Ekspandowanie nanowzorzystych substratów przy użyciu techniki ściegu do nanotopograficznej modulacji zachowania komórek
8 grudnia 2016
Przedstawiono protokół wytwarzania dużego obszaru nanowzorzystego podłoża z małych form o nanowzorze do badania nanotopograficznej modulacji zachowania komórek.
Ogólnym celem tej procedury jest wyprodukowanie dużego obszaru nanowzorzystego podłoża z małych form o nanowzorze przy użyciu prostej i niedrogiej, ale wszechstronnej techniki ściegu. Metoda ta może pomóc w badaniu modulacji nanotopografii substratu fenotypu i funkcji komórki na poziomie komórkowym i molekularnym, takiej jak ekspresja ogniskowych białek adhezyjnych. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest prosta i opłacalna.
Na początek przygotuj silanizowaną formę krzemową w prepolimerze PDMS, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Umieść silanizowaną silikonową formę na 60-milimetrowej szalce Petriego. Wlej prepolimer PDMS na formę silikonową na szalce Petriego.
Umieść szalkę Petriego w plastikowym eksykatorze i odgazowuj przez około 10 minut, aż wszystkie pęcherzyki znikną. Przenieś szalkę Petriego na płytkę grzejną i utwardź prepolimer PDMS w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez cztery godziny. Ostrożnie oderwij formę PDMS od formy silikonowej za pomocą pęsety.
Określ orientację anizotropowych nanowzorów PDMS, takich jak nanosiatki, pod mikroskopem optycznym i zaznacz je na odwrocie form PDMS za pomocą markera. Oczyść podłoże silikonowe etanolem w dygestorium, a następnie osusz je sprężonym powietrzem. Odetnij niewzorzyste obszary każdej formy PDMS za pomocą ostrza.
Formy PDMS powinny być wyrównane tak blisko, jak to możliwe, ale nie dotykając otaczającej formy, aby zminimalizować obszar bez wzoru i uniknąć dotykania deformacji nanowzoru po przyłożeniu siły sprężarki. Umieść przyciętą formę PDMS z nanowzorem skierowaną w dół po lustrzanej stronie podłoża silikonowego, a następnie wyrównaj inne formy blisko, ale nie dotykając otaczających form. Bardzo ważne jest, aby spróbować utwardzić PDMS w warstwie podstawnej, ponieważ nieutwardzony PDMS może przepływać przez szczelinę między wieloma formami i uszkodzić nanowzorce.
Jednak całkowicie utwardzony PDMS nie może połączyć ze sobą wielu form. Aby przygotować warstwę kleju PDMS, odlej jeden gram odgazowanego prepolimeru PDMS na czyste szkiełko podstawowe, aby utworzyć warstwę o grubości 0,5 milimetra. Piecz warstwę PDMS w temperaturze 100 stopni Celsjusza na gorącej płycie przez trzy do pięciu minut.
Użyj igły, aby dotknąć warstwy i upewnij się, że warstwa jest częściowo, ale nie całkowicie, utwardzona. Umieść warstwę PDMS na odwrocie wyrównanych form PDMS, szybko odwróć ten zespół i przenieś go na płytę grzejną. Zastosuj siłę ściskającą za pomocą metalowego bloku na górze zespołu, aby zapewnić dobry kontakt między warstwą kleju PDMS a tylną stroną form PDMS.
Warstwę kleju PDMS utwardzać w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez godzinę. Wyłącz płytę grzejną, usuń metalowy blok i oderwij formę PDMS z pojedynczym szyciem od podłoża silikonowego. Aby naodcisknąć zszytą formę PDMS w płytce PS, umieść płytkę PS w aluminiowym zestawie dystansowym na trzycalowej płytce krzemowej.
Podgrzej płytkę PS na płycie grzejnej w temperaturze 250 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie umieść zszytą formę PDMS, z nanowzorami zadrukowanymi do dołu, na stopionej płytce PS. Następnie umieść aluminiową płytkę na szklanym szkiełku zszytej formy PDMS.
Zastosuj ściskający nacisk za pomocą metalowych klocków na aluminiowej płycie i odczekaj trzy minuty. Podnieś i wymień metalowy blok z aluminiowej płyty i zwiększ ciśnienie ściskania do 25 kilopaskalów. Następnie powtórz ten krok z naciskiem zwiększonym do 50 kilopaskalów.
Utrzymuj temperaturę płyty grzejnej w zakresie od 240 do 250 stopni Celsjusza pod stałym ciśnieniem 50 kilopaskali przez 15 minut. Wyłącz płytę grzejną i ostudź cały zestaw. Usuń metalowe klocki, gdy temperatura spadnie poniżej 50 stopni Celsjusza i ostrożnie oderwij zszytą formę PDMS od płyty PS.
Aby naodcisknąć formę PDMS na cienkiej folii PS, umieść zszytą formę PDMS z nanotopografią zadrukowaną do dołu na cienkiej folii PS, która jest ustawiona na płycie grzejnej. Zastosuj nacisk ściskający 12 kilopaskali na formę PDMS za pomocą metalowych bloków na szklanym szkiełku formy PDMS. Zwiększ temperaturę płyty grzejnej do 180 stopni Celsjusza i utrzymuj ją przez 15 minut.
Wyłącz płytę grzejną i ostudź cały zestaw. Usuń metalowe klocki, gdy temperatura spadnie poniżej 50 stopni Celsjusza i ostrożnie oderwij zszytą formę PDMS od folii PS. Za pomocą wydrążonego stalowego stempla łukowego pokrój nanowzorzyste podłoża PDMS na krążki, aby pasowały do konfiguracji określonej płytki wielodołkowej.
Następnie za pomocą pęsety umieść krążki PDMS w dołkach płytki wielodołkowej. Sterylizuj podłoża PDMS przy użyciu 70% etanolu przez 30 minut. Następnie odessać etanol, a następnie poddać go ekspozycji na promieniowanie UV przez 30 minut.
Umyj podłoża PDMS trzykrotnie sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami. Następnie pokryj podłoża PDMS białkiem macierzy zewnątrzkomórkowej przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Przepłukać podłoża PDMS trzy razy sterylnym PBS, każdy przez pięć minut.
Zawieś ludzkie komórki raka płuc A549 w zmodyfikowanym pożywce Eagle Medium firmy Dulbecco z 10% płodową surowicą bydlęcą i policz komórki za pomocą hemocytometru. Płytkie komórki z gęstością wysiewu 2 000 komórek na centymetr kwadratowy na podłożach PDMS. Hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% dwutlenku węgla przez jeden dzień, a następnie obserwuj je.
Wygenerowany nanowzór na płytce PS i cienkiej folii są pokazane tutaj. Strzałki wskazują podniesienie polimeru w szczelinach zszytych form PDMS. Te obrazy SEM pokazują, że podłoża pracujące z PDMS są wiernie przenoszone z nanowzoru zapisanego w litografii wiązką elektronów poprzez zastosowanie techniki ściegu.
Reprezentatywne obrazy SEM komórek A549 hodowanych na nanosiatkach i nanofilarach są pokazane tutaj. Komórki wykazują wyrównaną morfologię komórek na nanosiatkach, podczas gdy komórki rozprzestrzeniają się losowo na nanofilarach. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wygenerować duży obszar podłoża z nanowzorami poprzez zszywanie wielu małych, zdefiniowanych form o nanowzorze
.Nie zapominaj, że praca z toluenem i paraformaldehydem może być niezwykle niebezpieczna i zawsze noś odpowiedni sprzęt ochrony osobistej podczas wykonywania zabiegów.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł przedstawia protokół wytwarzania dużej powierzchni nanowzorcowej podłoża z małych nanowzorcowych foremek. Metoda koncentruje się na badaniu nanotopograficznej modulacji zachowania komórek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Zachowanie komórek
- Nanotopografia
- Inżynieria podłoża
Tło
- Nanowzorcowe podłoża wpływają na fenotyp i funkcję komórek.
- Białka adhezji ogniskowej są kluczowym elementem do zrozumienia interakcji komórek z powierzchniami.
- Obecne metody mogą być skomplikowane lub kosztowne.
- Potrzebna jest prosta i przystępna cenowo technika do szerszej aplikacji.
Cel badania
- Rozwój opłacalnej metody tworzenia dużych nanowzorcowych obszarów.
- Ułatwienie badań nad wpływem nanotopografii na zachowanie komórek.
- Poprawa rozumienia odpowiedzi komórkowych i molekularnych na zmiany podłoża.
Stosowane metody
- Przygotowanie silanowanej foremki krzemu.
- Zastosowanie prepolimeru PDMS do tworzenia podłoża.
- Zastosowanie techniki szycia do transferu wzorca.
- Wykorzystanie łyżeczek Petriego do umieszczania form.
Główne wyniki
- Udana produkcja dużych nanowzorcowych podłoży.
- Zdemonstrowana modulacja zachowania komórek na podstawie topografii podłoża.
- Podkreślenie prostoty i opłacalności metody.
- Podanie podstawy dla dalszych badań nad interakcjami komórka-podłoże.
Wnioski
- Przedstawiona metoda jest opłacalnym podejściem do tworzenia nanowzorcowych podłoży.
- Otwiera nowe drogi badań nad modulacja zachowania komórek.
- Przyszłe badania mogą wykorzystać tę technikę do zbadania różnych reakcji komórkowych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Generating large-area, well-defined nanopatterned substrates enables robust phenotypic screening and mechanistic de-risking in early discovery. This approach supports target validation by providing reproducible, scalable models to assess how nanotopography influences cell spreading, adhesion, and signaling—key phenotypes in oncology and fibrosis research. The method’s affordability and versatility allow integration into multi-well formats, facilitating cross-functional collaboration between bioengineering, assay development, and translational teams.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of how nanotopography modulates focal adhesion protein expression and cell morphology, supporting hypothesis testing in mechanotransduction pathways.
- Operational Value: Provides standardized, large-area substrates for consistent cell seeding and imaging across replicates.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces reproducible nanotopographical cues that can be used to screen compounds or genetic perturbations affecting cell adhesion and spreading.
- Operational Value: Compatible with multi-well plate formats, enabling high-throughput preparation of PDMS discs for standardized assay conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant modeling using cell lines like A549 to study how substrate topography influences cancer cell behavior, informing preclinical target confidence.
- Operational Value: Allows extrapolation from discovery to preclinical workflows via reusable, sterilizable PDMS working substrates.
Pipeline & Workflow Integration
The stitch technique bridges nanofabrication and cell-based assays, positioning nanopattern generation as an enabling capability in the discovery-to-preclinical continuum for mechanobiology-focused targets.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis-driven testing of how topographical cues alter cell phenotype, supporting pathway clarification in integrin and FAK signaling.
- Screening: Yields quantifiable, topography-modulated cell spreading metrics that serve as phenotypic readouts for compound or target modulation.
- Analytics: Enables measurement of cell alignment, spreading area, and morphology as outputs for comparing experimental conditions.
- Translational Research: Uses cancer cell models (e.g., A549) to link nanotopography to phenotypic responses with potential relevance to tumor microenvironment modeling.
- Enterprise Reuse: The PDMS mold stitching and nanoimprinting workflow is reusable across projects, reducing redundant nanofabrication efforts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing variability in nanotopographical inputs across experiments.
- Operational Value: Enables low-cost, in-house generation of large-area nanopatterns without reliance on specialized nanofab facilities.
- Strategic Value: Supports go/no-go decisions in target validation by providing mechanistic insights into how physical cues modulate cell behavior.
- Portfolio Impact: De-risks early-stage targets by clarifying whether observed phenotypes are target-dependent or influenced by substrate artifacts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in soft lithography, PDMS handling, and nanoimprinting techniques.
- Depends on access to hot plates, vacuum desiccators, metal blocks for compression, and optical/SEM imaging for mold alignment and validation.
- Necessitates standardization of mold trimming, alignment, and adhesive layer curing to prevent nanopattern deformation.
- Adaptation to different polystyrene formats (thin film vs. plate) requires pressure and temperature optimization.
- Practical limitations include alignment precision at mold edges and potential interstice artifacts if compressive force is uneven.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:38
Stitching of Poly(dimethylsiloxane) (PDMS) Molds into a Large, Single Mold
3:51
Generation of a Master Mold on Polystyrene (PS) Substrates
6:01
Nanotopographical Modulation of Cell Behavior
7:33
Results: Generated PS Nanopatterns and Nanotopography Modulation of Cell Morphology
8:26
Conclusion
