Name: Badanie składania proteasomu za pomocą rekombinowanych proteasomów archeonów i niedenaturujących PAGE: Argumenty przemawiające za podejściem łączonym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Poznaj metodę badania składania proteasomu z użyciem rekombinowanych podjednostek archeonów i niedenaturującego PAGE. To podejście pozwala szybko analizować dynamikę montażu kompleksu białkowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była częściowo wspierana przez Research Support Funds Grant (RSFG) z Indiana University-Purdue University, Indianapolis, a częściowo przez nagrodę od American Heart Association 14GRNT20390154, dla A.R.K.

1. Ekspresja bakteryjna.
Uwaga: Plazmidy ekspresji użyte w tym badaniu są opisane w Tabeli 1. Roztwory, pożywki i użyte w tym badaniu opisano w tabeli 2. Klonowanie archeonów podjednostek proteasomu i wytwarzanie plazmidów ekspresyjnych opisano w innym miejscu18,20. Krótko mówiąc, plazmidy do rekombinowanej koekspresji podjednostek wykorzystują strategię operonu bicistronicznego, która pomaga w uzyskaniu porównywalnych poziomów ekspresji poszczególnych podjednostek18,20. Wymienione poniżej parametry ekspresji zostały empirycznie określone jako optymalne dla podjednostek proteasomu w tym badaniu. Może być konieczna optymalizacja ekspresji dla innych mutantów proteasomów, dla proteasomów z innych gatunków archeonów lub dla innych rekombinowanych kompleksów białkowych (patrz Dyskusja).
<ol>
	<li>Przekształć interesujący nas plazmid ekspresyjny w chemicznie kompetentne komórki E.coli BL21(DE3).</li>
	<li>Dodaj 1 - 2 μl plazmidu (zwykle 50 - 100 ng) do podwielokrotności komórek DE3, które zostały świeżo rozmrożone na lodzie i kontynuuj inkubację na lodzie przez 20 minut.</li>
	<li>Szok termiczny ogniw w temperaturze 42 °C przez 45 s i powrót rurki do lodu na dodatkowe 2 minuty.</li>
	<li>Dodać 1 ml pożywki LB i inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem (150 obr./min) przez 1 godzinę.</li>
	<li>Rozprowadzić 100 - 200 μL mieszaniny transformacyjnej na płytkach LB-kan (płytki zawierające stałe podłoże LB, uzupełnione kanamycyną (wszystkie plazmidy użyte w tym badaniu kodują oporność na ten antybiotyk)). Inkubować płytki w temperaturze 37 °C O/N.</li>
	<li>Następnego ranka zaszczepij pojedynczą kolonię z płytki LB-kan do 3 ml płynnej pożywki LB-kan w szklanej probówce hodowlanej. Inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem (150 obr./min) przez około 2,5 - 3 godziny lub do momentu uzyskania zmętnienia.</li>
	<li>Zmierzyć gęstość optyczną kultury przy 600 nm (OD600) w spektrofotometrze. Rozcieńczyć hodowlę komórkową odpowiednią ilością wstępnie podgrzanej pożywki LB-kan do OD600 0,4 w końcowej objętości 6 ml. Wznowić wytrząsanie w temperaturze 37 ºC przez 40 minut.</li>
	<li>Indukować ekspresję białek w płynnych kulturach poprzez dodanie IPTG z roztworu podstawowego do końcowego stężenia 1 mM. Inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem (150 obr./min) przez około 6-7 godzin.</li>
	<li>Zbierz kultury komórek bakteryjnych w całości do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Dodać 1,5 ml kultury do probówki do mikrowirówki. Wirować przy 10 000 × g przez 1 min.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i dodać kolejne 1,5 ml tej samej kultury do osadu. Wirować przy 10 000 × g przez 1 min.</li>
	<li>Powtarzaj krok 1.11, aż cała kultura zostanie zebrana do probówki mikrowirówkowej.</li>
	<li>Indukowane granulki przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu lizy.</li>
</ol>
2. Liza bakteryjna i mieszanie lizatów.
Uwaga: Dla próbek badanych za pomocą koekspresji, postępuj zgodnie z sekcją 2.1 (i jej podsekcjami). W przypadku próbek wymagających mieszania lizatu należy postępować zgodnie z sekcją 2.2 (i jej podsekcjami). Analiza TSP (Total, Soluble, Pellet), która jest zawarta w protokole, jest przydatna w optymalizacji ekspresji białek, co może pomóc w zapewnieniu, że podczas mieszania lizatu łączone są w przybliżeniu równe ilości podjednostek α i β (patrz Dyskusja). Zapewnia również ważną kontrolę, jeśli dalsze wyniki nie są zgodne z oczekiwaniami (tj. sprawdza, czy białko uległo ekspresji i jest rozpuszczalne). Dlatego zdecydowanie zalecamy włączenie na początku analizy TSP. Po osiągnięciu optymalnego protokołu dla określonej kombinacji podjednostek, analiza TSP nie jest ściśle wymagana, dlatego poniżej opisano ją jako opcjonalną.
<ol>
	<li>Liza komórek bakteryjnych i przygotowanie frakcji rozpuszczalnych.
	<ol>
		<li>Rozmrozić indukowaną osadkę komórkową na lodzie przez 5 minut. Zawiesić osad w 600 μl buforu do lizy.</li>
		<li>Inkubować zawiesinę w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem (150 obr./min) przez 30 minut, aby wytworzyć całkowity lizat surowy. 
		nuta: Następny krok i następująca po nim podsekcja są opcjonalne.</li>
		<li>Pobrać dwie podwielokrotności o objętości 25 μl z całkowitego lizatu surowego do oddzielnych probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i przeprowadzić analizę TSP w następujący sposób.
		<ol>
			<li>Do jednej z dwóch podwielokrotności o pojemności 25 μl dodać 5-krotny bufor próbki SDS do końcowego stężenia 1X. Oznaczyć probówkę symbolem "T" dla "całkowitego lizatu surowego".</li>
			<li>Inkubować próbkę "T" w temperaturze 100 °C przez 5 minut w celu całkowitej denaturacji białek.</li>
			<li>W międzyczasie pobrać drugą porcję o pojemności 25 μl i odwirować ją w temperaturze 10 000 × g przez 10 minut. Ostrożnie usunąć supernatant, nie naruszając maleńkiego osadu, i przenieść go do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Oznacz tę nową probówkę "S" dla "frakcji rozpuszczalnej".</li>
			<li>Do maleńkiej osadki pozostawionej w poprzednim kroku dodaj 25 μl buforu do lizy i wir do ponownego zawieszenia. Oznacz tę rurkę "P" dla "frakcji granulek".</li>
			<li>Dodać 6 μl buforu do próbek 5X SDS do probówek "S" i "P" i inkubować w temperaturze 100 °C, jak opisano powyżej. 
			nuta: Jeżeli próbki TSP nie zostaną użyte tego dnia do analizy ekspresji, mogą one zostać zamrożone w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będą potrzebne. Po rozmrożeniu należy je ponownie inkubować w temperaturze 100 ºC, jak opisano powyżej, bezpośrednio przed załadowaniem na 12% i/lub 15% standardowy żel SDS-PAGE.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Podczas przeprowadzania analizy TSP należy odwirować pozostałe 550 μl całkowitego lizatu surowego (lub całe 600 μl całkowitego lizatu surowego, jeśli nie przeprowadza się analizy TSP) przy stężeniu 10 000 × g przez 10 minut. Zebrać supernatant w świeżej probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Jest to rozpuszczalny lizat, który będzie używany do oczyszczania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mieszanie lizatu.
	<ol>
		<li>Przeprowadzić lizę zgodnie z opisem w krokach 2.1.1 i 2.1.2 powyżej.</li>
		<li>Zmieszać 600 μl całkowitego surowego lizatu od bakterii wykazujących ekspresję pożądanej podjednostki α z 600 μl całkowitego surowego lizatu od bakterii wykazujących ekspresję pożądanej podjednostki β. Inkubować w temperaturze 37 °C, powoli wstrząsając przez 30 min. 
		nuta: Może być konieczne zoptymalizowanie czasu inkubacji, aby osiągnąć maksymalny montaż podczas mieszania lizatu (patrz Dyskusja). Przedstawiony tutaj czas i temperatura są optymalne dla rekombinowanych białek w tym badaniu i zostały określone w innym miejscu18.</li>
		<li>Odwirować zmieszany lizat o stężeniu 10 000 × g przez 10 minut, aby oddzielić rozpuszczalny materiał od nierozpuszczalnego osadu. Przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Użyj tego mieszanego rozpuszczalnego lizatu do oczyszczania białka.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Oczyszczanie białek za pomocą unieruchomionej żywicy kobaltowej (ICAR).
<ol>
	<li>Zrównoważyć żywicę.
	<ol>
		<li>Dokładnie zawiesić żywicę, odwracając butelkę i przenieść 50 μl zawiesiny do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Wirować przy 700 × g przez 2 minuty do granulowania żywicy. Ostrożnie odessać supernatant. 
		nuta: Aspirację pipety przeprowadzamy za pomocą niebieskiej końcówki do pipety o pojemności 1 ml, aby usunąć większość płynu. Biała końcówka o pojemności 2 μl służy do dokładnej kontroli usuwania pozostałego supernatantu, pozostawiając bardzo cienką warstwę płynu pokrywającą kulki.</li>
		<li>Dodać 1 ml buforu A. Delikatnie wymieszać, aby zawiesić żywicę i odwirować przy 700 × g przez 2 minuty do granulowania żywicy. Ostrożnie odessać supernatant i powtórzyć ten etap prania jeszcze raz.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozpuszczalny lizat otrzymany uprzednio w sekcji 2.1 lub 2.2 nanieść na zrównoważoną żywicę. Inkubować probówkę, delikatnie obracając w temperaturze 4 °C przez 60 minut. Odwirować probówkę o masie 700 × g przez 5 minut i ostrożnie zassać supernatant.</li>
	<li>Umyj żywicę w następujący sposób, aby usunąć niespecyficznie związane białka.
	<ol>
		<li>Zawiesić żywicę w 1 ml buforu A i inkubować, delikatnie kołysząc w temperaturze 4 °C przez 10 minut. Odwirować probówkę o sile 700 × g przez 5 minut i ostrożnie zassać supernatant. Powtórz ten krok prania jeszcze raz.</li>
		<li>Zawiesić żywicę w 1 ml buforu B (bufor A z 5 mM imidazolu) i inkubować z delikatnym kołysaniem w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Odwirować probówkę o stężeniu 700 × g przez 5 minut i ostrożnie zassać supernatant. Powtórz ten krok prania jeszcze raz.</li>
		<li>Zawiesić żywicę w 1 ml buforu C (bufor A z 10 mM imidazolu) i inkubować z delikatnym kołysaniem w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Odwirować probówkę o sile 700 × g przez 5 minut i ostrożnie zassać supernatant.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Eluować białko, dodając 400 μl buforu E (bufor A z 200 mM imidazolem) do żywicy. Inkubować z delikatnym kołysaniem w temperaturze 4 ºC przez 5 minut. Wirować przy 700 × g przez 5 min.</li>
	<li>Przenieść supernatant zawierający oczyszczone białko do nowej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Oczyszczone białko odsolić przez seryjne wirowanie w następujący sposób.
	<ol>
		<li>Do 400 μl oczyszczonego białka dodaj 100 μl buforu A (zmniejsza to stężenie imidazolu z 200 mM do 160 mM). Zastosuj oczyszczone białko do 0,5 ml filtrów ultraodśrodkowych z odcięciem masy cząsteczkowej 10 kDa. Wirować przy 14 000 × g przez 5 min.</li>
		<li>Odrzucić filtrat i dodać 400 μl buforu A w celu rozcieńczenia retentatu i ponownie odwirować. Kontynuować cykle wirowania/rozcieńczania, aż stężenie imidazolu spadnie poniżej 4 mM. Na przykład, jeśli każde wirowanie zagęszcza 500 μl do ~70 μl (lub około 7-krotnie), to dwa cykle zmniejszą początkowe stężenie imidazolu 160 mM (7×7 = 49-krotnie) do około 3,3 mM.</li>
		<li>Zmierzyć stężenie białka w odsolonej próbce za pomocą testu BCA21. 
		nuta: Odsalanie jest wymagane w celu obniżenia poziomów imidazolu poniżej granicy tolerancji dla testu BCA, zgodnie z opisem w instrukcjach producenta. Nasze laboratorium preferuje test BCA, ponieważ jest czuły, ma duży zakres dynamiki i wykazuje znacznie mniejszą zmienność między białkami. Jednak inne metody oznaczania stężenia białka można zastąpić testem BCA. Kluczem jest świadomość zalet i ograniczeń każdej metody.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodaj 5X natywny bufor próbki do końcowego stężenia 1X i przystąp do elektroforezy. Alternatywnie, próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C do późniejszej analizy.</li>
</ol>
4. Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym bez denaturacji (STRONA).
Uwaga: Niespolimeryzowany akrylamid jest neurotoksyną. Nosić odpowiedni sprzęt ochronny.
<ol>
	<li>Przygotować niedenaturujący żel PAGE w następujący sposób.
	<ol>
		<li>Przygotuj kasetę z żelem do odlewania, używając czystych szklanych płytek i stojaka odlewniczego. Umieść ekspres do gradientów na małym mieszadle magnetycznym i umieść maleńki pręt mieszadła w każdej komorze.</li>
		<li>Używając roztworów podstawowych 40% (w/v) akrylamidu i 2% (w/v) bisakryloamidu, należy przygotować 5% i 10% (w/v) roztwory żelu akrylowego w buforze o natywnej rozdzielczości. Upewnij się, że stosunek całkowitego akrylamidu do bisakryloamidu wynosi 37,5:1. Schłodzić na lodzie przed nalaniem . 
		nuta: Zastosowany tutaj niedenaturujący system PAGE jest zasadniczo identyczny z systemem SDS-PAGE Laemmli, z pominięciem SDS22.</li>
		<li>Dodać nadsiarczan amonu (z 10% (w/v) roztworu podstawowego przygotowanego w wodzie) do roztworów akryloamidu, aby zainicjować polimeryzację. Końcowe stężenie nadsiarczanu amonu wynosi 0,1% (w/v).</li>
		<li>Wlej roztwory akrylamidu do dwóch komór ekspresu do gradientów. Po włożeniu rurki wylotowej między płytki kasety żelowej aktywuj mieszadło magnetyczne i otwórz zawory ekspresu gradientowego. Wlej 5 - 10% niedenaturujący żel gradientowy.</li>
		<li>Po wylaniu pokryj żel cienką warstwą izopropanolu i pozostaw żel do polimeryzacji przez 30 minut. W tym czasie należy przygotować świeży 5% roztwór żelu akrylowo-amlidowego w natywnym buforze rozdzielczym. Po stwardnieniu żelu odlej Isopropanol i spłucz wierzch żelu dejonizowaną wodą z butelki ze spryskiwaczem.</li>
		<li>Do 5% roztworu żelu przygotowanego powyżej, dodać nadsiarczan amonu (dokładnie tak, jak opisano w ppkt 4.1.3) i wlać na wierzch spolimeryzowanego żelu, aż szklane płytki będą pełne. Włóż grzebień żelowy. Pozostaw nałożony żel do polimeryzacji przez dodatkowe 30 minut.</li>
		<li>Po polimeryzacji żelu zmontuj kasetę żelową w aparacie do elektroforezy. Alternatywnie, żel należy przechowywać w temperaturze 4 ºC, zawinięty w zwilżone ręczniki papierowe i folię spożywczą, aż będzie gotowy do użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po złożeniu niedenaturującego żelu PAGE w aparacie do elektroforezy, napełnij zbiornik 1X natywnym buforem roboczym przygotowanym świeżo z 10X natywnego zapasu buforowego.</li>
	<li>Załadować 10 μg oczyszczonego białka, otrzymanego na końcu sekcji 3, do każdego dołka za pomocą szklanej strzykawki.</li>
	<li>Załaduj 2 μl natywnego wzorca białka o wysokiej masie cząsteczkowej (rozcieńczonego w 1X natywnym buforze do pracy) do jednego z dołków.</li>
	<li>Uruchomić żel pod napięciem 55 V i w temperaturze 4 ºC, aż czoło barwnika spłynie z żelu (około 4 - 4,5 godziny).</li>
	<li>Oprócz żelu niedenaturującego należy przeanalizować porcje oczyszczonego białka za pomocą standardowej karty SDS-PAGE22.
	<ol>
		<li>Zmieszać podwielokrotności (10 μg) oczyszczonych próbek białka, otrzymanych na końcu sekcji 3, z 5-krotnym buforem próbki SDS do końcowego stężenia 1X.</li>
		<li>Inkubować w temperaturze 100 ºC przez 5 minut i załadować na standardowe żele SDS-PAGE22% i/lub 15%.</li>
		<li>Pracuj przy napięciu 80 V przez 20 minut, a następnie przy napięciu 120 V, aż czoło barwnika spłynie z żelu (jest to około dodatkowe 75 minut w przypadku żelu 12% i 120 minut w przypadku żelu 15%).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Wizualizacja aktywności i barwienie białek.
<ol>
	<li>Po elektroforezie ostrożnie oddziel szklane płytki i przenieś niedenaturujący żel do tacki żelowej zawierającej 50 ml wody dejonizowanej. Płukać żel delikatnym kołysaniem przez 5 min. Wylej wodę i powtórz ten krok prania trzy razy.</li>
	<li>Wykonaj test nakładania podłoża w następujący sposób.
	<ol>
		<li>Dodać 1 ml buforu rozwijającego zawierającego substrat peptydu fluorogenicznego Suc-LLVY-AMC i równomiernie rozprowadzić na żelu. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 min. 
		nuta: Do rozprowadzenia płynu na żelu można użyć szklanego pręta lub rozdzielacza żelu (mały klin z tworzywa sztucznego używany do oddzielania szklanych płytek).</li>
		<li>Ostrożnie przenieś żel na transiluminator UV systemu obrazowania żelu i obserwuj fluorescencję spowodowaną rozszczepionym substratem peptydowym. Nagraj obraz. Ostrożnie przenieś żel z powrotem do tacki na żel.</li>
		<li>Spłucz żel dwukrotnie 50 ml wody dejonizowanej przez 5 minut, delikatnie kołysząc.</li>
		<li>Zabarwić żel 10 ml koloidalnego odczynnika do barwienia coomassie przez 60 minut, delikatnie kołysząc. Odplamić żel 50 ml wody, aż tło stanie się czyste. Ten etap barwienia dotyczy również standardowych żeli SDS-PAGE.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Wan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Panorama+of+ancient+metazoan+macromolecular+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Panorama of ancient metazoan macromolecular complexes.</a> Nature. 525, 339-344 (2015).</li>
<li>Marsh, J. A., Teichmann, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure%2C+dynamics%2C+assembly%2C+and+evolution+of+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Structure, dynamics, assembly, and evolution of protein complexes.</a> Annu Rev Biochem. 84, 551-575 (2015).</li>
<li>Williamson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperativity+in+macromolecular+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Cooperativity in macromolecular assembly.</a> Nat Chem Biol. 4, 458-465 (2008).</li>
<li>Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin-proteasome+system+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 192, 319-360 (2012).</li>
<li>Groll, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+20S+proteasome+from+yeast+at+2.4+A+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of 20S proteasome from yeast at 2.4 A resolution.</a> Nature. 386, 463-471 (1997).</li>
<li>Lander, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+subunit+architecture+of+the+proteasome+regulatory+particle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Complete subunit architecture of the proteasome regulatory particle.</a> Nature. 482, 186-191 (2012).</li>
<li>Lowe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+20S+proteasome+from+the+archaeon+T.+acidophilum+at+3.4+A+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the 20S proteasome from the archaeon T. acidophilum at 3.4 A resolution.</a> Science. 268, 533-539 (1995).</li>
<li>Hu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+Mycobacterium+tuberculosis+proteasome+and+mechanism+of+inhibition+by+a+peptidyl+boronate%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Structure of the Mycobacterium tuberculosis proteasome and mechanism of inhibition by a peptidyl boronate.</a> Mol Microbiol. 59, 1417-1428 (2006).</li>
<li>Zwickl, P., Kleinz, J., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+elements+in+proteasome+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Critical elements in proteasome assembly.</a> Nat Struct Biol. 1, 765-770 (1994).</li>
<li>Groll, M., Brandstetter, H., Bartunik, H., Bourenkow, G., Huber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigations+on+the+maturation+and+regulation+of+archaebacterial+proteasomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Investigations on the maturation and regulation of archaebacterial proteasomes.</a> J Mol Biol. 327, 75-83 (2003).</li>
<li>Frankenberg, R. J., Hsu, T. S., Yakota, H., Kim, R., Clark, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+denaturation+and+elevated+folding+temperatures+are+required+for+wild-type+activity+and+stability+of+recombinant+Methanococcus+jannaschii+20S+proteasome%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Chemical denaturation and elevated folding temperatures are required for wild-type activity and stability of recombinant Methanococcus jannaschii 20S proteasome.</a> Protein Sci. 10, 1887-1896 (2001).</li>
<li>Maupin-Furlow, J. A., Aldrich, H. C., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+the+20S+proteasome+from+the+methanoarchaeon+Methanosarcina+thermophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of the 20S proteasome from the methanoarchaeon Methanosarcina thermophila.</a> J Bacteriol. 180, 1480-1487 (1998).</li>
<li>Maupin-Furlow, J. A., Ferry, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proteasome+from+the+methanogenic+archaeon+Methanosarcina+thermophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A proteasome from the methanogenic archaeon Methanosarcina thermophila.</a> J Biol Chem. 270, 28617-28622 (1995).</li>
<li>Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Blue native PAGE.</a> Nat Protoc. 1, 418-428 (2006).</li>
<li>Langer, T., Pfeifer, G., Martin, J., Baumeister, W., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaperonin-mediated+protein+folding%3A+GroES+binds+to+one+end+of+the+GroEL+cylinder%2C+which+accommodates+the+protein+substrate+within+its+central+cavity%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Chaperonin-mediated protein folding: GroES binds to one end of the GroEL cylinder, which accommodates the protein substrate within its central cavity.</a> EMBO J. 11, 4757-4765 (1992).</li>
<li>McKenzie, M., Lazarou, M., Thorburn, D. R., Ryan, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+subunit+assembly+into+respiratory+chain+complexes+using+Blue+Native+polyacrylamide+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial subunit assembly into respiratory chain complexes using Blue Native polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Anal Biochem. 364, 128-137 (2007).</li>
<li>Tomko, R. J., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+the+Rpn12+subunit+couples+completion+of+proteasome+regulatory+particle+lid+assembly+to+lid-base+joining%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Incorporation of the Rpn12 subunit couples completion of proteasome regulatory particle lid assembly to lid-base joining.</a> Mol Cell. 44, 907-917 (2011).</li>
<li>Panfair, D., Ramamurthy, A., Kusmierczyk, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-ring+Independent+Assembly+of+the+20S+Proteasome%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Alpha-ring Independent Assembly of the 20S Proteasome.</a> Sci Rep. 5, 13130(2015).</li>
<li>Zimmerman, S. B., Trach, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+macromolecule+concentrations+and+excluded+volume+effects+for+the+cytoplasm+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Estimation of macromolecule concentrations and excluded volume effects for the cytoplasm of Escherichia coli.</a> J Mol Biol. 222, 599-620 (1991).</li>
<li>Kusmierczyk, A. R., Kunjappu, M. J., Kim, R. Y., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+20S+proteasome+assembly+factor+requires+a+C-terminal+HbYX+motif+for+proteasomal+precursor+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A conserved 20S proteasome assembly factor requires a C-terminal HbYX motif for proteasomal precursor binding.</a> Nat Struct Mol Biol. 18, 622-629 (2011).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal Biochem. 150, 76-85 (1985).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li>
<li>Chen, P., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autocatalytic+subunit+processing+couples+active+site+formation+in+the+20S+proteasome+to+completion+of+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Autocatalytic subunit processing couples active site formation in the 20S proteasome to completion of assembly.</a> Cell. 86, 961-972 (1996).</li>
<li>Li, X., Kusmierczyk, A. R., Wong, P., Emili, A., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Subunit+appendages+promote+20S+proteasome+assembly+by+overcoming+an+Ump1-dependent+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">beta-Subunit appendages promote 20S proteasome assembly by overcoming an Ump1-dependent checkpoint.</a> EMBO J. 26, 2339-2349 (2007).</li>
<li>Kusmierczyk, A. R., Kunjappu, M. J., Funakoshi, M., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multimeric+assembly+factor+controls+the+formation+of+alternative+20S+proteasomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A multimeric assembly factor controls the formation of alternative 20S proteasomes.</a> Nat Struct Mol Biol. 15, 237-244 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Pokazujemy korzyści płynące z połączonego podejścia do analizy składania proteasomu przez niedenaturację PAGE przy użyciu rekombinowanych proteasomów archeonów. Zwykła metoda9,11 bakteryjnej koekspresji podjednostek proteasomu pozwala na szybką analizę, ale może nie ujawniać kluczowych produktów pośrednich. Sugerujemy połączenie koekspresji z mieszaniem lizatu w celu opracowania szerszego obrazu zdarzeń montażowych.
Zaletą tego połączonego podejścia jest to, że pomimo konieczności o...

Kompleksy wielobiałkowe przeprowadzają wiele krytycznych działań komórkowych1. W przypadku wielu z tych kompleksów znacznie więcej wiadomo o ich budowie i funkcji niż o ich montażu2,3. Proteasom jest jednym z takich kompleksów i występuje we wszystkich dziedzinach życia. U eukariontów ta maszyna molekularna stanowi rdzeń układu ubikwityna/proteasom (UPS) i zapewnia główną drogę wewnątrzkomórkowej degradacji białek4. Proteasom eukariotyczny (określany jako proteasom 26S) składa się z dwóch głównych podzespołów: proteasomu 20S lub cząstki rdzenia (CP)5, która może być zamknięta na jednym lub obu końcach cząstką regulatorową 19S (RP)6.
Proteasom 20S to duża proteaza podzielona na przedziały. Jego czwartorzędowa struktura jest absolutnie zachowana we wszystkich dziedzinach życia i składa się ze stosu czterech siedmioczłonowych pierścieni zawierających dwa typy strukturalnie powiązanych podjednostek, α i β5,7,8. U eukariontów dwa zewnętrzne pierścienie składają się z siedmiu odrębnych podjednostek α, a dwa wewnętrzne pierścienie składają się z siedmiu odrębnych podjednostek β; Aktywność proteolityczna znajduje się w trzech β podjednostkach. Natomiast pierścienie CP archeonów i bakterii zwykle składają się tylko z jednego rodzaju α i jednego rodzaju podjednostki β. Archeomy proteasomy dostarczyły ważnego systemu modelowego do badania składania proteasomów zarówno ze względu na ich prostotę składu, jak i dzielenie wspólnego mechanizmu składania z ich eukariotycznymi odpowiednikami9-13. Krótko mówiąc, α podjednostki najpierw łączą się w α pierścienie, które służą jako rusztowanie, na którym gromadzą się β podjednostki. Powstałe półproteasomy (α7β7) dimeryzują, dając początek w pełni złożonemu CP (α7β7β7α7). Podczas dimeryzacji propeptydy obecne na podjednostkach β są autokatalitycznie usuwane, odsłaniając katalityczne N-końcowe treoniny. Wykorzystanie proteasomów archeonów do składania modeli często wykorzystuje produkcję rekombinowanych białek proteasomu archeonów w Escherichia coli. Jest to opłacalne podejście, ponieważ umożliwia wytwarzanie podjednostek w różnych kombinacjach, zarówno jako wersje WT, jak i zmutowane, w organizmie gospodarza, który nie wytwarza własnych proteasomów.
Monitorowanie biochemicznego składania kompleksów wielobiałkowych wymaga jakiejś metody frakcjonowania, która oddziela w pełni złożone kompleksy od półproduktów i prekursorów składania. Ze względu na doskonałą zdolność rozdzielczą, niedenaturująca elektroforeza w żelu poliakrylamidowym (PAGE) okazała się szczególnie przydatna we frakcjonowaniu różnych dużych kompleksów wielobiałkowych14-17. Połączenie rekombinowanej produkcji proteasomu archeonów i niedenaturującego PAGE stało się potężnym podejściem do analizy składania proteasomów9,11,12,18. Jednak zwykła metoda, za pomocą której stosuje się to podejście (tj. poprzez rekombinowaną koekspresję podjednostek α i β) ma istotną wadę. Reakcje składania są kooperacyjne i silnie zależne od stężenia3. Biorąc pod uwagę, że stężenie białka wewnątrz komórek jest bardzo wysokie19, ze względu na wykluczone efekty objętościowe, reakcje składania przebiegają szybko in vivo. W związku z tym możliwe jest pominięcie ważnych półproduktów montażowych, gdy α i β podjednostki są współwyrażane.
Tutaj opowiadamy się za podejściem łączonym w badaniu składania proteasomów przy użyciu rekombinowanych podjednostek proteasomu archeonów. W tym podejściu stosuje się zarówno metody koekspresji, jak i mieszania lizatu. Pierwsza z nich pozwala na szybką analizę montażu, ponieważ koekspresja jest mniej pracochłonna. To ostatnie polega na oddzielnej ekspresji podjednostek α i β, a następnie mieszaniu. Chociaż wymaga to nieco więcej wysiłku niż koekspresja, jest to z nawiązką rekompensowane przez zdolność do wykrywania produktów pośrednich, które są pomijane podczas koekspresji. Razem te dwie metody mogą zapewnić pełniejszy obraz składania proteasomów.

<table><tbody><tr><td>Roztwór akrylamidu (40%)</td><td>Biorad</td><td>1610104</td><td>Niespolimeryzowany akryloamid jest neurotoksyną. Nosić odpowiedni sprzęt ochronny</td></tr><tr><td>Filtry odśrodkowe Amicon ultra 0,5 ml</td><td>EMDMillipore</td><td>UFC501024</td><td></td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu</td><td>Sigma</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania BCA</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór bisakryloamidu (2%)</td><td>Biorad</td><td>1610142</td><td></td></tr><tr><td>Błękit</td> <td>bromofenolowySigma</td><td>B8026</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Sigma</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Ditiothreitol (DTT)</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP172</td><td></td></tr><tr><td>E. coli BL21 kompetentne komórki</td><td>EMD Millipore</td><td>69450</td><td></td></tr><tr><td>GelCode Blue</td><td>Thermo Fisher</td><td>24592</td><td>Koloidalny odczynnik do barwienia coomassie do żeli</td></tr><tr><td>Żel doc EZ system</td><td>Biorad</td><td>1708270</td><td>System dokumentacji żelu</td></tr><tr><td>Uwalniacze żelu</td><td>Biorad</td><td>1653320</td><td>Tworzywo sztuczne w kształcie klina służące do oddzielania płytek żelowych; przydatne do rozprowadzania cieczy.</td></tr><tr><td>Pręt szklany</td><td>Thermo Fisher</td><td>11-380B</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>49767</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP3865</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka Hamilton</td><td>Thermo Fisher</td><td>14-813-38</td><td>Szklana strzykawka do ładowania żeli</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>US Biologicals</td><td>H2010</td><td></td></tr><tr><td>HMW Natywny zestaw kalibracyjny</td><td>GE Healthcare</td><td>170445-01</td><td>Wzorce białek o wysokiej masie cząsteczkowej</td></tr><tr><td>Hoefer SG30</td><td>Thermo Fisher</td><td>03-500-277</td><td>Producent gradientów</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>US Biologicals</td><td>280671</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>US Biologicals</td><td>I8500</td><td>Do indukcji ekspresji białka</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP26181</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan kanamycyny</td><td>US Biologicals</td><td>K0010</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Sigma</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fluka analityczny</td><td>630680</td><td></td></tr><tr><td>Mini Protean Tetra Cell</td><td>Biorad</td><td>1658002EDU</td><td>Aparat do elektroforezy żelowej</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Thermo Fisher</td><td>S640-3</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Thermo Fisher</td><td>S318-1</td><td></td></tr><tr><td>Pefabloc SC</td><td>Roche</td><td>11429876001</td><td>Inhibitor proteazy</td></tr><tr><td>pET42</td><td>EMD Milipor</td><td>70562</td><td>Ekspresja plazmidu</td></tr><tr><td>Precyzja plus cały niebieski standard</td><td>Biorad</td><td>1610373</td><td>Molekularny wzorzec białka dla SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Zestaw do szybkiej zmiany mutagenezy</td><td>Technologie Agilent</td><td>200521</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu (SDS)</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP166</td><td></td></tr><tr><td>Suc-LLVY-AMC</td><td>Enzo lifesciences</td><td>BML P802-0005</td><td>Podłoże fluorogenne</td></tr><tr><td>Talon Metal Affinity Resin</td><td>Clontech</td><td>635502</td><td>Immobilizowana żywica kobaltowa</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma</td><td>T7024</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>US Biologicals</td><td>T8600</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Sigma</td><td>93426</td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Bacto BD</td><td></td><td></td>211699</tr><tr><td>Tacka na próbki UV</td><td>Biorad</td><td>1708271</td><td>Do obrazowania UV żeli</td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Bacto BD</td><td>212720</td><td></td></tr></tbody></table>

badanie składania proteasomu za pomocą rekombinowanych proteasomów archeonów i niedenaturujących page: argumenty przemawiające za podejściem łączonym

Examining Proteasome Assembly with Recombinant Archaeal Proteasomes and Nondenaturing PAGE:  The Case for a Combined Approach

Proteasomy znajdują się we wszystkich dziedzinach życia. Stanowią główną drogę wewnątrzkomórkowej degradacji białek u eukariontów, chociaż ich składanie nie jest w pełni zrozumiałe. Wszystkie proteasomy zawierają strukturalnie konserwowaną cząstkę rdzenia (CP) lub proteasom 20S, zawierającą dwa pierścienie podjednostek heptamerycznych β umieszczone między dwoma pierścieniami podjednostek heptamerycznych α. Archeonowe proteasomy 20S są składem prostszym w porównaniu do swoich eukariotycznych odpowiedników, ale oba mają wspólny mechanizm składania. W związku z tym proteasomy archeonów 20S nadal są ważnymi modelami składania proteasomów eukariotycznych. W szczególności rekombinowana ekspresja archeonów proteasomów 20S w połączeniu z niedenaturującą elektroforezą w żelu poliakrylamidowym (PAGE) dostarczyła wielu ważnych informacji na temat biogenezy proteasomów. W tym miejscu omawiamy sposoby ulepszenia zwykłej strategii koekspresji podjednostek proteasomu archeonów α i β przed niedenaturującym PAGE. Pokazujemy, że chociaż szybkie i wydajne, samo podejście do koekspresji może pominąć kluczowe produkty pośrednie montażu. W przypadku proteasomu koekspresja może nie pozwalać na wykrycie półproteasomu, produktu pośredniego zawierającego jeden kompletny pierścień α i jeden kompletny pierścień β. Jednak ten produkt pośredni jest łatwo wykrywalny przez mieszanie lizatu. Sugerujemy, że połączenie koekspresji z mieszaniem lizatu daje podejście, które jest bardziej dokładne w analizie montażu, ale pozostaje niepracochłonne. Takie podejście może być przydatne do badania innych rekombinowanych kompleksów wielobiałkowych.

Montaż proteasomu (Rysunek 1) rozpoczyna się, gdy podjednostki α łączą się, tworząc pierścienie9. Można to zilustrować, gdy podjednostki α z archeona Methanococcus maripaludis S2 są ekspresjonowane w E. coli jako pochodne z sześciohistydynową etykietą na C-końcu (his-tag) (Tabela 1). Po oczyszczeniu rekombinowanego białka α-his metodą ICAR i analizie za pomocą nieodtwarzającej elektroforezy w żelu PAGE zaobserwowano dwa prążki (Rysunek 2A, śc...

Ten protokół wykorzystuje zarówno koekspresję podjednostek, jak i mieszanie podjednostek postlizy w celu dokładniejszego zbadania złożenia rekombinowanego proteasomu.

Badanie składania proteasomu za pomocą rekombinowanych proteasomów archeonów i niedenaturujących PAGE: Argumenty przemawiające za podejściem łączonym

Proteasomes are found in all domains of life. They provide the major route of intracellular protein degradation in eukaryotes, though their assembly is ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest analiza składania wielobiałkowego kompleksu, takiego jak proteasom, z wykorzystaniem rekombinowanych podjednostek oraz nieoddenaturującej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE). Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad proteasomami, takie jak to, jakie gatunki pośrednie pojawiają się na ścieżce składania tego kompleksu białkowego. Główną zaletą tej techniki jest możliwość szybkiego przesiewania procesu składania za pomocą dwóch równoległych podejść, co pozwala na wykrycie produktów pośrednich znajdujących się na ścieżce głównej oraz pobocznych. Procedura ta rozpoczyna się od ekspresji bakteryjnej opisanej w protokole tekstowym. Aby przeprowadzić lizę bakteryjną, rozmrozić na lodzie przez pięć minut indukowany osad komórkowy koekspresujący pożądaną kombinację podjednostek proteasomu. Po rozmrożeniu resuspender osad w 600 µL Buforu do Lizy. Inkubować zawiesinę w temperaturze 30

examining-proteasome-assembly-with-recombinant-archaeal-proteasomes

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Oczyszczanie powinowactwa oznaczonych białek w połączeniu ze spektrometrią mas (APMS) to potężna metoda systematycznego mapowania sieci interakcji białek i badania mechanistycznych podstaw procesów biologicznych. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowaną procedurę APMS opartą na powinowactwie do peptydów sekwencyjnych (SPA) opracowaną dla bakterii Escherichia coli, która może być stosowana do izolowania i charakteryzowania stabilnych kompleksów wielobiałkowych do niemal jednorodności, nawet...

Identyfikacja kompleksów białkowych w Escherichia coli za pomocą sekwencyjnego oczyszczania powinowactwa peptydów w połączeniu z tandemową spektrometrią mas

W tym filmie demonstrujemy komórkowy test agregacji białek za pomocą inhibitorów proteasomów, które blokują aktywność proteasomu, zapobiegając nieprawidłowo sfałdowanym, zmutowanym białkom, połączonym z fluorescencyjnym znacznikiem, przed degradacją proteasomalną zależną od ubikwityny, prowadzącą do ich akumulacji w cytoplazmie komórki. Agregaty białkowe są następnie wizualizowane i oznaczane ilościowo za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Test tworzenia agregatów białkowych: metoda wykrywania i ilościowego określania agregacji białek w hodowanych komórkach po indukcji przez inhibitor proteasomu

Opisane porównawcze, ilościowe podejście proteomiczne ma na celu uzyskanie wglądu w skład kompleksów wielobiałkowych w różnych warunkach i jest demonstrowane przez porównanie genetycznie różnych szczepów. Do analizy ilościowej równe objętości różnych frakcji z gradientu gęstości sacharozy miesza się i analizuje za pomocą spektrometrii mas.

Nowe podejście do analizy porównawczej kompleksów wielobiałkowych oparte na znakowaniu metabolicznym 15N i ilościowej spektrometrii mas

Ukierunkowana degradacja białek stanowi główny mechanizm regulujący funkcjonowanie komórki. Zachodzi za pośrednictwem konserwatywnego szlaku ubikwityna-proteasom, który przyłącza łańcuchy poliubikwityny do białka docelowego, które następnie służą jako molekularne "znaczniki" dla proteasomu 26S. W tym miejscu opisujemy prosty i niezawodny bezkomórkowy test proteasomalnej degradacji białek.

Oznaczanie degradacji proteasomalnej w systemie bezkomórkowym u roślin

Przedstawiono metodę stabilizacji i separacji natywnych kompleksów białkowych z niemodyfikowanego lizatu tkankowego za pomocą aminowo-reaktywnego białka sieciującego sprzężonego z nowatorskim dwuwymiarowym systemem elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE).

Multimer-PAGE: Metoda wychwytywania i rozdzielania kompleksów białkowych w próbkach biologicznych

Tutaj prezentujemy protokoły oczyszczania kompleksów białkowych i ich separacji za pomocą niebieskiej natywnej STRONY, a następnie profilowania korelacji białek za pomocą ilościowej spektrometrii mas bez etykiet. Ta metoda jest przydatna do przekształcania interaktomów w odrębne kompleksy białkowe.

Rozwiązywanie kompleksów białkowych oczyszczonych z powinowactwa za pomocą Blue Native PAGE i profilowania korelacji białek

Architektura kompleksów białkowych jest niezbędna dla ich funkcjonowania. Połączenie różnych technik spektrometrii mas okazało się skuteczne w badaniu ich składania. Udostępniamy protokoły sieciowania chemicznego i natywnej spektrometrii mas oraz pokazujemy, w jaki sposób te uzupełniające się techniki pomagają wyjaśnić architekturę wielopodjednostkowych zespołów białkowych.

Połączenie chemicznego sieciowania i spektrometrii mas nienaruszonych kompleksów białkowych w celu zbadania architektury wielopodjednostkowych zespołów białkowych

Ta metoda opisuje klonowanie, ekspresję i oczyszczanie rekombinowanego Nsa1 do określania strukturalnego za pomocą krystalografii rentgenowskiej i rozpraszania promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem (SAXS), i ma zastosowanie do hybrydowej analizy strukturalnej innych białek zawierających zarówno uporządkowane, jak i nieuporządkowane domeny.

Połączenie krystalografii rentgenowskiej z rozpraszaniem promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem w celu modelowania nieustrukturyzowanych obszarów Nsa1 z S. cerevisiae

Interakcje białko-białko i białko-metabolit są kluczowe dla wszystkich funkcji komórkowych. W niniejszym artykule opisujemy protokół, który umożliwia równoległą analizę tych interakcji z wybranym białkiem. Nasz protokół został zoptymalizowany pod kątem hodowli komórek roślinnych i łączy oczyszczanie powinowactwa z wykrywaniem białek i metabolitów opartym na spektrometrii mas.

2 w 1: Jednoetapowe oczyszczanie powinowactwa do równoległej analizy kompleksów białko-białko i białko-metabolit

Pokrewne białka domeny J współpracują z opiekunem Hsp70, aby pomóc w niezliczonych procesach biologicznych, począwszy od fałdowania białek, a skończywszy na degradacji. W tym miejscu opisujemy test ligacji zbliżeniowej in situ, który umożliwia monitorowanie tych przejściowo utworzonych mechanizmów opiekuńczych w komórkach bakteryjnych, drożdżowych i ludzkich.

Monitorowanie in situ przejściowo utworzonych molekularnych zespołów opiekuńczych w bakteriach, drożdżach i komórkach ludzkich

Ten protokół szczegółowo opisuje przygotowanie kompleksów nukleosomalnych przy użyciu dwóch metod przygotowania próbek do zamrażania siatek TEM.

Przygotowanie cząstek rdzenia nukleosomów skompleksowanych z czynnikami naprawy DNA do oznaczania strukturalnego w mikroskopii krioelektronowej

Poznaj metodę badania składania proteasomu z użyciem rekombinowanych podjednostek archeonów i niedenaturującego PAGE. To podejście pozwala szybko analizować dynamikę montażu kompleksu białkowego.

Badanie składania proteasomu za pomocą rekombinowanych proteasomów archeonów i niedenaturujących PAGE: Argumenty przemawiające za podejściem łączonym (Wideo) | JoVE Journal

Badanie składania proteasomu za pomocą rekombinowanych proteasomów archeonów i niedenaturujących PAGE: Argumenty przemawiające za podejściem łączonym

Przeglądaj więcej filmów