Ilościowe modelowanie 3D in silico (q3DISM) mózgowej fagocytozy beta-amyloidowej w modelach gryzoni choroby Alzheimera

Ogólnym celem tego ilościowego modelowania 3D in silico (technika q3DISM) jest ilościowe określenie wychwytu beta-amyloidu przez fagocyty jednojądrzaste w mózgach gryzoni z chorobą Alzheimera. Metoda ta odpowiada na pilną potrzebę w dziedzinie badań nad chorobą Alzheimera w zakresie ilościowego określenia klirensu beta-amyloidu, który odkłada się w mózgach pacjentów z chorobą Alzheimera, tworząc blaszki starcze. Po raz pierwszy technika ta umożliwia prawdziwą rekonstrukcję 3D i ilościowe określenie beta amyloidu przez makrofagi in vivo Zaczęliśmy używać cued 3-Dism do badania depozycji beta-amyloidu, ponieważ potrzebowaliśmy solidnego narzędzia do wizualizacji i ilościowego określenia fagocytozy mikrofagów in vivo.

Technika ta może okazać się przydatna w testowaniu eksperymentalnych leków na chorobę Alzheimera w celu oceny, które leki stymulują makrofagi do skutecznego usuwania beta-amyloidu. Gdy próbki tkanek są gotowe do barwienia immunologicznego, wypełnij obszar tkanki otoczony długopisem bariery hydrofobowej buforem blokującym na jedną godzinę inkubacji w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze. Pod koniec inkubacji zastąpić bufor blokujący pierwszym badanym przeciwciałem pierwszorzędowym przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza w wilgotnej komorze.

Następnego ranka umyj próbki w trzech pięciominutowych kąpielach PBS w temperaturze pokojowej z lekkim mieszaniem. Po trzecim przemyciu inkubować szkiełka z odpowiednim fluorescencyjnym przeciwciałem drugorzędowym w temperaturze pokojowej chronionej przed światłem. Po godzinie umyj sekcje jeszcze trzy razy w PBS chronionym przed światłem.

Następnie oznacz komórki innymi odpowiednimi dla tkanek pierwszorzędowymi i drugorzędowymi przeciwciałami będącymi przedmiotem zainteresowania w ciągu następnych dwóch do czterech dni, jak właśnie wykazano. Aby skutecznie wybarwić przedziały komórkowe i superkomórkowe oraz złogi beta-amyloidu, ważne jest, aby znakować tylko jednym przeciwciałem pierwszorzędowym na raz, a następnie odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym. Jest to czasochłonny, ale optymalizujący wyniki proces.

Po ostatnim przemyciu wtórnego barwienia przeciwciałami, pozostawić skrawki do całkowitego wyschnięcia przez noc w temperaturze pokojowej w ciemności. Następnie przykryj wysuszone próbki szkiełkiem nakrywkowym uszczelnionym fluorescencyjnym medium montażowym zawierającym DAPI. Aby zobrazować próbki za pomocą mikroskopii konfokalnej, wybierz obiektyw mikroskopu 60x i dodaj olejek immersyjny do soczewki.

Umieść próbkę na uchwycie szkiełka mikroskopowego i podnieś obiektyw, aż olej zetknie się ze szkiełkiem. Korzystając z oświetlenia epifluorescencyjnego, dostosuj płaszczyznę ogniskowej, aby zlokalizować blaszki amyloidowe w hipokampie lub korze mózgowej. Następnie uzyskaj obrazy konfokalne aktywowanych fagocytów jednojądrzastych otaczających złogi amyloidu w hipokampie lub korze.

W przypadku jakościowego modelowania 3D in silico, najpierw przeanalizuj zestawy danych konfokalnych z naukowym przetwarzaniem obrazu 3D w module kolokalizacji oprogramowania analitycznego pod kątem przestrzennej bliskości aktywowanego barwienia markerem makrofagów we wszystkich płaszczyznach Z jednocześnie. Utwórz kanały kolokalizacyjne, które odpowiadają barwieniu fagolizosomów w aktywowanych fagocytach jednojądrzastych. Wybierz TRITC dla kanału A i FITC dla kanału B.In oknie Sprawdzanie trybu wybierz Próg.

W przypadku intensywności kolokalizacji wybierz opcję Kanały źródłowe. Kliknij przycisk Edytuj, aby wybrać kolor kolokalizacji. Następnie dostosuj progi każdego kanału niezależnie, aby uwzględnić określone barwienie i wykluczyć sygnały tła i niespecyficzne.

Kolokalizowane woksele pojawią się w wybranym kolorze kolokalizacji we wszystkich stosach z jednocześnie. Następnie kliknij pozycję Zbuduj kanał kolokalizacji. Utworzony kanał kolokalizacyjny pojawi się w oknie Display Adjustment (Dopasowanie wyświetlania).

Kliknij kanał kolokalizacji, aby otworzyć statystyki kanału. Procent objętości materiału A powyżej progu kolokalizowanego reprezentuje objętość monocytów zajmowaną przez fagolizosomy. Korzystając z modułu kolokalizacji, przeanalizuj kanał kolokalizacyjny pod kątem przestrzennej bliskości z sygnałami beta-amyloidu, aby określić ilościowo beta-amyloid zamknięty w fagolizososomach.

Wybierz zestaw danych kolokalizacji kanału A i Cy5 dla kanału B i zbuduj kanał kolokalizacji, jak pokazano poniżej. Kliknij kanał kolokalizacji, aby ponownie otworzyć statystyki kanału. Procent objętości materiału A powyżej progu kolokalizowanego reprezentuje objętość fagolizosomalną zajmowaną przez beta-amyloid

Korzystając z modułu Surpass, zrekonstruuj stosy obrazów konfokalnych i wygeneruj modele 3D zamkniętego w kapsułkach beta-amyloidu w fagolizosomach monocytów. W oknie Display Adjustment (Dopasowanie wyświetlania) wybierz TRITC, aby wyświetlić tylko barwienie makrofagów, a następnie kliknij dodaj nową powierzchnię" we właściwościach woluminu. W obszarze Ustawienia w kroku pierwszym z pięciu algorytmu wybierz pozycję Powierzchnia.

W polu Kolor wybierz interesujący Cię typ koloru i odpowiednio dostosuj przezroczystość. Następnie zaznacz pole wyboru regionu zainteresowania i kliknij Dalej. W kroku drugim z pięciu, obszar zainteresowania, dostosuj współrzędne X, Y i Z, aby narysować okno wokół interesującej komórki, a następnie kliknij przycisk Dalej.

W kroku trzecim z pięciu, kanał źródłowy, wybierz kanał źródłowy TRITC i zaznacz pole Gładkie. Ustaw poziom szczegółowości pola powierzchni na 0,4 mikrona i kliknij przycisk Dalej. W kroku czwartym z pięciu, próg, dostosuj próg tak, aby utworzona głośność idealnie pokrywała się z sygnałem kanału TRITC i kliknij Dalej.

Na koniec, w kroku piątym z pięciu, klasyfikuj powierzchnie, w sekcji Typy filtrów wybierz obiekty w zależności od ich rozmiaru, które mają zostać uwzględnione lub wykluczone z woluminów, które mają zostać utworzone. Powtórz te same kroki, aby utworzyć powierzchnie 3D dla fagolizosomów z kanałem FITC i amyloidu-beta z kanałem Cy5. Po jakościowym modelowaniu 3D in silico, jak właśnie wykazano, można przeanalizować wychwyt beta amyloidu do fagolizosomów monocytów w mózgach transgenicznych myszy i szczurów.

Co ciekawe, objętość zajmowana przez fagolizosomy CD68 dodatnie jest znacznie zwiększona w fagocytach jednojądrzastych Iba1-dodatnich, związanych z, w porównaniu z odległymi od blaszek, zarówno u myszy, jak i szczurów, co pokazuje, że fagocyty jednojądrzaste w pobliżu blaszek są gotowe do fagocytozy w porównaniu z komórkami znajdującymi się z dala od blaszek. Warto również zauważyć, że fagocyty jednojądrzaste związane z blaszkami wykazują zwiększony wychwyt beta amyloidu u myszy transgenicznych w porównaniu z komórkami odległymi od blaszek, podczas gdy u transgenicznych szczurów obserwuje się ogólnie bardzo skromny wychwyt włókienek beta amyloidu, bez widocznej zmiany w fagocytozie włókienka amyloidu beta w funkcji odległości od blaszek. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać, że jakość obrazów konfokalnych jest kluczowa i że podobne progi powinny być stosowane dla wszystkich kanałów podczas analizy kolokalizacji.

Od czasu jej opracowania, technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się zapaleniem nerwów do badania zdarzeń fagocytarnych w mózgach gryzoni w modelach choroby Alzheimera. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak oznaczać skrawki mózgu gryzoni pod kątem fagocytów jednojądrzastych, fagolizosomu i beta-amyloidu. Ilościowe określenie fagocytozy mózgowego beta-amyloidu w 3-D in vivo.