Obserwacja i kwantyfikacja zachowań godowych nicieni sosnówki, Bursaphelenchus xylophilus

Ogólnym celem tej procedury jest obserwacja zachowań godowych nicienia sosnowego, Bursaphelenchus xylophilus. Ta metoda może pomóc w postępie badań psychologicznych nicieni. W szczególności zajmuje się obserwacją zachowań godowych nicienia sosnowego.

Główną zaletą tej techniki jest to, że można uzyskać dziewicze dorosłe osobniki, co znacznie ułatwia obserwację zachowań godowych dorosłych. Implikacje tej techniki rozciągają się wyłącznie w kierunku szerszego badania nicieni, ponieważ mają one podobne zachowania w cyklach życiowych. Demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ nabycie dziewiczych dorosłych nicieni jest trudne, ponieważ ograniczenia rozwojowe nicieni wymagają praktyki i nie jest łatwo dokładnie odróżnić samce od samic u młodych osobników we wczesnym pierwszym stadium.

Aby hodować nicienie sosnowe, najpierw przygotuj talerze agarowe z dekstrozą ziemniaczaną. Aby zaszczepić płytkę, należy przebić kawałek maty grzybowej o średnicy 10 milimetrów z maty betritus senaria i umieścić go na środku nowej płytki PDA. Hoduj matę grzybową przez pięć dni w temperaturze 25 stopni Celsjusza w ciemności.

Po pięciu dniach dodaj nicienie sosnowe do przygotowanej szalki Petriego i hoduj je przez trzy dni w temperaturze 25 stopni Celsjusza w ciemności. Aby odizolować nicienie od grzyba, najpierw przygotuj narzędzie do zbierania. Umieść zaciśniętą gumową rurkę pod lejkiem i przytrzymaj przygotowany lejek w stojaku, aby zmontować aparat lejkowy Baermann.

Następnie umieść dwie warstwy bibuły filtracyjnej zamiast gazy w otworze lejka. Teraz przenieś kultury grzybów do lejka i dodaj wodę, aż mata grzybowa zostanie zanurzona. Po dwóch godzinach nicienie wyjdą z kultury grzybów, przejdą przez bibułę filtracyjną i osiądą w najniższej części lejka Baermanna.

Zbierz nicienie, umieszczając 15-mililitrową rurkę pod lejkiem, a następnie powoli zwalniając zacisk, aby zebrać kilka kropli wody, która będzie zawierać nicienie. Odwirować zbieranie nicieni w temperaturze 3 000 G przez dwie minuty w temperaturze pokojowej. Następnie należy przeprowadzić asparację górnego poziomu wody i ponownie zawiesić robaki w jednym mililitrze wody.

Przenieś zawiesinę nicieni do sześciocentymetrowego szklanego naczynia i dodaj trzy mililitry wody, aby pomóc nicieniom swobodnie pływać. Teraz zbieraj jajka, aby zrobić dziewicze zapasy. Przenieś naczynie do ciemnego inkubatora i pozwól ciężarnym samicom złożyć jaja przez 10 minut.

Ze względu na powierzchnię glikoproteiny jaja przyklejają się do szkła. Następnie ostrożnie usuń wodę z robakami, aby nie naruszyć jajek przyklejonych do naczynia. Następnie szybko dodaj z powrotem 3 mililitry wody do naczynia, aby jajka nie wysychały.

Powtórz ten proces czyszczenia jaj co najmniej trzy razy, aby usunąć wszystkie larwy i dorosłe osobniki i uzyskać czyste jaja. Do umytej czystej kolekcji jaj dodaj pięć mililitrów wody i kontynuuj rozwijanie jaj w ciemności w temperaturze 25 stopni Celsjusza. 24 godziny po rozpoczęciu hodowli jaj należy zebrać wyklute larwy J2.

Ostrożnie przenieś larwy J2 do 15-mililitrowej probówki. Następnie odwirować zbiór o stężeniu 3 000 G przez dwie minuty. Asparuj górną warstwę wody i dodaj z powrotem 200 mikrolitrów wody.

Następnie hoduj larwy J2 na płytce PDA przygotowanej z maty grzybów. Po 52 godzinach większość larw J2 rozwinie się we wczesne stadium larwy J4. Złóż lejek Baermanna i ekstrahuj nicienie z kultur grzybów przez dwie godziny, jak opisano wcześniej.

Czekając, przygotuj igłę do zbierania robaków. Narysuj końcówkę ze szklanej kapilary podgrzanej nad palnikiem alkoholowym. Końcówka musi mieć średnicę około 50 mikronów, czyli mniej więcej szerokość ciała dorosłego nicienia.

Po dwóch godzinach przenieś larwy J4 na czystą szalkę Petriego, jak opisano wcześniej. Teraz seksuj z nicieniami pod mikroskopem stereoskopowym. Około dwie trzecie larw to zwykle samice.

Srom samicy różni się oczywiście od anatomii samca, ale ponieważ robaki są bardzo aktywne, seksowanie będzie wymagało praktyki. Najważniejszym krokiem w tym protokole jest precyzyjne odróżnienie i oddzielenie samców od samic we wczesnym pierwszym stadium. W przeciwnym razie będą mieszane i złe, gdy staną się dorosłe.

A to utrudnia obserwację krycia. Stopniowo zbieraj i przenoś robaki do kropli wody na zjeżdżalni dla samców lub samic. Aby zapewnić sukces, dwie różne osoby powinny dokładnie sprawdzić przydział płci.

Teraz przenieś kroplę wody zawierającą seksowane robaki na odpowiednią płytkę do hodowli grzybów. Następnie hoduj dziewice przez kolejne 24 godziny, zanim zbadasz ich zachowania godowe. Aby zaobserwować zachowanie godowe nicieni sosnowych, najpierw przygotuj kilka wklęsłych szkiełek, dodając 200 mikrolitrów wody do każdej z ich studni.

Następnie wybierz pojedynczego przygotowanego dziewiczego dorosłego osobnika i przenieś go na przygotowany szkiełko. Trzymaj dziewicze dorosłe osobniki w studni przez godzinę, aby mogły przystosować się do nowego środowiska wodnego. Po godzinie dodaj do studzienki pojedynczą dziewiczą osobę dorosłą płci przeciwnej za pomocą pipety.

Następnie obserwuj zachowanie godowe pod mikroskopem stereoskopowym i sfilmuj zachowanie do analizy ilościowej. Cały proces krycia kończy się zwykle w ciągu dwóch godzin. Co 30 minut dodawaj 50 mikrolitrów wody, aby skompensować parowanie.

Aby zbadać wybór krycia i konkurencję międzypłciową, grupuj i obserwuj dziewicze nicienie w dwóch różnych kombinacjach. Wskaźnik sukcesu kryjnego dziewiczych dorosłych osobników wynosił około 87%, co było znacznie wyższe niż w przypadku losowo wybranych dorosłych. Pary potrzebowały średnio 83 minut, aby ukończyć cały proces krycia, który składa się z czterech różnych faz.

Szukanie, kontaktowanie się, kopulacja i przebywanie. W ramach tych faz można zaobserwować wiele specyficznych wzorców zachowań. Kiedy jedna samica spotkała kilka samców, wybór krycia był oczywisty.

Samica zwykle używa głowy do kontaktu z jednym samcem, zwykle w głowę, tułów, ogon i okolice narządów płciowych. Samica następnie kopulowała z samcem lub szybko go opuściła i podpłynęła do innego samca. Wskaźniki udanego krycia mierzono po pierwszym kontakcie dla różnych kombinacji nicieni.

Pojawiła się również rywalizacja międzypłciowa. Kiedy jedna dziewicza samica została zmieszana z trzema dziewiczymi samcami, samce starały się zbliżyć i skontaktować z samicą tak bardzo, jak to możliwe, aby mieć szansę na krycie z nią. Kiedy srom był zajęty, inne samce próbowały zakłócić proces godowy za pomocą gwałtownych zamachów ciała lub ciągnięcia, aby je rozdzielić.

Stwierdzono, że kobieca konkurencja interseksualna jest mniej więcej podobna do męskiej konkurencji interseksualnej. Ze względu na konkurencję międzypłciową, częstotliwości kopulacji z różnymi kombinacjami były znacznie różne. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę do eksploracji ekologii behawioralnej u nicieni.

Po opanowaniu tej procedury można ją wykonać w ciągu 12 dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując tej procedury, należy pamiętać o dokładnym oddzieleniu samców od samic, wczesnych czterech młodych osobników, aby uzyskać dziewicze dorosłe osobniki.