Indukowalne, stabilne linie komórkowe znakowane na LAP do badania funkcji białek, lokalizacji czasoprzestrzennej i sieci interakcji białek

Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie indukowalnej lokalizacji i oczyszczania powinowactwa lub stabilnych linii komórkowych znakowanych LAP w celu zbadania funkcji białek, lokalizacji czasoprzestrzennej i sieci interakcji białek. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w biologii molekularnej i komórkowej związane z funkcją białek, lokalizacją cyklu komórkowego białek w temperaturach poniżej zera i interakcjami białek. Główną zaletą tej metody jest to, że jest ona podatna na wysokoprzepustową analizę grup białek i może być stosowana do preparowania składników białkowych szlaków biologicznych.

Aby rozpocząć tę procedurę, sklonuj otwartą ramkę odczytu interesującego genu do wektora oznaczonego tagiem LAP i transfekuj go do komórek HEK293, jak opisano w protokole tekstowym. Jednego dnia po transfekcji zastąp pożywkę minus Tet DMEM/F12 świeżą pożywką. Dwa dni po transfekcji podziel komórki na 25% zbiegu.

Pozwól komórkom na około pięć godzin, aby się przyczepić. Następnie dodać pożywkę zawierającą higromycynę minus Tet DMEM/F12 w ustalonym stężeniu. W przypadku komórek HEK293 użyj 100 mikrogramów na mililitr higromycyny.

W razie potrzeby wymieniaj pożywkę, aż pojawią się wyraźne ogniska komórek, które przypominają nieprzezroczyste plamy na przezroczystej płytce. Dodaj 20 mikrolitrów trypsyny na wierzch każdego ogniska komórkowego i wyciśnij go w górę iw dół dwa razy za pomocą końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów. Przenieś komórki na 24-dołkową płytkę i rozmnośnij komórki przez ciągły wzrost w pożywkach zawierających higromycynę minus Tet DMEM/F12.

Rozszerzenie zwalidowanej linii komórkowej znakowanej przez LAP do tandemowego oczyszczania powinowactwa lub TAP (TAP) izolacji kompleksów białkowych. Aby to zrobić, należy w sposób ciągły przechodzić wszystkie komórki HEK293 do większych płytek i/lub butelek rolkowych, bez pożywki Tet DMEM/F12 w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięciu procentach dwutlenku węgla. W przypadku linii komórkowych indukowanych Tet/Dox indukuj komórki przez 10 do 15 godzin, dodając stężenie 0,2 mikrograma na mililitr Tet/Dox, gdy komórki osiągną około 70% konfluencji.

Zbierz komórki przez mieszanie lub trypsynizację. Następnie granuluj je w ilości 875 razy g przez pięć do 10 minut. Aby połączyć przeciwciało anty-GFP z kulkami białka A, zrównoważ 160 mikrolitrów upakowanych objętościowo kulek białka A z PBST w 1,5 mililitrowej probówce.

Umyj koraliki trzykrotnie 1 mililitrem PBST. Po każdym etapie płukania podczas tej procedury kulki są odwirowywane z prędkością 5000 razy g przez 10 sekund, a supernatant jest usuwany. Po ponownym zawieszeniu kulek w 500 mikrolitrach PBST, dodaj 80 mikrogramów oczyszczonego powinowactwa szybkiego przeciwciała anty-GFP do każdej probówki, zawierającej 160 mikrolitrów kulek.

Mieszaj przez godzinę w temperaturze pokojowej. Umyj kulki dwa razy jednym mililitrem PBST, a następnie umyj kulki dwa razy jednym mililitrem 0,2 molowego boranu sodu, pH Po ostatnim płukaniu dodaj 900 mikrolitrów buforu boranowego sodu, aby doprowadzić końcową objętość do jednego mililitra. Następnie dodaj 100 mikrolitrów 220 molowych DMP do zawiesiny kulek, aby uzyskać końcowe stężenie 20 milimolów.

Delikatnie obracaj rurki w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Po inkubacji z DMP przemyć kulki jeden raz jednym mililitrem 0,2 molowej etanoloaminy, 0,2 molowego chlorku sodu o pH 8,5, aby dezaktywować resztkowy środek sieciujący. Następnie ponownie zawieś kulki w jednym mililitrze tego samego buforu i obracaj przez godzinę w temperaturze pokojowej.

Po granulowaniu kulek ponownie zawiesić je w dodatkowych 500 mikrolitrach bufora. Przygotowane koraliki są stabilne przez kilka miesięcy w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby przygotować lizaty komórkowe, ponownie zawiesić 500 mikrolitrów objętości upakowanych komórek w 2,5 mililitrach LAP 300, z 0,5 milimolowym DTT i inhibitorami proteazy.

Dodaj 90 mikrolitrów 10% nonylofenoksyetoksyetanolu i wymieszaj przez odwrócenie. Umieść mieszaninę na lodzie na 10 minut. Wirować przy 21 000 g przez 10 minut.

Po odwirowaniu zebrać ten supernatant o niskiej prędkości i odłożyć próbkę o objętości 10 mikrolitrów do analizy żelu. Po przeniesieniu supernatantu wolnoobrotowego do probówki TLA 100,3 wirować z prędkością 100 000 razy g przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zebrać ten supernatant o dużej prędkości w probówce i umieścić na lodzie, rezerwując próbkę o objętości 10 mikrolitrów do analizy żelu.

W celu pierwszego wychwycenia powinowactwa poprzez wiązanie z kulkami anty-GFP, należy wstępnie wymyć kulki sprzężone z przeciwciałami, przemłukując je trzykrotnie jednym mililitrem buforu elucyjnego w celu usunięcia rozprzężonych przeciwciał i zmniejszenia tła. Zrób to szybko. Nie zostawiaj koralików w soli przez długi czas.

Następnie umyj kulki trzykrotnie jednym mililitrem LAP 200 N. Następnie wymieszaj szybki ekstrakt supernatant z kulkami przeciwciał przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odwirowaniu ekstraktu w ilości 21 000 g przez 10 minut, należy zarezerwować 10 mikrolitrów próbki supernatantu do analizy żelu. Wykonaj trzy szybkie płukanie kulek jednym mililitrem LAP 200 N, zawierającym 0,5 milimolowego DTT i inhibitory proteazy.

Użyj tego samego bufora do umycia kulek dwa dodatkowe razy z pięciominutowym czasem inkubacji na każde pranie. Następnie umyj kulki szybko jeszcze dwa razy 1 mililitrem LAP 200 N zawierającym 0,5 milimolowego DTT i bez inhibitorów proteazy, przed dodaniem proteazy Tobacco Etch Virus lub TEV. Dodaj 10 mikrogramów proteazy TEV w jednym mililitrze LAP 200 N do kulek i obracaj probówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.

Następnego dnia granulki należy ogranulować i przenieść supernatant do świeżej probówki. Przepłucz kulki dwukrotnie 160 mikrolitrami LAP 200 N, zawierającym 0,5 milimolowego DTT i inhibitory proteazy, aby usunąć wszelkie resztki białka. W celu drugiego wychwycenia powinowactwa poprzez wiązanie z białkiem S-agarozy, przemyj jedną probówkę 80 mikrolitrów zawiesiny agarozy S-białkowej trzy razy jednym mililitrem LAP 200 N. Dodaj supernatant eluowany TEV do kulek białka S i kołysz je przez trzy godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po ogranulowaniu kulek przemyj je trzykrotnie jednym mililitrem LAP 200 N zawierającego 0,5 milimolowego DTT i inhibitory proteazy. Następnie umyj koraliki dwa razy jednym mililitrem LAP 100. Eluować białka z agarozy białka S, dodając 50 mikrolitrów 4x buforu próbki Laemmli i ogrzewając w temperaturze 97 stopni Celsjusza przez 10 minut.

Aby zidentyfikować białka oddziałujące za pomocą analizy spektrometrii mas, należy przetestować jakość oczyszczania, analizując pobrane próbki za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym z dodecylosiarczanem sodu. Srebrna plama powstały żel. Ponadto należy osuszyć immunologicznie eluaty i sondować przeciwciałami anty-GFP, aby upewnić się, że oczyszczanie ze znacznikiem LAP zadziałało.

Aby zidentyfikować stechiometryczne i substechiometryczne gatunki współoczyszczające, należy pobrać końcową próbkę elucyjną i oddzielić ją za pomocą SDS-PAGE. Wybarwić żel barwnikiem białkowym zgodnym ze spektrometrią mas. Należy wyciąć najbardziej widoczne prążki w żelu i przestrzeń między nimi, aby przetworzyć prążki oddzielnie do analizy za pomocą spektrometrii mas.

Pokazano tutaj reprezentatywną analizę western blot próbek białek z nieindukowanych i indukowanych przez Dox komórek LAP-Tau HEK293. Komórki są badane przeciwciałami anty-tubulinowymi w celu wykrycia kontroli obciążenia tubuliny i sondowane anty-GFP w celu wykrycia białka Tau znakowanego LAP. Należy zauważyć, że LAP-Tau ulega ekspresji tylko wtedy, gdy komórki są indukowane za pomocą Dox.

Komórki mitotyczne eksprymujące LAP-Tau utrwalono i wybarwiono pod kątem DNA i tubuliny przeciwciałami anty-tubuliny, a subkomórkową lokalizację LAP-Tau analizowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Należy zauważyć, że LAP-Tau lokalizuje się na wrzecionie mitotycznym i biegunach wrzeciona podczas mitozy. Pokazany tutaj jest reprezentatywny zabarwiony na srebro żel do oczyszczania LAP-Tau.

Pasy reprezentują masę cząsteczkową, oczyszczone lizaty i końcowe eluaty. Próbki prowadzono na żelu 4-20% SDS-PAGE, a żel był barwiony srebrem w celu wizualizacji oczyszczonych białek. Należy zauważyć, że pasmo odpowiadające LAP-Tau jest oznaczone gwiazdką i można zobaczyć kilka innych prążków odpowiadających białkom współoczyszczającym.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak generować indukowalne stabilne linie komórkowe oznaczone LAP oraz jak przeprowadzać biochemiczne oczyszczanie białek oznaczonych LAP w celu analizy proteomicznej i identyfikacji sieci interakcji białek.