Name: Wykluczenie według wielkości i chromatografia jonowymienna online na linii badawczej SAXS (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Poznaj metodę SEC i IEC online z SAXS w biologii strukturalnej. Techniki te poprawiają jakość danych poprzez minimalizację opóźnień między przygotowaniem próbki a pomiarem, zapobiegając denaturacji białek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy za wsparcie finansowe dla projektu z francuskiego grantu REPLIPOX ANR-13-BSV8-0014 oraz z grantów badawczych od Service de Santé des Armées i Délégation Générale pour l'Armement. Jesteśmy wdzięczni ESRF za czas poświęcony na wiązkę SAXS. Dziękujemy Andrew McCarthy'emu, Gordonowi Leonardowi, Wimowi Burmeisterowi i Guyowi Schoehnowi za wsparcie finansowe i naukowe.

<ol><li>Graewert, M. A., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+and+progress+in+small+and+wide+angle+X-ray+scattering+%28SAXS+and+WAXS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Impact and progress in small and wide angle X-ray scattering (SAXS and WAXS).</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 23, 748-754 (2013).</li>
<li>Jacques, D. A., Trewhella, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-angle+scattering+for+structural+biology-Expanding+the+frontier+while+avoiding+the+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Small-angle scattering for structural biology-Expanding the frontier while avoiding the pitfalls.</a> Protein Sci. 19, 642-657 (2010).</li>
<li>Kikhney, A. G., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+small+angle+X-ray+scattering+%28SAXS%29+of+flexible+and+intrinsically+disordered+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">A practical guide to small angle X-ray scattering (SAXS) of flexible and intrinsically disordered proteins.</a> FEBS Lett. 589, 2570-2577 (2015).</li>
<li>Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+solution+scattering+%28SAXS%29+combined+with+crystallography+and+computation%3A+defining+accurate+macromolecular+structures%2C+conformations+and+assemblies+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Q.+Rev.+Biophys%22%5BJournal%5D)">X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution.</a> Q. Rev. Biophys. 40, 191-285 (2007).</li>
<li>Vestergaard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+biostructural+changes%2C+dynamics%2C+and+interactions+-+Small-angle+X-ray+scattering+to+the+rescue%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Analysis of biostructural changes, dynamics, and interactions - Small-angle X-ray scattering to the rescue.</a> Arch. Biochem. Biophys. , (2016).</li>
<li>David, G., Pérez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+sampler+robot+and+high-performance+liquid+chromatography%3A+a+fully+automated+system+for+biological+small-angle+X-ray+scattering+experiments+at+the+Synchrotron+SOLEIL+SWING+beamline%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Combined sampler robot and high-performance liquid chromatography: a fully automated system for biological small-angle X-ray scattering experiments at the Synchrotron SOLEIL SWING beamline.</a> J. Appl. Crystallogr. 42, 892-900 (2009).</li>
<li>Graewert, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+Pipeline+for+Purification%2C+Biophysical+and+X-Ray+Analysis+of+Biomacromolecular+Solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Automated Pipeline for Purification, Biophysical and X-Ray Analysis of Biomacromolecular Solutions.</a> Sci. Rep. 5, (2015).</li>
<li>Lambright, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementary+techniques+enhance+the+quality+and+scope+of+information+obtained+from+SAXS%5BTitle%5D)+AND+%22ACA+Trans%22%5BJournal%5D)">Complementary techniques enhance the quality and scope of information obtained from SAXS.</a> ACA Trans. , 1-12 (2013).</li>
<li>Mathew, E., Mirza, A., Menhart, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid-chromatography-coupled+SAXS+for+accurate+sizing+of+aggregating+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Synchrotron+Radiat%22%5BJournal%5D)">Liquid-chromatography-coupled SAXS for accurate sizing of aggregating proteins.</a> J. Synchrotron Radiat. 11, 314-318 (2004).</li>
<li>Round, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+GH3.+12+protein+conformation+through+HPLC-integrated+SAXS+measurements+combined+with+X-ray+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+Sect.+D.+Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Determination of the GH3. 12 protein conformation through HPLC-integrated SAXS measurements combined with X-ray crystallography.</a> Acta Crystallogr. Sect. D. Biol. Crystallogr. 69, 2072-2080 (2013).</li>
<li>Watanabe, Y., Inoko, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-exclusion+chromatography+combined+with+small-angle+X-ray+scattering+optics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr%22%5BJournal%5D)">Size-exclusion chromatography combined with small-angle X-ray scattering optics.</a> J. Chromatogr. 1216, 7461-7465 (2009).</li>
<li>Hutin, S., Brennich, M. E., Maillot, B., Round, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Online+ion-exchange+chromatography+for+small+angle+X-ray+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst%22%5BJournal%5D)">Online ion-exchange chromatography for small angle X-ray scattering.</a> Acta Cryst. , (2016).</li>
<li>Selkirk, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion-exchange+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Purification+Protocols%22%5BJournal%5D)">Ion-exchange chromatography.</a> Protein Purification Protocols. , 125-131 (2004).</li>
<li>Yigzaw, Y., Hinckley, P., Hewig, A., Vedantham, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+exchange+chromatography+of+proteins+and+clearance+of+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Pharm.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Ion exchange chromatography of proteins and clearance of aggregates.</a> Curr. Pharm. Biotechnol. 10, 421-426 (2009).</li>
<li>Pernot, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upgraded+ESRF+BM29+beamline+for+SAXS+on+macromolecules+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Synchrotron+Radiat%22%5BJournal%5D)">Upgraded ESRF BM29 beamline for SAXS on macromolecules in solution.</a> J. Synchrotron Radiat. 20, 660-664 (2013).</li>
<li>Iyer, L. M., Koonin, E. V., Leipe, D. D., Aravind, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+evolution+of+the+archaeo-eukaryotic+primase+superfamily+and+related+palm-domain+proteins%3A+structural+insights+and+new+members%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Origin and evolution of the archaeo-eukaryotic primase superfamily and related palm-domain proteins: structural insights and new members.</a> Nucleic Acids Res. 33, 3875-3896 (2005).</li>
<li>Singleton, M. R., Dillingham, M. S., Wigley, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+mechanism+of+helicases+and+nucleic+acid+translocases%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Structure and mechanism of helicases and nucleic acid translocases.</a> Annu. Rev. Biochem. 76, 23-50 (2007).</li>
<li>Hutin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Domain+organization+of+vaccinia+virus+helicase-primase+D5%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Domain organization of vaccinia virus helicase-primase D5.</a> J. Virol. , 4604-4613 (2016).</li>
<li>Round, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BioSAXS+Sample+Changer%3A+a+robotic+sample+changer+for+rapid+and+reliable+high-throughput+X-ray+solution+scattering+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+Sect.+D.+Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">BioSAXS Sample Changer: a robotic sample changer for rapid and reliable high-throughput X-ray solution scattering experiments.</a> Acta Crystallogr. Sect. D. Biol. Crystallogr. 71, 67-75 (2015).</li>
<li>De Maria Antolinos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ISPyB+for+BioSAXS%2C+the+gateway+to+user+autonomy+in+solution+scattering+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%22%5BJournal%5D)">ISPyB for BioSAXS, the gateway to user autonomy in solution scattering experiments.</a> Acta Crystallographica Section D. 71, 76-85 (2015).</li>
<li>Brennich, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Online+data+analysis+at+the+ESRF+bioSAXS+beamline%2C+BM29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Online data analysis at the ESRF bioSAXS beamline, BM29.</a> J. Appl. Crystallogr. 49, (2016).</li>
<li>Petoukhov, M. V., Konarev, P. V., Kikhney, A. G., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATSAS+2.1-towards+automated+and+web-supported+small-angle+scattering+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">ATSAS 2.1-towards automated and web-supported small-angle scattering data analysis.</a> J. Appl. Crystallogr. 40, 223-228 (2007).</li>
<li>Franke, D., Jeffries, C. M., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+Map%2C+a+goodness-of-fit+test+for+one-dimensional+X-ray+scattering+spectra%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Correlation Map, a goodness-of-fit test for one-dimensional X-ray scattering spectra.</a> Nat. Methods. 12, 419-422 (2015).</li>
<li>Schrodinger, LLC. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+PyMOL+Molecular+Graphics+System%2C+Version+1.8%22">The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8</a>. , (2015).</li>
<li>Jensen, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-resolved+SAXS+measurements+facilitated+by+online+HPLC+buffer+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Synchrotron+Radiat%22%5BJournal%5D)">Time-resolved SAXS measurements facilitated by online HPLC buffer exchange.</a> J. Synchrotron Radiat. 17, 769-773 (2010).</li>
<li>Hynson, R. M., Duff, A. P., Kirby, N., Mudie, S., Lee, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+ultracentrifugation+coupled+to+small-angle+X-ray+scattering+on+macromolecular+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Differential ultracentrifugation coupled to small-angle X-ray scattering on macromolecular complexes.</a> J. Appl. Crystallogr. 48, 769-775 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W przypadku wielu makrocząsteczek przed zebraniem danych SAXS wymagany jest końcowy etap oczyszczania za pomocą chromatografii w celu uzyskania zestawu danych dobrej jakości. Jednak nie wszystkie próbki pozostają stabilne; Mogą być podatne na agregację lub rebalansację do mieszaniny stanów oligomeryzacji. W związku z tym wymagany jest końcowy etap oczyszczania online na linii badawczej, aby zminimalizować czas między oczyszczaniem a zbieraniem danych w celu uzyskania najlepszej jakości danych SAXS. W zależności od właściwości biofizycznych białka będącego przedmiotem zainteresowania, w celu uzyskania optymalnej jakości próbki można wybrać SEC-SAXS lub IEC-SAXS. Tutaj, na konstrukcie białkowym pochodzącym z helikazy/prymazy D5, obie techniki są wyjaśnione i omówione.
Akwizycja danych SEC-SAXS staje się coraz bardziej ustandaryzowana i jest dostępna na wielu liniach badawczych BioSAXS. Analiza danych, a zwłaszcza odejmowanie tła, jest stosunkowo prosta i łatwa. Niezbędny pozostaje jednak stabilny sygnał buforowy i wystarczająca separacja gatunków wielkocząsteczkowych. Dlatego tak ważne jest, aby zarezerwować wystarczająco dużo czasu, aby dokładnie wyrównać kolumnę. Niepowodzenie tej metody może być spowodowane trwałymi zanieczyszczeniami o wielkości podobnej do białka będącego przedmiotem zainteresowania, niskimi stężeniami i wrażliwymi na promieniowanie.
W praktyce, początkowo, SEC-SAXS będzie prawdopodobnie stosowana jako metoda z wyboru dla większości próbek makromolekularnych. Mimo to wiele protokołów oczyszczania wymaga wcześniejszego kroku IEC ze względu na obecność zanieczyszczeń lub agregację. Biorąc pod uwagę, że każdy etap koncentracji i chromatografii wiąże się ze stratami próbki (szacowanymi na 30-50%) i czasem, bezpośredni IEC-SAXS jest korzystny. W przypadku próbek, których nie można oczyścić metodą SEC, czy to ze względu na obecność "zanieczyszczeń" o podobnej wielkości, czy też dlatego, że poważnie agregują się w niezbędnych stężeniach, IEC-SAXS zawsze będzie lepszym podejściem. Ponadto wyższe natężenia przepływu obsługiwane przez wiele kolumn IEC mogą pomóc w skróceniu czasu przejścia między oczyszczaniem a pomiarem. W przedstawionym przykładzie zastosowano IEC z elucją krokową, która pozwala na oddzielenie bliskich pików D5323-785 od zanieczyszczeń poprzez staranny dobór stopni stężenia soli. Zasadniczo liczba kroków jest nieograniczona, ale w praktyce wymagany jest co najmniej 1 krok na szczyt i nie należy wybierać zbyt wiele. W przypadku opisanej powyżej metody odejmowania tła kluczowe jest zmierzenie stosunkowo dużej liczby różnych kompozycji buforowych w celu znalezienia pasującego.
Wspólną wadą obu technik jest brak precyzyjnych informacji o stężeniu białka. Z tego powodu precyzyjne określenie masy na podstawie rozpraszania do przodu nie jest możliwe. Dla białek globularnych, takich jak D5323-785, objętość Porod zapewnia alternatywne, choć mniej precyzyjne, oszacowanie masy, ale dla białek wysoce elastycznych lub nieuporządkowanych podejście to nie byłoby prawidłowe.
Odmianą przedstawionej tutaj metody gradientu krokowego IEC-SAXS jest zastosowanie gradientu liniowego. Podczas gdy możliwa jest praca z dowolną liczbą kroków w celu wyizolowania podpików za pomocą elucji krokowej, w podejściu gradientowym liniowym wymagana jest staranna optymalizacja warunków gradientu w celu całkowitego oddzielenia pików przed rozpoczęciem eksperymentu SAXS. Odejmowanie tła w tym podejściu mogłoby odbywać się klatkowo i mogłoby być weryfikowane przez porównanie poszczególnych ramek, ale wymaga to bardziej zaawansowanej obsługi danych, a dedykowane oprogramowanie jeszcze nie istnieje.
Wybór odpowiedniej kolumny ma kluczowe znaczenie dla obu technik, ponieważ decyduje o separacji gatunków makromolekularnych. Kolumny wykluczające wielkość różnią się nośnością, zakresem wielkości oddzielalnych makrocząsteczek i rozdzielczością, podczas gdy kolumny jonowymienne różnią się rodzajem i gęstością ich unieruchomionych ładunków.
Podczas gdy przedstawiony tutaj protokół jest specyficzny dla linii badawczej ESRF BM29, adaptacja do każdej innej linii badawczej SAXS jest w zasadzie prosta. Główne wymagania to wystarczająco wysoki strumień promieniowania rentgenowskiego i odpowiedni detektor (najlepiej zliczający pojedyncze fotony), aby uzyskać rozsądne dane dotyczące stosunku sygnału do szumu w ciągu kilku sekund lub krócej, a także system chromatografii cieczowej online zdolny do tworzenia gradientów. Dokładna implementacja będzie oczywiście zależała od lokalnego środowiska linii badawczej.
Wyniki uzyskane na D5323-785 przy użyciu tych dwóch metod różnią się nieznacznie. Promień bezwładności jest nieco mniejszy dla danych IEC niż dla danych SEC, a lokalne minima krzywej rozpraszania są przesunięte do nieco większych wektorów rozpraszania. Oznacza to, że D5323-785 mierzony za pomocą IEC-SAXS jest nieco bardziej kompaktowy niż D5323-785 mierzony za pomocą SEC-SAXS. Może to być spowodowane różnicami w przygotowaniu próbki, czasem między oczyszczaniem a pomiarem (IEC jest szybszy) lub, co mniej prawdopodobne, zanieczyszczeniem w próbce oczyszczonej metodą SEC. Modele ściegów uzyskane całkowicie niezależnie za pomocą obu metod są porównywalne (rysunek 1H). D5323-785 pokazuje oczekiwaną pustą, heksameryczną strukturę18.
Podsumowując, wymiana jonowa online i chromatografia wykluczania wielkości online są ważnymi metodami oczyszczania biochemicznego, które można bezpośrednio sprzęgnąć z SAXS6,7,9-12,25,26. Odejmowanie tła danych IEC-SAXS jest nieco trudniejsze i bardziej niejednoznaczne niż w przypadku SEC-SAXS, ale mimo to jest możliwe. W zależności od właściwości biofizycznych białka będącego przedmiotem zainteresowania, zarówno SEC, jak i IEC-SAXS pozwalają na optymalizację separacji gatunków z nieodłącznymi korzyściami. Pod warunkiem, że kroki walidacji (zgodnie z opisem) są prawidłowo przestrzegane, uzyskane dane mogą być analizowane z pewnością, a modele mogą być określane przy użyciu standardowych narzędzi dostępnych w społeczności. Obie techniki umożliwiają separację online dla szerokiego zakresu makrocząsteczek biologicznych, uzyskując dane niedostępne za pomocą standardowych pomiarów statycznych.

BioSAXS to potężne narzędzie do określania kształtu obiektów o rozmiarachnano 1-4. Rozpraszanie promieni rentgenowskich przez roztwór zawierający makrocząsteczki o rozmiarach w zakresie nm rejestrowane jest pod bardzo małymi kątami. Ten zakres kątowy zawiera informacje o parametrach globalnych: promieniu bezwładności; największa odległość od wpustu; kształt cząstek; oraz stopień fałdowania, denaturacji lub nieporządku. Technika ta nie wymaga kryształów, a makrocząsteczka pozostaje w roztworze, a zatem może być przechowywana w warunkach naśladujących pewne ważne parametry komórki, takie jak siła jonowa, pH itp. Znajomość tych czynników może pomóc na przykład w określeniu fizjologicznie istotnego stanu oligomerycznego białka będącego przedmiotem zainteresowania lub w walidacji proponowanego modelu kompleksu. Charakterystyka oddziaływań białko-białko w różnych warunkach buforowych, tworzenie modeli brakujących domen, udoskonalanie modeli homologii oraz określanie dyskretnych stanów fałdowania i niesfałdowania może być przeprowadzone szybko iłatwo5.
Jak w przypadku każdej techniki, BioSAXS ma wewnętrzne słabości: zagregowane lub zdenaturowane próbki, mieszaniny cząstek, próbki niejednorodne, uszkodzenia spowodowane promieniowaniem i niedopasowania mogą skutkować niemożliwymi do zinterpretowania danymi. W przypadku wielu metod analizy zakłada się domyślnie, że próbka jest monodyspersyjna, co jest często wymogiem trudnym do uzyskania w praktyce. W wielu przypadkach degradacja próbki jest subtelna i nie można jej samodzielnie wykryć w danych, a każda próba interpretacji danych daje niedokładne lub nawet mylące wyniki. Aby przezwyciężyć te przeszkody, na wielu liniach badawczych zastosowano połączenie chromatografii wykluczającej wielkość (SEC) i SAXS, aby zapewnić jakość danych i uczynić tę technikę bardziej dostępną dla coraz trudniejszych próbek6-11. Niedawno dodaliśmy nową metodę do repertuaru, opracowując SAXS12 sprzężoną z chromatografią jonowymienną (IEC) online. Obie techniki otwierają SAXS na szeroki zakres cząstek biologicznych, które wcześniej były niemożliwe do analizy. Wybór metody zależy od właściwości biofizycznych interesujących nas cząstek.
SEC rozdziela makrocząsteczki według ich wielkości, przy czym do separacji potrzebne jest co najmniej 10% różnicy w pozornej masie cząsteczkowej. Fizyczne ograniczenia kolumny i właściwości fizjologiczne próbek, takie jak powierzchnie hydrofobowe, elastyczność i brak stabilności, również komplikują gromadzenie, analizę i interpretację danych.
Chromatografia jonowymienna, która rozdziela cząsteczki na podstawie ich ładunku, a co za tym idzie, ich powinowactwa wiązania do kolumny IEC, może być stosowana zamiast lub oprócz SEC. Całkowitym ładunkiem można łatwo manipulować poprzez zmianę pH lub zmianę stężenia soli w buforze, zapewniając stosunkowo prostą metodę kontrolowanej elucji cząsteczek z kolumny IEC. Dzięki zastosowaniu ładunku, separacja podobnych typów i rozmiarów cząsteczek, które w przeciwnym razie byłyby trudne do rozdzielenia, może być wykonywana rutynowo za pomocą IEC. Dodatkowo IEC ma tę zaletę, że jest w stanie poradzić sobie z rozcieńczonymi próbkami, co pozwala uniknąć etapów koncentracji, które niosą ze sobą potencjalne ryzyko denaturacji białka. Niestety, ponieważ rozkład ładunku jest w dużym stopniu zależny od próbki, IEC wymaga optymalizacji pod względem pH i stężeń soli13,14.
Dla wielu białek, które są trudne do ekspresji, oczyszczenia, lub obu, dostępne są tylko niewielkie ilości próbek do zbadania. Ważne jest, aby być wydajnym i zminimalizować liczbę etapów oczyszczania, a tym samym straty. Z tego powodu ostatni etap oczyszczania odbywa się w trybie online bezpośrednio przed akwizycją danych SAXS, aby zwiększyć prawdopodobieństwo zebrania dobrego zestawu danych.
Tutaj prezentujemy i porównujemy online SEC-SAXS i IEC-SAXS. Obie techniki zostały wdrożone na linii badawczej BioSAXS BM29 w Europejskim Ośrodku Promieniowania Synchrotronowego (ESRF) w Grenoblewe Francji 15. Jako przypadek testowy wykorzystaliśmy domenę D5N i helikazę białka wirusa krowianki D5, które było dość trudne do strukturalnej analizy przy użyciu innych metod. Wirus krowianki należy do rodziny Poxviridae i jest w 98% identyczny z wirusem ospy wietrznej, przyczyną ospy prawdziwej. Korzystając z systemu krowianki, badamy maszynerię replikacji, skupiając się tutaj na niezbędnej helikazie-prymazie D5.
D5 to białko o masie 95 kDa z N-końcową domeną archeo-eukariotycznej prymazy (AEP)16, po której następuje region klastra cysteiny (res. 240-345)16. Dalej w kierunku C-końca znajduje się domena D5N (res. 340-460), która jest zawsze związana z helikazami typu D5, a na końcu domena helikazy nadrodziny 3 (SF3) (res. 460-785) 17 (Rysunek 1A). Domena helikazy D5 buduje heksameryczną strukturę pierścieniową, która jest potrzebna do ścisłego wiązania się z DNA. Dzięki niedawnym badaniom SAXS i EM znane są obecnie niskorozdzielcze struktury domen prymazy i helikazy18.
Tutaj pokazujemy, jak korzystać z zaimplementowanych technik chromatografii online na linii badawczej BioSAXS BM29 w ESRF, aby uzyskać wgląd w strukturę C-końcowego fragmentu (reszta 323-785) D5.

<table><tbody><tr><td>1,4-ditiotreitol [DTT]</td><td>Euromedex</td><td>EU0006-B</td><td></td></tr><tr><td>10% Mini-PROTEAN TGX Prefabrykowany żel białkowy</td><td>Biorad</td><td>4561033</td><td></td></tr><tr><td>2x Phusion Flash PCR Master Mix</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>F 548</td><td></td></tr><tr><td>kwas octowy lodowaty</td><td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td><td>20104.298</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza D-5</td><td>Euromedex</td><td>LF45130653</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra -15 Filtry odśrodkowe Ultracel -30K</td><td>Millipore Ltd</td><td>UFC903024</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa ampicyliny</td><td>Euromedex</td><td>EU0400-D</td><td></td></tr><tr><td>Benzonaza</td><td>Novagene</td><td>70750-3</td><td></td></tr><tr><td>błękit bromofenolowy&nbsp;</td><td>MERCK</td><td>8122</td><td></td></tr><tr><td>Kompletny koktajl inhibitorów proteazy&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11231400</td><td></td></tr><tr><td>Econo-Pac 10 DG Kolumna odsalająca</td><td>Bio-rad</td><td>732-2010</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E-5134</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td><td>24388.295</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Euromedex</td><td>26-128-6405-C</td><td></td></tr><tr><td>HindIII</td><td>Roche</td><td>656313</td><td></td></tr><tr><td>HisSelect HF Powinowactwo do niklu Żel</td><td>Sigma</td><td>H0537</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny (HCl)</td><td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td><td>20252.295</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>AppliChem Panreac</td><td>A1073,0500</td><td></td></tr><tr><td>InstantBlue</td><td>Expedeon</td><td>ISB1L</td><td></td></tr><tr><td>LB bulion Miller</td><td>Fluka Analytical</td><td>L3152</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>ICN Biomedicals Inc.</td><td></td><td></td>191421</tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td><td>27808.297</td><td></td></tr><tr><td>NcoI</td><td>Fermentas</td><td>ER0571</td><td></td></tr><tr><td>One Shot BL21 Star (DE3)&nbsp;</td><td>Wektor wektorowy ThermoFisher scientific</td><td>C6010-03</td><td></td></tr><tr><td>pProEx HTb&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>10711018</td><td></td></tr><tr><td>Primer</td><td>&nbsp; Eurofins mwg operon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Zestaw miniprep</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Zestaw do ekstrakcji żelu</td><td>QIAGEN</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR oczyszczanie kid</td><td>QIAGEN</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>SDS&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>75746</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5172-01</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Bezpieczny barwnik żelowy DNA</td><td>Invitrogen life technology</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Ligaza T4</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>TEV</td><td></td><td></td><td>domowej roboty</td></tr><tr><td>TOP 10</td><td>technologii Invitrogen life</td><td>C404003&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Podstawa Tris</td><td>Euromedex</td><td>26-128-3094-B</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna Uno Q 1R&nbsp;</td><td>Bio-rad</td><td>720 0011</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-merkaptoetanol</td><td>MPBiomedicals, LLC</td><td>194834</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Softwares</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie BsXCuBE</td><td>ESRF</td><td>Pernot et al. (2013), J. Synchrotron Rad. 20, 660-664</td><td>rozwój lokalny</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Camserver</td><td>Oprogramowanie Dectris</td><td>n.a.detector</td> <td>oprogramowanie sterujące</td></tr><tr><td>DAMAVER</td><td>ATSAS 2.6.0</td><td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td><td>program do wyrównywania modeli ab initio&nbsp;</td></tr><tr><td>DAMMIF</td><td>ATSAS 2.6.0</td><td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td><td>ab initio program do rekonstrukcji modelu</td></tr> program <tr><td>HPLC Biologic Duo Flow</td><td>Bio-rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPLC program LabSolutions</td><td>Shimadzu</td><td>n.a.ISPyB</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>ESRF</td><td>De Maria Antolinos et al. (2015). Acta Cryst. D71, 76-85.</td><td>Rozwój lokalny</td></tr><tr><td>PRIMUS</td><td>ATSAS 2.6.0</td><td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td><td>program, który wykonuje manipulację eksperymentalnym SAXS</td></tr><tr><td>PyMOL</td><td>DeLano Scientific LLC</td><td>https://www.pymol.org/</td> <td>oprogramowanie do wizualizacji</td></tr><tr><td>SUPCOMB</td><td>ATSAS 2.6.0</td><td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td><td>program do nakładania struktur 3D</td></tr><tr><td>Name</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioLogic Duo Flow</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioLogic Biofrac Kolektor frakcji</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPLC system</td><td>Shimadzu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Labsonic P</td><td>Sartorius Stedim biotech</td><td>BBI8535108</td><td></td></tr></tbody></table>

wykluczenie według wielkości i chromatografia jonowymienna online na linii badawczej saxs

Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

Biologiczne rozpraszanie promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem (BioSAXS) to potężna technika w biologii molekularnej i strukturalnej, używana do określania struktury roztworu, wielkości i kształtu cząstek oraz stosunku powierzchni do objętości makromolekuł. Technika ta ma zastosowanie do bardzo szerokiej gamy warunków roztworu obejmujących szeroki zakres stężeń, wartości pH, siły jonowej, temperatur, dodatków itp., ale próbka musi być monodyspersyjna. To zastrzeżenie doprowadziło do wdrożenia systemów chromatografii cieczowej na liniach badawczych SAXS. W tym miejscu opisujemy wcześniejszą integrację wykluczania wielkości (SEC) i chromatografii jonowymiennej (IEC) na linii badawczej, różne metody optymalnego odejmowania tła i redukcji danych. Jako przykład opisujemy, w jaki sposób używamy SEC i IEC-SAXS na fragmencie niezbędnego białka wirusa krowianki D5, składającym się z domeny helikazy D5N. Określamy jego ogólny kształt i masę cząsteczkową, pokazując heksameryczną strukturę białka.

Wyniki analizy niezmienników w podejściu model-free przedstawiono w Tabeli 1. Analiza danych SEC-SAXS dla D5323-785 wykazała szacunkową masę cząsteczkową (na podstawie analizy Poroda) wynoszącą 345 kDa w porównaniu do 338 kDa zaobserwowanych w IEC-SAXS. Obie wartości są zgodne z oczekiwaną masą 6 razy 53,5 kDa (321 kDa) dla heksameru. Modelowanie ab initio obu zestawów danych przeprowadzono bez narzuconej symetrii (SEC-SAXS: χ2 = 0,88, IEC-SAXS: χ2 = 3,1) oraz przy zastosowaniu symetrii C6 (SEC-SAXS: χ2 = 1,0, IEC-SAXS: χ2 = 4). Ponieważ całkowite dopasowanie do danych rozpraszania dla obu rekonstrukcji jest w obu przypadkach porównywalne (Rycina 1D i E), można przyjąć symetrię C6. Zatem model odpowiada strukturze przypominającej stożek sześciokątny z kanałem centralnym, który wydaje się częściowo zablokowany (SEC: Rycina 1F; IEC: Rycina 1G, nałożenie Rycina 1H). Analiza pojedynczych modeli przed uśrednieniem wskazuje, że blokada ta jest najprawdopodobniej artefaktem procesu uśredniania.
<img alt="Schemat chromatografii; eksperymenty SEC/IEC; wykresy absorbancji w funkcji intensywności; modele molekularne." src="/files/ftp_upload/54861/54861fig1x.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Analiza danych SAXS i porównanie D5323-785 (rycina zaadaptowana z referencji 12 i 18). A) Schematyczna struktura domen białka D5 i D5323-785. B) Offline chromatogram wymiany jonowej z zaznaczeniem trzech pików. Krzywa pomarańczowa: Absorbancja przy 280 nm (au), krzywa niebieska: procent buforu B. Wskazano procenty buforu B w obrębie pików. C) Online chromatogram wymiany jonowej. Legenda kolorów jak w B. Dodatkowo zaznaczono zmierzoną intensywność kolorem zielonym. Eksperymentalna krzywa rozpraszania i krzywa obliczona dla modelu uzyskanego w wyniku analizy danych SEC-SAXS D) i IEC E) dla D5323-785. F) Model sferyczny (bead model) D5323-785 na podstawie danych SEC oraz G) danych IEC. H) Nałożenie modeli SEC i IEC. Panele od F) do H) zostały stworzone przy użyciu oprogramowania do wizualizacji molekularnej24. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54861/54861fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Parametry gromadzenia danych</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Przyrząd:</td>
			<td>ESRF BM29</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Długość fali (Å)</td>
			<td>0.99</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>zakres q (Å⁻¹)-1)</td>
			<td>0.0032 – 0.49</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odległość próbki od detektora</td>
			<td>2,864 m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Czas ekspozycji (s)</td>
			<td>1 na klatkę</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zakres stężeń</td>
			<td>Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperatura (K)</td>
			<td>293</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detektor</td>
			<td>Pilatus 1M (Dectris)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strumień (fotony/s)</td>
			<td>1 × 1012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rozmiar wiązki (µm2)</td>
			<td>700 × 700</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parametry strukturalne dla D5323-785, SEC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I0 (cm-1) [z analizy Guiniera]</td>
			<td>0.0237</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rg (Å) [z analizy Guiniera]</td>
			<td>48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qminRg – qmaksymalnyRg stosowane do analizy Guiniera</td>
			<td>0.77 - 1.24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dmaksymalny (Å) [z p(r)]</td>
			<td>145</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>zakres q użyty do p(r) (Å-1)</td>
			<td>0.02 - 0.17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objętość pory Vp (Å3) [z rozproszenia]</td>
			<td>(570 ± 5) × 103</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masa cząsteczkowa Mr (kDa) [z Vp]</td>
			<td>345</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Obliczona masa cząsteczkowa monomeru Mr na podstawie sekwencji (kDa)</td>
			<td>321</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parametry strukturalne dla D5323-785, IEC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I0 (cm-1) [z analizy Guiniera]</td>
			<td>0.386</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rg (Å) [z analizy Guiniera]</td>
			<td>46.5 ± 0.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qminRg – qmaksymalnyRg stosowane do analizy Guiniera</td>
			<td>0.44 - 1.29</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dmaksymalnie (Å) [z p(r)]</td>
			<td>120</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>zakres q użyty do p(r) (Å⁻¹)-1)</td>
			<td>0.03 - 0.18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objętość pory Vp (Å3) [z rozproszenia]</td>
			<td>(577 ± 5) × 103</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masa cząsteczkowa Mr (kDa) [z Vp]</td>
			<td>339</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Obliczona masa cząsteczkowa (Mr) heksameru na podstawie sekwencji (kDa)</td>
			<td>321</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Parametry danych SAXS. Tabela podsumowuje parametry akwizycji i analizy danych SAXS.

Określenie struktury roztworu białka za pomocą rozpraszania promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem (SAXS) wymaga próbek monodyspersyjnych. W tym miejscu przedstawiamy dwie możliwości zapewnienia minimalnych opóźnień między przygotowaniem próbki a akwizycją danych: chromatografia wykluczania wielkości online (SEC) i chromatografia jonowymienna online (IEC).

Wykluczenie według wielkości i chromatografia jonowymienna online na linii badawczej SAXS

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

Ogólnym celem wdrożenia internetowej chromatografii wykluczania wielkości i chromatografii jonowymiennej na liniach wiązki rozpraszającej promieniowanie rentgenowskie pod małym kątem jest uzyskanie lepszej jakości danych modelowych o niskiej rozdzielczości poprzez zapewnienie minimalnych opóźnień między przygotowaniem próbki a akwizycją danych. Metody te mogą pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii strukturalnej. Podobnie jak operacja promienia, największa odległość wewnątrz danego obszaru, kształt cząstki, stopień fałdowania, denaturacji lub nieporządku.SAXS wymaga próbek zdyspergowanych molowo. Główną zaletą tej techniki jest to, że czas między oczyszczaniem a pomiarem jest krótki, co pomaga uniknąć denaturacji lub skazania próbki. Przed udaniem się na teren linii badawczej należy przygotować zagęszczoną próbkę przy użyciu wcześniej opublikowanych metod i wykonać testy SEC.Na linii badawczej umieścić jeden mililitr żelowego buforu filtracyjnego w 1,5 mililitrowej probówce reakcyjnej. Następnie podłączyć butelkę z żelowym buforem filtracyjnym do systemu HPLC zgodnie z kapilarą przepływową zestawu SAXS. Ustaw natężenie przepływu, maksymalne ciśnienie w kolumnie i czas akwizycji.Zwróć uwagę na ciśnienie wsteczne bez kolumny. Usuń linie, a następnie połącz i zrównoważ kolumnę chromatografii wykluczania rozmiaru. Załadować jednomililitrową próbkę buforową do podajnika próbek.Wyjdź i zabezpiecz lub zablokuj klatkę doświadczalną, a następnie zaloguj się do oprogramowania sterującego linią badawczą w trybie zmieniacza próbek. Wyślij próbkę buforową w podajniku próbek bezpośrednio przez kapilarnę przepływową SAXS. Wykonaj krótki test SAXS i sprawdź, czy intensywność rozpraszania promieniowania rentgenowskiego nie wykazuje oznak uszkodzenia przez promieniowanie.Przełącz system sterowania linią badawczą w tryb HPLC i wykonaj próbny przebieg bufora SAXS przez pełny system HPLC SAXS. Jeśli dane nie zgadzają się z pierwszym pomiarem, należy ponownie wyrównać i wykonać kolejny przebieg testowy. Następnie w laboratorium odwirować próbkę białka w temperaturze 13 000 razy G przez 10 minut, aby usunąć agregaty.Przenieść supernatant do szklanej fiolki zgodnej z HPLC. Załadować fiolkę do automatycznego próbnika, zwracając uwagę na pozycję próbki. Zablokuj klatkę i utwórz folder na dane eksperymentu w systemie sterowania linią badawczą.Następnie w oprogramowaniu HPLC kliknij szybkie wsady. Ustaw ścieżkę pliku i aktywuj automatyczną konwersję danych UV/VIS w formacie ascii. Wprowadź objętość wtrysku i pozycję próbki w automatycznym próbniku.Kliknij start, aby dodać bieg do kolejki. Wprowadź nazwę pliku, ale nie klikaj "zapisz" jeszcze. W oprogramowaniu sterującym linią badawczą należy ustawić liczbę ramek danych tak, aby czas zbierania danych SAXS był nieco dłuższy niż czas akwizycji HPLC.Otwórz migawkę linii badawczej i rozpocznij zbieranie danych SAXS. Przełącz się na oprogramowanie HPLC i kliknij Zapisz", aby wstrzyknąć próbkę. Zanotuj numer klatki na początku akwizycji danych UV/VIS i monitoruj zsumowaną intensywność w czasie.Podczas przygotowywania próbki należy wykonać test IEC z liniowym gradientem chlorku sodu od 25 milimolów do jednego zęba trzonowego. Dla każdego interesującego piku należy określić odpowiednią ilość buforu B o wysokiej zawartości soli w fazie ruchomej. Aby rozpocząć eksperyment IEC SAXS, należy odłożyć na bok jedną mililitrową próbkę A i B, a następnie podłączyć do systemu HPLC.Ustaw parametry HPLC, a następnie oczyść system i przepłucz przewody buforem o niskiej zawartości soli A. Połącz i zrównoważ kolumnę jonowymienną z buforem A. Załaduj jednomililitrowe próbki A i B do podajnika próbek. Zablokuj klatkę i wykonaj krótki test SAXS dla każdej próbki buforowej w trybie zmieniacza próbek, aby sprawdzić podatność bufora na uszkodzenia spowodowane promieniowaniem. Następnie przełącz się w tryb HPLC i wykonaj kolejny test SAXS dla buforu A. Porównaj wzorce rozpraszania z tymi uzyskanymi z przebiegu testowego zmieniacza próbek.Następnie utwórz folder na dane eksperymentu. Następnie zaprojektuj krok po kroku gradient HPLC, który zaczyna się od zerowego procenta buforu B o wysokiej zawartości soli i zwiększa się o pięć procent w odstępach dwóch objętości kolumn, aby osiągnąć 100 procent buforu B. Ustaw pojedynczy przebieg gradientu, w którym nie jest wstrzykiwana żadna próbka. Otwórz migawkę linii badawczej, rozpocznij zbieranie danych SAXS i rozpocznij przebieg HPLC.Zwróć uwagę na liczbę klatek, które upłynęły od momentu rozpoczęcia zbierania danych UV/VIS. Po zebraniu danych sprawdź, czy zsumowana intensywność pozostała stała przez co najmniej 100 klatek i odpowiada wartościom uzyskanym z próbek A i B. Następnie wykonaj kolejną krok po kroku gradientową metodę HPLC, zaczynając od zerowego procentowego bufora B. Utwórz krok dla każdej wartości procentowej B określonej w przebiegu testu gradientu IEC off-line. Dodaj stopnie gradientu o jeden punkt procentowy poniżej i 1,5 punktu powyżej każdej z tych wartości.Ustaw interwał każdego kroku na 2,5 objętości kolumny, a ostatni krok w gradiencie na 100 procent B. Rozcieńczyć supernatant w razie potrzeby, aby uzyskać skład buforu A. Zatrzymaj pompy HPLC, odłącz rurki kolumny od detektorów i umieść koniec linii w pojemniku, aby zebrać przepływ kolumny. Następnie przenieść linię buforu A do rozcieńczonej próbki, upewniając się, że w probówce nie zostały uwięzione pęcherzyki powietrza. Uruchom pompy, aby wciągnąć próbkę do kolumny.Gdy pojemnik na próbkę jest prawie pusty, zatrzymaj pompy i umieść butelkę buforu A z powrotem na linii. Uruchom pompy i przepuść bufor A przez kolumnę dla dwóch objętości kolumny, a następnie zatrzymaj pompy i ponownie podłącz kolumnę do detektorów. Korzystając z nowej metody krokowej, skonfiguruj pojedynczy przebieg HPLC bez automatycznego wstrzykiwania próbki.Otwórz migawkę linii badawczej i pobierz dane SAXS oraz UV/VIS. Monitoruj zsumowaną intensywność w czasie. Następnie użyj oprogramowania do przetwarzania końcowego, aby przekonwertować dane HPLC do formatu ascii.Korzystając z menedżera danych online, zidentyfikuj ramki SAXS odpowiadające pikowi elucji próbki. Sprawdź, czy promień giyracji jest stabilny na całym piku. Zaimportuj klatki pików do programu do przetwarzania danych SAXS i utwórz średnią nieskorygowaną krzywą rozpraszania.W przypadku SCC SAXS należy potwierdzić, że jest to obszar o wysokim Q średniego bufora, a nie tylko nieskorygowana krzywa rozpraszania. Załaduj i przeskaluj automatycznie odjęte klatki od wartości szczytowej i sprawdź, czy nie ma systematycznych różnic. Uśrednij wszystkie krzywe, aby uzyskać końcową krzywą SAXS.W przypadku IEC SAXS średnio 50 klatek z każdego kroku gradientu. Porównaj te średnie z nieskorygowaną krzywą i wybierz krok gradientu z najlepszym dopasowaniem wysokiego Q. Odejmij wybraną średnią od nieskorygowanej krzywej, aby utworzyć końcową krzywą SAXS.Na koniec określ rozkład odległości par i wykonaj modelowanie ab initio, aby określić najbardziej reprezentatywny model białka. Parametry danych strukturalnych uzyskane z SEC i IEC SAXS białka D5 były bardzo podobne. Oszacowania masy cząsteczkowej były zgodne z przewidywaną masą.Modelowanie ab initio wykonano bez symetrii narzuconej i z symetrią C6. Oba modele są zgodne z danymi eksperymentalnymi, co wskazuje, że struktura białka posiada symetrię C6. Modelowanie molekularne daje sześciokątną strukturę przypominającą piramidę z częściowo zablokowanym kanałem centralnym.Uśrednione modele SEC i IEC były bardzo podobne. Po zbadaniu poszczególnych modeli stwierdzono, że przeszkody w kanałach mogą być artefaktem procesu uśredniania. SAXS staje się rozsądny, bardziej standardowy, ale dla wielu etapów oczyszczania i innych etapów chromotografii jonowymiennej potrzebnych do pozbycia się agregatów lub zanieczyszczeń.W niniejszym protokole przedstawiliśmy obie techniki, chromatografię wykluczania wielkości online oraz chromatografię jonowymienną online na linii badawczej bio SAXS. Zastrzeżeniem obu technik jest to, że dokładne stężenie białka nie jest znane, więc nie możemy określić rozpraszania masy cząsteczkowej. Jednak w przypadku białek globularnych nadal możemy oszacować objętość masy.Zamiast gradientu krokowego, którego użyliśmy w chromatografii jonowymiennej, można zastosować gradient liniowy, chociaż wymaga to optymalizacji warunków buforowych w celu optymalnego oddzielenia pików. Techniki te pozwalają nam na gromadzenie dobrej jakości danych SAXS, nawet w skomplikowanych systemach.

online-size-exclusion-ion-exchange-chromatography-on-saxs

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ten film demonstruje technikę chromatografii kationowymiennej do izolowania rekombinowanego białka z lizatu białka komórki owada.

Chromatografia kationowymienna: technika izolowania docelowego białka rekombinowanego z lizatu komórek owadów na podstawie ładunku powierzchniowego netto

Ten film opisuje SEC-MALS, który wykorzystuje możliwości chromatografii wykluczającej rozmiar (SEC) i wielokątowego rozpraszania światła (MALS). W SEC-MALS SEC-MALS SEC rozdziela białka lub kompleksy białkowe na podstawie ich wielkości, a detektor MALS określa średnią masę cząsteczkową, mierząc intensywność światła rozproszonego przez cząsteczkę pod różnymi kątami.

Chromatografia wykluczania wielkości z wielokątowym rozpraszaniem światła dla oligomerów białkowych

Przedstawiono metodę analizy spektrometrycznej endogennych peptydów w ludzkim płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF). Dzięki zastosowaniu filtracji odcięcia masy cząsteczkowej, wstępnego frakcjonowania chromatograficznego, analizy spektrometrii mas i późniejszej kombinacji strategii identyfikacji peptydów, możliwe było prawie dziesięciokrotne rozszerzenie znanego peptydomu płynu mózgowo-rdzeniowego w porównaniu z poprzednimi badaniami.

Przygotowanie próbki do analizy endopeptydomicznej w ludzkim płynie mózgowo-rdzeniowym

Tutaj opisujemy, jak korzystać z opcji automatycznego badania przesiewowego i zbierania danych dostępnych na niektórych liniach synchrotronowych. Naukowcy wysyłają próbki chłodzone kriogenicznie do synchrotronu, gdzie badane są właściwości dyfrakcyjne, zestawy danych są zbierane i przetwarzane, a tam, gdzie to możliwe, przeprowadzane jest rozwiązanie strukturalne – a wszystko to bez interwencji człowieka.

W pełni autonomiczna charakterystyka i zbieranie danych z kryształów makrocząsteczek biologicznych

Ten protokół opisuje użycie chromatografii jonowymiennej o wysokiej specyficzności z wielokątowym rozpraszaniem światła do dokładnego wyznaczania masy molowej białek, kompleksów białkowych i peptydów w heterogenicznej próbce. Metoda ta jest cenna dla oceny jakości, a także dla scharakteryzowania natywnych oligomerów, wariantów ładunku i próbek białek mieszanych.

Chromatografia jonowymienna (IEX) sprzężona z wielokątowym rozpraszaniem światła (MALS) w celu separacji i charakterystyki białek

Przedstawiono wszechstronny protokół krioskalizacji BN-MS z wykorzystaniem mikrotomu do profilowania kompleksomów w wysokiej rozdzielczości.

Profilowanie kompleksomów w wysokiej rozdzielczości za pomocą analizy BN-MS metodą krioslicingu

Pomiary makrocząsteczek biologicznych SEC-BioSAXS są standardowym podejściem do określania struktury roztworu makrocząsteczek i ich kompleksów. W tym miejscu analizujemy dane SEC-BioSAXS z dwóch typów powszechnie spotykanych śladów SEC - chromatogramów z pikami w pełni rozdzielczymi i częściowo rozdzielczymi. Demonstrujemy analizę i dekonwolucję za pomocą rozpraszania i BioXTAS RAW.

Analiza danych SEC-SAXS za pomocą dekonwolucji i rozproszenia EFA

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania próbek kriogenicznych i transferu kryształów do stacji końcowej próżni na linii badawczej I23 w Diamond Light Source, dla eksperymentów makromolekularnej krystalografii rentgenowskiej o długich falach.

Protokół przygotowania i transferu próbki do krystalografii długofalowej w próżni na linii badawczej I23 przy diamentowym źródle światła

Elastyczność konformacyjna odgrywa kluczową rolę w funkcjonowaniu białek. W tym artykule opisujemy zastosowanie czasowo-rozdzielczej spektrometrii mas z jonizacją elektronrozpylającą sprzężoną z wymianą wodorowo-deuterową do badania szybkich zmian strukturalnych, które napędzają funkcję w uporządkowanych i nieuporządkowanych białkach.

Spektrometria mas z jonizacją wodorowo-deuterową z jonizacją elektrorozpylającą do badania struktury i dynamiki białek

Przedstawiamy protokół do dokładnego oznaczania ilościowego białek za pomocą znakowania izobarycznego, intensywnego frakcjonowania, narzędzi bioinformatycznych i etapów kontroli jakości w połączeniu z chromatografią cieczową połączoną ze spektrometrem masowym o wysokiej rozdzielczości.

Głębokie profilowanie proteomu za pomocą znakowania izobarycznego, rozległej chromatografii cieczowej, spektrometrii mas i kwantyfikacji wspomaganej programowo

Poznaj metodę SEC i IEC online z SAXS w biologii strukturalnej. Techniki te poprawiają jakość danych poprzez minimalizację opóźnień między przygotowaniem próbki a pomiarem, zapobiegając denaturacji białek.

Wykluczenie według wielkości i chromatografia jonowymienna online na linii badawczej SAXS

Przeglądaj więcej filmów