Name: Skuteczność przeciwnowotworowa terapii fotodynamicznej nanocząstkami ukierunkowanymi na raka płuc (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Poznaj terapię fotodynamiczną z nanocząstkami ukierunkowanymi na raka płuc w badaniach in vitro i in vivo. Ta metoda łączy fotouczulacz z lekiem przeciwnowotworowym, zwiększając skuteczność leczenia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez grant nr 14-2014-017 z Funduszu Badawczego SNUBH.
Autorzy są wdzięczni J. Patrickowi Barronowi, emerytowanemu profesorowi Uniwersytetu Medycznego w Tokio i adiunktowi w Szpitalu Bundang Uniwersytetu Narodowego w Seulu za jego pro bono redakcję tego rękopisu.

UWAGA: Wszystkie protokoły badań na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt w Szpitalu Bundang Uniwersytetu Narodowego w Seulu (BA1308-134/072-01).
1. Synteza kwasu hialuronowego-ceramidu (HACE)
<ol>
	<li>Rozpuścić 12,21 mmol oligomeru kwasu hialuronowego (HA) i 9,77 mmol wodorotlenku tetra-n-butyloamonu (TBA) w 60 ml podwójnie destylowanej wody (DDW). Mieszaj przez 30 minut.</li>
	<li>Aby zsyntetyzować łącznik DS-Y30, rozpuść 8,59 mmol ceramidu DS-Y30 i 9,45 mmol trietyloaminy w 25 ml tetrahydrofuranu (THF). Wymieszać z 8,59 mmol chlorku 4-chlorometylobenzoilu w THF. Mieszać przez 6 godzin w temperaturze 60 °C.</li>
	<li>Rozpuścić zsyntetyzowane 8,10 mmol HA-TBA i 0,41 mmol łącznika DS-Y30 w mieszaninie THF i acetonitrylu (4:1, v/v). Mieszać przez 5 godzin w temperaturze 40 °C.</li>
	<li>Usuń zanieczyszczenia przez filtrowanie za pomocą środka filtrującego i wyeliminuj rozpuszczalnik organiczny przez odparowanie próżniowe. Oczyścić produkt za pomocą membrany dializacyjnej (odcięcie masy cząsteczkowej: 3,5 kDa) i poddać liofilizacji.</li>
</ol>
2. Przygotowanie nanocząstek
<ol>
	<li>Rozpuścić 1 mg HB i 1 mg paklitakselu w 0,5 ml dimetylosulfotlenku (DMSO) i zmieszać z 0,5 ml DDW przez mieszanie wirowe przez 5 minut. Następnie rozpuścić HACE w tej mieszaninie przez mieszanie wirowe przez kolejne 5 minut.</li>
	<li>W celu wyeliminowania rozpuszczalnika należy ogrzewać w temperaturze 70 °C przez 4 godziny pod delikatnym strumieniem azotu.</li>
	<li>Zawiesić błonę złożoną z HACE, HB i paklitakselu w 1 ml DDW. Przefiltrować z filtrem strzykawkowym (wielkość porów 0,45 μm) w celu usunięcia niekapsułkowanych leków.</li>
</ol>
3. Fototoksyczność in vitro
<ol>
	<li>Wychwyt nanocząstek w liniach komórkowych raka płuc
	<ol>
		<li>Przygotować RPMI-1640 zawierające 10% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej i 1% (w/v) penicyliny-streptomycyny.</li>
		<li>Nasiona komórek A549 na 24-dołkowych płytkach do hodowli komórkowych o gęstości 1 × 105 komórek/basenik (trzykrotnie dla każdej grupy). Inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C w nawilżonej atmosferze 5%CO2 i 95% powietrza.</li>
		<li>Po przyłączeniu komórek usuń pożywkę i umyj komórki, dodając 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).</li>
		<li>Rozpuścić nanocząstki w PBS do końcowego stężenia 2 μM/ml HB. Następnie inkubować komórki z 1 ml PBS, pustymi NPs, HB-NP lub HB-P-NPs w każdym dołku przez 4 godziny w ciemności.</li>
		<li>Usuń cały roztwór i przemyj komórki, dodając 1 ml zimnego PBS. Powtórz krok prania jeszcze raz. Dodaj świeżą pożywkę hodowlaną.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test żywotności komórek
	<ol>
		<li>Umieść płytkę do hodowli komórkowej pod włóknem PDT (z zachowaniem 1 cm odległości od włókna PDT do studzienki). Nosić laserowe okulary ochronne i oświetlać komórki laserem PDT (630 nm, 400 mW/cm2) w ciemności przez różne okresy czasu: 0, 5, 10, 20, 30 i 40 sekund (0, 2, 4, 8, 12 i 16 J/cm2). Następnie inkubuj komórki przez 24 godziny w ciemności.</li>
		<li>Odessać pożywkę i przemyć komórki, dodając 1 ml zimnego PBS. Powtórz krok prania jeszcze raz.</li>
		<li>Do każdego dołka dodać 10 μl roztworu do pomiaru cytotoksyczności. Inkubować w ciemności przez 2 godziny.</li>
		<li>Zmierzyć absorbancję przy długości fali 450 nm za pomocą czytnika mikropłytek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza mikroskopowa
	<ol>
		<li>Umieść płytkę do hodowli komórkowej pod włóknem PDT (z zachowaniem 1 cm odległości od włókna PDT do studzienki). Załóż okulary ochronne do lasera i oświetl komórki laserem PDT (630 nm, 400 mW/cm2) w ciemności przez 0, 20 lub 40 sekund (0, 8 lub 16 J/cm2). Następnie inkubuj komórki przez 24 godziny w ciemności.</li>
		<li>Odessać pożywkę i przemyć komórki, dodając 1 ml zimnego PBS. Powtórz krok prania jeszcze raz.</li>
		<li>Dodać 50 μl aneksyny V-FITC i 50 μl 4',6-diamidyn-2-fenyloindolu (DAPI, 1,5 μg/ml). Delikatnie potrząśnij płytką i inkubuj ją przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. 
		UWAGA: Użyj aneksyny V-FITC z zestawu mikroskopu fluorescencyjnego.</li>
		<li>Umyj komórki, dodając 1 ml zimnego PBS. Powtórz krok prania jeszcze raz. Przechowuj komórki w świeżym PBS. Zidentyfikuj komórki apoptotyczne za pomocą mikroskopii świetlnej przy 100-krotnym powiększeniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS)
	<ol>
		<li>Umieść płytkę do hodowli komórkowej pod włóknem PDT (z zachowaniem 1 cm odległości od włókna PDT do studzienki). Nosić laserowe okulary ochronne i oświetlać komórki laserem PDT (630 nm, 400 mW/cm2) przez 0, 20 lub 40 sekund (0, 8 lub 16 J/cm2). Następnie inkubuj komórki przez 24 godziny w ciemności.</li>
		<li>Odessać pożywkę i przemyć komórki, dodając 1 ml zimnego PBS. Powtórz krok prania jeszcze raz.</li>
		<li>Ponownie zawiesić komórki w 1 ml 1× buforu wiążącego (rozcieńczyć 1 część 10-krotnego buforu wiążącego; 0,1 M Hepes/NaOH (pH 7,4), 1,4 M NaCl i 25 mM CaCl2 do 9 części wody destylowanej) i przenieść 100 μl roztworu próbki do 5-mililitrowej probówki hodowlanej.</li>
		<li>Dodać 5 μl aneksyny V-FITC i 5 μl jodku propydyny (PI). Delikatnie zwirować probówkę i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej (RT) w ciemności. Dodać 400 μl 1× buforu wiążącego. 
		UWAGA: Użyj aneksyny V-FITC i PI z zestawu mikroskopu fluorescencyjnego.</li>
		<li>Zidentyfikuj komórki apoptotyczne za pomocą FACS14. Linie lasera wzbudzenia PI i aneksyny V-FITC wynoszą odpowiednio 488 nm i 635 nm. Zmierzyć emisję fluorescencji PI i aneksyny V-FITC odpowiednio przy 610 ± 20 nm i 660 ± 20 nm. Zbierz pozyskane komórki na cytometrze przepływowym na 10 000 zdarzeń.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Skuteczność przeciwnowotworowa in vivo u myszy z guzem
<ol>
	<li>Mysi model wywołany rakiem płuc
	<ol>
		<li>Przygotuj 1 × 106 komórek A549 w 0,1 ml pożywki RPMI-1640; trzymaj ją w lodzie.</li>
		<li>Znieczulenie myszy za pomocą iniekcji dożylnej ksylazyny i mieszaniny tiletaminy i zolazepamu (1:2, 1 ml/kg). Potwierdź prawidłowe znieczulenie, delikatnie szczypiąc mały fałd skóry myszy. Użyj maści weterynaryjnej na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia. 
		UWAGA: Jeśli nie zaobserwuje się żadnego ruchu, zwierzę jest wystarczająco znieczulone, aby rozpocząć eksperymenty.</li>
		<li>Wstrzyknąć komórki podskórnie w lewe boki nagich samców myszy BALB/C (6-7 tygodni, 20-22 g).</li>
		<li>Obserwuj myszy, aż zaczną poruszać się po klatce. 
		UWAGA: Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą na mostku. Nie należy zwracać zwierzęcia, które przeszło operację, do towarzystwa innych zwierząt, dopóki w pełni nie wyzdrowieje. Trzymaj myszy w określonych warunkach wolnych od patogenów (SPF).</li>
		<li>Codziennie mierz rozmiar guza za pomocą suwmiarki. Oblicz objętość guza (mm3) jako (długość × szerokość2) / 2. Gdy rozmiar guza osiągnie około 200 mm3 objętości, rozpocznij eksperyment.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Badanie skuteczności przeciwnowotworowej
	<ol>
		<li>Losowo podziel myszy na 4 grupy (n = 10 dla każdej grupy).</li>
		<li>Znieczulenie myszy za pomocą iniekcji dożylnej ksylazyny i mieszaniny tiletaminy i zolazepamu (1:2, 1 ml/kg). Potwierdź prawidłowe znieczulenie, delikatnie szczypiąc mały fałd skóry myszy. Użyj maści weterynaryjnej na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia. 
		UWAGA: Jeśli nie zaobserwuje się żadnego ruchu, zwierzę jest wystarczająco znieczulone, aby rozpocząć eksperymenty.</li>
		<li>Rozpuścić nanocząstki w PBS do końcowego stężenia 2 mg/ml HB. Wstrzyknąć PBS, wolne HB, HB-NPs lub HB-P-NPs przez żyłę ogonową (2 mg/kg w przeliczeniu na HB) dwa razy w dniach 0 i 7.</li>
		<li>Obserwuj myszy, aż zaczną poruszać się po klatce. 
		UWAGA: Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą na mostku. Nie należy zwracać zwierzęcia, które przeszło operację, do towarzystwa innych zwierząt, dopóki nie wyzdrowieje. Utrzymuj klatki w ciemności i w określonych warunkach SPF.</li>
		<li>24 godziny po każdym wstrzyknięciu należy znieczulić myszy zastrzykiem dożylnym ksylazyny oraz mieszaniny tiletaminy i zolazepamu (1:2, 1 ml/kg). Potwierdź prawidłowe znieczulenie, delikatnie szczypiąc mały fałd skóry myszy. Użyj maści weterynaryjnej na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia. 
		UWAGA: Jeśli nie zaobserwuje się żadnego ruchu, zwierzę jest wystarczająco znieczulone, aby rozpocząć eksperymenty.</li>
		<li>Umieść miejsce guza pod włóknem PDT (z zachowaniem 1 cm odległości od włókna PDT do guza). Załóż laserowe okulary ochronne, wyłącz przełącznik i oświetl guz laserem PDT (630 nm, 400 mW/cm2) przez 500 sekund (200 J/cm2) dwa razy w 1 i 8 dniu.</li>
		<li>Obserwuj myszy, aż zaczną poruszać się po klatce. Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą na mostku. Nie należy zwracać zwierzęcia, które przeszło operację, do towarzystwa innych zwierząt, dopóki nie wyzdrowieje.</li>
		<li>Utrzymuj klatki w warunkach SPF. Utrzymuj klatki w ciemności przez 24 godziny po zabiegu laserowym.</li>
		<li>Codziennie monitoruj wizualnie objętość guza i zmiany w miejscu guza. Zmierz rozmiar guza za pomocą suwmiarki i oblicz objętość jako (długość × szerokość2) / 2 (mm3). Codziennie rób zdjęcia miejsc guza, aby sprawdzić, czy nie ma zmian na powierzchni guza po PDT.</li>
		<li>W dniu 16 należy poskładać ofiarę pięciu myszy na grupę w znieczuleniu końcowym przy użyciu izofluranu.</li>
		<li>Za pomocą kleszczy i nożyczek przetnij zewnętrzną skórę i odsłoń guzy15. Ostrożnie je zbierz. Utrwal je w 10% formalinie, zanurz w parafinie i zabarwij hematoksyliną i eozyną (H&E) do analizy histologicznej16.</li>
		<li>Po 45 dniach monitorowania należy poświębić pozostałe myszy w znieczuleniu końcowym przy użyciu izofluranu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Shang, L., Zhou, N., Gu, Y., Liu, F., Zeng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+on+killing+effect+of+esophageal+cancer+cell+line+between+hypocrellin+B-photodynamic+therapy+and+hematoporphyrin+derivative-photodynamic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Chin+J+Cancer+Prev+Treat%22%5BJournal%5D)">Comparative study on killing effect of esophageal cancer cell line between hypocrellin B-photodynamic therapy and hematoporphyrin derivative-photodynamic therapy.</a> Chin J Cancer Prev Treat. 12, 1139-1142 (2005).</li>
<li>Huisman, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paclitaxel+triggers+cell+death+primarily+via+caspase-independent+routes+in+the+non-small+cell+lung+cancer+cell+line+NCI-H460%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Paclitaxel triggers cell death primarily via caspase-independent routes in the non-small cell lung cancer cell line NCI-H460.</a> Clin Cancer Res. 8 (2), 596-606 (2002).</li>
<li>Dolmans, D. E., Fukumura, D., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+therapy+for+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Photodynamic therapy for cancer.</a> Nat Rev Cancer. 3 (5), 380-387 (2003).</li>
<li>Pass, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+therapy+in+oncology%3A+mechanisms+and+clinical+use%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Photodynamic therapy in oncology: mechanisms and clinical use.</a> J Natl Cancer Inst. 85 (6), 443-456 (1993).</li>
<li>Sutedja, T. G., Postmus, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+therapy+in+lung+cancer.+A+review+%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Photochem.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Photodynamic therapy in lung cancer. A review .</a> J. Photochem. Photobiol. 36 (2), 199-204 (1996).</li>
<li>Peng, C. L., Shieh, M. J., Tsai, M. H., Chang, C. C., Lai, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembled+star-shaped+chlorin-core+poly%28epsilon-caprolactone%29-poly%28ethylene+glycol%29+diblock+copolymer+micelles+for+dual+chemo-photodynamic+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Self-assembled star-shaped chlorin-core poly(epsilon-caprolactone)-poly(ethylene glycol) diblock copolymer micelles for dual chemo-photodynamic therapies.</a> Biomaterials. 29 (26), 3599-3608 (2008).</li>
<li>Chen, B., Pogue, B. W., Hasan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomal+delivery+of+photosensitising+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Liposomal delivery of photosensitising agents.</a> Expert Opin Drug Deliv. 2 (3), 477-487 (2005).</li>
<li>Lee, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+photosensitizer+loaded+and+conjugated+glycol+chitosan+nanoparticles+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Comparative study of photosensitizer loaded and conjugated glycol chitosan nanoparticles for cancer therapy.</a> J Control Release. 152 (1), 21-29 (2011).</li>
<li>Chang, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anticancer+efficacy+of+photodynamic+therapy+with+hematoporphyrin-modified%2C+doxorubicin-loaded+nanoparticles+in+liver+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Photochem.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Anticancer efficacy of photodynamic therapy with hematoporphyrin-modified, doxorubicin-loaded nanoparticles in liver cancer.</a> J. Photochem. Photobiol. 140, 49-56 (2014).</li>
<li>Chang, J. E., Cho, H. J., Yi, E., Kim, D. D., Jheon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypocrellin+B+and+paclitaxel-encapsulated+hyaluronic+acid-ceramide+nanoparticles+for+targeted+photodynamic+therapy+in+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Photochem.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Hypocrellin B and paclitaxel-encapsulated hyaluronic acid-ceramide nanoparticles for targeted photodynamic therapy in lung cancer.</a> J. Photochem. Photobiol. 158, 113-121 (2016).</li>
<li>Wang, A. Z., Langer, R., Farokhzad, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle+delivery+of+cancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Med%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle delivery of cancer drugs.</a> Annu. Rev. Med. 63, 185-198 (2012).</li>
<li>Matsumura, Y., Maeda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+concept+for+macromolecular+therapeutics+in+cancer+chemotherapy%3A+mechanism+of+tumoritropic+accumulation+of+proteins+and+the+antitumor+agent+smancs%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent smancs.</a> Cancer Res. 46 (12 Pt 1), 6387-6392 (1986).</li>
<li>Penno, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+CD44+in+human+lung+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Expression of CD44 in human lung tumors.</a> Cancer Res. 54 (5), 1381-1387 (1994).</li>
<li>Wilkins, R., Kutzner, B., Truong, M., Sanchez-Dardon, J., McLean, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+radiation-induced+apoptosis+in+human+lymphocytes%3A+Flow+cytometry+using+Annexin+V+and+propidium+iodide+versus+the+neutral+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Analysis of radiation-induced apoptosis in human lymphocytes: Flow cytometry using Annexin V and propidium iodide versus the neutral comet assay.</a> Cytometry. 48 (1), 14-19 (2002).</li>
<li>Bannas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+nanobody+and+antibody+based+in+vivo+tumor+xenograft+NIRF-imaging+experiments+in+mice+using+ex+vivo+flow+cytometry+and+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Validation of nanobody and antibody based in vivo tumor xenograft NIRF-imaging experiments in mice using ex vivo flow cytometry and microscopy.</a> J Vis Exp. (98), e52462(2015).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematoxylin+and+eosin+staining+of+tissue+and+cell+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2008).</li>
<li>Lam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+therapy+of+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Photodynamic therapy of lung cancer.</a> Semin Oncol. 21 (6 Suppl 15), 15-19 (1994).</li>
<li>Simone, C. B. 2nd, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+therapy+for+the+treatment+of+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thorac+Dis%22%5BJournal%5D)">Photodynamic therapy for the treatment of non-small cell lung cancer.</a> J Thorac Dis. 4 (1), 63-75 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Najważniejszym krokiem w tym badaniu jest wybór odpowiednich warunków pracy lasera: długości fali, mocy i czasu naświetlania. Odpowiednia długość fali światła odpowiednia dla konkretnego fotouczulacza jest niezbędna dla PDT. Użyliśmy lasera o długości fali 630 nm, który był odpowiedni dla hipokrelliny B. Kolejnym ważnym czynnikiem była moc wyjściowa, którą ustalono na poziomie 400 mW/cm2 na podstawie wielu badań pilotażowych. Moce wyjściowe przekraczające 400 mW/cm2 uszkadzały komórki lub powierzchn...

Terapia fotodynamiczna (PDT) składa się z trzech głównych czynników: fotouczulaczy, światła i tlenu. PDT jest opisywana jako obiecująca metoda leczenia różnych nowotworów3. Kiedy fotouczulacze są podawane pacjentowi z rakiem, selektywnie gromadzą się w tkankach nowotworowych. Po zastosowaniu odpowiedniej długości fali światła wysoce reaktywny tlen singletowy i inne wolne rodniki prowadzą do uszkodzenia komórek nowotworowych4. 
Rak płuc został wprowadzony jako jedno z pierwszych zastosowań PDT na początku lat 80. 5. PDT zapewnia kilka korzyści w leczeniu raka płuc. Ponieważ PDT jest leczeniem nieinwazyjnym i niechirurgicznym, jest atrakcyjną alternatywą dla pacjentów, u których resekcja chirurgiczna jest niewskazana.
Było wiele wyzwań mających na celu zwiększenie skuteczności fotosensybilizatorów w zwalczaniu raka. Zwiększenie akumulacji fotouczulacza w miejscach raka i zmniejszenie akumulacji w zdrowych tkankach to identyczne cele badań ukierunkowanych na raka. Różnorodne ukierunkowane systemy dostarczania leków, takie jak polimery, liposomy i nanocząstki, są stosowane jako nośniki fotouczulaczy6-8. W naszych poprzednich badaniach nanocząstki skutecznie zwiększały zdolność fotouczulaczy do zwalczania nowotworów9,10. Nanocząstki są idealnymi nosicielami ukierunkowanymi na raka, ponieważ posiadają zarówno pasywne, jak i aktywne zdolności celowania. Nieszczelne naczynia nowotworowe dają możliwość łatwego gromadzenia się nano nośników w guzach, co jest dobrze znane jako efekt zwiększonej przepuszczalności i retencji (EPR)11,12. Interakcja między nanocząstkami a specyficznymi receptorami na komórkach nowotworowych umożliwia aktywne celowanie w raka. W tym badaniu przygotowaliśmy nanocząstki na bazie kwasu hialuronowego do interakcji z CD44, głównym receptorem kwasu hialuronowego, który ulega nadekspresji na komórkach raka płuc13. 
Aby zmaksymalizować skuteczność przeciwnowotworową, w niniejszym badaniu zastosowano kombinację PDT i chemioterapii. Ta koncepcja skojarzona może pozwolić na zwiększenie efektu terapeutycznego. Co więcej, zmniejszone dawki zarówno fotouczulacza, jak i leku przeciwnowotworowego mogą zmniejszyć działania niepożądane. W niniejszym badaniu wybraliśmy hipokrellinę B (HB) jako nowy fotouczulacz. HB jest izolowany z chińskiego grzyba leczniczego Hypocrella bambuase. Shang i wsp. stwierdzili, że PDT oparta na HB ma wyższą skuteczność przeciwnowotworową w porównaniu z PDT1 na bazie pochodnej hematoporfiryny. Paklitaksel został wybrany jako lek przeciwnowotworowy, ponieważ okazał się być potencjalnym lekiem w leczeniu różnych nowotworów, w tym raka płuc2. 
Tutaj porównaliśmy skuteczność przeciwnowotworową roztworu fotosensybilizatora (hipokrelina B, HB), nanocząsteczek kwasu hialuronowego i nanocząsteczek ceramidowych (HB-NPs) w kapsułkach fotouczulacza oraz nanocząsteczek ceramidowych kwasu hialuronowego i kwasu hialuronowego (HB-P-NPs) zarówno w fotouczulaczu, jak i przeciwnowotworowych (paklitaksel) po PDT. Oceniano fototoksyczność in vitro w komórkach A549 (gruczolakorak płuc) oraz skuteczność przeciwnowotworową in vivo u myszy z guzem A549.

<table><tbody><tr><td>oligo kwas hialuronowy</td><td>Bioland Co., Ltd.</td><td>_</td><td></td></tr><tr><td>DS-Y30 (ceramid 3B; głównie N-oleoilo-fitosfingozyna)</td><td>Doosan Biotech Co., Ltd.</td><td>_</td><td></td></tr><tr><td>kwas adypinowy dihydrazyd</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A0638</td><td></td></tr><tr><td>N-(3-dimetyloaminopropylo)-N&prime; -etylokarbodimid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>39391</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek 4-(chlorometylo)benzoilu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>270784</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.</td><td>T0546</td><td></td></tr><tr><td>filtr strzykawkowy</td><td>Sartorius Stedim Biotech GmbH</td><td>17762</td><td>15 mm, RC, PP, 0,45 i mikro; m</td></tr><tr><td>rurki trietyloaminowe</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T0886</td><td></td></tr><tr><td>Mini-GeBAflex</td><td>Gene Bio-Application Sp. z o.o.</td><td>D070-12-100</td><td></td></tr><tr><td>Paclitaxel</td><td>Taihua Corporations</td><td>_</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco Life Technologies, Inc.</td><td>11875</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina&ndash; streptomycyna</td><td>Gibco Life Technologies, Inc.</td><td>15070</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td> płodu <td>Gibco Life Technologies, Inc.</td><td></td><td></td>16140071</tr><tr><td>Celite (Środek filtrujący)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>6858</td><td>Patrz krok 1.4</td></tr></tbody></table>

skuteczność przeciwnowotworowa terapii fotodynamicznej nanocząstkami ukierunkowanymi na raka płuc

Anticancer Efficacy of Photodynamic Therapy with Lung Cancer-Targeted Nanoparticles

Terapia fotodynamiczna (PDT) jest nieinwazyjną i niechirurgiczną metodą stanowiącą atrakcyjną alternatywę w leczeniu raka płuc. Fotouczulacze selektywnie kumulują się w tkance nowotworowej i prowadzą do śmierci komórek nowotworowych w obecności tlenu i odpowiedniej długości fali światła.
Aby zwiększyć efekt terapeutyczny PDT, opracowaliśmy nanocząsteczki ukierunkowane na raka płuc zarówno pod kątem fotouczulaczy, jak i środków przeciwnowotworowych. Zastosowano zarówno celowanie pasywne oparte na efekcie zwiększonej przepuszczalności i retencji (EPR), jak i aktywne celowanie oparte na interakcji kwasu hialuronowego-CD44. CD44 jest dobrze znanym receptorem kwasu hialuronowego, który jest często wprowadzany jako biomarker niedrobnokomórkowego raka płuca. 
Ponadto, w niniejszym badaniu zastosowano kombinację PDT i chemioterapii. Ta koncepcja skojarzona może zwiększyć działanie przeciwnowotworowe i zmniejszyć działania niepożądane. 
Wybraliśmy hipokrellinę B (HB) jako nowy fotosensybilizator w tym badaniu. Doniesiono, że HB powoduje wyższą skuteczność przeciwnowotworową PDT w porównaniu z pochodnymi hematoporfiryny1. Paklitaksel został wybrany jako lek przeciwnowotworowy, ponieważ okazał się potencjalnym lekiem na raka płuc2. 
Skuteczność przeciwnowotworowa roztworu fotosensybilizatora (HB), fotouczulacza kapsułkowanego kwasem hialuronowym i nanocząstkami ceramidu (HB-NPs) oraz nanocząstek kwasu hialuronowego i ceramidu (HB-P-NPs) w kapsułkach fotouczulacza i środka przeciwnowotworowego (paklitaksel) po PDT były porównywane zarówno in vitro, jak i in vivo. Oceniano fototoksyczność in vitro w komórkach A549 (gruczolakorak płuc) oraz skuteczność przeciwnowotworową in vivo u myszy z guzem A549.
Grupa leczona HB-P-NP wykazała najskuteczniejsze działanie przeciwnowotworowe po PDT. Podsumowując, HB-P-NP przygotowane w niniejszym badaniu stanowią potencjalny i nowatorski system dostarczania fotouczulaczy w leczeniu raka płuc za pomocą PDT.

Przygotowaliśmy zarówno HB-NPs, jak i HB-P-NPs, stosując techniki opisane powyżej. Średnice HB-NPs i HB-P-NPs wynosiły odpowiednio 220.9 ± 3.2 nm oraz 21.9 ± 1.6 nm.
Żywotność komórek A549 po 4-godzinnej inkubacji z PBS, pustymi NPs, HB-NPs oraz HB-P-NPs, a następnie naświetlaniu światłem (od 0 do 16 J/cm2), przedstawiono na Ryc. 1. Bez naświetlania w grupie traktowanej HB-NP nie stwierdzono żadnej cy...

Terapia fotodynamiczna (PDT) jest alternatywnym wyborem w leczeniu raka płuc. Aby zwiększyć efekt terapeutyczny PDT, opracowano nanocząstki ukierunkowane na raka płuc w połączeniu z chemioterapią. Oceniano zarówno skuteczność przeciwnowotworową PDT in vitro, jak i in vivo z przygotowanymi nanocząstkami.

Skuteczność przeciwnowotworowa terapii fotodynamicznej nanocząstkami ukierunkowanymi na raka płuc

Photodynamic therapy (PDT) is a non-invasive and non-surgical method representing an attractive alternative choice for lung cancer treatment. ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest zwiększenie efektu terapeutycznego terapii fotodynamicznej w leczeniu raka płuc poprzez zastosowanie nanocząstek ukierunkowanych na raka płuc, obciążonych zarówno fotouczulaczem, jak i lekiem przeciwnowotworowym. Ta metoda może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie terapii fotodynamicznej, takie jak ustalenie odpowiednich warunków dla czynników stosowanych w badaniach in vitro oraz in vivo. Ponieważ terapie fotodynamiczne są szeroko stosowane w onkologii, za pomocą tej techniki można przeprowadzać badania przednowotworowe z użyciem standardowych fotouczulaczy lub badać nowe wskazania terapeutyczne.Zastosowania tej techniki rozciągają się na terapię różnych schorzeń, takich jak gruźlica, owrzodzenia oraz dziedziny dermatologii, z wykorzystaniem różnych modułów rocznych. Aby rozpocząć, należy zsyntetyzować ceramid kwasu hialuronowego zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym. Produkt należy oczyścić za pomocą membrany dializacyjnej o wielkości 3,5 kilodaltona, a następnie poddać miofalizacji.Następnie przygotuj same nanocząsteczki kwasu hialuronowego i ceramidu. Nanocząsteczki kwasu hialuronowego i ceramidu wraz z fotosensybilizatorem oraz nanocząsteczki kwasu hialuronowego i ceramidu z czynnikiem przeciwnowotworowym i fotosensybilizatorem. Wysiej linię komórek raka płuca A549 do studni 24-dołkowej płytki hodowlanej z gęstością 1*10⁵ komórek na studnię i inkubuj komórki przez 24 godziny.Następnego dnia usunąć medium i przemyć komórki jednym mililitrem PBS. Następnie, rozpuścić przygotowane nanocząstki w PBS do końcowej stężenia dwóch mikromoli na mililitr fotosensybilizatora Hypocrellin B, mieszając na wortexie. Do czterech studni dodać odpowiednio: jeden mililitr PBS, jeden mililitr pustych nanocząsteczek kwasu hialuronowego i ceramidu, jeden mililitr nanocząsteczek zawierających fotosensybilizator oraz jeden mililitr nanocząsteczek zawierających zarówno fotosensybilizator, jak i lek przeciwnowotworowy.Po zakończeniu przykryj płytkę i inkubuj ją w temperaturze 37 °C przez cztery godziny w ciemności, aby umożliwić wchłanianie nanocząsteczek przez komórki. Następnie usuń cały roztwór i przemyj komórki, dodając 1 mL zimnego PBS. Powtórz etap płukania jeszcze raz, a następnie dodaj świeżą pożywkę hodowlaną.Następnie umieść 24-dołkową płytkę hodowlaną pod światłowodem do terapii fotodynamicznej i ustaw światłowód w odległości jednego centymetra od pierwszego dołka. Odległość od światłowodu do terapii fotodynamicznej do komórek była krytycznym czynnikiem w niniejszym badaniu. Ważne było ustalenie optymalnej odległości, która umożliwi naświetlenie całego obszaru z komórkami.Następnie załóż okulary ochronne i zgaś światła. Naświetlaj komórki laserem w ciemności przez czas od 5 do 40 sekund, aby aktywować wysokoreaktywny tlen singletowy oraz inne wolne rodniki w nanocząsteczkach zawierających fotousensybilizator. Po ekspozycji na światło inkubuj komórki w ciemności przez 24 godziny.Następnie odessać pożywkę hodowlaną i przemyć komórki jednym mililitrem zimnego PBS. Powtórzyć etap płukania jeszcze raz, a następnie dodać do każdej studni 100 mikrolitrów pożywki oraz 10 mikrolitrów roztworu do pomiaru cytotoksyczności. Inkubować komórki w roztworze przez dwie godziny w ciemności, a następnie przenieść wszystkie próbki na płytkę 96-dołkową.Zmierz absorbancję przy 450 nanometrach za pomocą czytnika mikro amicowych. Zbierz komórki A549 i resuspendu jeden milion komórek w 0,1 mililitrach medium RPMI-1640. Umieść resuspendowane komórki w lodzie.Następnie przygotuj samca myszy nagojowej szczepu BALB/C do iniekcji. Potem wprowadź komórki do strzykawki o pojemności 1 ml wyposażonej w igłę o rozmiarze 26 G i wstrzyknij je w lewy bok myszy. Codziennie mierz rozmiar guza za pomocą suwmiarki.Gdy objętość guza osiągnie około 200 mm³, rozpocząć eksperyment, najpierw ważąc każdą mysz. Następnie rozpuścić nanocząsteczki w PBS do końcowego stężenia 2 mg/mL i nabrać do strzykawki o pojemności 1 mL wyposażonej w igłę 26G 1 µL zawiesiny na gram masy ciała myszy. Wstrzyknąć nanocząsteczki drogą dożylną do ogona w dniu zerowym oraz siódmym.24 godziny po każdym wstrzyknięciu znieczuli mysz i umieść miejsce guza pod światłowodem do terapii fotodynamicznej w odległości jednego centymetra od światłowodu. Ważne jest, aby pokryć światłem całą powierzchnię guza w celu osiągnięcia najlepszych rezultatów. Załóż okulary ochronne do laserów, wyłącz światło w pomieszczeniu i naświetlaj guz laserem do terapii fotodynamicznej przez 500 sekund zarówno w dniu pierwszym, jak i ósmym.Po zabiegu laserowym należy utrzymywać myszy w klatkach w ciemności przez 24 godziny. Każdego dnia należy wizualnie monitorować objętość guza oraz zmiany w miejscu jego występowania. Do pomiaru wielkości guza należy użyć suwmiarki, a codziennie wykonywać zdjęcia miejscy występowania guza w celu sprawdzenia zmian powierzchniowych.Przedstawiono tutaj żywotność komórek raka płuca po czterech godzinach inkubacji z nanocząsteczkami, a następnie po naświetleniu. Bez światła komórki eksponowane na nanocząsteczki zawierające wyłącznie fotouczulacz nie wykazały żadnych oznak toksyczności, podczas gdy komórki eksponowane na nanocząsteczki zawierające zarówno fotouczulacz, jak i paklitaksel wykazały żywotność na poziomie około 81%. Wraz z wydłużeniem czasu naświetlania żywotność komórek spadała w obu grupach leczonych fotouczulaczem.Grupa leczona preparatem zawierającym również paklitaksel wykazała największy stopień fototoksyczności. Odzwierciedlono to również w badaniu modelu nowotworowego, w którym objętość guza u myszy leczonych tymi dwiema grupami była niższa niż w grupach kontrolnych. Ponadto w grupie leczonej nanocząstkami zawierającymi paklitaksel i fotouczulacz objętość ta była znacząco niższa niż we wszystkich pozostałych grupach.Mimo że rozmiar guza był znacznie mniejszy, u myszy leczonych nanocząsteczkami zawierającymi zarówno fotouczulacz, jak i paklytaksel, zaobserwowano silne krwawienia oraz najszybszy rozwój martwicy. Opracowanie tej techniki utorowało drogę do wykorzystania laseroterapii w dziedzinie terapii fotodynamicznej w badaniach nad leczeniem nowotworów w systemach in vitro i in vivo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak przeprowadzać terapię fotodynamiczną w systemach in vitro i in vivo.

anticancer-efficacy-photodynamic-therapy-with-lung-cancer-targeted

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Terapia fotodynamiczna (PDT) jest nieinwazyjną i niechirurgiczną metodą leczenia raka płuc. Fotouczulacze selektywnie kumulują się w tkance nowotworowej i prowadzą do śmierci komórek nowotworowych w obecności tlenu i odpowiedniej długości fali światła. W tym filmie z protokołem metoda oparta na PDT jest stosowana do oceny potencjału fototoksycznego potencjalnego fotosensybilizatora w komórkach raka płuc.

Test fototoksyczności in vitro: metoda oparta na PDT do oceny potencjału fototoksycznego fotosensybilizatora w komórkach raka płuc

Terapia fotodynamiczna (PDT) jest nieinwazyjną i niechirurgiczną metodą leczenia raka płuc. Fotouczulacze selektywnie kumulują się w tkance nowotworowej i prowadzą do śmierci komórek nowotworowych w obecności tlenu i odpowiedniej długości fali światła. Ten film opisuje analizę skuteczności przeciwnowotworowej in vivo przy użyciu fotouczulacza zawierającego nanocząstki u myszy z nowotworem, w celu określenia potencjału fototoksycznego fotouczulacza.

Analiza skuteczności przeciwnowotworowej PDT in vivo: technika określania potencjału fototoksycznego fotouczulacza u myszy z nowotworem

Ten film demonstruje technikę fotoimmunoterapii w bliskiej podczerwieni w leczeniu raka płuc na zmodyfikowanym modelu myszy, w którym komórki nowotworowe wykazują ekspresję lucyferazy. Po wstrzyknięciu koniugatu przeciwciało-fotosensybilizator (APC), który wiąże się ze specyficznymi antygenami na komórkach nowotworowych, mysz jest wystawiona na promieniowanie bliskiej podczerwieni, wywołując zmiany fotochemiczne w APC i prowadząc do martwiczej śmierci związanych komórek nowotworowych.

Technika fotoimmunoterapii w bliskiej podczerwieni w leczeniu raka płuc w modelu mysim

Opisany tutaj protokół pozwala na ocenę skuteczności terapii fotodynamicznej (PDT) w liniach komórkowych i optymalizację ustawień PDT przed zastosowaniem terapii na modelach zwierzęcych.

Cytotoksyczna skuteczność terapii fotodynamicznej w komórkach kostniakomięsaka in vitro

Ten protokół opisuje metodę wytwarzania przewodzących nanocząstek polimerowych zmieszanych z fulerenem. Nanocząstki te zostały zbadane pod kątem ich potencjalnego zastosowania jako fotouczulacze nowej generacji w terapii fotodynamicznej (PDT).

Terapia fotodynamiczna z mieszanymi fotouczulaczami z przewodzącego polimeru / fulerenu

Fotoimmunoterapia w bliskiej podczerwieni (NIR-PIT) to nowa strategia leczenia raka, która wykorzystuje koniugat przeciwciało-fotoabsorber (IR700Dye) i światło NIR do niszczenia komórek rakowych. W tym miejscu przedstawiono metodę oceny działania przeciwnowotworowego NIR-PIT w mysim modelu rozsianego raka płuc i złośliwego międzybłoniaka opłucnej z wykorzystaniem obrazowania bioluminescencyjnego.

Fotoimmunoterapia w bliskiej podczerwieni w mysich modelach rozsiewu opłucnej

Tutaj opisujemy nowatorskie, proste i tanie urządzenie do skutecznego przeprowadzania testów terapii fotodynamicznej in vitro (PDT) przy użyciu dwuwymiarowej hodowli komórek HeLa i werteporfiny jako fotosensybilizatora.

Zbudowane przez nas urządzenie do terapii fotodynamicznej oparte na diodach elektroluminescencyjnych do zwiększania cytotoksyczności werteporfiny w modelu hodowli komórkowej 2D

Manuskrypt ten przedstawia nowatorskie, innowacyjne urządzenie oświetleniowe wydrukowane w 3D do badania terapii fotodynamicznej za pośrednictwem Rose Bengal in vitro.

Opracowanie innowacyjnego urządzenia oświetleniowego opartego na diodach LED do zastosowania terapii fotodynamicznej in vitro z użyciem róży bengalskiej

W protokole tym przedstawiono techniki i metodologię niezbędne do celowanej terapii hipertermicznej w modelach guzów litych. Podejście to wykorzystuje fototermiczną konwersję światła w bliskiej podczerwieni przez wstrzykiwane domięśniowo złote nanopręty w celu wywołania miejscowego ogrzewania w mikrośrodowisku guza.

Indukowanie ukierunkowanej łagodnej hipertermii w mysich modelach nowotworów poprzez fototermiczną konwersję światła w bliskiej podczerwieni za pomocą wewnątrznowotworowych nanoprętów złota

Procedura ortotopowego wszczepienia komórek raka trzustki z ekspresją białka zielonej fluorescencji (PANC-1 GFP) do trzustki myszy Balb-c Ola Hsd-Fox1nu w celu oceny progresji guza i przerzutów jest przedstawiona tutaj.

Fluorescencyjny ortotopowy model raka trzustki u myszy

Poznaj terapię fotodynamiczną z nanocząstkami ukierunkowanymi na raka płuc w badaniach in vitro i in vivo. Ta metoda łączy fotouczulacz z lekiem przeciwnowotworowym, zwiększając skuteczność leczenia.

Skuteczność przeciwnowotworowa terapii fotodynamicznej nanocząstkami ukierunkowanymi na raka płuc

Przeglądaj więcej filmów