicine.</a> Wiley Interdiscip. Rev. Nanomed. Nanobiotechnol. 2 (5), 478-495 (2010).</li>
<li>Yang, Y., Kulangara, K., Sia, J., Wang, L., Leong, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+a+Microfluidic+Cell+Culture+Platform+Embedded+with+Nanoscale+Features%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Engineering of a Microfluidic Cell Culture Platform Embedded with Nanoscale Features.</a> Lab Chip. 11 (9), 1638-1646 (2011).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanotopographical+modulation+of+cell+function+through+nuclear+deformation%5BTitle%5D)+AND+%22Acs+Appl.+Mater.+Inter%22%5BJournal%5D)">Nanotopographical modulation of cell function through nuclear deformation.</a> Acs Appl. Mater. Inter. 8 (8), 5082-5092 (2016).</li>
<li>Lee, J. N., Park, C., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solvent+Compatibility+of+Poly%28dimethylsiloxane%29-Based+Microfluidic+Devices%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Solvent Compatibility of Poly(dimethylsiloxane)-Based Microfluidic Devices.</a> Anal. Chem. 75 (23), 6544-6554 (2003).</li>
<li>Yang, Y., Kulangara, K., Lam, R. T. S., Dharmawan, R., Leong, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Topographical+and+Mechanical+Property+Alterations+Induced+by+Oxygen+Plasma+Modification+on+Stem+Cell+Behavior%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Effects of Topographical and Mechanical Property Alterations Induced by Oxygen Plasma Modification on Stem Cell Behavior.</a> ACS Nano. 6 (10), 8591-8598 (2012).</li>
<li>Hua, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer+Imprint+Lithography+with+Molecular-Scale+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Polymer Imprint Lithography with Molecular-Scale Resolution.</a> Nano Lett. 4 (12), 2467-2471 (2004).</li>
<li>Delamarche, E., Schmid, H., Michel, B., Biebuyck, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+of+molded+polydimethylsiloxane+microstructures%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Stability of molded polydimethylsiloxane microstructures.</a> Adv. Mater. 9 (9), 741-746 (1997).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiamy prostą, niedrogą, a jednocześnie wszechstronną metodę generowania dużego obszaru podłoża o nanowzorze. Aby wiernie rozwinąć wysoce zdefiniowane nanowzorce, należy zwrócić dużą uwagę na kilka krytycznych kroków. Pierwszym z nich jest przycięcie wielu form PDMS. Niewzorzyste obszary form PDMS muszą zostać usunięte. Dodatkowo ścianki boczne form powinny być jak najbardziej idealnie przycięte w pionie, aby zminimalizować przerwy między formami. Łącznie można zmniejszyć część obszarów bez wzoru w końcowej formie...

A wiele ostatnich odkryć pokazuje, że nanotopografia substratów ma wyraźny wpływ na zachowanie komórek, od adhezji komórek, rozprzestrzeniania się i migracji, po proliferację i różnicowanie1-6. Na przykład mniejszy rozmiar komórek i niższy wskaźnik proliferacji zaobserwowano w komórkach hodowanych na głębokich nanosiatkach, co doprowadziło nawet do apoptozy, chociaż wyrównanie, wydłużenie i migracja komórek zostały wzmocnione w porównaniu z płaskimi kontrolami2,7-10. Co więcej, wykazano, że nanotopografia ułatwia różnicowanie komórek macierzystych w określone linie, takie jak neuron2,11,12, mięśnie13 i kość3,4. Ponadto ze względu na rosnące obawy dotyczące toksyczności nanomateriałów inżynieryjnych14,15 istnieje potrzeba włączenia nanotopografii do fizjologicznie istotnych modeli in vitro w celu dokładnej oceny ryzyka związanego z nanomateriałami. Aby przeprowadzić analizy biochemiczne i biologii molekularnej, potrzebna jest wystarczająca liczba komórek, które można wyhodować na dużym obszarze podłoża o nanowzorze. Jednak konwencjonalne techniki nanowytwarzania mają ograniczenia w generowaniu wysoce zdefiniowanych nanowzorów na dużym obszarze.
Samoorganizacja, w tym litografiakoloidalna16 i mieszaniepolimerów17, może łatwo generować nanostruktury o dużej powierzchni przy niskich kosztach. Ponieważ samoorganizacja opiera się na oddziaływaniach między elementami składającymi, takimi jak cząstki koloidalne i makrocząsteczki, oraz możliwych interakcjach między tymi pierwiastkami a substratem, nie może to być samodzielna metoda wytwarzania nanostruktur o precyzyjnym pozycjonowaniu przestrzennym i dowolnych kształtach18. Wadą jest również towarzyszące mu duże zagęszczenie wad. Precyzyjną kontrolę przestrzenną nanowzorów można osiągnąć poprzez zastosowanie szablonowej samoorganizacji, która wykorzystuje podejścia litograficzne odgórne w celu zapewnienia topograficznego i/lub chemicznego szablonu do kierowania oddolnym montażem elementów montażowych19-21. Opracowano alternatywne techniki nanowytwarzania, takie jak litografia krokowa i błyskawiczna22 oraz litografia nanoimprintingu typu roll-to-roll23, ale ich zastosowanie jest ograniczone ze względu na ich wyrafinowany proces lub wymóg specjalistycznego sprzętu. Niemniej jednak do szablonowych lub alternatywnych technik nanowytwarzania potrzebny jest szablon lub forma wzorcowa ze zdefiniowanymi wzorami w nanoskali. 
Takie szablony i wzorce są tradycyjnie generowane za pomocą litografii z użyciem skupionej wiązki elektronów, jonów lub fotonów. Na przykład litografia wiązką elektronów (EBL)24 i litografia skupionej wiązki jonów25 mogą generować zdefiniowane wzory o rozdzielczości poniżej 5 nm. Litografia dwufotonowa wykazała rozmiar obiektu wynoszący zaledwie 30 nm26. Chociaż techniki litografii wiązką skupioną umożliwiają generowanie dobrze zdefiniowanych struktur w nanoskali, inwestycje kapitałowe oraz czasochłonny i kosztowny proces ograniczają ich powszechne zastosowanie w badaniach akademickich27. W związku z tym wysoce pożądane jest opracowanie umożliwiających, a jednocześnie niedrogich technik wytwarzania dużego obszaru powierzchni z nanowzorami z wysoką dokładnością.
Opisaliśmy prostą, opłacalną technikę ściegu do generowania dużego obszaru powierzchni z nanowzorów z małej, dobrze zdefiniowanej formy28. Protokół ten zapewnia procedurę krok po kroku od replikacji form poli(dimetylosiloksanu) (PDMS) przy użyciu wzoru napisanego przez EBL, do montażu wielu form PDMS w jedną dużą formę, do wygenerowania formy wzorcowej na podłożach polimerowych, takich jak polistyren (PS), do produkcji podłoży roboczych. Za pomocą ekspandowanych substratów o nanowzorze zademonstrowaliśmy nanotopograficzną modulację rozprzestrzeniania się komórek.

<table><tbody><tr><td>Emisja pola JEOL SEM</td><td>JEOL</td><td>JSM-7600F</td><td></td></tr><tr><td>Parownik e-beam</td> EBL <td>Kurt J. Lesker</td><td>Model: Parownik e-beam LAB 18</td><td>osadzanie niklu</td></tr><tr><td>Trion Minilock III ICP/RIE</td><td>Trion technology</td><td>Model: Minilock-phantom III</td><td></td></tr><tr><td>Prasa</td><td>prasowa PHI</td> Prasa hydrauliczna <td>Forma: SQ-230H</td><td></td></tr><tr><td>Powlekarka wirowa</td><td>Laurell Technologie</td><td>Moduł: WS-400A-6NPP-LITE</td><td></td></tr><tr><td>Krytyczna suszarka CO2</td><td>Tousimis</td><td>Modle: Autosamdri-815</td><td></td></tr><tr><td>Wafel krzemowy</td><td>University Wafer</td><td>1080</td><td></td></tr><tr><td>Płyty aluminiowe</td><td>McMaster-carr</td><td>9057K123</td><td></td></tr><tr><td>Arkusze teflonowe</td><td>McMaster-carr</td><td>8711K92</td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petriego 100 mm</td><td>FALCON</td><td></td><td></td>353003</tr><tr><td>Szalka Petriego 60 mm</td><td>FALCON</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe szklane</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko szklane</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-34</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe łódki wagowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-735-743</td><td></td></tr><tr><td>Eksykator szklany</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-913-360</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowy eksykator</td><td>Bel-Art Products</td><td>F42025-000</td><td></td></tr><tr><td>Płyta grzejna</td><td>Fisher Scientific</td><td>1110049SH</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta</td><td>Ted Pella, inc.</td><td>5726</td><td></td></tr><tr><td>Blade</td><td>Fisher Scientific</td><td>S17302</td><td></td></tr><tr><td>Klocki metalowe</td><td>McMaster-carr</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Punch</td><td>Brettuns Village Leather Craft Supplies</td><td>Dziurkacz</td><td></td>łukowy</tr><tr><td>Poli(metakrylan metylu)</td><td>MicroChem</td><td>495 PMMA A4</td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184 zestaw</td><td></td></tr><tr><td>Polistyren</td><td>Dow Chemical</td><td>Styron 685D</td><td></td></tr><tr><td>1H,1H,2H,2H-perfluorooktylometylodichlorosilan</td><td>Oakwood Chemical</td><td>7142</td><td></td></tr><tr><td>Developer</td><td>MicroChem</td><td>MIBK/IPA w stosunku</td><td></td>1: 3</tr><tr><td>Remover</td><td>MicroChem</td><td>Remover PG</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818500</td><td></td></tr><tr><td>Toluen</td><td>Fisher Scientific</td><td>T324-500</td><td></td></tr><tr><td>Solanka solankowa buforowana fosforanami</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s zmodyfikowana pożywka orła</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauka</td><td>15712-S</td><td></td></tr><tr><td>Aldehyd glutarowy&nbsp;</td><td>Fisher Chemical</td><td>G151-1</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Corning</td><td>356008</td><td></td></tr><tr><td>A549 komórki</td><td>ATCC</td><td>ATCC CCL-185</td><td></td></tr></tbody></table>

ekspandowanie nanowzorzystych substratów przy użyciu techniki ściegu do nanotopograficznej modulacji zachowania komórek

Expanding Nanopatterned Substrates Using Stitch Technique for Nanotopographical Modulation of Cell Behavior

Wykazano, że nanotopografia substratów jest silnym modulatorem fenotypu i funkcji komórki. Aby przeanalizować modulację zachowania komórek w nanotopografii, pożądany jest duży obszar nanowzorzystego substratu, aby można było wyhodować wystarczającą liczbę komórek w nanotopografii do późniejszych analiz biochemicznych i biologii molekularnej. Jednak obecne techniki nanowytwarzania mają ograniczenia w generowaniu wysoce zdefiniowanych nanowzorów na dużym obszarze. W niniejszym artykule przedstawiamy metodę rozszerzania podłoży o nanowzorze z małego, wysoce zdefiniowanego nanowzoru na duży obszar przy użyciu techniki ściegu. Metoda łączy w sobie wiele technik, w tym miękką litografię w celu odtworzenia form poli(dimetylosiloksanu) (PDMS) z dobrze zdefiniowanej formy, technikę ściegu w celu złożenia wielu form PDMS w jedną dużą formę oraz nanoimprinting w celu wygenerowania formy wzorcowej na podłożach polistyrenowych (PS). Za pomocą formy głównej PS wytwarzamy podłoża robocze PDMS i demonstrujemy nanotopograficzną modulację rozprzestrzeniania się komórek. Metoda ta zapewnia prostą, przystępną cenowo, ale wszechstronną drogę do generowania dobrze zdefiniowanych nanowzorców na dużych obszarach i może zostać rozszerzona o tworzenie urządzeń w mikro/nanoskali z komponentami hybrydowymi.

Technika zszywania (stitch technique) pozwala na wytworzenie nanostrukturalnych podłoży o dużej powierzchni z wysoką wiernością odwzorowania. Rysunek 1a oraz 1b przedstawiają dużą powierzchnię nanowzorów przeniesionych z zszytej formy PDMS odpowiednio na płytkę PS oraz cienką warstwę PS na podłożu Si. Porównanie oryginalnej formy wykonanej metodą EBL (Rysunek 1c) i końcowego roboczego podłoża z PDMS (Rysunek 1d) potwierdz...

Przedstawiono protokół wytwarzania dużego obszaru nanowzorzystego podłoża z małych form o nanowzorze do badania nanotopograficznej modulacji zachowania komórek.

Ekspandowanie nanowzorzystych substratów przy użyciu techniki ściegu do nanotopograficznej modulacji zachowania komórek

Substrate nanotopography has been shown to be a potent modulator of cell phenotype and function. To dissect nanotopography modulation of cell behavior, a ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wytworzenie dużego obszaru nanostrukturalnego podłoża z niewielkich nanostrukturalnych form przy użyciu prostej i przystępnej cenowo, a jednocześnie wszechstronnej techniki łączenia (stitch technique). Metoda ta może pomóc w badaniu wpływu modulacji nanotopografii podłoża na fenotyp i funkcję komórek na poziomach komórkowym i molekularnym, np. w zakresie ekspresji białek adhezji ogniskowej. Główną zaletą tej techniki jest jej prostota oraz efektywność kosztowa.Na początek należy przygotować sylanizowaną formę krzemową w prepolimerze PDMS, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Umieść sylanizowaną formę krzemową w 60 mm szalce Petriego. Wlej prepolimer PDMS na formę krzemową w szalce Petriego.Umieść szalkę Petriego w plastikowym eksykatore i odgazowuj przez około 10 minut, aż znikną wszystkie pęcherzyki powietrza. Przenieś szalkę Petriego na płytkę grzejną i utwardz prepolimer PDMS w temperaturze 70 °C przez cztery godziny. Ostrożnie oddziel formę PDMS od formy silikonowej za pomocą pęsety.Określ orientację anizotropowych nanowzorów PDMS, takich jak nanokratki, pod mikroskopem optycznym i zaznacz ją markerem na tylnej stronie form z PDMS. Oczyść podłoże krzemowe etanolem w dygestorium, a następnie osusz je sprężonym powietrzem. Odetnij nieuformowane obszary każdej formy z PDMS za pomocą ostrza.Formy z PDMS powinny być ustawione jak najbliżej siebie, ale nie mogą dotykać sąsiednich form, aby zminimalizować obszary bez wzoru i uniknąć deformacji nanowzorów podczas przykładania siły kompresora. Umieść przyciętą formę z PDMS nanowzorem skierowanym w dół na lustrzanej stronie podłoża krzemowego, a następnie ustaw pozostałe formy blisko, lecz nie dotykając sąsiednich form. Krytyczne jest dopilnowanie utwardzenia PDMS w warstwie podstawowej, ponieważ nieutwardzony PDMS może wpłynąć przez szczeliny między formami i uszkodzić nanowzory.Jednakże całkowicie utwardzony PDMS nie może trwale łączyć ze sobą wielu form. Aby przygotować warstwę klejącą z PDMS, należy wylać jeden gram odgazowanego prepolimeru PDMS na czystą szkiełko przedmiotowe, tworząc warstwę o grubości 0,5 mm. Warstwę PDMS należy wypiekać w temperaturze 100 °C na płycie grzejnej przez od trzech do pięciu minut.Użyj igły, aby dotknąć warstwy i upewnić się, że jest ona częściowo, ale nie całkowicie utwardzona. Umieść warstwę PDMS na tylnej stronie wyrównanych form z PDMS, szybko odwróć ten zespół i przenieś go na płytkę grzewczą. Zastosuj siłę nacisku, kładąc metalowy blok na górze zespołu, aby zapewnić dobry kontakt między warstwą klejącą z PDMS a tylną stroną form z PDMS.Utwardzaj warstwę kleju PDMS w temperaturze 100 °C przez jedną godzinę. Wyłącz płytkę grzejną, wyjmij blok metalowy i odklej pojedynczo zszywaną formę PDMS od podłoża krzemowego. Aby wykonać nanoimprint zszywanej formy PDMS w płytce PS, umieść płytkę PS w aluminiowym dystansie ustawionym na trzycalowym waflu krzemowym.Nagrzej płytkę PS na płycie grzejnej w temperaturze 250 °C przez 30 minut. Następnie umieść zszywaną formę PDMS nanowzorami skierowanymi w dół na stopioną płytkę PS. Następnie połóż płytkę aluminiową na szkiełku podstawowym zszywanej formy PDMS.Wywrzyj nacisk kompresyjny, używając bloków metalowych na płycie aluminiowej, i odczekaj trzy minuty. Zdejmij blok metalowy z płyty aluminiowej, a następnie zwiększ nacisk kompresyjny do 25 kilopascals. Następnie powtórz ten krok, zwiększając nacisk do 50 kilopascals.Utrzymuj temperaturę płyty grzejnej w zakresie od 240 do 250 °C pod stałym ciśnieniem 50 kPa przez 15 minut. Wyłącz płytę grzejną i ostudź cały układ. Zdejmij bloki metalowe, gdy temperatura spadnie poniżej 50 °C, a następnie ostrożnie oddziel zszytą formę z PDMS od płytki PS.Aby wykonać nanoimprinting formy z PDMS na cienkiej warstwie PS, należy położyć zmontowaną formę z PDMS stroną z nanotopografią do dołu na cienkiej warstwie PS, która została umieszczona na płycie grzewczej. Za pomocą bloków metalowych na szkiełku podstawnym formy z PDMS należy przyłożyć nacisk kompresyjny rzędu 12 kilopascals. Następnie należy zwiększyć temperaturę płyty grzewczej do 180 degrees Celsius i utrzymać ją przez 15 minut.Wyłącz płytkę grzejną i wystudź cały układ. Po spadku temperatury poniżej 50 °C wyjmij bloki metalowe i ostrożnie oddziel zszyty odlew PDMS od folii PS. Za pomocą stalowego wycinaka łukowego wytnij z nanostrukturalnych podłoży PDMS krążki dopasowane do konfiguracji konkretnej płytki wielodołkowej.Następnie za pomocą pęsety umieść krążki PDMS w dołkach płytki wielodołkowej. Sterylizuj podłoża PDMS, stosując 70% ethanol przez 30 minut. Po tym czasie odessij ethanol, a następnie poddaj podłoża działaniu promieniowania UV przez 30 minut.Przemyj podłoża PDMS trzykrotnie 1X sterylnym roztworem soli fosforanowej w buforze (PBS). Następnie pokryj podłoża PDMS białkiem macierzy zewnątrzkomórkowej, inkubując przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Przepłucz podłoża PDMS trzykrotnie sterylnym PBS, płucząc za każdym razem przez pięć minut.Zawiesić ludzkie komórki raka płuca A549 w pożywce DMEM z dodatkiem 10% płodowej surowicy bydlęcej i policzyć komórki za pomocą hemocytometru. Wysiać komórki na podłoża PDMS z gęstością zasiewu 2 000 komórek na centymetr kwadratowy. Hodować komórki w temperaturze 37 °C w atmosferze z dodatkiem 5% dwutlenku węgla przez jeden dzień, a następnie przeprowadzić obserwację.Tutaj przedstawiono wygenerowany nanowzór na płytce PS oraz cienką warstwę. Strzałki wskazują wypukłości polimeru w szczelinach między połączonymi formami PDMS. Powyższe obrazy SEM wykazują, że podłoża robocze z PDMS są wiernie odwzorowane z nanowzoru naniesionego metodą litografii wiązką elektronów dzięki zastosowaniu techniki łączenia (stitch technique).Tutaj przedstawiono reprezentatywne obrazy SEM komórek A549 hodowanych na nanoprążkach oraz nanopilarach. Komórki wykazują wyrównaną morfologię na nanoprążkach, podczas gdy na nanopilarach rozprzestrzeniają się w sposób losowy. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak wytworzyć podłoże z nanoprzestrzenią o dużej powierzchni poprzez łączenie wielu małych, zdefiniowanych form z nanowzorami.Należy pamiętać, że praca z toluenem i paraformaldehydem może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania procedur należy zawsze stosować odpowiednie środki ochrony osobistej.

expanding-nanopatterned-substrates-using-stitch-technique-for

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Samoorganizujące się monowarstwy (SAMs) utworzone z długołańcuchowych alkanotioli na złocie stanowią precyzyjnie zdefiniowane podłoża do tworzenia wzorów białkowych oraz ograniczania przestrzeni wzrostu komórek. Mikro kontaktowy druk heksadekanotiolu przy użyciu stempla z polidimetylosiloksanu (PDMS), a następnie wypełnienie wolnych przestrzeni monomerem alkanotiolu zakończonym grupą glikolową, pozwala na uzyskanie wzoru, w którym białka i komórki adsorbują wyłącznie do obszaru z nadrukowanym...

Tworzenie dwuwymiarowych wzorowanych podłoży do ograniczania przestrzeni białek i komórek

Opisujemy techniki mikrotworzenia cienkich warstw nanoporowatego złota za pomocą druku szablonowego i fotolitografii, a także metody hodowli komórek na mikrofabrykowanych wzorach. Ponadto opisano metody analizy obrazu w celu scharakteryzowania morfologii materiału i hodowanych komórek przy użyciu technik skaningowej mikroskopii elektronowej i fluorescencyjnej.

Mikrofabrykacja nanoporowatych wzorów złota do badań interakcji komórka-materiał

Ten protokół opisuje metodę tworzenia wzorów komórkowych na SiO2 kompatybilną z mikrofabrykacją. Predefiniowany wzór parylenu-C jest drukowany fotolitograficznie na płytkach SiO2. Po inkubacji z surowicą (lub innym roztworem aktywacyjnym) komórki przylegają specyficznie (i rosną zgodnie z zgodnością) leżącego poniżej parylenu-C, będąc jednocześnie odpychane przez regiony SiO2.

Wzorcowanie komórek na zdefiniowanych fotolitograficznie 
Parylene-C: Substraty SiO2

Ten manuskrypt przedstawia technikę wywierania lub uwalniania sił na przylegające komórki lub tkanki za pomocą jednokierunkowego rozciągania.

Rozciąganie komórek z mikrowzorem na błonie PDMS

Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (hPSC) mają wrodzoną zdolność do różnicowania się i samoorganizacji w odrębne wzorce tkankowe; chociaż wymaga to prezentacji przestrzennych gradientów środowiskowych. Przedstawiamy mikrowzorce szablonowe jako prostą i solidną metodę generowania gradientów biochemicznych i mechanicznych w celu kontrolowania wzorców różnicowania hPSC.

Szablonowe mikrowzorce ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do badania przestrzennej organizacji losów różnicowania

Ten raport opisuje prostą, łatwą do wykonania technikę, wykorzystującą próżnię niskociśnieniową, do wypełniania kanałów mikroprzepływowych komórkami i substratami do badań biologicznych.

Wszechstronna metoda modelowania białek i komórek

Tutaj prezentujemy protokół wytwarzania gradientowych płytek nanowzorcowych za pomocą termicznego nanoimprintingu oraz metodę przesiewowego wykrywania odpowiedzi ludzkich komórek progenitorowych śródbłonka na nanostruktury. Dzięki zastosowaniu opisanej technologii możliwe jest wytworzenie rusztowania, które może manipulować zachowaniem komórki za pomocą bodźców fizycznych.

Wytwarzanie gradientowego nanowzoru za pomocą techniki nanoimprintingu termicznego i badanie przesiewowe odpowiedzi komórek tworzących kolonie śródbłonka

Ten protokół wprowadza metodę mikrowzorowania bez litografii, która jest prosta i dostępna dla osób z ograniczonym doświadczeniem w bioinżynierii. Metoda ta wykorzystuje spersonalizowane, wycinane laserowo szablony do mikromodelowania białek macierzy zewnątrzkomórkowej w kształcie interesującym do modulowania morfologii komórek. Procedura mikrowzorcowania została zademonstrowana przy użyciu indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych.

Proste, wolne od litografii mikromodelowanie pojedynczych komórek przy użyciu szablonów wycinanych laserowo

Przedstawiony tutaj protokół umożliwia zautomatyzowane wytwarzanie mikrowzorów, które standaryzują kształt komórki, do badania struktur cytoszkieletu w komórkach ssaków. Ta przyjazna dla użytkownika technika może być skonfigurowana z dostępnymi na rynku systemami obrazowania i nie wymaga specjalistycznego sprzętu niedostępnego dla standardowych laboratoriów biologii komórki.

Kontrola geometrii komórki za pomocą mikromodelowania wspomaganego laserem w podczerwieni

Opisujemy ulepszenia standardowej metody pomiaru sił trakcyjnych komórek, opartej na drukowaniu mikrokontaktowym z pojedynczym krokiem subtraktywnego tworzenia wzorów układów punktowych białek macierzy zewnątrzkomórkowej na miękkich hydrożelach. Metoda ta pozwala na prostsze i bardziej spójne wytwarzanie wzorów wyspowych, niezbędnych do kontrolowania kształtu klastrów komórek.

Generowanie wzorców dla mikroskopii trakcyjnej mikrowzorców

Tradycyjnie, hodowla komórkowa jest przeprowadzana na płaskich podłożach, które słabo naśladują naturalne środowisko komórek in vivo. W tym miejscu opisujemy metodę wytwarzania substratów do hodowli komórkowych o fizjologicznie istotnych zakrzywionych geometriach i mikrowzorach białek zewnątrzkomórkowych, co pozwala na systematyczne badania nad komórkowym wykrywaniem tych zewnątrzkomórkowych sygnałów.

Generowanie wielokierunkowych mikrośrodowisk komórkowych za pomocą fotomodelingu UV trójwymiarowych substratów do hodowli komórkowych

Naucz się tworzyć nanowzorzyste substraty metodą ściegu do badania modulacji zachowania komórek przez nanotopografię. Prosta i ekonomiczna technika umożliwia analizę fenotypu komórkowego oraz ekspresji białek adhezji.

Ekspandowanie nanowzorzystych substratów przy użyciu techniki ściegu do nanotopograficznej modulacji zachowania komórek

Przeglądaj więcej filmów