Name: Ilościowe modelowanie 3D in silico (q3DISM) mózgowej fagocytozy beta-amyloidowej w modelach gryzoni choroby Alzheimera (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Poznaj metodę q3DISM do ilościowego modelowania 3D fagocytozy beta-amyloidowej przez fagocyty jednojądrzaste w mózgach gryzoni z chorobą Alzheimera. Ta technika umożliwia rekonstrukcję przestrzenną i kwantyfikację procesów fagocytozy in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

M-V. G-S. jest wspierany przez BrightFocus Foundation Alzheimer's Disease Research Fellowship Award (A2015309F) oraz Alzheimer's Association, California Southland Chapter Young Investigator Award. T.M.W. jest wspierany przez Fundację ARCS i Francuską Fundację Alzheimera im. Johna Douglasa Maggie McKnight Russell-JDFAF Memorial Postdoctoral Fellowship. Praca ta była wspierana przez National Institute on Neurologic Disorders and Stroke (1R01NS076794-01, do T.T.), Alzheimer's Association Zenith Fellows Award (ZEN-10-174633, do T.T.) oraz American Federation of Aging Research/Ellison Medical Foundation Julie Martin Mid-Career Award in Aging Research (M11472, do T.T.). Jesteśmy wdzięczni za fundusze na start z Instytutu Neurogenetycznego Zilkha, które pomogły w realizacji tej pracy.

Oświadczenie o etyce badawczej: Wszystkie eksperymenty na zwierzętach wyszczególnione w niniejszym dokumencie zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Południowej Kalifornii (IACUC) i przeprowadzone w ścisłej zgodności z wytycznymi i zaleceniami National Institutes of Health oraz zaleceniami Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International.
1. Izolacja mózgu gryzoni i przygotowanie do barwienia immunologicznego
DZIEŃ 1:
<ol>
	<li>Umieść sędziwe szczury TgF344-AD (14-miesięczne) lub myszy APP/PS1 (12-miesięczne) pod ciągłym głębokim znieczuleniem izofluranem (4%). Oceń głębokość znieczulenia przez uszczypnięcie palca u nogi i brak odruchu wycofania.</li>
	<li>Przetnij obie strony klatki piersiowej i podnieś, aby odsłonić serce. Wbić igłę 23 G do lewej komory serca i wykonać małe nacięcie w prawym przedsionku. Przystąpić do wykrwawiania przez perfuzję przezsercową lodowato buforowaną fosforanem soli fizjologicznej (PBS) za pomocą pompy perystaltycznej (30 ml dla myszy; 150 - 200 ml dla szczurów).</li>
	<li>Wykonaj ogonowe nacięcie linii środkowej w skórze i odsuń skórę i mięśnie na bok. Przeciąć górną część czaszki wzdłuż linii środkowej i między oczami. Usuń płytki kostne i odizoluj cały mózg od czaszki.</li>
	<li>Umieść mózg w koronalnej matrycy mózgu gryzonia i pokrój go na ćwiartki. Inkubować tylne ćwiartki O/N (16 h) w utrwalaczu paraformaldehydu (4% PFA w PBS) w temperaturze 4 °C. Przemyć 3x w PBS, a następnie przenieść do 70% etanolu. Ostrzeżenie: PFA jest toksyczny i należy obchodzić się z nim pod kapturem chemicznym przy użyciu odpowiednich środków ochrony osobistej.</li>
</ol>
DZIEŃ 2:
<ol start="5">
	<li>Umieść ćwiartki mózgu w kasetach osadzających i stopniowo odwadniaj tkankę w kolejno bardziej skoncentrowanych 1-godzinnych kąpielach etanolowych (70%, 80%, 95% i 100% x3).</li>
	<li>Usuń etanol z tkanki za pomocą trzech kolejnych kąpieli 100% ksylenu (1 h każda). Uwaga: Ksylen jest toksyczny i należy obchodzić się z nim pod kapturem chemicznym przy użyciu odpowiednich środków ochrony osobistej.</li>
	<li>Zanurzyć tkankę w blokach parafinowych po dwóch kąpielach w stopionym wosku parafinowym (56 - 58 °C, 90 min każda).</li>
</ol>
DZIEŃ 3:
<ol start="8">
	<li>Wytnij odcinki mózgów o grubości 10 μm zatopionych w parafinie za pomocą mikrotomu. Zanurz skrawki w łaźni wodnej (50 °C na 1 min) i nałóż na szkiełka mikroskopowe. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia, upewniając się, że szkiełko przylega do szkiełka.</li>
</ol>
2. Barwienie immunologiczne
Uwaga: Do opisanej poniżej procedury barwienia można wykorzystać różne kombinacje przeciwciał. Koktajle przeciwciał kompatybilne z tkanką mózgową szczurów i myszy są wymienione w Tabeli 1.
DZIEŃ 4:
<ol>
	<li>Deparafinizacja skrawków mózgu za pomocą 2x kąpieli 100% ksylenu (12 min każda).</li>
	<li>Nawadniaj sekcje mózgu w kolejnych kąpielach etanolowych – 100% przez 10 min, 95% przez 5 min, 80% przez 10 min i wreszcie 70% przez 15 min – a następnie 3x płukanie PBS [5 min w temperaturze pokojowej, z lekkim mieszaniem]. W międzyczasie podgrzej roztwór do pobierania antygenu do 95 - 97 °C na płycie grzejnej z mieszaniem pręta magnetycznego.</li>
	<li>Inkubować skrawki mózgu w roztworze do pobierania antygenu w temperaturze 95-97 °C przez 30 minut. Następnie umyć 3x w PBS (5 min w temperaturze pokojowej, z lekkim mieszaniem).</li>
	<li>Szybko wysusz szkiełka za pomocą delikatnych wycieraczek zadaniowych, aby uniknąć wysuszenia tkanek, i narysuj hydrofobową barierę wokół obszaru tkanki za pomocą hydrofobowego pisaka barierowego. Wypełnij otoczony obszar tkanki buforem blokującym [PBS zawierający 0,3% Triton X-100 i 10% normalnej surowicy osła (NDS)] i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę w wilgotnej komorze.</li>
	<li>Zastąp bufor blokujący pierwszorzędowym przeciwciałem Iba1 (rozcieńczonym w buforze blokującym) w celu znakowania fagocytów jednojądrzastych i inkubuj O/N w temperaturze 4 °C w wilgotnej komorze. W przypadku żywicieli opartych na przeciwciałach i rozcieńczeń roboczych zob. Tabela 1 i Tabela materiałów.</li>
</ol>
DZIEŃ 5:
<ol start="6">
	<li>Przepłukać przeciwciało pierwotne 3 kąpielami PBS (5 minut w temperaturze pokojowej z lekkim mieszaniem). Inkubować z fluorescencyjnym przeciwciałem drugorzędowym (sprzężonym z fluoroforem emisyjnym o długości fali 594 nm) przez 1 godzinę (w buforze blokującym w temperaturze pokojowej w ciemności), a następnie 3 razy w kąpieli PBS (5 minut w temperaturze pokojowej z lekkim mieszaniem). W tym czasie utrzymuj sekcje w ciemności, aby uniknąć blaknięcia sygnału fluorescencyjnego.</li>
</ol>
DZIEŃ 6 - 7:
<ol start="7">
	<li>Powtórz kroki 2.5 i 2.6 z przeciwciałami CD68 (mózgi szczurów) lub LAMP1 (tkanka myszy) i odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi (sprzężonymi z fluoroforem emisyjnym 488 nm), aby oznaczyć fagolizososomy.</li>
</ol>
DZIEŃ 7 - 8:
<ol start="8">
	<li>Powtórz kroki 2.5 i 2.6 z przeciwciałami OC (tkanka szczura) lub 4G8 (mózgi myszy) i odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi (sprzężonymi z fluoroforem 647 nm), aby oznaczyć depozyty Aβ. 
	UWAGA: Alternatywnie, przeciwciało 6E10 może być z powodzeniem stosowane zarówno na tkankach myszy, jak i szczurów. Odpowiednie kombinacje przeciwciał znajdują się w Tabeli materiałów.</li>
	<li>Pozwól sekcjom całkowicie wyschnąć przy RT w ciemności. Następnie przykryj próbki szkiełkiem nakrywkowym uszczelnionym fluorescencyjnym nośnikiem montażowym zawierającym DAPI.</li>
</ol>
3. Akwizycja dużych zestawów danych konfokalnych Z-stack
Uwaga: Ten protokół wymaga w pełni zautomatyzowanego skaningowego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w obiektyw 60X i lasery 405 nm, 488 nm, 594 nm i 647 nm. Wszystkie urządzenia są sterowane komputerowo za pomocą oprogramowania do obrazowania i sterowania laserem. Przed rozpoczęciem protokołu obrazowania włącz komputer, lampę epifluorescencyjną, mikroskop, lasery i kamerę.
DZIEŃ 9:
<ol>
	<li>Wybierz obiektyw mikroskopu 60X. Dodaj olejek immersyjny do soczewki i umieść próbkę na uchwycie szkiełka mikroskopowego. Podnieś obiektyw, aż olej zetknie się z prowadnicą. Dostosuj płaszczyznę ogniskowej, aby zlokalizować blaszki amyloidowe w hipokampie lub korze mózgowej za pomocą epifluorescencyjnego oświetlenia przez okulary.</li>
	<li>Uzyskaj obrazy konfokalne aktywowanych fagocytów jednojądrzastych otaczających złogi amyloidu w hipokampie lub korze gryzoni za pomocą mikroskopii konfokalnej (60-krotne powiększenie, kroki z-stack: 0,25 μm < z < 0,40 μm, liczba kroków 25 < n < 35).</li>
</ol>
4. q3DISM
Uwaga: Aby uzyskać znaczące wyniki, sugerujemy przeanalizowanie co najmniej 3 obrazów na zwierzę/region zainteresowania. Dla każdego obrazu obfitość komórek do analizy może się różnić w zależności od paradygmatów eksperymentalnych. W reprezentatywnych wynikach przedstawionych w tym raporcie przeanalizowaliśmy 3 komórki / stan (np. fagocyty jednojądrzaste odległe od blaszek lub związane z blaszkami; patrz ryc. 1C - D i 2C - D).
DZIEŃ 10:
<ol>
	<li>Analizuj zestawy danych konfokalnych za pomocą naukowego modułu kolokalizacji oprogramowania do przetwarzania i analizy obrazów 3D (coloc) pod kątem przestrzennej bliskości barwienia Iba1/CD68 (tkanka szczura) lub Iba1/LAMP1 (tkanka myszy) we wszystkich płaszczyznach Z jednocześnie. Utwórz kanały kolokalizacyjne Iba+/CD68+ lub Iba+/LAMP1+, które odpowiadają fagolizosomom w aktywowanych fagocytach jednojądrzastych.
	<ol>
		<li>Wybierz TRITC dla kanału A (odpowiadającego barwieniu Iba1 sprzężonemu z fluoroforem 594 nm) i FITC dla kanału B (odpowiadającego barwieniu CD68 lub LAMP1 sprzężonemu z fluoroforem 488 nm). Po prawej stronie okna oprogramowania dla "Sprawdzanie trybu" wybierz "próg", a dla "Intensywności coloc" wybierz "Kanały źródłowe".</li>
		<li>Kliknij "Edytuj", aby wybrać "kolor coloc" po prawej stronie okna oprogramowania.</li>
		<li>Dla każdego kanału niezależnie dostosuj progi, aby uwzględnić określone barwienie i wykluczyć sygnały tła/niespecyficzne. Po dostosowaniu nie zmieniaj progów między obrazami, aby zapewnić bezstronną analizę. Kolokalizowane woksele (piksele ze wszystkich stosów z) pojawią się w kolorze wybranym w kroku 4.1.2 we wszystkich stosach z jednocześnie.</li>
		<li>Kliknij "zbuduj kanał coloc". Utworzony kanał kolokalizacji pojawi się w oknie regulacji wyświetlania.</li>
		<li>Kliknij na kanał coloc, aby otworzyć statystyki kanału. "% objętości/materiału A powyżej progu kolokalizowanego" oznacza % sygnału Iba1 (woksele odpowiadające fluoroforowi 594 nm) kolokalizowanego z sygnałem LAMP1 lub CD68 (woksele odpowiadające fluoroforowi 488 nm). Mówiąc prościej, jest to objętość monocytów zajmowana przez fagolizosomy (patrz ryc. 1C i 2C). 
		UWAGA: "% objętości/materiału B powyżej progu kolokalizowanego" odpowiada % sygnału LAMP1 lub CD68 kolokalizowanego z Iba1. Powinno to być bliskie 100%, ponieważ fagolizosomy są strukturami wewnątrzkomórkowymi. Wartości są oparte na stosunku sygnału ze wszystkich stosów z powyżej progu kolokalizowanego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Korzystając z modułu coloc, przeanalizuj kanał coloc utworzony w kroku 4.1 pod kątem bliskości przestrzennej z sygnałami OC (tkanka szczura) lub 4G8 (tkanka myszy) Aβ. Pozwala to na ilościowe określenie Aβ zamkniętego w fagolizosomach.
	<ol>
		<li>Wybierz zestaw danych coloc kanału A (odpowiadający kanałowi coloc Iba1/CD68 lub Iba1/LAMP1 utworzonemu w kroku 4.1) i Cy5 dla kanału B (odpowiadającego barwieniu OC lub 4G8 sprzężonemu z fluoroforem 647 nm).</li>
		<li>Zbuduj kanał coloc zgodnie z opisem w krokach od 4.1.2 do 4.1.5.</li>
		<li>Kliknij na kanał coloc, aby otworzyć statystyki kanału. "% objętości/materiału A powyżej progu kolokalizowanego" oznacza % Iba1/LAMP1 lub Iba1/CD68 (wokseli odpowiadających kanałowi coloc zbudowanemu w kroku 4.1.5) kolokalizowanych z sygnałem OC lub 4G8 (woksele odpowiadające fluoroforowi o długości fali 647 nm). Jest to objętość fagolizosomalna zajmowana przez Aβ (patrz rysunki 1D i 2D). 
		UWAGA: "% objętości/materiału B powyżej progu kolokalizowanego" odpowiada % całkowitego sygnału Aβ kolokalizowanego z fagolizosomami. Można to wykorzystać do oceny frakcji całkowitych depozytów Aβ zamkniętych w fagolizosomach (niepokazanych w obecnych reprezentatywnych wynikach).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj modułu surpass, aby zrekonstruować stosy obrazów konfokalnych i wygenerować modele 3D Aβ zamknięte w fagolizosomach monocytów.
	<ol>
		<li>W oknie "Regulacja wyświetlania" wybierz TRITC (aby wyświetlić tylko barwienie Iba1). W oknie "Właściwości objętości" kliknij "dodaj nową powierzchnię".</li>
		<li>W kroku "Algorytm 1/5", w "ustawieniach" wybierz "powierzchnia". Również w "kolorze" wybierz typ koloru w palecie lub RGB i dostosuj przezroczystość (kolor czerwony jest ustawiony na 60% przezroczystości na rysunkach 1B i 2B). Zaznacz pole wyboru "wybierz obszar zainteresowania". Kliknij Dalej.</li>
		<li>W kroku "2/5 obszar zainteresowania" narysuj okno wokół interesującej komórki, dostosowując współrzędne x, y i z (patrz białe pola na rysunkach 1A i 2A). Kliknij Dalej.</li>
		<li>W kroku "Kanał źródłowy 3/5" wybierz kanał źródłowy TRITC. Zaznacz pole "gładkie" i ustaw poziom szczegółowości powierzchni na 0,4 μm. W polu "thresholding" (określanie progów) wybierz intensywność bezwzględną. Kliknij Dalej.</li>
		<li>W kroku "Próg 4/5" dostosuj próg tak, aby utworzona głośność idealnie pokrywała się z sygnałem kanału TRITC. Kliknij Dalej.</li>
		<li>W kroku "5/5 Klasyfikacja powierzchni" w sekcji "Typ filtra" wybierz obiekty w zależności od ich rozmiaru, które mają zostać uwzględnione lub wykluczone z tworzonych objętości. Kliknij przycisk Zakończ, wykonaj wszystkie kroki tworzenia i zamknij kreatora.</li>
		<li>Powtórz kroki od 4.3.1 do 4.3.6, aby utworzyć powierzchnię 3D dla kanału FITC (fagolizososomy LAMP1+ lub CD68+).</li>
		<li>Powtórz kroki od 4.3.1 do 4.3.6, aby utworzyć powierzchnię 3D dla kanału Cy5 (osady OC+ lub 4G8+ Aβ).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Brookmeyer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((National+estimates+of+the+prevalence+of+Alzheimer%27s+disease+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimers+Dement%22%5BJournal%5D)">National estimates of the prevalence of Alzheimer's disease in the United States.</a> Alzheimers Dement. 7 (1), 61-73 (2011).</li>
<li>Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's disease.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (7), (2011).</li>
<li>Heneka, M. T., Golenbock, D. T., Latz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immunity+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Innate immunity in Alzheimer's disease.</a> Nat Immunol. 16 (3), 229-236 (2015).</li>
<li>Mawuenyega,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+clearance+of+CNS+beta-amyloid+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Decreased clearance of CNS beta-amyloid in Alzheimer's disease.</a> Science. 330 (6012), 1774(2010).</li>
<li>Hickman, S. E., Allison, E. K., El Khoury, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+dysfunction+and+defective+beta-amyloid+clearance+pathways+in+aging+Alzheimer%27s+disease+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglial dysfunction and defective beta-amyloid clearance pathways in aging Alzheimer's disease mice.</a> J Neurosci. 28 (33), 8354-8360 (2008).</li>
<li>Johnston, H., Boutin, H., Allan, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+contribution+of+inflammation+in+models+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Assessing the contribution of inflammation in models of Alzheimer's disease.</a> Biochem Soc Trans. 39 (4), 886-890 (2011).</li>
<li>Gjoneska, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+epigenomic+signals+in+mice+and+humans+reveal+immune+basis+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Conserved epigenomic signals in mice and humans reveal immune basis of Alzheimer's disease.</a> Nature. 518 (7539), 365-369 (2015).</li>
<li>Reitz, C., Mayeux, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer+disease%3A+epidemiology%2C+diagnostic+criteria%2C+risk+factors+and+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Alzheimer disease: epidemiology, diagnostic criteria, risk factors and biomarkers.</a> Biochem Pharmacol. 88 (4), 640-651 (2014).</li>
<li>Hazrati, L. -N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+association+of+CR1+with+Alzheimer%27s+disease%3A+a+tentative+disease+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Genetic association of CR1 with Alzheimer's disease: a tentative disease mechanism.</a> Neurobiol Aging. 33 (12), 2949(2012).</li>
<li>Griciuc, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s+Disease+Risk+Gene+CD33+Inhibits+Microglial+Uptake+of+Amyloid+Beta%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's Disease Risk Gene CD33 Inhibits Microglial Uptake of Amyloid Beta.</a> Neuron. , 1-13 (2013).</li>
<li>Li, X., Long, J., He, T., Belshaw, R., Scott, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+genomic+approaches+identify+major+pathways+and+upstream+regulators+in+late+onset+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Integrated genomic approaches identify major pathways and upstream regulators in late onset Alzheimer's disease.</a> Scientific reports. 5, 12393(2015).</li>
<li>Weitz, T. M., Town, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+Alzheimers+Disease%3A+%22Its+All+About+Context%22%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Alzheimers+Dis%22%5BJournal%5D)">Microglia in Alzheimers Disease: "Its All About Context".</a> Int J Alzheimers Dis. , 314185(2012).</li>
<li>Guillot-Sestier, M. -V., Doty, K. R., Town, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+Immunity+Fights+Alzheimer%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Innate Immunity Fights Alzheimer's Disease.</a> Trends Neurosci. 38 (11), 674-681 (2015).</li>
<li>Guillot-Sestier, M. -V., Town, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immunity+in+Alzheimer%27s+disease%3A+a+complex+affair%5BTitle%5D)+AND+%22CNS+Neurol+Disord+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Innate immunity in Alzheimer's disease: a complex affair.</a> CNS Neurol Disord Drug Targets. 12 (5), 593-607 (2013).</li>
<li>Jankowsky, J. L., Slunt, H. H., Ratovitski, T., Jenkins, N. A., Copeland, N. G., Borchelt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-expression+of+multiple+transgenes+in+mouse+CNS%3A+a+comparison+of+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Biomol+Eng%22%5BJournal%5D)">Co-expression of multiple transgenes in mouse CNS: a comparison of strategies.</a> Biomol Eng. 17 (6), 157-165 (2001).</li>
<li>Guillot-Sestier, M. -V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Il10+deficiency+rebalances+innate+immunity+to+mitigate+Alzheimer-like+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Il10 deficiency rebalances innate immunity to mitigate Alzheimer-like pathology.</a> Neuron. 85 (3), 534-548 (2015).</li>
<li>Cohen, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+Alzheimer+rat+with+plaques%2C+tau+pathology%2C+behavioral+impairment%2C+oligomeric+a%CE%B2%2C+and+frank+neuronal+loss%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A transgenic Alzheimer rat with plaques, tau pathology, behavioral impairment, oligomeric aβ, and frank neuronal loss.</a> J Neurosci. 33 (15), 6245-6256 (2013).</li>
<li>Imai, Y., Ibata, I., Ito, D., Ohsawa, K., Kohsaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+gene+iba1+in+the+major+histocompatibility+complex+class+III+region+encoding+an+EF+hand+protein+expressed+in+a+monocytic+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">A novel gene iba1 in the major histocompatibility complex class III region encoding an EF hand protein expressed in a monocytic lineage.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 224 (3), 855-862 (1996).</li>
<li>Ohsawa, K., Imai, Y., Sasaki, Y., Kohsaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia%2Fmacrophage-specific+protein+Iba1+binds+to+fimbrin+and+enhances+its+actin-bundling+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Microglia/macrophage-specific protein Iba1 binds to fimbrin and enhances its actin-bundling activity.</a> J Neurochem. 88 (4), 844-856 (2004).</li>
<li>Bandyopadhyay, U., Nagy, M., Fenton, W. A., Horwich, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+lipofuscin+in+motor+neurons+of+SOD1-linked+ALS+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Absence of lipofuscin in motor neurons of SOD1-linked ALS mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (30), 11055-11060 (2014).</li>
<li>Holness, C. L., Simmons, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+of+CD68%2C+a+human+macrophage+marker+related+to+lysosomal+glycoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning of CD68, a human macrophage marker related to lysosomal glycoproteins.</a> Blood. 81 (6), 1607-1613 (1993).</li>
<li>Connor, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+the+translation+initiation+factor+eIF2alpha+increases+BACE1+levels+and+promotes+amyloidogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of the translation initiation factor eIF2alpha increases BACE1 levels and promotes amyloidogenesis.</a> Neuron. 60 (6), 988-1009 (2008).</li>
<li>Cai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipase+D1+corrects+impaired+betaAPP+trafficking+and+neurite+outgrowth+in+familial+Alzheimer%27s+disease-linked+presenilin-1+mutant+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Phospholipase D1 corrects impaired betaAPP trafficking and neurite outgrowth in familial Alzheimer's disease-linked presenilin-1 mutant neurons.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (6), 1936-1940 (2006).</li>
<li>Marsh, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adaptive+immune+system+restrains+Alzheimer%27s+disease+pathogenesis+by+modulating+microglial+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The adaptive immune system restrains Alzheimer's disease pathogenesis by modulating microglial function.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (9), 1316-1325 (2016).</li>
<li>Lefterov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apolipoprotein+A-I+deficiency+increases+cerebral+amyloid+angiopathy+and+cognitive+deficits+in+APP%2FPS1DeltaE9+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Apolipoprotein A-I deficiency increases cerebral amyloid angiopathy and cognitive deficits in APP/PS1DeltaE9 mice.</a> J Biol. Chem. 285 (47), 36945-36957 (2010).</li>
<li>Blurton-Jones, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+improve+cognition+via+BDNF+in+a+transgenic+model+of+Alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells improve cognition via BDNF in a transgenic model of Alzheimer disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (32), 13594-13599 (2009).</li>
<li>Stalder, M., Deller, T., Staufenbiel, M., Jucker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D-Reconstruction+of+microglia+and+amyloid+in+APP23+transgenic+mice%3A+no+evidence+of+intracellular+amyloid%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">3D-Reconstruction of microglia and amyloid in APP23 transgenic mice: no evidence of intracellular amyloid.</a> Neurobiol Aging. 22 (3), 427-434 (2001).</li>
<li>Leinenga, G., Götz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+ultrasound+removes+amyloid-%CE%B2+and+restores+memory+in+an+Alzheimer%27s+disease+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Scanning ultrasound removes amyloid-β and restores memory in an Alzheimer's disease mouse model.</a> Sci Transl Med. 7 (278), 33(2015).</li>
<li>Liarski, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+distance+mapping+identifies+functional+T+follicular+helper+cells+in+inflamed+human+renal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Cell distance mapping identifies functional T follicular helper cells in inflamed human renal tissue.</a> Sci Transl Med. 6 (230), 46(2014).</li>
<li>Nichols, L., Pike, V. W., Cai, L., Innis, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+and+in+vivo+quantitation+of+beta-amyloid%3A+an+exemplary+biomarker+for+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Imaging and in vivo quantitation of beta-amyloid: an exemplary biomarker for Alzheimer's disease.</a> Biol Psychiatry. 59 (10), 940-947 (2006).</li>
<li>Skovronsky, D. M., Zhang, B., Kung, M. P., Kung, H. F., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+detection+of+amyloid+plaques+in+a+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In vivo detection of amyloid plaques in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (13), 7609-7614 (2000).</li>
<li>Lian, H., Litvinchuk, A., Chiang, A. C. -A., Aithmitti, N., Jankowsky, J. L., Zheng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte-Microglia+Cross+Talk+through+Complement+Activation+Modulates+Amyloid+Pathology+in+Mouse+Models+of+Alzheimer%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocyte-Microglia Cross Talk through Complement Activation Modulates Amyloid Pathology in Mouse Models of Alzheimer's Disease.</a> J Neurosci. 36 (2), 577-589 (2016).</li>
<li>Novotny, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+Synthetic+A%CE%B2+to+In+Vivo+Active+Seeds+and+Amyloid+Plaque+Formation+in+a+Hippocampal+Slice+Culture+Model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Conversion of Synthetic Aβ to In Vivo Active Seeds and Amyloid Plaque Formation in a Hippocampal Slice Culture Model.</a> J Neurosci. 36 (18), 5084-5093 (2016).</li>
<li>Tartaro, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+fluorescence-based+in+vivo+phagocytosis+assay+to+measure+mononuclear+phagocyte+system+function+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunotoxicol%22%5BJournal%5D)">Development of a fluorescence-based in vivo phagocytosis assay to measure mononuclear phagocyte system function in the rat.</a> J Immunotoxicol. 12 (3), 239-246 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół, który opisujemy w tym raporcie, dotyczący prawdziwej kwantyfikacji 3D fagocytozy Aβ in vivo przez fagocyty jednojądrzaste, opiera się na specyficznym znakowaniu przedziałów komórkowych i subkomórkowych, a także złogów Aβ. W szczególności używamy Iba1 (cząsteczka 1 zjonizowanego adaptera wiążącego wapń), białka, które bierze udział w marszczeniu błony i fagocytozie po aktywacji komórek18,19, do barwienia jednojądrzastych fagocytów mózgowych. Chociaż komórki Iba1 +</...

Choroba Alzheimera (AD), najczęstsza demencja związana z wiekiem1, charakteryzuje się akumulacją amyloid β u w mózgu (Aβ) w postaci "starczych" blaszek β-amyloidowych, przewlekłego zapalenia nerwów o niskim poziomie, tauopatii, utraty neuronów i zaburzeń poznawczych2. W mózgach pacjentów z chorobą Alzheimera zapalenie nerwów jest sygnalizowane przez reaktywne astrocyty i fagocyty jednojądrzaste (określane jako mikroglej, chociaż ich centralne i obwodowe pochodzenie pozostaje niejasne) otaczające złogi Aβ3. Jako wrodzeni strażnicy immunologiczni OUN, mikroglej jest centralnie umieszczony w celu oczyszczenia mózgu Aβ. Jednak rekrutacji mikrogleju do blaszek Aβ towarzyszy bardzo mało, jeśli w ogóle, fagocytozy Aβ4,5. Jedna z hipotez głosi, że mikroglej jest początkowo neuroprotekcyjny poprzez fagocytozowanie małych zespołów Aβ. Jednak w końcu komórki te stają się neurotoksyczne, ponieważ przytłaczające obciążenie Aβ i/lub związany z wiekiem spadek funkcjonalny prowokuje mikroglej do dysfunkcyjnego fenotypu prozapalnego, przyczyniając się do neurotoksyczności i pogorszenia funkcji poznawczych6.
Ostatnie badania asocjacyjne całego genomu (GWAS) zidentyfikowały grupę alleli ryzyka AD należących do podstawowych wrodzonych szlaków immunologicznych7, które modulują fagocytozę8-11. W związku z tym odpowiedź immunologiczna na odkładanie się amyloidu w mózgu stała się głównym obszarem zainteresowania, zarówno pod względem zrozumienia etiologii choroby Alzheimera, jak i opracowania nowych podejść terapeutycznych12-14. Istnieje jednak pilna potrzeba opracowania metodologii oceny fagocytozy Aβ in vivo. Aby zaspokoić tę niezaspokojoną potrzebę, opracowaliśmy ilościowe modelowanie 3D in silico (q3DISM), aby umożliwić prawdziwą kwantyfikację 3D mózgowej fagocytozy Aβ za pomocą fagocytów jednojądrzastych w modelach choroby podobnej do choroby Alzheimera u gryzoni.
Ograniczone jedynie przez zakres, w jakim rekapitulują chorobę, modele zwierzęce okazały się nieocenione dla zrozumienia patoetiologii AD i oceny eksperymentalnych metod terapeutycznych. Ze względu na fakt, że mutacje w genach preseniliny (PS) i białka prekursorowego amyloidu (APP) niezależnie powodują autosomalną dominującą chorobę Alzheimera, te zmutowane transgeny są szeroko wykorzystywane do generowania transgenicznych modeli gryzoni. Transgeniczne myszy APP / PS1 jednocześnie koeksprymujące "szwedzką" zmutowaną ludzką APP (APPswe) i zmutowaną ludzką presenilinę 1 eksonu 9 Δ (PS1ΔE9) z przyspieszoną amyloidozą mózgową i zapaleniem nerwów15,16. Ponadto wygenerowaliśmy bi-transgeniczne szczury, którym wstrzyknięto jednocześnie konstrukty APPswe i PS1ΔE9 (linia TgF344-AD, na tle Fischera 344). W przeciwieństwie do transgenicznych mysich modeli amyloidozy mózgowej, szczury TgF344-AD rozwijają amyloid mózgowy, który poprzedza tauopatię, apoptozę neuronów i upośledzenie zachowania17.
W tym raporcie opisujemy protokół immunologicznego barwienia mikrogleju, fagolizosomów i złogów Aβ w sekcjach mózgu myszy APP/PS1 i szczurów TgF344-AD oraz pozyskiwania dużych obrazów konfokalnych w wymiarze z. Szczegółowo opisujemy generowanie i analizę prawdziwych rekonstrukcji 3D na podstawie konfokalnych zestawów danych umożliwiających ilościowe określenie wychwytu Aβ przez fagolizososomy mikrogleju. W szerszym ujęciu, metodologia, którą tutaj szczegółowo opisujemy, może być wykorzystana do ilościowego określenia praktycznie każdej formy fagocytozy in vivo.

<table><tbody><tr><td>Isoflurane</td><td>Abbott</td><td>NDC 0044-5260-05</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki preparacyjne</td><td>VWR</td><td>82027-582</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki preparacyjne końcówka</td><td>VWR</td><td>82027-588</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta</td><td>VWR</td><td>94024-408</td><td></td></tr><tr><td>Igła 23 G</td><td>Pompa</td><td></td> perystaltyczna VWR BD305145 <td></td></tr><tr><td>FH10</td><td>Thermo Scientific</td><td>72-310-010</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Bioland Scientific</td><td>PBS01-02</td><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami; Stężenie robocze 1x</td></tr><tr><td>Matryca mózgu dorosłej myszy, plastry koronalne, stal nierdzewna 1 mm&nbsp;</td><td>Kent Scientific</td><td>RBMS-200C</td><td></td></tr><tr><td>Matryca mózgu dorosłego szczura, plastry koronalne, stal nierdzewna 1 mm&nbsp;</td><td>Kent Scientific</td><td>RBMS-305C&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>32% wodny roztwór paraformaldehydu (PFA)</td><td>EMS</td><td>15714-S</td><td>Uwaga: Toksyczny. Stężenie robocze: 4% w PBS</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>VWR</td><td>89125-188</td><td>Różne stężenia, patrz protokół</td></tr><tr><td>Kasety Tissue-Tek Uni Sakura</td><td>VWR</td><td>25608-774</td><td></td></tr><tr><td>Parafina do zatapiania i infiltracji</td><td>VWR</td><td>15147-839</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom Leica RM2125</td> Jednorazowe ostrza do mikrotomów <td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>VWR</td><td>25608-964</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna Leica HI 1210</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro slide Superfrost plus</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>534056-4X4L</td><td>Uwaga: Toksyczny&nbsp;</td></tr><tr><td>Roztwór do odzyskiwania celu 10x</td><td>DAKO</td><td>S1699</td><td>Stężenie robocze 1x</td></tr><tr><td>KimWipes</td><td>VWR</td><td>21905-026</td><td></td></tr><tr><td>Hydrofobowy długopis PAP</td><td>VWR</td><td>95025-252</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>VWR</td><td>97062-208</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica osła (NDS)</td><td>Jackson Immuno</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>VWR</td><td>48393081</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik przeciwblaknięcia Prolong Gold z DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>Szklany stojak na slajdy</td><td>VWR</td><td>100492-942</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało Iba1 (poliklonalne, królik)</td><td>Wako</td><td>019-19741&nbsp;</td><td>Stężenie robocze 1:200</td></tr><tr><td>Przeciwciało Iba1 (poliklonalne, kozie)</td><td>LifeSpan Bioscience</td><td>LS-B2645</td><td>Stężenie robocze 1:200</td></tr><tr><td>szczur CD68 [KP1] przeciwciało (monoklonalne, mysz)</td><td>Abcam</td><td>ab955</td><td>Stężenie robocze 1:200</td></tr><tr><td>mysz CD68 [FA-11] przeciwciało (monoklonalne, szczur)</td><td>Abcam</td><td>ab53444</td><td>Stężenie robocze 1:200</td></tr><tr><td>mysz CD107a (LAMP1) przeciwciało (monoklonalne, szczur)</td><td>Affymetrix</td><td>14-1071</td><td>Stężenie robocze 1:100</td></tr><tr><td>Beta-Amyloid, 17 - 24 (4G8) przeciwciało (monoklonalne, mysie)</td><td>Covance</td><td>SIG-39220</td><td>Stężenie robocze 1:200</td></tr><tr><td>Beta-amyloid, 1 - 16 (6E10) przeciwciało (monoklonalne, mysie)</td><td>Covance</td><td>SIG-39320</td><td>Stężenie robocze 1:200</td></tr><tr><td>Przeciwciało OC (poliklonalne, królik)</td><td>Podarowane przez D. H. Cribbs i C. G. Glabe (UC Irvine)</td><td>Stężenie robocze 1:200</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało wtórne myszy Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11001</td><td>Stężenie robocze 1:1,000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 przeciwciało wtórne szczura</td><td>Invitrogen</td><td>A-11006</td><td>Stężenie robocze 1:1,000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 przeciwciało drugorzędowe królika</td><td>Invitrogen</td><td>A-11037</td><td>Stężenie robocze 1:1,000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 kozie przeciwciało wtórne</td><td>Invitrogen</td><td>A-11080</td><td>Stężenie robocze 1:1,000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 mysie przeciwciało wtórne</td><td>Invitrogen</td><td>A-21235</td><td>Stężenie robocze 1:1,000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 przeciwciało wtórne królika</td><td>Invitrogen</td><td>A-21443</td><td>Stężenie robocze 1:1,000</td></tr><tr><td>Olejek immersyjny</td><td>Nikon&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny A1</td><td>Nikon&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie NIS Elements Advanced Research</td><td>Nikon&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris:Oprogramowanie Bitplane w wersji 7.6</td> Używane są moduły <td>Bitplane</td><td></td> <td>"coloc" i "supass". Alternatywnie, darmowe oprogramowanie typu open source&nbsp; ImageJ może być używany do kolokalizacji&nbsp; Analiza zbiorów danych konfokalnych stosów Z.</td></tr></tbody></table>

ilościowe modelowanie 3d in silico (q3dism) mózgowej fagocytozy beta-amyloidowej w modelach gryzoni choroby alzheimera

Quantitative 3D In Silico Modeling (q3DISM) of Cerebral Amyloid-beta Phagocytosis in Rodent Models of Alzheimer's Disease

Zapalenie układu nerwowego jest teraz uznawane za główny czynnik etiologiczny w chorobach neurodegeneracyjnych. Fagocyty jednojądrzaste to wrodzone komórki odpornościowe odpowiedzialne za fagocytozę i usuwanie gruzu i detrytusu. Komórki te obejmują makrofagi rezydujące w OUN, znane jako mikroglej, oraz fagocyty jednojądrzaste infiltrujące z peryferii. Mikroskopia świetlna jest zwykle stosowana do wizualizacji fagocytozy w próbkach mózgu gryzoni lub ludzi. Jednak metody jakościowe nie dostarczyły ostatecznych dowodów na fagocytozę in vivo. W tym miejscu opisujemy ilościowe modelowanie 3D in silico (q3DISM), solidną metodę pozwalającą na prawdziwą kwantyfikację 3D fagocytozy β amyloidu (Aβ) przez fagocyty jednojądrzaste w modelach choroby Alzheimera (AD) gryzoni. Metoda polega na fluorescencyjnej wizualizacji Aβ zamkniętego w fagolizosomach w wycinkach mózgu gryzoni. Duże zestawy danych konfokalnych w wymiarze z są następnie rekonstruowane w 3D w celu ilościowego określenia Aβ przestrzennie kolokalizowanego w fagolizosomie. Wykazujemy udane zastosowanie q3DISM do mózgów myszy i szczurów, ale metodologia ta może być rozszerzona na praktycznie każde zdarzenie fagocytarne w dowolnej tkance.

Wykorzystując szczegółowo opisaną powyżej wieloetapową metodologię q3DISM, jesteśmy w stanie ilościowo określić wychwyt Aβ do fagolizosomów monocytów w mózgach myszy APP/PS1 (Rysunek 1) i szczurów TgF34-AD (Rysunek 2). Zatem metodologia q3DISM umożliwiła analizę fagocytów jednojadrowych w mysich i szczurzych modelach AD. Co ciekawe, objętość zajmowana przez fagolizosomy CD68+ jest znacznie zwiększona w fagocytach jednojadrowych Iba1+...

Opracowaliśmy metodologię ilościowego modelowania 3D in silico (q3DISM) amyloid-β (Aβ) fagocytoza przez jednojądrzaste fagocyty w modelach gryzoni choroby Alzheimera. Metodę tę można uogólnić w celu ilościowego określenia praktycznie każdego zdarzenia fagocytarnego in vivo.

Ilościowe modelowanie 3D in silico (q3DISM) mózgowej fagocytozy beta-amyloidowej w modelach gryzoni choroby Alzheimera

Neuroinflammation is now recognized as a major etiological factor in neurodegenerative disease. Mononuclear phagocytes are innate immune cells responsible ...

Ogólnym celem tego ilościowego modelowania 3D in silico (technika q3DISM) jest ilościowe określenie wychwytu beta-amyloidu przez fagocyty jednojądrzaste w mózgach gryzoni z chorobą Alzheimera. Metoda ta odpowiada na pilną potrzebę w dziedzinie badań nad chorobą Alzheimera w zakresie ilościowego określenia klirensu beta-amyloidu, który odkłada się w mózgach pacjentów z chorobą Alzheimera, tworząc blaszki starcze. Po raz pierwszy technika ta umożliwia prawdziwą rekonstrukcję 3D i ilościowe określenie beta amyloidu przez makrofagi in vivo Zaczęliśmy używać cued 3-Dism do badania depozycji beta-amyloidu, ponieważ potrzebowaliśmy solidnego narzędzia do wizualizacji i ilościowego określenia fagocytozy mikrofagów in vivo.Technika ta może okazać się przydatna w testowaniu eksperymentalnych leków na chorobę Alzheimera w celu oceny, które leki stymulują makrofagi do skutecznego usuwania beta-amyloidu. Gdy próbki tkanek są gotowe do barwienia immunologicznego, wypełnij obszar tkanki otoczony długopisem bariery hydrofobowej buforem blokującym na jedną godzinę inkubacji w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze. Pod koniec inkubacji zastąpić bufor blokujący pierwszym badanym przeciwciałem pierwszorzędowym przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza w wilgotnej komorze.Następnego ranka umyj próbki w trzech pięciominutowych kąpielach PBS w temperaturze pokojowej z lekkim mieszaniem. Po trzecim przemyciu inkubować szkiełka z odpowiednim fluorescencyjnym przeciwciałem drugorzędowym w temperaturze pokojowej chronionej przed światłem. Po godzinie umyj sekcje jeszcze trzy razy w PBS chronionym przed światłem.Następnie oznacz komórki innymi odpowiednimi dla tkanek pierwszorzędowymi i drugorzędowymi przeciwciałami będącymi przedmiotem zainteresowania w ciągu następnych dwóch do czterech dni, jak właśnie wykazano. Aby skutecznie wybarwić przedziały komórkowe i superkomórkowe oraz złogi beta-amyloidu, ważne jest, aby znakować tylko jednym przeciwciałem pierwszorzędowym na raz, a następnie odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym. Jest to czasochłonny, ale optymalizujący wyniki proces.Po ostatnim przemyciu wtórnego barwienia przeciwciałami, pozostawić skrawki do całkowitego wyschnięcia przez noc w temperaturze pokojowej w ciemności. Następnie przykryj wysuszone próbki szkiełkiem nakrywkowym uszczelnionym fluorescencyjnym medium montażowym zawierającym DAPI. Aby zobrazować próbki za pomocą mikroskopii konfokalnej, wybierz obiektyw mikroskopu 60x i dodaj olejek immersyjny do soczewki.Umieść próbkę na uchwycie szkiełka mikroskopowego i podnieś obiektyw, aż olej zetknie się ze szkiełkiem. Korzystając z oświetlenia epifluorescencyjnego, dostosuj płaszczyznę ogniskowej, aby zlokalizować blaszki amyloidowe w hipokampie lub korze mózgowej. Następnie uzyskaj obrazy konfokalne aktywowanych fagocytów jednojądrzastych otaczających złogi amyloidu w hipokampie lub korze.W przypadku jakościowego modelowania 3D in silico, najpierw przeanalizuj zestawy danych konfokalnych z naukowym przetwarzaniem obrazu 3D w module kolokalizacji oprogramowania analitycznego pod kątem przestrzennej bliskości aktywowanego barwienia markerem makrofagów we wszystkich płaszczyznach Z jednocześnie. Utwórz kanały kolokalizacyjne, które odpowiadają barwieniu fagolizosomów w aktywowanych fagocytach jednojądrzastych. Wybierz TRITC dla kanału A i FITC dla kanału B.In oknie Sprawdzanie trybu wybierz Próg.W przypadku intensywności kolokalizacji wybierz opcję Kanały źródłowe. Kliknij przycisk Edytuj, aby wybrać kolor kolokalizacji. Następnie dostosuj progi każdego kanału niezależnie, aby uwzględnić określone barwienie i wykluczyć sygnały tła i niespecyficzne.Kolokalizowane woksele pojawią się w wybranym kolorze kolokalizacji we wszystkich stosach z jednocześnie. Następnie kliknij pozycję Zbuduj kanał kolokalizacji. Utworzony kanał kolokalizacyjny pojawi się w oknie Display Adjustment (Dopasowanie wyświetlania).Kliknij kanał kolokalizacji, aby otworzyć statystyki kanału. Procent objętości materiału A powyżej progu kolokalizowanego reprezentuje objętość monocytów zajmowaną przez fagolizosomy. Korzystając z modułu kolokalizacji, przeanalizuj kanał kolokalizacyjny pod kątem przestrzennej bliskości z sygnałami beta-amyloidu, aby określić ilościowo beta-amyloid zamknięty w fagolizososomach.Wybierz zestaw danych kolokalizacji kanału A i Cy5 dla kanału B i zbuduj kanał kolokalizacji, jak pokazano poniżej. Kliknij kanał kolokalizacji, aby ponownie otworzyć statystyki kanału. Procent objętości materiału A powyżej progu kolokalizowanego reprezentuje objętość fagolizosomalną zajmowaną przez beta-amyloid.Korzystając z modułu Surpass, zrekonstruuj stosy obrazów konfokalnych i wygeneruj modele 3D zamkniętego w kapsułkach beta-amyloidu w fagolizosomach monocytów. W oknie Display Adjustment (Dopasowanie wyświetlania) wybierz TRITC, aby wyświetlić tylko barwienie makrofagów, a następnie kliknij dodaj nową powierzchnię" we właściwościach woluminu. W obszarze Ustawienia w kroku pierwszym z pięciu algorytmu wybierz pozycję Powierzchnia.W polu Kolor wybierz interesujący Cię typ koloru i odpowiednio dostosuj przezroczystość. Następnie zaznacz pole wyboru regionu zainteresowania i kliknij Dalej. W kroku drugim z pięciu, obszar zainteresowania, dostosuj współrzędne X, Y i Z, aby narysować okno wokół interesującej komórki, a następnie kliknij przycisk Dalej.W kroku trzecim z pięciu, kanał źródłowy, wybierz kanał źródłowy TRITC i zaznacz pole Gładkie. Ustaw poziom szczegółowości pola powierzchni na 0,4 mikrona i kliknij przycisk Dalej. W kroku czwartym z pięciu, próg, dostosuj próg tak, aby utworzona głośność idealnie pokrywała się z sygnałem kanału TRITC i kliknij Dalej.Na koniec, w kroku piątym z pięciu, klasyfikuj powierzchnie, w sekcji Typy filtrów wybierz obiekty w zależności od ich rozmiaru, które mają zostać uwzględnione lub wykluczone z woluminów, które mają zostać utworzone. Powtórz te same kroki, aby utworzyć powierzchnie 3D dla fagolizosomów z kanałem FITC i amyloidu-beta z kanałem Cy5. Po jakościowym modelowaniu 3D in silico, jak właśnie wykazano, można przeanalizować wychwyt beta amyloidu do fagolizosomów monocytów w mózgach transgenicznych myszy i szczurów.Co ciekawe, objętość zajmowana przez fagolizosomy CD68 dodatnie jest znacznie zwiększona w fagocytach jednojądrzastych Iba1-dodatnich, związanych z, w porównaniu z odległymi od blaszek, zarówno u myszy, jak i szczurów, co pokazuje, że fagocyty jednojądrzaste w pobliżu blaszek są gotowe do fagocytozy w porównaniu z komórkami znajdującymi się z dala od blaszek. Warto również zauważyć, że fagocyty jednojądrzaste związane z blaszkami wykazują zwiększony wychwyt beta amyloidu u myszy transgenicznych w porównaniu z komórkami odległymi od blaszek, podczas gdy u transgenicznych szczurów obserwuje się ogólnie bardzo skromny wychwyt włókienek beta amyloidu, bez widocznej zmiany w fagocytozie włókienka amyloidu beta w funkcji odległości od blaszek. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać, że jakość obrazów konfokalnych jest kluczowa i że podobne progi powinny być stosowane dla wszystkich kanałów podczas analizy kolokalizacji.Od czasu jej opracowania, technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się zapaleniem nerwów do badania zdarzeń fagocytarnych w mózgach gryzoni w modelach choroby Alzheimera. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak oznaczać skrawki mózgu gryzoni pod kątem fagocytów jednojądrzastych, fagolizosomu i beta-amyloidu. Ilościowe określenie fagocytozy mózgowego beta-amyloidu w 3-D in vivo.

quantitative-3d-silico-modeling-q3dism-cerebral-amyloid-beta

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ten film demonstruje precyzyjną stereotaktyczną infuzję beta amyloidu do zakrętu zębatego w celu stworzenia mysiego modelu choroby Alzheimera. Dokładne określenie współrzędnych i kontrolowane dostarczanie białek beta amyloidu powoduje degradację neuronów, zakłócając przetwarzanie pamięci i przyczyniając się do rozwoju choroby Alzheimera.

Bezpośrednia stereotaktyczna infuzja białek beta amyloidu w mózgu dla modelu choroby Alzheimera

Źródło: Arango-Lievano, M. et. al., Podłużne obrazowanie in vivo naczyń mózgowych: znaczenie dla chorób OUN. J. Vis. Exp. (2016)Ten film demonstruje obrazowanie dwufotonowe in vivo w celu wizualizacji znakowanych fluorescencyjnie blaszek amyloidowych i naczyń mózgowych. Niebieska fluorescencja oznacza blaszki miażdżycowe, podczas gdy zielona fluorescencja podkreśla naczynia krwionośne mózgu. Mapa 3D obszaru zainteresowania i obrazowanie mozaikowe o wysokiej rozdzielczości ujawniają szczegółowe...

Obrazowanie in vivo naczyń mózgowych i blaszek amyloidowych w mysim modelu choroby Alzheimera

Tutaj prezentujemy protokół bezpośredniej stereotaktycznej infuzji beta-amyloidu do mózgu. Metodologia ta zapewnia alternatywny model mysi in vivo w celu rozwiązania krótkoterminowych skutków beta-amyloidu na neurony mózgowe.

Stereotaktyczny wlew oligomerycznego beta-amyloidu do hipokampa myszy

Model zwierzęcy z wstrzyknięciem β amyloidu (Aβ) umożliwia podawanie określonej ilości i gatunku fragmentów Aβ oraz redukuje indywidualne różnice w każdej badanej grupie. Protokół ten opisuje wstrzyknięcie Aβ do komory mózgowej (ICV) bez instrumentów stereotaktycznych, umożliwiając wytwarzanie nieprawidłowości behawioralnych podobnych do choroby Alzheimera u normalnych myszy.

Wstrzyknięcie domózgowo-komorowe peptydów β amyloidu u normalnych myszy w celu ostrego wywołania deficytów poznawczych podobnych do choroby Alzheimera

Ten artykuł opisuje protokół wizualizacji blaszek amyloidowych Aβ w mysich modelach choroby Alzheimera za pomocą metoksy-X04, który przenika przez barierę krew-mózg i selektywnie wiąże się z β-plisowanymi arkuszami znajdującymi się w gęstych blaszkach rdzeniowych Aβ. Umożliwia wstępne badanie przesiewowe skrawków tkanek zawierających płytkę przed barwieniem immunologicznym i przetwarzaniem do mikroskopii elektronowej.

Korelacyjna mikroskopia świetlna i elektronowa do badania interakcji mikrogleju z blaszkami β-amyloidowymi

Opisane tutaj jest etapowe, behawioralne podejście przesiewowe, które może być użyte do badania przesiewowego pod kątem związków wykazujących skuteczność in vivo na poznawcze i funkcjonalne zachowania motoryczne w transgenicznych mysich modelach β-amyloidozy i tauopatii. Metody te są zoptymalizowane pod kątem badań przesiewowych związków pod kątem aktywności w zadaniach pamięci krótkotrwałej i roboczej.

Ocena spontanicznej przemiany, rozpoznawania nowych obiektów i zaciskania kończyn w transgenicznych mysich modelach β amyloidu i neuropatologii tau

Ten protokół ilustruje metodę enkapsulacji komórek poprzez szybkie fizyczne żelowanie alginianu w celu unieruchomienia komórek. Uzyskane mikrogranulki umożliwiają kontrolowane i trwałe wydzielanie β amyloidu w czasie i mogą być wykorzystywane do badania skutków wydzielania β amyloidu w modelach in vitro i in vivo.

Wytwarzanie mikrogranulek alginianu wydzielających β amyloid do wykorzystania w modelowaniu choroby Alzheimera

Obecny protokół opisuje i porównuje procedurę przeprowadzania analizy całego regionu lub podregionu zainteresowania odcinków mózgu myszy strzałkowej w celu ilościowego określenia obciążenia beta-amyloidu w transgenicznym mysim modelu choroby Alzheimera APP/PS1.

Pełna, kontra subregionalna kwantyfikacja obciążenia beta-amyloidem w wycinkach mózgu myszy

Tutaj opisujemy pomiar szybkości transportu aksonów konstytutywnych stabilizatorów błon retikulum endoplazmatycznego (ER) związanych z mitochondriami (MAM) poprzez zwiększanie lub utrzymywanie neurotoksycznego generowania β-amyloidu (Aβ) z neuronów choroby Alzheimera (AD) w czasie rzeczywistym, aby służyć jako bezpośredni i ilościowy wskaźnik do pomiaru stabilizacji MAM i wspomagania rozwoju terapii AD.

Analiza ilościowa stabilizacji błony retikulum endoplazmatycznego powiązanej z mitochondriami (MAM) w neuronalnym modelu choroby Alzheimera (AD)

Omówiono metodologię gromadzenia gęstych danych potencjałów wywołanych podczas wykonywania przez pacjentów z chorobą Alzheimera zadania z pamięcią rozpoznawczą. Protokół ten obejmuje przygotowanie badanych, zapewnienie jakości, akwizycję danych oraz analizę danych.

Badanie charakterystyki pamięci epizodycznej z wykorzystaniem potencjałów wywołanych zdarzeniami u pacjentów z chorobą Alzheimera

Poznaj metodę q3DISM do ilościowego modelowania 3D fagocytozy beta-amyloidowej przez fagocyty jednojądrzaste w mózgach gryzoni z chorobą Alzheimera. Ta technika umożliwia rekonstrukcję przestrzenną i kwantyfikację procesów fagocytozy in vivo.

Ilościowe modelowanie 3D in silico (q3DISM) mózgowej fagocytozy beta-amyloidowej w modelach gryzoni choroby Alzheimera

Przeglądaj więcej filmów