Ekspandowanie nanowzorzystych substratów przy użyciu techniki ściegu do nanotopograficznej modulacji zachowania komórek

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wytworzenie dużego obszaru nanostrukturalnego podłoża z niewielkich nanostrukturalnych form przy użyciu prostej i przystępnej cenowo, a jednocześnie wszechstronnej techniki łączenia (stitch technique). Metoda ta może pomóc w badaniu wpływu modulacji nanotopografii podłoża na fenotyp i funkcję komórek na poziomach komórkowym i molekularnym, np. w zakresie ekspresji białek adhezji ogniskowej. Główną zaletą tej techniki jest jej prostota oraz efektywność kosztowa.

Na początek należy przygotować sylanizowaną formę krzemową w prepolimerze PDMS, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Umieść sylanizowaną formę krzemową w 60 mm szalce Petriego. Wlej prepolimer PDMS na formę krzemową w szalce Petriego.

Umieść szalkę Petriego w plastikowym eksykatore i odgazowuj przez około 10 minut, aż znikną wszystkie pęcherzyki powietrza. Przenieś szalkę Petriego na płytkę grzejną i utwardz prepolimer PDMS w temperaturze 70 °C przez cztery godziny. Ostrożnie oddziel formę PDMS od formy silikonowej za pomocą pęsety.

Określ orientację anizotropowych nanowzorów PDMS, takich jak nanokratki, pod mikroskopem optycznym i zaznacz ją markerem na tylnej stronie form z PDMS. Oczyść podłoże krzemowe etanolem w dygestorium, a następnie osusz je sprężonym powietrzem. Odetnij nieuformowane obszary każdej formy z PDMS za pomocą ostrza.

Formy z PDMS powinny być ustawione jak najbliżej siebie, ale nie mogą dotykać sąsiednich form, aby zminimalizować obszary bez wzoru i uniknąć deformacji nanowzorów podczas przykładania siły kompresora. Umieść przyciętą formę z PDMS nanowzorem skierowanym w dół na lustrzanej stronie podłoża krzemowego, a następnie ustaw pozostałe formy blisko, lecz nie dotykając sąsiednich form. Krytyczne jest dopilnowanie utwardzenia PDMS w warstwie podstawowej, ponieważ nieutwardzony PDMS może wpłynąć przez szczeliny między formami i uszkodzić nanowzory.

Jednakże całkowicie utwardzony PDMS nie może trwale łączyć ze sobą wielu form. Aby przygotować warstwę klejącą z PDMS, należy wylać jeden gram odgazowanego prepolimeru PDMS na czystą szkiełko przedmiotowe, tworząc warstwę o grubości 0,5 mm. Warstwę PDMS należy wypiekać w temperaturze 100 °C na płycie grzejnej przez od trzech do pięciu minut.

Użyj igły, aby dotknąć warstwy i upewnić się, że jest ona częściowo, ale nie całkowicie utwardzona. Umieść warstwę PDMS na tylnej stronie wyrównanych form z PDMS, szybko odwróć ten zespół i przenieś go na płytkę grzewczą. Zastosuj siłę nacisku, kładąc metalowy blok na górze zespołu, aby zapewnić dobry kontakt między warstwą klejącą z PDMS a tylną stroną form z PDMS.

Utwardzaj warstwę kleju PDMS w temperaturze 100 °C przez jedną godzinę. Wyłącz płytkę grzejną, wyjmij blok metalowy i odklej pojedynczo zszywaną formę PDMS od podłoża krzemowego. Aby wykonać nanoimprint zszywanej formy PDMS w płytce PS, umieść płytkę PS w aluminiowym dystansie ustawionym na trzycalowym waflu krzemowym.

Nagrzej płytkę PS na płycie grzejnej w temperaturze 250 °C przez 30 minut. Następnie umieść zszywaną formę PDMS nanowzorami skierowanymi w dół na stopioną płytkę PS. Następnie połóż płytkę aluminiową na szkiełku podstawowym zszywanej formy PDMS.

Wywrzyj nacisk kompresyjny, używając bloków metalowych na płycie aluminiowej, i odczekaj trzy minuty. Zdejmij blok metalowy z płyty aluminiowej, a następnie zwiększ nacisk kompresyjny do 25 kilopascals. Następnie powtórz ten krok, zwiększając nacisk do 50 kilopascals.

Utrzymuj temperaturę płyty grzejnej w zakresie od 240 do 250 °C pod stałym ciśnieniem 50 kPa przez 15 minut. Wyłącz płytę grzejną i ostudź cały układ. Zdejmij bloki metalowe, gdy temperatura spadnie poniżej 50 °C, a następnie ostrożnie oddziel zszytą formę z PDMS od płytki PS.

Aby wykonać nanoimprinting formy z PDMS na cienkiej warstwie PS, należy położyć zmontowaną formę z PDMS stroną z nanotopografią do dołu na cienkiej warstwie PS, która została umieszczona na płycie grzewczej. Za pomocą bloków metalowych na szkiełku podstawnym formy z PDMS należy przyłożyć nacisk kompresyjny rzędu 12 kilopascals. Następnie należy zwiększyć temperaturę płyty grzewczej do 180 degrees Celsius i utrzymać ją przez 15 minut.

Wyłącz płytkę grzejną i wystudź cały układ. Po spadku temperatury poniżej 50 °C wyjmij bloki metalowe i ostrożnie oddziel zszyty odlew PDMS od folii PS. Za pomocą stalowego wycinaka łukowego wytnij z nanostrukturalnych podłoży PDMS krążki dopasowane do konfiguracji konkretnej płytki wielodołkowej.

Następnie za pomocą pęsety umieść krążki PDMS w dołkach płytki wielodołkowej. Sterylizuj podłoża PDMS, stosując 70% ethanol przez 30 minut. Po tym czasie odessij ethanol, a następnie poddaj podłoża działaniu promieniowania UV przez 30 minut.

Przemyj podłoża PDMS trzykrotnie 1X sterylnym roztworem soli fosforanowej w buforze (PBS). Następnie pokryj podłoża PDMS białkiem macierzy zewnątrzkomórkowej, inkubując przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Przepłucz podłoża PDMS trzykrotnie sterylnym PBS, płucząc za każdym razem przez pięć minut.

Zawiesić ludzkie komórki raka płuca A549 w pożywce DMEM z dodatkiem 10% płodowej surowicy bydlęcej i policzyć komórki za pomocą hemocytometru. Wysiać komórki na podłoża PDMS z gęstością zasiewu 2 000 komórek na centymetr kwadratowy. Hodować komórki w temperaturze 37 °C w atmosferze z dodatkiem 5% dwutlenku węgla przez jeden dzień, a następnie przeprowadzić obserwację.

Tutaj przedstawiono wygenerowany nanowzór na płytce PS oraz cienką warstwę. Strzałki wskazują wypukłości polimeru w szczelinach między połączonymi formami PDMS. Powyższe obrazy SEM wykazują, że podłoża robocze z PDMS są wiernie odwzorowane z nanowzoru naniesionego metodą litografii wiązką elektronów dzięki zastosowaniu techniki łączenia (stitch technique).

Tutaj przedstawiono reprezentatywne obrazy SEM komórek A549 hodowanych na nanoprążkach oraz nanopilarach. Komórki wykazują wyrównaną morfologię na nanoprążkach, podczas gdy na nanopilarach rozprzestrzeniają się w sposób losowy. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak wytworzyć podłoże z nanoprzestrzenią o dużej powierzchni poprzez łączenie wielu małych, zdefiniowanych form z nanowzorami.

Należy pamiętać, że praca z toluenem i paraformaldehydem może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania procedur należy zawsze stosować odpowiednie środki ochrony osobistej.