Opracowanie systemu zgłaszania wirusa zapalenia wątroby typu B w celu monitorowania wczesnych etapów cyklu replikacji

Ogólnym celem tego rekombinowanego systemu reporterowego HBV jest ułatwienie przeprowadzania masowych badań przesiewowych na obecność wirusa zapalenia wątroby typu B lub czynników HBV. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie HBV, takie jak badania przesiewowe w kierunku czynników anty-HBV i identyfikacja czynników HBV. Główną zaletą tej techniki jest to, że system reporterowania HBV może monitorować wcześniejsze etapy cyklu replikacji HBV.

Po przygotowaniu pożywki do hodowli komórkowych, dzień przed transwekcją, umieścić cztery razy po 10 do sześciu komórek HepG2 w pożywce, na 10 cm naczyniu pokrytym kolagenem. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni C w wilgotnym inkubatorze o stężeniu 5% CO2. Za pomocą środka transwekcyjnego zgodnie z instrukcjami producenta należy transwekować komórki 5 mcg pUC1 2HBV delta epsilon i 5 mcg pUC1 2HBV/NL.

Następnego dnia usuń pożywkę hodowlaną i dodaj 10 ml świeżej pożywki hodowlanej. Następnie, tydzień po transwekcji, przenieść pożywkę zawierającą rekombinowany HBV do probówki o pojemności 50 ml. Następnie dodać 10 ml świeżej pożywki hodowlanej do płytki zawierającej transfekcyjne komórki.

Następnie zebrać i odwirować pożywkę hodowlaną o sile 2 300 x g przez pięć minut w celu usunięcia resztek komórkowych zawierających rekombinowany HBV. Przepuścić supernatant przez filtr membranowy o pojemności 45 mcm. Następnie dodaj równą objętość 25% PEG, 1,5 molowego NaCl do filtratu i delikatnie wymieszaj.

Inkubować próbkę przez noc w temperaturze czterech stopni C. Następnego dnia wirować roztwór w temperaturze 2,300 x g i czterech stopni C przez 20 minut. Odrzucić supernatant i rozpuścić osad w 5 ml buforu TNE. Teraz ponownie odwirować próbkę, aby usunąć resztki komórek, a następnie załadować 5 ml rekombinowanego HBV zawierającego TNE na 8 ml 20% sacharozy w TNE.

Odwiruj je w temperaturze 100 000 x g i 15 stopni Celsjusza przez trzy godziny. Wyrzucić jak najwięcej supernatantu i użyć 1 ml DMEM bez surowicy na 40 ml kultury wyjściowej, aby ponownie zawiesić osad. Zawiesinę inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.

Następnego ranka przefiltruj zawiesinę przez filtr o pojemności 45 mcm. Następnie przygotuj 5 ml porcji i przechowuj probówki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Płytki Komórki HepG2, stabilnie eksprymujące polipeptyd kotransportujący taurocholan sodu lub NTCP, które są podatne na zakażenie HBV, i inkubują w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2.

Na dzień przed zakażeniem umieść około pięć razy 10 do czwartego HepG2 komórek NTCP w dołkach 96-dołkowej płytki pokrytej kolagenem, w 1 ml pożywki hodowlanej. Rozmrozić rekombinowany wirus HBV w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż w fiolce pozostanie niewielka ilość lodu. Przygotuj pożywkę do infekcji, łącząc 78 mcL świeżej pożywki hodowlanej, 2 mcL DMSO, 10 mcL 40% PEG 8000 w 1x PBS i 10 mcL rekombinowanego HPV.

Dodać 100 mcl rekombinowanego roztworu HBV do każdego dołka na 96-dołkowej płytce. Jednego dnia po zakażeniu użyj 300 mcl PBS, aby trzykrotnie przemyć komórkę w celu usunięcia zanieczyszczającego białka reporterowego z frakcji wirusa. Dodać 200 mcl pożywki hodowlanej, zawierającej 2% DMSO, do zakażonych komórek i inkubować przez tydzień lub krócej.

Aby przeprowadzić analizę zakażenia HBV, tydzień po zakażeniu należy użyć PBS do trzykrotnego przemycia zakażonych komórek. Dodaj 50 mcL buforu do lizy do zainfekowanych komórek. Kołysz płytką hodowlaną przez pięć minut, a następnie odwiruj przy 2 000 x g przez pięć minut.

Dodać 50 mcL substratu reporterowego do płytki luminometru. Następnie dodaj 20 mcl lizatu komórkowego do płytki i wymieszaj, krótko wstrząsając. Na koniec umieść płytkę w luminometrze i rozpocznij odczyt.

Żel ten pokazuje trawienie skonstruowanego plazmidu reporterowego pUC1 2HBVNL oraz plazmidu pomocniczego pUC1 2HBV delta z HindII i EcoRI. Obie próbki dają oczekiwane rozmiary pasm. W tym western blot lizaty z komórek HepG2 lub komórek HepG2 eksprymujących rekombinowany NTCP znakowany myc i zakażone rekombinowanym HBV, badano przeciwciałem anty-myc, które rozpoznaje niezylylowane białka niezylowane o masie 34 kDa i glikozolowane białka o masie 65 kDa.

Przedstawione tutaj wykresy ilustrują kinetykę genu reporterowego. Poziomy RNA i DNA w rekombinowanych komórkach myc-klonu 22 HepG2 NTCP zakażonych HBV lub ludzkich pierwotnych komórkach hepatocytów. Poziomy RNA HBV w aktywności reporterowej były podwyższone po trzech dniach od zakażenia, zarówno w zakażonych komórkach, jak i w pierwotnych hepatocytach.

W przeciwieństwie do tego, nie zaobserwowano zmian w poziomie DNA po dziewięciu dniach od zakażenia, ponieważ rekombinowany HBV ma niedobór funkcjonalnego rdzenia i bieguna, które odgrywają ważną rolę w wewnątrzkomórkowym szlaku replikacji DNA. Na tym rysunku zilustrowano hamowanie rekombinowanego HBV przez immunoglobulinę wirusa zapalenia wątroby typu B lub HBIG, heparynę i IFN-beta. HBIG i heparyna silnie hamowały aktywność reporterową do mniej niż 10% przy odpowiednio 75 U/ml i 150 U/ml.

Z drugiej strony IFN-beta tłumił aktywność reporterową do mniej niż 50% przy 1000 U/ml. Po opanowaniu, technikę tę można wykonać w ciągu jednego tygodnia w przypadku przygotowania rekombinowanego HBV, w ciągu sześciu dni w przypadku zakażenia rekombinowanego HBV i w skrócie, środków do pomiaru białka reporterowego, jeśli zostanie to wykonane prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o etapie mycia, który usuwa zanieczyszczające białko reporterowe z frakcji odchylenia.

Po tej procedurze można wykonać inne wyniki, takie jak zakażenie szerokim wirusem HBV, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytanie, że rekombinowany HBV nie dał pierwszych pozytywnych wyników. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się HBV do zbadania możliwości opracowania czynnika anty-HBV w modelu hodowli komórkowej. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak oczyszczać i infekować komórki rekombinowanym wirusem HBV.

Nie zapominaj, że praca z rekombinowanym wirusem HBV może być bardzo niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek.