Name: Wydłużony czas rekonwalescencji i zmniejszone podawanie LPS w celu zbadania mechanizmów stymulacji nerwu błędnego w ograniczonych reakcjach zapalnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 43 s
Description: Poznaj zmodyfikowaną metodę stymulacji nerwu błędnego do badania cholinergicznych mechanizmów przeciwzapalnych w neuroimmunologii. Technika ta pozwala analizować interakcje między układem nerwowym a odpowiedzią immunologiczną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badanie było wspierane przez Szwedzką Radę ds. Badań Naukowych, Szwedzkie Stowarzyszenie Reumatyzmu, Fundacje Instytutu Karolinska, Radę Hrabstwa Sztokholm, Fundację Wallenberga oraz Fundację Naukową GV 80 Years. Autorzy pragną również podziękować Hannah Aucott za korektę rękopisu.

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt, zatwierdzonymi przez lokalną Komisję Etyki w Instytucie Karolinska w Sztokholmie. Lokalna Komisja Etyki postępuje zgodnie z dyrektywami Unii Europejskiej dotyczącymi opieki nad zwierzętami.
UWAGA: Główne zmiany w stosunku do oryginalnego protokołu to czas rekonwalescencji po operacji (6 godzin w porównaniu z 1 godziną) oraz poziom wstrzykniętego LPS (2 mg/kg w porównaniu z 15 mg/kg). W przeciwnym razie różne ustawienia związane z samym zabiegiem nie zostały zmienione.
1. Przygotowanie materiału do stymulacji
<ol>
	<li>Włącz komputer i system gromadzenia danych połączony z elektrodą stymulującą (Rysunek 1A).</li>
	<li>Wejdź do programu Potwierdź.</li>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy LPS o stężeniu 5 mg/ml w 1 PBS, podwielokrotnić go i przechowywać w temperaturze -20 °C. W dniu doświadczenia rozmrozić podwielokrotność i przygotować odpowiednią próbkę LPS (0,5 mg/ml) w celu wstrzyknięcia zwierzęciu około 100 μl, w zależności od masy.</li>
</ol>
2. Przygotowanie zwierzęcia do znieczulenia
<ol>
	<li>Użyj myszy C57Bl/6. Utrzymuj je w kontrolowanych warunkach klimatycznych z 12-godzinnym cyklem światła/ciemności, karm je standardową karmą dla gryzoni i podawaj im wodę ad libitum.</li>
	<li>Wykonaj operację na myszach, które ważą około 25 g w dniu eksperymentu. 
	UWAGA: W przypadku wywołania reakcji zapalnych szczególnie ważne jest przeprowadzanie regularnych badań kontrolnych i obserwacji reakcji klinicznych u zwierząt. Przedwczesna eutanazja przez wdychanie CO2 jest konieczna, jeśli stan zwierząt nie spełnia kryteriów etycznych.</li>
	<li>Ustaw urządzenie do znieczulania.
	<ol>
		<li>Upewnij się, że rurka jest prawidłowo podłączona i nie jest w żaden sposób uszkodzona. Upewnij się, że wentylowany obszar działa prawidłowo. Podłącz filtr klucza do butelki z izofluranem i napełnij waporyzator odpowiednią ilością izofluranu.</li>
		<li>Otwórz dopływ gazu (powietrze i tlen) i upewnij się, że butelki zawierają wystarczającą ilość gazu do przeprowadzenia eksperymentu. Trójdrożne złącze jest następnie w stanie przesłać przepływ izofluranu do komory indukcyjnej lub maski.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przekręć złącze trójdrożne do komory indukcyjnej. Wybierz jedną mysz z domowej klatki i włóż zwierzę do komory. Ustaw regulator przepływu na 1.0 l/min tlenu i 1.0 l/min powietrza. Dostosować stężenie izofluranu do 4 - 5%.</li>
	<li>Gdy zostanie osiągnięty pożądany poziom znieczulenia, Gdy pożądany poziom znieczulenia zostanie osiągnięty, należy ogolić obszar chirurgiczny i przenieść zwierzę z komory do maski. Przekręć trójdrożne złącze do przepływu maski. Ustaw regulator przepływu na 0.25 l/min tlenu i 0.25 l/min powietrza.
	<ol>
		<li>Dostosuj stężenie izofluranu do 1,5 - 2,5%. Przed rozpoczęciem zabiegu chirurgicznego należy sprawdzić poziom znieczulenia poprzez kontrolę odruchów i częstość oddechów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przymocuj nogi myszy do stołu roboczego za pomocą taśmy klejącej. Upewnij się, że nos zwierzęcia jest nadal starannie umieszczony w masce.</li>
</ol>
3. Chirurgia i stymulacja nerwu błędnego
<ol>
	<li>Zdezynfekuj obszar operacyjny 70% etanolem.</li>
	<li>Za pomocą skalpela ostrożnie naciąć skórę na wysokości szyi (nacięcie około 1 do 1,5 cm). 
	nuta: W protokole procedura chirurgiczna kończy się tutaj w przypadku zwierząt operowanych metodą SHAM. Rzeczywiście, wykazano, że samo dotknięcie nerwu metalowym narzędziem już go do pewnego stopnia stymuluje. Dlatego, aby uzyskać dokładniejsze zwierzę kontrolne podczas stosowania niewielkiej ilości LPS, przerwij operację na tym etapie.</li>
	<li>Za pomocą mikroskopu (obiektyw 12,5x) odizoluj lewy nerw błędny od tętnicy szyjnej za pomocą kleszczy preparacyjnych. Najpierw zlokalizuj mięsień mostkowo-obojczykowo-sutkowy, usuwając warstwy skóry i tłuszczu, a następnie cofnij go, aby umieścić kleszcze zarówno za nerwem, jak i tętnicą. 
	nuta: Następny krok jest bardzo trudny, ponieważ nerw i tętnica są ściśle ze sobą przylegające. Dlatego bardzo łatwo jest przeciąć naczynie i zabić zwierzę. Jednak bardzo ostrożnie umieszczając kleszcze między nerwem a tętnicą, w końcu się rozdzielają i możliwe jest odizolowanie nerwu.</li>
	<li>Umieść elektrodę (ryc. 1B) pod nerwem błędnym. Elektroda igłowa jest dość długa, więc nawet jeśli nerw lekko się poruszy podczas stymulacji, zawsze będzie w kontakcie z elektrodą.</li>
	<li>Wykonać dootrzewnowe (i.p.) wstrzyknięcie LPS (2 mg/kg) za pomocą strzykawki (w celu odczytu poziomu cytokin; tj. w celu zmierzenia efektu regulacji w dół).</li>
	<li>Odczekaj 5 minut przed rozpoczęciem stymulacji.</li>
	<li>Stymuluj nerw błędny przez 5 minut przy napięciu 5 V i 1 Hz, naciskając przycisk start w programie Potwierdź.</li>
	<li>Usuń elektrodę i zszyj ranę zwierzęcia za pomocą nici do szwu chirurgicznego.</li>
	<li>Spryskaj ranę folią barierową No Sting Barrier Film (NSBF), aby przyspieszyć gojenie i chronić przed infekcjami.</li>
</ol>
4. Odzyskanie zwierzęcia
<ol>
	<li>Po operacji przenieś zwierzę z powrotem do jego klatki domowej w celu przebudzenia i powrotu do zdrowia. W świetle podczerwonym, aby utrzymać temperaturę ciała, należy monitorować zwierzę do momentu odzyskania pełnej świadomości.</li>
	<li>Pozwól zwierzęciu dojść do siebie w klatce przez 6 godzin przed uśmierceniem do analizy. 
	nuta: Efekt stymulacji nerwu błędnego jest bardzo szybki i wykazano również, że jest długotrwały (do 48 godzin), więc czas powrotu do zdrowia może być ustawiony przez eksperymentatora zgodnie z potrzebami badania.</li>
</ol>
5. Poświęcenie dla dalszej analizy
<ol>
	<li>Umieść zwierzę w klatce połączonej z urządzeniem do podawania CO2 .</li>
	<li>Ustaw urządzenie na 5-minutowy cykl wdychania CO2 .</li>
	<li>Po zakończeniu eutanazji należy pobrać interesujące nas narządy i bezpośrednio zamrozić je na suchym lodzie w celu dalszej analizy (np. pomiaru poziomu cytokin w ekstraktach ze śledziony za pomocą mysiego testu TH1/TH2 9-Plex)3.</li>
</ol>

<ol><li>Nathan, C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12490957">Points of control in inflammation.</a> Nature. 420 (6917), 846-852 (2002).</li>
<li>Rosas Ballina, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylcholine-synthesizing+T+cells+relay+neural+signals+in+a+vagus+nerve+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Acetylcholine-synthesizing T cells relay neural signals in a vagus nerve circuit.</a> Science. 334 (6052), 98-101 (2011).</li>
<li>Le Maître, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+vagus-mediated+immunosuppression+in+microsomal+prostaglandin+E+synthase-1+deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Prostaglandins+Other+Lipid+Mediat%22%5BJournal%5D)">Impaired vagus-mediated immunosuppression in microsomal prostaglandin E synthase-1 deficient mice.</a> Prostaglandins Other Lipid Mediat. 121 (Part B), 155-162 (2015).</li>
<li>Borovikova, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vagus+nerve+stimulation+attenuates+the+systemic+inflammatory+response+to+endotoxin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Vagus nerve stimulation attenuates the systemic inflammatory response to endotoxin.</a> Nature. 405 (6785), 458-462 (2000).</li>
<li>Olofsson, P. S., Rosas-Ballina, M., Levine, Y. A., Tracey, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rethinking+inflammation%3A+neural+circuits+in+the+regulation+of+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Rethinking inflammation: neural circuits in the regulation of immunity.</a> Immunol. Rev. 248 (1), 188-204 (2012).</li>
<li>Pavlov, V. A., Tracey, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+circuitry+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Res%22%5BJournal%5D)">Neural circuitry and immunity.</a> Immunol Res. 63 (1-3), 38-57 (2015).</li>
<li>Huston, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splenectomy+inactivates+the+cholinergic+antiinflammatory+pathway+during+lethal+endotoxemia+and+polymicrobial+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Splenectomy inactivates the cholinergic antiinflammatory pathway during lethal endotoxemia and polymicrobial sepsis.</a> J. Exp. Med. 203 (7), 1623-1628 (2006).</li>
<li>Rosas-Ballina, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2504833/">Splenic nerve is required for cholinergic anti-inflammatory pathway control of TNF in endotoxemia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (31), 11008-11013 (2008).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotinic+acetylcholine+receptor+alpha7+subunit+is+an+essential+regulator+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nicotinic acetylcholine receptor alpha7 subunit is an essential regulator of inflammation.</a> Nature. 421 (6921), 384-388 (2003).</li>
<li>Pavlov, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+muscarinic+cholinergic+regulation+of+the+systemic+inflammatory+response+during+endotoxemia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Central muscarinic cholinergic regulation of the systemic inflammatory response during endotoxemia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103 (13), 5219-5223 (2006).</li>
<li>Pavlov, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+acetylcholinesterase+activity+controls+systemic+cytokine+levels+through+the+cholinergic+anti-inflammatory+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav.+Immun%22%5BJournal%5D)">Brain acetylcholinesterase activity controls systemic cytokine levels through the cholinergic anti-inflammatory pathway.</a> Brain Behav. Immun. 23 (1), 41-45 (2009).</li>
<li>Rosas-Ballina, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xanomeline+suppresses+excessive+pro-inflammatory+cytokine+responses+through+neural+signal-mediated+pathways+and+improves+survival+in+lethal+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav.+Immun%22%5BJournal%5D)">Xanomeline suppresses excessive pro-inflammatory cytokine responses through neural signal-mediated pathways and improves survival in lethal inflammation.</a> Brain Behav. Immun. 44, 19-27 (2014).</li>
<li>Bellinger, D. L., Lorton, D., Lubahn, D., Felten, D. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBellinger%2C+DL+%22Psychoneuroimmunology%22">Psychoneuroimmunology</a>. Ader, R., Felten, D. L., Cohen, N. 55, Academic. San Diego. 55-112 (2001).</li>
<li>Andersson, U., Tracey, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+to+rheumatoid+arthritis%3A+treating+inflammation+with+computerized+nerve+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebrum%22%5BJournal%5D)">A new approach to rheumatoid arthritis: treating inflammation with computerized nerve stimulation.</a> Cerebrum. 2012, 3(2012).</li>
<li>Ono, S. J., Nakamura, T., Miyazaki, D., Ohbayashi, M., Dawson, M., Toda, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12789214">Chemokines: Roles in leucocyte development, trafficking, and effector function.</a> J. Allergy Clin. Immunol. 111 (6), 1185-1199 (2003).</li>
<li>Silvestre-Roig, C., Hidalgo, A., Soehnlein, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+heterogeneity%3A+implications+for+homeostasis+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Neutrophil heterogeneity: implications for homeostasis and pathogenesis.</a> Blood. , (2016).</li>
<li>Matteoli, G., Boeckxstaens, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vagal+innervation+of+the+gut+and+immune+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">The vagal innervation of the gut and immune homeostasis.</a> Gut. 62, 1214-1222 (2013).</li>
<li>Pereira, M. R., Leite, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+involvement+of+parasympathetic+and+sympathetic+nerve+in+the+inflammatory+reflex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The involvement of parasympathetic and sympathetic nerve in the inflammatory reflex.</a> J. Cell. Physiol. 231, 1862-1869 (2016).</li>
<li>Levine, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurostimulation+of+the+cholinergic+anti-inflammatory+pathway+ameliorates+disease+in+rat+collagen-induced+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Neurostimulation of the cholinergic anti-inflammatory pathway ameliorates disease in rat collagen-induced arthritis.</a> PLoS One. 9 (8), e104530(2014).</li>
<li>Huston, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcutaneous+vagus+nerve+stimulation+reduces+serum+high+mobility+group+box+1+levels+and+improves+survival+in+murine+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Transcutaneous vagus nerve stimulation reduces serum high mobility group box 1 levels and improves survival in murine sepsis.</a> Crit. Care Med. 35 (12), 2762-2768 (2007).</li>
<li>Yuan, H., Silberstein, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vagus+nerve+and+vagus+nerve+stimulation%2C+a+comprehensive+review%3A+Part+II%5BTitle%5D)+AND+%22Headache%22%5BJournal%5D)">Vagus nerve and vagus nerve stimulation, a comprehensive review: Part II.</a> Headache. 56 (2), 259-266 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Od czasu jej odkrycia na początku 2000 roku, mechanizmy działania WPR zostały dokładnie zbadane. Mamy teraz dobry obraz szlaku, a w szczególności narządu docelowego, śledziony, gdzie NE, limfocyty T pamięci, Ach i makrofagi działają jako bardzo skuteczny zespół do obniżania mediatorów stanu zapalnego2. Niedawno opublikowaliśmy również dane na temat znaczenia funkcjonalnego układu prostaglandyn u myszy, w szczególności PGE2, który jest oczywiście obowiązkowym składnikiem uwalniania ACh w...

Wrodzona odporność stanowi natychmiastową pierwszą linię obrony przed infekcjami i chorobami w szerokim zakresie organizmów. Nie tylko inicjuje pierwotną odpowiedź immunologiczną w celu wyeliminowania zagrożenia, ale także odgrywa kluczową rolę w aktywacji i kształceniu odporności adaptacyjnej, która przeprowadza wtórne odpowiedzi immunologiczne w sposób specyficzny dla patogenu. Stan zapalny jest koordynowany przez mnóstwo cytokin i chemokin, które z kolei mają zdolność przyciągania innych komórek odpornościowych do miejsca infekcji i wywoływania kardynalnych objawów zapalenia, takich jak zaczerwienienie, obrzęk, ból, utrata funkcji i gorączka. Czas trwania i intensywność stanu zapalnego zależą od kilku czynników, ale ustąpienie stanu zapalnego i przywrócenie homeostazy jest kluczowym krokiem, aby uniknąć wystąpienia przewlekłych chorób zapalnych. Ostatnie postępy w dziedzinie neurobiologii i immunologii pozwoliły odkryć specyficzne mechanizmy neuronalne o ogromnym potencjale terapeutycznym w kontrolowaniu stanu zapalnego zarówno w ośrodkowym układzie nerwowym, jak i na jego obrzeżach. Jednym z tych mechanizmów jest cholinergiczny szlak przeciwzapalny (CAP), znany również jako odruch zapalny, który jest napędzany przez autonomiczny układ nerwowy4,5.
Obecnie uważa się, że mediatory stanu zapalnego aktywują nerwy czuciowe i wysyłają sygnały dotyczące stanu zapalnego do ośrodkowego układu nerwowego. Reakcja odruchowa jest następnie aktywowana przez odprowadzający nerw błędny. Szeroko zakrojone badania nad szczegółami anatomicznymi CAP ujawniły model przywspółczulno-współczulny składający się odpowiednio z dwóch nerwów, nerwu błędnego i nerwu śledzionowego6. W CAP aktywowany cholinergiczny odprowadzający nerw błędny kończy się w zwoju trzewno-krezkowym, co powoduje aktywację adrenergicznego nerwu śledziony przez mechanizm, który nie został jeszcze zbadany. Wiadomo, że aktywowany w ten sposób nerw śledziony unerwia się w bliskim sąsiedztwie komórek odpornościowych w białej miazdze, strefie brzeżnej i czerwonej miazdze śledziony, głównym i obowiązkowym narządzie klasy CAP<sup="xref">7,8. Noradrenalina (NE) z zakończeń nerwów śledziony wiąże się z odpowiednimi receptorami adrenergicznymi β2 ulegającymi ekspresji na limfocytach T śledziony. Indukuje to uwalnianie acetylocholiny (ACh) za pośrednictwem acetylocholiny choliny (ChAT), co z kolei aktywuje nikotynowe receptory acetylocholiny α7 (α7nACh) na makrofagach, ograniczając w ten sposób produkcję cytokin i stan zapalny2. W związku z tym jest teraz jasne, że układ nerwowy jest w stanie regulować stan zapalny w tkankach obwodowych i przywracać miejscową homeostazę immunologiczną.
Jak sugeruje nazwa szlaku, system ACh ma kluczowe znaczenie dla funkcjonowania tego neuroimmunologicznego szlaku regulacyjnego. Co ciekawe, mechanizmy zaangażowane w aktywację CAP wydają się być różne na obrzeżach i w ośrodkowym układzie nerwowym. Podczas gdy znaczenie receptorów nikotynowych (α7nAChR) w śledzionie zostało wykazane wcześniej9, receptory muskarynowe (mAChR) są obowiązkowe dla centralnej aktywacji szlaku10,11. Niedawno, obwodowe podawanie ośrodkowego agonisty muskarynowego M1 znacząco hamowało czynnik martwicy nowotworu śledziony α (TNFα) w surowicy i śledzionie podczas śmiertelnej mysiej endotoksemii, działania, które wymagało nienaruszonej sygnalizacji nerwu błędnego i śledziony12. Wykazaliśmy również niedawno, że myszy pozbawione prostaglandyny E2 (PGE2) nie były w stanie zareagować na stymulację nerwu błędnego i nie obniżyły indukowanego przez LPS uwalniania cytokin w surowicy i śledzionie3. W związku z tym CAP może być również regulowany przez systemy inne niż główny szlak ACh.
Nerw błędny został tak nazwany ze względu na jego wędrujący przebieg w ciele, unerwiając główne organy, w tym wątrobę, płuca, śledzionę, nerki i jelita13. Biorąc pod uwagę tak duże unerwienie i bardzo silne działanie immunosupresyjne nerwu błędnego, potencjał terapeutyczny CAP może obejmować szeroki zakres stanów zapalnych. Nerw błędny może być aktywowany elektrycznie (lub mechanicznie), z kontrolą napięcia i częstotliwości, i w przeciwieństwie do konwencjonalnego leczenia, bez dodawania leków do organizmu. Obecnie prowadzone są badania z udziałem pacjentów z reumatyzmem, na przykład w celu sprawdzenia klinicznego znaczenia VNS w leczeniu przewlekłego stanu zapalnego14. Ogólnie rzecz biorąc, obecnie prowadzone są badania nad komunikacją neuroimmunologiczną i regulacją stanu zapalnego, które mogą stanowić alternatywę dla konwencjonalnej terapii. Dlatego analiza efektu stymulacji nerwu błędnego w różnych unerwionych narządach, ale także charakterystyka potencjalnego działania terapeutycznego w zwierzęcych modelach przewlekłego stanu zapalnego, z pewnością dałaby wgląd i nadzieję na nowe potencjalne cele terapeutyczne.
Oryginalna metodologia opracowana przez Tracey i współpracowników4 nie mogła zostać przeniesiona do naszego obszaru badań z powodu nadmiernej stymulacji odpowiedzi zapalnej (przez śmiertelną dawkę LPS) i zbyt krótkiego zakresu czasu między aktywacją CAP a odczytem. W niniejszym artykule przedstawimy zmiany wprowadzone w stosunku do pierwotnego protokołu, porównamy dwie różne metodologie dotyczące poziomu cytokin oraz zwrócimy uwagę na nową i przeciwstawną obserwację dotyczącą narządu docelowego (śledziony).

<table><tbody><tr><td>Komputer</td><td>Toshiba-Każdy</td><td></td> <td>komputer jest w rzeczywistości kompatybilny</td></tr><tr><td>System akwizycji danych MP-150</td> Oprogramowanie <td>Biopac Systems</td><td>MP150WSW</td><td></td></tr><tr><td>Confirm</td> Myszy <td>Biopac</td> Systems <td></td><td></td></tr><tr><td>C57Bl / 6</td> Charles <td>River</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anestezjologiczna</td> butla z tlenem <td>Simtec Engineering</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>AGA</td><td>107563</td><td></td></tr><tr><td>Butla powietrza medycznego&nbsp;</td><td>AGA</td><td>108639</td><td></td></tr><tr><td>Vetflurane (1,000 mg/g)</td><td>Virbac</td><td>137317</td><td></td></tr><tr><td>LPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2630</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna</td><td>Merck Millipore</td><td>1024060080</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493</td><td>Rozcieńczony 10 razy dla zużytego stężenia</td></tr><tr><td>Strzykawka (1 ml)</td><td>BD Plastipak</td><td>303172</td><td></td></tr><tr><td>Igły 23 G</td><td>KD-FINE</td><td></td> 900284 <td>0,6 x 30 mm (niebieskie)</td></tr><tr><td>Kleszcze do mikropreparacji (zakrzywione)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4142</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki preparacyjne</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z265969</td><td></td></tr><tr><td>Szew chirurgiczny 4-0</td><td>Ethicon</td><td>G667G</td><td></td></tr><tr><td>Jednostka eutanazji</td><td>Euthanex Smartbox</td><td>EA-32000</td><td></td></tr><tr><td>Cavilon Bez folii</td> <td>barierowejTest 3M Health Care</td><td>3346N</td><td></td></tr><tr><td>TH1/TH2 9-Plex, zestaw ultraczuły</td><td>MesoScale Discovery</td><td>K15013C-1</td><td></td></tr><tr><td>Elektroda stymulująca</td><td>Biopac Systems</td><td>Golarka STIMSOC</td><td></td></tr><tr><td>Aesculap Isis</td><td>Agnthos</td><td>GT420</td><td></td></tr><tr><td>R70</td><td></td><td></td><td>Dieta dla gryzoni firmy Lantmannen, Sztokholm, Szwecja</td></tr></tbody></table>

wydłużony czas rekonwalescencji i zmniejszone podawanie lps w celu zbadania mechanizmów stymulacji nerwu błędnego w ograniczonych reakcjach zapalnych

Increased Recovery Time and Decreased LPS Administration to Study the Vagus Nerve Stimulation Mechanisms in Limited Inflammatory Responses

Stan zapalny to lokalna reakcja na infekcję i uszkodzenie tkanki, w której pośredniczą aktywowane makrofagi, monocyty i inne komórki odpornościowe, które uwalniają cytokiny i inne mediatory stanu zapalnego. Przez długi czas mechanizmy humoralne i komórkowe były badane pod kątem ich roli w regulacji odpowiedzi immunologicznej, ale ostatnie postępy w dziedzinie immunologii i neuronauki odkryły również specyficzne mechanizmy neuronalne o interesującym potencjale terapeutycznym. Tak zwany cholinergiczny szlak przeciwzapalny (CAP) został opisany w celu kontrolowania wrodzonych odpowiedzi immunologicznych i stanu zapalnego w bardzo silny sposób. Na początku 2000 roku Tracey i jej współpracownicy opracowali technikę, która stymuluje nerw błędny i naśladuje działanie tego szlaku. Metodologia opiera się na elektrycznej stymulacji nerwu błędnego przy niskim napięciu i częstotliwości, w celu uniknięcia wszelkich skutków ubocznych nadmiernej stymulacji, takich jak deregulacja zmienności rytmu serca. Obecnie dostępne są urządzenia elektryczne do stymulacji, co ułatwia wdrożenie metodologii w laboratorium. Celem tych badań było zbadanie potencjalnego udziału prostaglandyn w CAP. Niestety, opierając się na wcześniejszych próbach, nie udało nam się zastosować oryginalnego protokołu, ponieważ wywołana odpowiedź zapalna była albo zbyt wysoka, albo nie była odpowiednia dla właściwości metabolizmu enzymatycznego. Różne ustawienia oryginalnego protokołu chirurgicznego pozostały w większości niezmienione, ale warunki dotyczące indukcji zapalenia i punktu czasowego przed ofiarą zostały poprawione, aby pasowały do naszych celów (tj. zbadania udziału CAP w bardziej ograniczonych reakcjach zapalnych). 
Zmodyfikowana wersja oryginalnego protokołu, przedstawiona tutaj, obejmuje dłuższy zakres czasowy między stymulacją nerwu błędnego a analizą, co wiąże się z niższą indukcją reakcji zapalnych. Dodatkowo, zmniejszając poziom lipopolisacharydów (LPS) do wstrzykiwania, natknęliśmy się również na nowe obserwacje dotyczące właściwości mechanistycznych śledziony.

Poziom TNFα i interleukiny-1β (IL-1β) po wydłużeniu czasu od operacji i zmniejszeniu dawki LPS
Jak wykazano wcześniej, przy zastosowaniu oryginalnego protokołu VNS obniżyła poziomy TNFα (169,3 ± 24,9 pg/mg w grupie SHAM w porównaniu do 39,7 ± 10,8 pg/mg w grupie VNS, p &lt; 0,001) oraz IL-1β (360,0 ± 40,21 pg/mg w grupie SHAM w porównaniu do 191,7 ± 27,2 pg/mg w grupie VNS, p &lt; 0,01) w śledzionie po dostryperitonealnym wstrzykni...

Stymulacja nerwu błędnego okazała się skuteczna w zmniejszaniu obwodowego stanu zapalnego. W niniejszym artykule przedstawiamy zmodyfikowany protokół stymulacji nerwu błędnego, który pozwala na dalsze badania cholinergicznych mechanizmów przeciwzapalnych w ograniczonych odpowiedziach zapalnych.

Wydłużony czas rekonwalescencji i zmniejszone podawanie LPS w celu zbadania mechanizmów stymulacji nerwu błędnego w ograniczonych reakcjach zapalnych

Inflammation is a local response to infection and tissue damage mediated by activated macrophages, monocytes, and other immune cells that release ...

Ogólnym celem tej interwencji chirurgicznej jest obserwacja efektu stymulacji nerwu błędnego w stanach zapalnych. Analiza i zrozumienie różnych mechanizmów i komórek zaangażowanych w tak zwany cholinergiczny szlak przeciwzapalny. Metoda ta została opracowana w laboratorium Kevina Traceya w Instytucie Feinsteina.Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neuroimmunologii. Najnowsze osiągnięcia wskazują na ścisły związek między układem nerwowym a odpornościowym. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją łatwo skonfigurować w laboratorium.Należy jednak przestrzegać ważnych zasad dotyczących opieki nad zwierzętami i protokołu operacji. Wędrujący bieg nerwu błędnego w całym ciele i jego zdolność do obniżania regulacji informacji w różnych modelach zwierzęcych sugeruje, że jego stymulacja może być przydatna w leczeniu wielu chorób zapalnych. Zwykle osoby, które dopiero zaczynają stosować tę technikę, będą miały trudności z identyfikacją i odizolowaniem nerwu błędnego od tętnicy szyjnej pod obserwacją mikroskopową.Jednak, chociaż na początku jest to trudne, z czasem i praktyką staje się łatwiejsze. Zacznij od włączenia komputera i systemu akwizycji danych połączonego z elektrodą stymulującą. Uruchom oprogramowanie do akwizycji i analizy danych.Następnie postępuj zgodnie z podwielokrotnością 5 miligramów na mililitr lipopolisacharydu lub LPS i rozcieńcz go do punktu zerowego pięciu miligramów na mililitr solą fizjologiczną. Znieczulij 25-gramową mysz w komorze indukcyjnej. Po osiągnięciu pożądanego poziomu znieczulenia przenieś zwierzę z komory do maski.Obróć złącze trójdrożne, aby zasilić maskę i wyreguluj regulator przepływu. Przed rozpoczęciem zabiegu chirurgicznego sprawdź, czy nie ma znieczulenia w chirurgicznej płaszczyźnie znieczulenia poprzez utratę odruchu prostującego i regularną częstość oddechów wynoszącą około 100 oddechów na minutę. Gdy mysz zostanie odpowiednio znieczulona, przymocuj nogi myszy do stołu warsztatowego za pomocą taśmy klejącej.Upewnij się, że nos zwierzęcia jest nadal starannie umieszczony w masce. Prawidłowo zdezynfekuj obszar operacyjny zgodnie z zatwierdzonymi procedurami. Następnie, po wykonaniu jednopunktowego pięciocentymetrowego nacięcia w skórze na poziomie szyi, ustaw mikroskop stereoskopowy z 12-punktowym obiektywem o rozmiarze 5 x, aby zobaczyć obszar operacyjny.Zlokalizuj mięsień mostkowo-obojczykowo-sutkowy, usuwając warstwy skóry i tłuszczu za pomocą kleszczy. Wycofaj mięsień mostkowo-obojczykowo-sutkowy i przesuń kleszcze za lewy nerw błędny i tętnicę szyjną. Odizoluj nerw od tętnicy, bardzo ostrożnie umieszczając kleszcze między nerwem a tętnicą.Jest to krytyczny krok w procedurze, ponieważ nerw i tętnica są blisko siebie, bardzo łatwo jest przeciąć naczynia i zabić zwierzęta. Jednak po bardzo ostrożnym umieszczeniu kleszczy między nerwem a tętnicą, w końcu oddzielają się i możliwe jest odizolowanie nerwu błędnego. Teraz umieść elektrodę pod nerwem błędnym.Ponieważ elektroda igłowa jest dość długa, nerw zawsze będzie w kontakcie z elektrodą, nawet jeśli lekko się porusza. Następnie wykonaj dootrzewnowe wstrzyknięcie LPS i odczekaj pięć minut przed rozpoczęciem stymulacji. Po pięciu minutach stymuluj nerw błędny przez pięć minut przy napięciu pięciu woltów i jednym hercu, naciskając przycisk start w oprogramowaniu do akwizycji.Po zakończeniu okresu stymulacji należy zdjąć elektrodę, a następnie zszyć ranę zwierzęcia za pomocą nici do szwu chirurgicznego. Spryskaj ranę folią barierową, która nie szczypie, aby przyspieszyć gojenie i chronić przed infekcjami. Na koniec przenieś zwierzę do czystej klatki i obserwuj, jak odzyskuje pełną świadomość.Poniższe obrazy pokazują wpływ zmniejszonego stężenia LPS i zwiększonego opóźnienia do poświęcenia na poziomy TNF alfa i IL one beta po stymulacji nerwu błędnego. Tutaj można zauważyć, że oryginalny paradygmat znacznie zmniejsza zarówno TNF alfa, jak i IL jedną beta w porównaniu z kontrolami pozorowanymi. Protokół zademonstrowany w tym filmie znacznie obniża poziomy TNF alfa, ale nie IL one beta.Jak widać tutaj, sześciogodzinna rekonwalescencja bez wstrzyknięcia LPS nie wpływa na poziom TNF alfa lub IL one beta. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w około 20 minut, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie neuroimmunologii.Badanie związku między ośrodkowym układem nerwowym a układem odpornościowym. A także zbadać unerwienie nerwu błędnego nowych narządów i wpływ cholinergicznego szlaku przeciwzapalnego w przewlekłych chorobach zapalnych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zlokalizować, wyizolować i stymulować nerw błędny.Należy również pamiętać, że poziom wywołanego stanu zapalnego i czas powrotu do zdrowia zwierzęcia mogą być ważnymi kwestiami, które należy wziąć pod uwagę.

increased-recovery-time-decreased-lps-administration-to-study-vagus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Stymulacja nerwu błędnego (VNS) pojawiła się jako narzędzie do wywoływania ukierunkowanej plastyczności synaptycznej w przodomózgowiu w celu modyfikacji szeregu zachowań. Ten protokół opisuje, jak zaimplementować VNS, aby ułatwić konsolidację pamięci wygaszania strachu.

Stymulacja nerwu błędnego jako narzędzie do indukowania plastyczności w szlakach istotnych dla uczenia się wymierania

Ten artykuł przedstawia metodę, która wykorzystuje stymulację rdzenia kręgowego za pomocą wielokolumnowego przewodu do leczenia neuropatycznego bólu dolnego odcinka kręgosłupa u pacjentów po nieudanej operacji kręgosłupa.

Leczenie bólu krzyża u pacjentów po nieudanej operacji pleców za pomocą wielokolumnowej stymulacji rdzenia kręgowego

Stymulacja nerwu błędnego (VNS) okazała się skuteczna jako leczenie wspomagające depresję oporną na leczenie (TRD). VNS prowadzi do działania przeciwdepresyjnego i przeciwsamobójczego oraz poprawy jakości życia. Protokół ten zawiera przewodnik krok po kroku dotyczący zarządzania i dostosowywania stymulatora nerwu błędnego w celu skutecznego leczenia TRD.

Stymulacja nerwu błędnego jako wspomagające narzędzie neurostymulacji w depresji opornej na leczenie

Opisano metodologiczny opis techniki, potencjalnych celów i prawidłowego podawania przezskórnej stymulacji nerwu błędnego (taVNS) na ucho ludzkie.

Laboratoryjne podawanie przezskórnej stymulacji nerwu błędnego usznego (taVNS): technika, celowanie i rozważania

Prezentowany tutaj jest protokół produkcji wszczepialnego systemu do chronologicznego zapisu in vivo wywołanych i spontanicznych potencjałów elektromiograficznych. System jest stosowany do badania unerwienia mięśni krtani po uszkodzeniu nerwów.

Wszczepialny system do przewlekłej elektromiografii in vivo

Istniejące podejścia do konstruowania przewlekle wszczepialnych elektrod mankietowych nerwów obwodowych do użytku u małych gryzoni często wymagają specjalistycznego sprzętu i/lub wysoko wykwalifikowanego personelu. W tym protokole demonstrujemy proste, tanie podejście do wytwarzania przewlekle wszczepialnych elektrod mankietowych i wykazujemy ich skuteczność w stymulacji nerwu błędnego (VNS) u szczurów.

Przygotowanie elektrod stymulujących nerwy obwodowe do przewlekłej implantacji u szczurów

Zmodyfikowana operacja to uproszczona metoda dla modelu uszkodzenia nerwu oszczędzonego u myszy lub szczura, która wymaga tylko jednego podwiązania i jednego cięcia, aby uszkodzić zarówno wspólne nerwy strzałkowe, jak i łydkowe.

Zmodyfikowany model chirurgii oszczędzonego uszkodzenia nerwu bólu neuropatycznego u myszy

Obecny protokół opisuje technikę chirurgiczną polegającą na wszczepianiu elektrod do nerwu błędnego w jamie brzusznej u szczurów, wraz z metodami przewlekłego testowania elektrofizjologii i stymulacji za pomocą wszczepionego urządzenia.

Chirurgia implantacji w celu stymulacji nerwu błędnego jamy brzusznej i rejestrowanie badań na obudzonych szczurach

W tym badaniu wykazano, że nieinwazyjna technika instylacji tchawicy pozwala na rozwój ALI u szczurów za pomocą podstawowego laryngoskopu, aby zapewnić precyzyjne dostarczanie LPS do płuc. LPS jest wprowadzany za pomocą rurki tchawicowej za pomocą laryngoskopu. Skala uszkodzenia płuc jest oceniana w wielu punktach czasowych.

Nieinwazyjne podanie lipopolisacharydu przez endotchawicę w celu wywołania ostrego uszkodzenia płuc u gryzoni

Przeszczep szpiku kostnego umożliwia zmianę genotypu komórek pochodzących ze szpiku. Jeśli interesujący nas gen jest ekspresowany zarówno w komórkach pochodzących ze szpiku, jak i w komórkach niepochodzących ze szpiku, przeszczep szpiku kostnego pozwala na zmianę genotypu komórek pochodzących ze szpiku bez zmiany genotypu komórek niepochodzących ze szpiku.

Różnicowanie funkcjonalnych ról ekspresji genów w komórkach immunologicznych i nieimmunologicznych w zapaleniu jelita grubego u myszy za pomocą transplantacji szpiku kostnego

Poznaj zmodyfikowaną metodę stymulacji nerwu błędnego do badania cholinergicznych mechanizmów przeciwzapalnych w neuroimmunologii. Technika ta pozwala analizować interakcje między układem nerwowym a odpowiedzią immunologiczną.

Wydłużony czas rekonwalescencji i zmniejszone podawanie LPS w celu zbadania mechanizmów stymulacji nerwu błędnego w ograniczonych reakcjach zapalnych (Wideo) | JoVE Journal

Wydłużony czas rekonwalescencji i zmniejszone podawanie LPS w celu zbadania mechanizmów stymulacji nerwu błędnego w ograniczonych reakcjach zapalnych

Przeglądaj więcej filmów