Name: Obserwacja i kwantyfikacja zachowań godowych nicieni sosnówki, Bursaphelenchus xylophilus (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: Poznaj metodę obserwacji zachowań godowych nicieni sosnówki Bursaphelenchus xylophilus przy użyciu dziewiczych osobników dorosłych. Technika ta ułatwia badania behawioralne i ekologiczne w nawet.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Najie Zhu i Liqun Bai w równym stopniu przyczynili się do tej pracy. Prace te były wspierane finansowo przez Specjalny Fundusz Badań Naukowych w Leśnictwie w Dziedzinie Opieki Społecznej (201204501) oraz Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (31170604, 31270688 i 31570638). Dziękujemy dr Holighaus Gerrit i dr Danielle Hickford za ich pomocne sugestie dotyczące pisania w języku angielskim.

1. Pozyskiwanie dziewiczych dorosłych nicieni
<ol>
	<li>Izolat nicieni sosnowych i warunki hodowli 
	UWAGA: Izolat B. xylophilus Nxy61 został pierwotnie wyekstrahowany z chorego Pinus massoniana w rejonie Ningbo w prowincji Zhejiang w Chinach.
	<ol>
		<li>Przygotuj talerze z agarem z dekstrozą ziemniaczaną (PDA, patrz tabela materiałów) do uprawy Botrytis cinerea. </li>
		<li>W celu zaszczepienia należy wybić kawałek maty przeciwgrzybiczej o średnicy 10 mm z maty B. cinerea i umieścić go na środku nowej płytki PDA. Hodowla B. cinerea przez 5 dni w temperaturze 25 °C w ciemności.</li>
		<li>Hodowlę nicieni sosnowych na przygotowanej szalce Petriego zawierającej B. cinerea w temperaturze 25 °C w ciemności.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pozyskiwanie jaj B. xylophilus
	<ol>
		<li>Umieść zaciśniętą gumową rurkę pod lejkiem i przytrzymaj przygotowany lejek w stojaku, aby zmontować aparat lejkowy Baermann. Umieść dwie warstwy bibuły filtracyjnej zamiast gazy w otworze lejka.</li>
		<li>Przenieś kultury grzybów do lejka i dodaj wodę, aż mata grzybowa zostanie zanurzona. Odczekaj 2 godziny, a nicienie wyjdą z kultury grzybów, przetną bibułę filtracyjną i osiądą w najniższej części lejka Baermanna.</li>
		<li>Zbierz kilka pierwszych kropli wody z dna probówki do probówki o pojemności 15 ml i zbierz nicienie, powoli zwalniając zacisk na probówce.</li>
		<li>Odwirować powyższe zbiory w temperaturze 3 000 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Usunąć górną warstwę wody za pomocą pipety i ponownie zawiesić ją z 1 ml sterylnego podwójnie destylowanego (dd)H2O.</li>
		<li>Za pomocą pipety przenieść powyższą zawiesinę na nową szklaną szalkę Petriego (o średnicy 6 cm). Dodać 3 ml sterylnego ddH2Odo szalki Petriego, aby upewnić się, że nicienie są w stanie swobodnie pływać.</li>
		<li>Nicienie należy przechowywać w szklanej szalce Petriego przez 10 minut w temperaturze 25 °C w ciemności. Jaja będą składane przez ciężarne samice. Ze względu na powierzchnię glikoproteiny jaja będą przyklejać się do dna szklanej szalki Petriego.</li>
		<li>Ostrożnie usuń wodę i robaki, nie naruszając jaj. Natychmiast dodać 3 ml sterylnego ddH2Odo szklanej szalki Petriego, aby zapobiec wysychaniu jaj.</li>
		<li>Powtórz krok 1.2.8 3x, aby usunąć wszystkie larwy i dorosłe osobniki i uzyskać czyste jaja. Dodać dodatkowe 2 ml (łącznie 5 ml) sterylnego ddH2Odo szalki Petriego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pozyskiwanie młodocianych osobników czwartego stadium (larwy J4)
	<ol>
		<li>Zebrane jaja wykluwać się przez 24 godziny w ciemności w temperaturze 25 °C w celu uzyskania larw J2.</li>
		<li>Przenieść larwy J2 za pomocą pipety do probówki o pojemności 15 ml, odwirować przy 3 000 x g przez 2 minuty i usunąć górną warstwę wody.</li>
		<li>Zawiesić larwy J2 w 200 μl sterylnegodd H2O, a następnie przenieść je na płytkę PDA zawierającą B. cinerea.</li>
		<li>Hodowlę larw J2 należy prowadzić przez 52 godziny w temperaturze 25 °C w ciemności. W tym momencie większość larw J2 rozwinie się we wczesnym stadium larw J4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pozyskiwanie dziewiczych dorosłych nicieni
	<ol>
		<li>Przygotuj igłę do zbierania nicieni, rysując szklaną kapilarnę po podgrzaniu jej nad palnikiem alkoholowym. 
		UWAGA: Końcówka tej igły kapilarnej zwykle musi mieć średnicę 50 μm, czyli mniej więcej szerokość ciała dorosłego nicienia, aby można ją było wykorzystać jako narzędzie do wyłapywania pojedynczego nicienia.</li>
		<li>Złożyć lejek Baermanna i ekstrahować nicienie z kultur grzybów przez 2 godziny, jak opisano w krokach 1.2.1 - 1.2.3.</li>
		<li>Przenieś J4 z wodą na czystą szalkę Petriego.</li>
		<li>Obserwuj nicienie pod mikroskopem stereoskopowym i rozróżnij samce i samice na podstawie morfologii narządów płciowych, jak opisali Mamiya i Kiyohara8 (ryc. 1). Za pomocą przygotowanej igły kapilarnej należy pobrać nicienie o pożądanej płci i przenieść je na odpowiednią płytkę do hodowli grzybów dla samców lub samic. 
		UWAGA: Jest więcej kobiet niż mężczyzn, przy czym odsetek kobiet wynosi 60 - 70%. Żeński srom różni się oczywiście od męskiej spicule. W porównaniu z dorosłym, spikula lub srom we wczesnym stadium J4 są mniejsze, ale nadal można je łatwo zobaczyć i odróżnić. Nicienie zawsze poruszają się w wodzie, co czasami zwiększa trudność w odróżnieniu samców i samic.</li>
		<li>Hodowlę larw J4 należy prowadzić przez kolejne 24 godziny w temperaturze 25 °C w ciemności. 
		UWAGA: Wszystkie nicienie powinny rozwinąć się w dorosłe osobniki, ale ponieważ nie są kojarzone, uważa się je za dziewicze dorosłe osobniki.</li>
		<li>Zebrać dwa lejki Baermanna i ekstrahować dziewicze dorosłe osobniki z kultur grzybów przez 2 godziny, jak opisano w krokach 1.2.1 - 1.2.3, a następnie przenieść dziewicze dorosłe samce i samice na dwie oddzielne, czyste szalki Petriego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Obserwacja i nagrywanie wideo zachowań godowych
<ol>
	<li>Przygotować kilka wklęsłych szkiełek i dodać 200 μl sterylnegodd H 2O do każdego z ich studzienek.</li>
	<li>Podnieś przygotowanego dziewiczego dorosłego samca lub samicę za pomocą igły kapilarnej i włóż tylko jednego nicienia do wody z każdej wklęsłej szkiełka.</li>
	<li>Trzymaj dziewicze dorosłe osobniki w studni przez 1 godzinę, aby mogły przystosować się do nowego środowiska wodnego.</li>
	<li>Połącz dziewiczego samca i samicę, przenosząc jednego z nich z jednego dołka do drugiego za pomocą pipety.</li>
	<li>Obserwuj zachowanie łączeniowe kombinacji 1♀ + 1♂ na wklęsłym szkiełku pod mikroskopem stereoskopowym.</li>
	<li>Aby przeanalizować skuteczność krycia dziewiczych dorosłych osobników, oblicz ich wskaźnik sukcesu krycia (R) i porównaj go z losowo wybranymi dorosłymi parami. Obliczyć R jako odsetek kontrprób, w których zaobserwowano kopulację, w porównaniu z całkowitą liczbą badanych kontrprób.</li>
	<li>Aby zbadać wybór krycia i konkurencję wewnątrzpłciową, grupuj i obserwuj dziewicze nicienie w dwóch różnych kombinacjach: 1♀ + 3♂ i 3♀ + 1♂.</li>
	<li>Aby zebrać dane do analizy jakościowej i ilościowej, sfilmuj zachowanie godowe za pomocą mikroskopii wideo. Zwykle cały proces krycia, od momentu umieszczenia nicieni w studzience wklęsłego zjeżdżalni do momentu, gdy oddalają się po kopulacji, kończy się w ciągu 2 godzin. W związku z tym należy rejestrować proces krycia w sposób ciągły przez co najmniej 2 godziny jako jedną kontrpróbę. Ukończ co najmniej 30 powtórzeń dla każdej kombinacji. 
	UWAGA: Co 0,5 godziny dodawać do studzienki więcej sterylnegodd H 2O (zwykle 50 μL), aby skompensować parowanie podczas procesu nagrywania.</li>
</ol>
3. Zbieranie danych
<ol>
	<li>Uważnie obejrzyj wszystkie filmy na ekranie komputera i scharakteryzuj jakościowo podzachowania.</li>
	<li>Zmierz czas krycia za pomocą funkcji klatka po klatce magnetowidu. Ręcznie odejmij czas rozpoczęcia od punktu końcowego.</li>
	<li>W przypadku kombinacji 1♀ + 1♂ przeanalizuj każde nagranie wideo i zmierz czas trwania następujących zdarzeń:
	<ol>
		<li>Zmierz czas trwania poszukiwań (tj. czas od momentu, w którym samica i samiec zostają wprowadzeni do studni wklęsłej zjeżdżalni, do momentu, w którym spotykają się i stykają ze sobą).</li>
		<li>Zmierz czas kontaktu (tj. czas od pierwszego kontaktu do momentu, w którym samiec jest precyzyjnie ustawiony na sromie samicy do pierwszej kopulacji).</li>
		<li>Zmierz czas trwania kopulacji (tj. czas od momentu, gdy samiec jest precyzyjnie umieszczony na sromie samicy, aż zsuwa się z ciała samicy po wytrysku). Uwaga: Niektóre nicienie mogą kopulować kilka razy w ciągu 2 godzin. W takich przypadkach należy zmierzyć czas trwania kopulacji od pierwszej kopulacji do końca ostatniej, w tym czas pomiędzy.</li>
		<li>Zmierz czas trwania utrzymywania się (tj. okres po kopulacji, aż do momentu, gdy samiec i samica oddalają się od siebie i są oddzielone odległością większą niż długość ciała nicieni (zwykle 1 mm)).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Policz częstotliwość i czas trwania każdej kopulacji oraz średni czas trwania wszystkich kopulacji w ciągu 2 godzin dla każdej z różnych kombinacji (tj. 1♀ + 1♂, 3♀ + 1♂ i 1♀ + 3♂).</li>
	<li>Oblicz wskaźnik powodzenia krycia dla pierwszego kontaktu (P) dla różnych kombinacji jako wskaźnik powodzenia krycia po pierwszym kontakcie, który jest przeprowadzany natychmiast i bez żadnej przerwy. W fazie kontaktu można zaobserwować kilka kontaktów przed właściwą kopulacją.
	<ol>
		<li>Gdy odległość między dwiema osobami jest większa niż długość ciała, uznaj, że jeden kontakt się skończył. Dla jednej kontrpróby należy zapisać P jako 100%, gdy kopulację obserwuje się bezpośrednio po pierwszym kontakcie, bez przerwy, lub 0,00%, jeśli nie zaobserwowano kopulacji lub jeśli kopulacja miała miejsce, ale po dwóch lub więcej kontaktach. 
		UWAGA: Dla każdej opisanej tutaj kombinacji przypadło 30 powtórzeń.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Tokushige, Y., Kiyohara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bursaphelenchus+sp.+in+the+wood+of+dead+pine+trees%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Jap.+For.+Soc%22%5BJournal%5D)">Bursaphelenchus sp. in the wood of dead pine trees.</a> J. Jap. For. Soc. 51, 193-195 (1969).</li>
<li>Sun, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bursaphelenchus+xylophilus+was+discovered+in+Sun+Yet-sen%27s+mausoleum+in+Nanjing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Jiangsu+Fore.+Sci.+Tech.+%28in+Chinese%29%22%5BJournal%5D)">Bursaphelenchus xylophilus was discovered in Sun Yet-sen's mausoleum in Nanjing.</a> J. Jiangsu Fore. Sci. Tech. (in Chinese). 4, 47(1982).</li>
<li>Mota, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+report+of+Bursaphelenchus+xylophilus+in+Portugal+and+in+Europe%5BTitle%5D)+AND+%22Nematology%22%5BJournal%5D)">First report of Bursaphelenchus xylophilus in Portugal and in Europe.</a> Nematology. 1, 727-734 (1999).</li>
<li>Robertson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+of+the+pine+wood+nematode+Bursaphelenchus+xylophlius+Steiner+%26+Buhrer%2C+1934+%28Nickle%2C+1970%29+in+Spain%5BTitle%5D)+AND+%22Nematology%22%5BJournal%5D)">Incidence of the pine wood nematode Bursaphelenchus xylophlius Steiner & Buhrer, 1934 (Nickle, 1970) in Spain.</a> Nematology. 13, 755-757 (2011).</li>
<li>Vicente, C., Espada, M., Vieira, P., Mota, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pine+wilt+disease%3A+a+threat+to+European+forestry%5BTitle%5D)+AND+%22Euro.+J.+Plant+Path%22%5BJournal%5D)">Pine wilt disease: a threat to European forestry.</a> Euro. J. Plant Path. 133, 89-99 (2012).</li>
<li>Jones, J. T., Moens, M., Mota, M., Li, H., Kikuchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bursaphelenchus+xylophilus%3A+opportunities+in+comparative+genomics+and+molecular+host-parasite+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant.+Path%22%5BJournal%5D)">Bursaphelenchus xylophilus: opportunities in comparative genomics and molecular host-parasite interactions.</a> Mol. Plant. Path. 9, 357-368 (2008).</li>
<li>Mamiya, Y., Furukawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fecundity+and+reproduction+of+Bursaphelenchus+lignicolus%5BTitle%5D)+AND+%22Jap.+J.+Nemat%22%5BJournal%5D)">Fecundity and reproduction of Bursaphelenchus lignicolus.</a> Jap. J. Nemat. 7, 6-9 (1977).</li>
<li>Mamiya, Y., Kiyohara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Description+of+Bursaphelenchus+lignicolus.+n.+sp.+%28Nematoda%3A+Aphelenchoididae%29+from+pine+wood+and+histophathology+of+nematode-infested+trees%5BTitle%5D)+AND+%22Nematologica%22%5BJournal%5D)">Description of Bursaphelenchus lignicolus. n. sp. (Nematoda: Aphelenchoididae) from pine wood and histophathology of nematode-infested trees.</a> Nematologica. 18, 120-124 (1972).</li>
<li>Liu, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioural+features+of+Bursaphelenchus+xylophilus+in+the+mating+process%5BTitle%5D)+AND+%22Nematology%22%5BJournal%5D)">Behavioural features of Bursaphelenchus xylophilus in the mating process.</a> Nematology. 16, 895-902 (2014).</li>
<li>Simon, J. M., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+a+mate+finding+cue+in+the+hermaphrodite+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Evidence of a mate finding cue in the hermaphrodite nematode Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 1598-1603 (2002).</li>
<li>Barr, M. M., Garcia, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Male+mating+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22The+C.+elegans+Research+Community+Wormbook%22%5BJournal%5D)">Male mating behaviour.</a> The C. elegans Research Community Wormbook. , (2006).</li>
<li>Shinya, R., Chen, A., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+attraction+and+mating+in+Bursaphelenchus+okinawaensis+and+B.+xylophilus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nematol%22%5BJournal%5D)">Sex attraction and mating in Bursaphelenchus okinawaensis and B. xylophilus.</a> J. Nematol. 47 (3), 176-183 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Testy behawioralne są podstawowym aspektem ekologii chemicznej, neurobiologii, biologii molekularnej i genetyki. Nicienie, a zwłaszcza C. elegans, są szeroko wykorzystywane do badań w tych obszarach. Zachowania godowe C. elegans były badane wcześniej10-11. Jednak B. xylophilus jest gonochorystyczny i różni się od hermafrodytycznego C. elegans, a jego proces godowy ma różne cechy behawioralne9. Ostatnio odnotowano zachowania godowe Bursaphelenchus okinawaensis<...

Nicień sosnowy, Bursaphelenchus xylophilus (Steiner i Buhrer) Nickle, jest jednym z najbardziej destrukcyjnych gatunków inwazyjnych, powodującym więdnięcie i ostateczną śmierć sosen. Uważa się, że ten chorobotwórczy nicień pochodzi z USA, ale został przetransportowany do kilku krajów, w tym do Chin, Japonii, Korei Południowej i Portugalii. Ostatnio odnotowano go również w Hiszpanii, zabijając miliony sosen przy ogromnych stratach ekonomicznych i zagrażając produkcji leśnej i stabilności ekologicznej1-5.
Gdy sosna gospodarza zostanie zainfekowana przez nicienie sosnowe, tysiące milionów potomstwa jest szybko rozmnażanych w pniu. Powoduje to dysfunkcję ksylemu, powodującą więdnięcie i ostatecznie śmierć drzewa gospodarza6. Jednak obecnie nie ma skutecznego sposobu na kontrolowanie tej choroby. Zachowania godowe mogą odgrywać ważną rolę w wysokiej płodności tego nicienia7. W związku z tym zbadaliśmy zachowania godowe B. xylophilus w laboratorium, próbując znaleźć skuteczny sposób na zakłócenie jego krycia i zmniejszenie jego płodności. 
Ten protokół ma na celu wprowadzenie szczegółowych metod pozyskiwania dziewiczych dorosłych osobników B. xylophilus oraz obserwacji i analizy zachowań godowych za pomocą magnetowidu i stereomikroskopu. Protokół ten może być również wykorzystany jako odniesienie do badań behawioralnych innych nicieni.

<table><tbody><tr><td>B. xylophilus izolat Nxy61</td><td></td><td></td><td>Ekstrahowany z Pinus massoniana w rejonie Ningbo w Chinach</td></tr><tr>Szczep <td></td><td></td><td>szarej pleśni</td><td>Uzyskany z Chińskiej Akademii Leśnictwa</td></tr><tr><td>Lejki Baermanna</td> Probówki sokoła <td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td> Wirówka <td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pipeta</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>sterylna dd H2O</td><td></td><td></td><td>Sterylizowana pod wysokim ciśnieniem pary w temperaturze 121 & stopni; C przez 30 min.</td></tr><tr><td>Szalki Petriego</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDA medium</td><td>Huankai Bio.</td><td>021050</td><td></td></tr><tr><td>inkubator</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przepływ laminarny</td><td>Szklana</td> kapilara Sengong <td></td><td></td></tr><tr><td>Stereoskop</td><td>Sengong</td><td></td> Mikroskop stereoskopowy Leica LED5000 RL <td></td></tr><tr><td>Szkiełka wklęsłe</td><td></td> Zeiss A1 Sengong <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

obserwacja i kwantyfikacja zachowań godowych nicieni sosnówki, bursaphelenchus xylophilus

Observation and Quantification of Mating Behavior in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

Metoda obserwacji i ilościowego określania zachowań godowych nicienia sosnowego, Bursaphelenchus xylophilus, została opracowana pod mikroskopem stereoskopowym. Aby poprawić efektywność krycia B. xylophilus i zwiększyć szanse na obserwację krycia, dziewicze dorosłe osobniki wyhodowano i wykorzystano do badań. Jaja uzyskano, trzymając nicienie w wodzie i pozwalając samicom na składanie jaj przez 10 minut. Młodociane osobniki drugiego etapu (J2) synchronizowano przez inkubację jaj przez 24 godziny w temperaturze 25 °C w ciemności, a wczesne J4 uzyskano przez hodowlę J2 z szarą pleśnią, Botrytis cinerea, przez kolejne 52 godziny. W tym momencie większość nicieni J4 można było wyraźnie odróżnić jako samce lub samice na podstawie morfologii narządów płciowych. Samce i samice J4 zebrano i hodowano oddzielnie na dwóch różnych szalkach Petriego przez 24 godziny, aby uzyskać dziewicze dorosłe nicienie. Dziewiczy mężczyzna i dziewicza samica zostali połączeni w pary w kropli wody w studni wklęsłej zjeżdżalni. Zachowanie godowe zostało sfilmowane za pomocą magnetowidu pod mikroskopem stereoskopowym. Cały okres procesu krycia wynosił 82,8 ±3,91 min (średnia ±SE) i można go podzielić na 4 różne fazy: poszukiwanie, kontakt, kopulację i przebywanie. Średni czas trwania wynosił odpowiednio 21,8 ± 2,0, 28,0 ± 1,9, 25,8 ± 0,7 i 7,2 ± 0,5. Opisano jedenaście podzachowań: rejs, zbliżanie się, napotykanie, dotykanie, obręczowanie, lokalizowanie, przyczepianie się, wytrysk, oddzielanie, spokój i wędrowanie. Co ciekawe, wyraźną konkurencję wewnątrzpłciową zaobserwowano, gdy jedna samica była grupowana z 3 samcami lub jeden samiec z 3 samicami. Protokół ten jest przydatny i cenny, nie tylko w badaniu zachowań godowych B. xylophilus, ale także jako punkt odniesienia dla badań etologicznych innych nicieni.

Wskaźnik sukcesu kopulacji (R) u dziewiczych osobników dorosłych wyniósł średnio 86,67%, co było wartością istotnie wyższą niż w przypadku osobników dorosłych wybranych losowo: 13,33 ± 4,65% (F = 1301,71, df = 1, P = 0,0001) (Rysunek 2). Wynik ten sugeruje, że zachowania kopulacyjne B. xylophilus są łatwiejsze do zaobserwowania u dziewiczych osobników dorosłych niż u osobników wybranych losowo.
<p class="jove_content" fo:keep-together.within...

Przedstawiono protokół badania zachowań godowych nicienia sosnowego, Bursaphelenchus xylophilus. Cechy behawioralne B. xylophilus są opisane w procesie krycia.

Obserwacja i kwantyfikacja zachowań godowych nicieni sosnówki, Bursaphelenchus xylophilus

A method for observing and quantifying the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, was established under a stereomicroscope. ...

Ogólnym celem tej procedury jest obserwacja zachowań godowych nicienia sosnowego, Bursaphelenchus xylophilus. Ta metoda może pomóc w postępie badań psychologicznych nicieni. W szczególności zajmuje się obserwacją zachowań godowych nicienia sosnowego.Główną zaletą tej techniki jest to, że można uzyskać dziewicze dorosłe osobniki, co znacznie ułatwia obserwację zachowań godowych dorosłych. Implikacje tej techniki rozciągają się wyłącznie w kierunku szerszego badania nicieni, ponieważ mają one podobne zachowania w cyklach życiowych. Demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ nabycie dziewiczych dorosłych nicieni jest trudne, ponieważ ograniczenia rozwojowe nicieni wymagają praktyki i nie jest łatwo dokładnie odróżnić samce od samic u młodych osobników we wczesnym pierwszym stadium.Aby hodować nicienie sosnowe, najpierw przygotuj talerze agarowe z dekstrozą ziemniaczaną. Aby zaszczepić płytkę, należy przebić kawałek maty grzybowej o średnicy 10 milimetrów z maty betritus senaria i umieścić go na środku nowej płytki PDA. Hoduj matę grzybową przez pięć dni w temperaturze 25 stopni Celsjusza w ciemności.Po pięciu dniach dodaj nicienie sosnowe do przygotowanej szalki Petriego i hoduj je przez trzy dni w temperaturze 25 stopni Celsjusza w ciemności. Aby odizolować nicienie od grzyba, najpierw przygotuj narzędzie do zbierania. Umieść zaciśniętą gumową rurkę pod lejkiem i przytrzymaj przygotowany lejek w stojaku, aby zmontować aparat lejkowy Baermann.Następnie umieść dwie warstwy bibuły filtracyjnej zamiast gazy w otworze lejka. Teraz przenieś kultury grzybów do lejka i dodaj wodę, aż mata grzybowa zostanie zanurzona. Po dwóch godzinach nicienie wyjdą z kultury grzybów, przejdą przez bibułę filtracyjną i osiądą w najniższej części lejka Baermanna.Zbierz nicienie, umieszczając 15-mililitrową rurkę pod lejkiem, a następnie powoli zwalniając zacisk, aby zebrać kilka kropli wody, która będzie zawierać nicienie. Odwirować zbieranie nicieni w temperaturze 3 000 G przez dwie minuty w temperaturze pokojowej. Następnie należy przeprowadzić asparację górnego poziomu wody i ponownie zawiesić robaki w jednym mililitrze wody.Przenieś zawiesinę nicieni do sześciocentymetrowego szklanego naczynia i dodaj trzy mililitry wody, aby pomóc nicieniom swobodnie pływać. Teraz zbieraj jajka, aby zrobić dziewicze zapasy. Przenieś naczynie do ciemnego inkubatora i pozwól ciężarnym samicom złożyć jaja przez 10 minut.Ze względu na powierzchnię glikoproteiny jaja przyklejają się do szkła. Następnie ostrożnie usuń wodę z robakami, aby nie naruszyć jajek przyklejonych do naczynia. Następnie szybko dodaj z powrotem 3 mililitry wody do naczynia, aby jajka nie wysychały.Powtórz ten proces czyszczenia jaj co najmniej trzy razy, aby usunąć wszystkie larwy i dorosłe osobniki i uzyskać czyste jaja. Do umytej czystej kolekcji jaj dodaj pięć mililitrów wody i kontynuuj rozwijanie jaj w ciemności w temperaturze 25 stopni Celsjusza. 24 godziny po rozpoczęciu hodowli jaj należy zebrać wyklute larwy J2.Ostrożnie przenieś larwy J2 do 15-mililitrowej probówki. Następnie odwirować zbiór o stężeniu 3 000 G przez dwie minuty. Asparuj górną warstwę wody i dodaj z powrotem 200 mikrolitrów wody.Następnie hoduj larwy J2 na płytce PDA przygotowanej z maty grzybów. Po 52 godzinach większość larw J2 rozwinie się we wczesne stadium larwy J4. Złóż lejek Baermanna i ekstrahuj nicienie z kultur grzybów przez dwie godziny, jak opisano wcześniej.Czekając, przygotuj igłę do zbierania robaków. Narysuj końcówkę ze szklanej kapilary podgrzanej nad palnikiem alkoholowym. Końcówka musi mieć średnicę około 50 mikronów, czyli mniej więcej szerokość ciała dorosłego nicienia.Po dwóch godzinach przenieś larwy J4 na czystą szalkę Petriego, jak opisano wcześniej. Teraz seksuj z nicieniami pod mikroskopem stereoskopowym. Około dwie trzecie larw to zwykle samice.Srom samicy różni się oczywiście od anatomii samca, ale ponieważ robaki są bardzo aktywne, seksowanie będzie wymagało praktyki. Najważniejszym krokiem w tym protokole jest precyzyjne odróżnienie i oddzielenie samców od samic we wczesnym pierwszym stadium. W przeciwnym razie będą mieszane i złe, gdy staną się dorosłe.A to utrudnia obserwację krycia. Stopniowo zbieraj i przenoś robaki do kropli wody na zjeżdżalni dla samców lub samic. Aby zapewnić sukces, dwie różne osoby powinny dokładnie sprawdzić przydział płci.Teraz przenieś kroplę wody zawierającą seksowane robaki na odpowiednią płytkę do hodowli grzybów. Następnie hoduj dziewice przez kolejne 24 godziny, zanim zbadasz ich zachowania godowe. Aby zaobserwować zachowanie godowe nicieni sosnowych, najpierw przygotuj kilka wklęsłych szkiełek, dodając 200 mikrolitrów wody do każdej z ich studni.Następnie wybierz pojedynczego przygotowanego dziewiczego dorosłego osobnika i przenieś go na przygotowany szkiełko. Trzymaj dziewicze dorosłe osobniki w studni przez godzinę, aby mogły przystosować się do nowego środowiska wodnego. Po godzinie dodaj do studzienki pojedynczą dziewiczą osobę dorosłą płci przeciwnej za pomocą pipety.Następnie obserwuj zachowanie godowe pod mikroskopem stereoskopowym i sfilmuj zachowanie do analizy ilościowej. Cały proces krycia kończy się zwykle w ciągu dwóch godzin. Co 30 minut dodawaj 50 mikrolitrów wody, aby skompensować parowanie.Aby zbadać wybór krycia i konkurencję międzypłciową, grupuj i obserwuj dziewicze nicienie w dwóch różnych kombinacjach. Wskaźnik sukcesu kryjnego dziewiczych dorosłych osobników wynosił około 87%, co było znacznie wyższe niż w przypadku losowo wybranych dorosłych. Pary potrzebowały średnio 83 minut, aby ukończyć cały proces krycia, który składa się z czterech różnych faz.Szukanie, kontaktowanie się, kopulacja i przebywanie. W ramach tych faz można zaobserwować wiele specyficznych wzorców zachowań. Kiedy jedna samica spotkała kilka samców, wybór krycia był oczywisty.Samica zwykle używa głowy do kontaktu z jednym samcem, zwykle w głowę, tułów, ogon i okolice narządów płciowych. Samica następnie kopulowała z samcem lub szybko go opuściła i podpłynęła do innego samca. Wskaźniki udanego krycia mierzono po pierwszym kontakcie dla różnych kombinacji nicieni.Pojawiła się również rywalizacja międzypłciowa. Kiedy jedna dziewicza samica została zmieszana z trzema dziewiczymi samcami, samce starały się zbliżyć i skontaktować z samicą tak bardzo, jak to możliwe, aby mieć szansę na krycie z nią. Kiedy srom był zajęty, inne samce próbowały zakłócić proces godowy za pomocą gwałtownych zamachów ciała lub ciągnięcia, aby je rozdzielić.Stwierdzono, że kobieca konkurencja interseksualna jest mniej więcej podobna do męskiej konkurencji interseksualnej. Ze względu na konkurencję międzypłciową, częstotliwości kopulacji z różnymi kombinacjami były znacznie różne. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę do eksploracji ekologii behawioralnej u nicieni.Po opanowaniu tej procedury można ją wykonać w ciągu 12 dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując tej procedury, należy pamiętać o dokładnym oddzieleniu samców od samic, wczesnych czterech młodych osobników, aby uzyskać dziewicze dorosłe osobniki.

observation-quantification-mating-behavior-pinewood-nematode

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Nicienie entomopatogeniczne to glisty zamieszkujące glebę, które pasożytują na szerokiej gamie owadów.  Pokazujemy metody pobierania próbek stosowane do izolacji tych nicieni z gleby przy użyciu dwóch technik: przynęty na owady i zmodyfikowanej białej pułapki, do odzyskiwania nicieni odpowiednio z próbek gleby i zakażonych zwłok owadów.

Pobieranie próbek z gleby i izolacja nicieni entomopatogenicznych (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Testy behawioralne dostarczają potężnych narzędzi do zrozumienia funkcji neuronów. W tym miejscu przedstawiamy kilka protokołów ilościowego określania zachowań żywieniowych drapieżników występujących u modelowego nicienia Pristionchus pacificus i jego krewnych. Dodatkowo udostępniamy metody analizy adaptacji żywieniowych drapieżników, w tym budowy jamy ustnej i zębów.

Badanie drapieżnych zachowań żywieniowych u Pristionchus i innych nicieni

Pokazujemy test do analizy środowiskowych i genetycznych wskazówek, które wpływają na zachowania godowe muszki owocowej Drosophila melanogaster.

Metoda badania wpływu sygnałów środowiskowych na zachowania godowe u Drosophila melanogaster

Użycie dostosowanego "chipa węchowego" do efektywnego obrazowania wapnia u samców C. elegans jest opisane tutaj. Pokazano również badania dotyczące narażenia mężczyzn na glicerol i feromon.

Wykorzystanie dostosowanego mikroprzepływowego chipa węchowego do obrazowania aktywności neuronalnej w odpowiedzi na feromony w męskich neuronach głowy C. elegans

Zachowanie związane z ochroną partnera odgrywa ważną rolę w rozmnażaniu widłonogów z rodzaju Tigriopus. Jednak metody badania tego zachowania nie zostały dobrze opisane. Poniżej opisujemy metody: 1) indywidualnej hodowli dziewiczych zwierząt Tigriopus oraz 2) ilościowej analizy ich zachowań związanych z ochroną partnerów.

Indywidualne hodowle widłonogów Tigriopus i analiza ilościowa ich zachowań związanych z ochroną partnerów

W tym protokole, metody przeprowadzania krzyżówek wsobnych i oceny sukcesu tych krzyżówek, są opisane dla mrówki Vollenhovia emeryi. Protokoły te są ważne dla eksperymentów mających na celu zrozumienie genetycznych podstaw systemów determinacji płci u błonkoskrzydłych.

Indukcja i ocena krzyżówek wsobnych z wykorzystaniem mrówki, Vollenhovia emeryi

Plemnik musi pomyślnie przejść przez jajowód, aby zapłodnić oocyt. W tym miejscu opisujemy test do pomiaru migracji plemników w obrębie macicy hermafrodyty C. elegans. Test ten może dostarczyć danych ilościowych na temat rozmieszczenia plemników w macicy po kryciu, a także na temat prędkości, prędkości kierunkowej i częstotliwości odwrócenia.

Pomiar przewodnictwa i ruchliwości plemników w hermafrodytowym układzie rozrodczym Caenorhabditis elegans

Tutaj przedstawiamy szczegółową metodę moczenia interferencji RNA u Bursaphelenchus xylophilus , aby ułatwić badanie funkcji genów.

Zastosowanie interferencji RNA w nicieni sosnowym, Bursaphelenchus xylophilus

Ten protokół ustanawia metody ekstrakcji i ilościowego określania reakcji na lotny feromon płciowy w C. elegans, zapewniając narzędzia do badania komunikacji chemicznej i trajektorii nawigacji.

Lotna ekstrakcja feromonów płciowych i test chemoatrakcji w Caenorhabditis elegans

Protokół opisuje infekcję in vivo i in vitro nicieniami sosnówki Pinus pinaster oraz ich analizę lotną za pomocą chromatografii gazowej (GC) i GC sprzężonej ze spektrometrią mas (GC-MS).

Zakażenie sosen in vivo i in vitro nicieniem sosnowym Bursaphelenchus xylophilus i izolacja indukowanych substancji lotnych

Niniejszy protokół opisuje metodę indukowania dyspersji młodocianych osobników trzeciego stadium (młodocianych osobników sprzed dauer, JIII.) Bursaphelenchus xylophilus do kryptobiozy poprzez osmotyczną regulację jonów chlorku potasu (KCl). Metoda ta może stanowić wsparcie techniczne dla badań nad mechanizmami odporności B . xylophilus na stres.

Indukowanie wnikania w trzecim stadium dyspersyjnych młodych osobników Bursaphelenchus xylophilus do kryptobiozy poprzez regulację osmotyczną

Poznaj metodę obserwacji zachowań godowych nicieni sosnówki Bursaphelenchus xylophilus przy użyciu dziewiczych osobników dorosłych. Technika ta ułatwia badania behawioralne i ekologiczne w nawet.

Obserwacja i kwantyfikacja zachowań godowych nicieni sosnówki, Bursaphelenchus xylophilus

Przeglądaj więcej filmów