Name: Manipulacja elektrokortykogramem padaczkowym (ECoG) i snem u szczurów i myszy za pomocą akupunktury (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Poznaj metodę akupunktury w badaniach padaczki i snu u szczurów i myszy. Technika obejmuje implantację elektrod ECoG/EMG oraz analizę elektrokortykogramu padaczkowego w modelach zwierzęcych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty Ministerstwa Nauki i Technologii (MOST) MOST104-2410-H-002-053 & NSC99-2320-B-002-026-MY3. Rękopis ten został zredagowany i sprawdzony przez pana Briana Changa, który ma doświadczenie w poprawianiu profesjonalnych dokumentów.

Wszystkie protokoły eksperymentalne są zatwierdzane przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Narodowego Uniwersytetu Tajwańskiego.
1. Chirurgia stereotaktyczna do wszczepiania elektrod ECoG, elektrod EMG, termistora mózgu i kaniuli prowadzącej do wstrzykiwań
<ol>
	<li>Dla szczurów (250 - 350 g, 6- do 8-tygodniowych szczurów Sprague-Dawley)
	<ol>
		<li>Znieczulić szczury przez wstrzyknięcie IP z 50 mg/kg zoletylu. Potwierdź prawidłową głębokość znieczulenia, obserwując brak reakcji po uszczypnięciu w tylną łapę. Nałóż maść na oczy, ogol sierść i wysterylizuj skórę roztworem jodu powidonu i 75% etanolem. Wstrzyknij antybiotyk (penicylinę G), aby zapobiec infekcji.</li>
		<li>Przygotuj skalpele, nożyczki, hemostatyki, gazy i maszynę do kauteryzacji do operacji. Sterylizować sprzęt chirurgiczny i gazy w autoklawie i kauteryzacji 75% etanolem.</li>
		<li>Umieść pasek na uszy w przewodzie słuchowym i zamontuj szczura do stereotaksji.</li>
		<li>Za pomocą skalpela wykonaj około 2-centymetrowe nacięcie w linii środkowej czaszki wzdłuż linii między dwoma uszami, poruszając się doogonowo. Przytnij płaty skóry hemostatami, aby odsłonić czaszkę i usunąć tkankę nad czaszką za pomocą skalpela.</li>
		<li>Wywierć osiem otworów (F1, F2, P1, P2, O1, O2, R1 i R2), każdy o średnicy około 0.7 mm, w czaszce za pomocą narzędzia obrotowego. Przykręć osiem elektrod ECoG na płacie czołowym, ciemieniowym i potylicznym oraz móżdżku zarówno w lewej, jak i prawej półkuli. Elektrody te służą do wykrywania padaczki ogniskowej.
		<ol>
			<li>Użyj następujących współrzędnych dla elektrod rejestrujących: czołowa (F1 i F2): +2,0 mm przed bregmą i +2,5 mm od linii środkowej, ciemieniowa (P1 i P2): -2,0 mm przed bregmą i +3,0 mm od linii środkowej oraz potyliczna (O1 i O2): -5,5 mm przed bregmą i +3,0 mm od linii środkowej.</li>
			<li>Umieść dwie elektrody referencyjne (R1 i R2) nad móżdżkiem (-11,0 mm przed bregmą i +4,0 mm od linii środkowej).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>W oddzielnych grupach szczurów wywierć trzy otwory i umieść dwie przykręcane elektrody EEG nad prawym płatem czołowym (F2) i ciemieniowym (P2) kory mózgowej o tych samych współrzędnych, jak opisano w kroku 1.1.5.1. Umieść trzecią elektrodę EEG nad lewym móżdżkiem (R1), która służy do uziemienia zwierzęcia i zmniejszenia artefaktów sygnału. Elektrody te służą do potwierdzania padaczki uogólnionej i analizy etapów czujności.</li>
		<li>Oddziel skórę szyi i mięśnie i wprowadź dwie elektrody EMG do mięśnia szyi.</li>
		<li>Wywierć kolejny otwór w czaszce i umieść kaniulę prowadzącą do mikroiniekcji w lewym CeA (AP, 2,8 mm od bregma; ML, 4,2 mm; DV, 7,8 mm w stosunku do bregma) u szczurów. Współrzędne zostały zaczerpnięte z atlasu szczurów Paxinos i Watson10.</li>
		<li>Wywierć większy otwór (o średnicy 1,6 mm) w czaszce i umieść skalibrowany termistor 30 kV na powierzchni kory ciemieniowej, który zostanie później zacementowany, aby monitorować temperaturę kory mózgowej u szczurów.</li>
		<li>Użyj gazy i kauteryzacji, aby zatrzymać krwawienie, gdy się pojawi.</li>
		<li>Poprowadź izolowane przewody od elektrod ECoG i elektrod EMG do cokołu i podłącz termistor do linki. Zacementuj cokół i poprowadź kaniulę do czaszki za pomocą akrylu dentystycznego.</li>
		<li>Leczyć nacięcie miejscowo polisporyną (bacytracyny/siarczan polimyksyny B), aby zapobiec infekcji. Podawaj zwierzętom zarówno ibuprofen, jak i penicylinę G w wodzie przez tydzień po zabiegu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dla myszy (20 - 30 g, myszy C57BL/C w wieku od 6 do 8 tygodni)
	<ol>
		<li>Znieczulić myszy przez wstrzyknięcie IP z 50 mg/kg zoletilu i potwierdzić właściwą głębokość znieczulenia, obserwując brak odpowiedzi po uszczypnięciu tylnej łapy. Nałóż maść do oczu. Po zgoleniu sierści wysterylizuj skórę roztworem jodu powidonu i 75% etanolem. Wstrzyknij antybiotyk (penicylinę G), aby zapobiec infekcji.</li>
		<li>Umieść pasek douszny w przewodzie słuchowym i zamontuj mysz do stereotaksji.</li>
		<li>Za pomocą skalpela wykonaj około 1,5-centymetrowe nacięcie w linii środkowej czaszki wzdłuż linii między dwoma uszami, poruszając się doogonowo. Przytnij płaty skóry hemostatykami, aby odsłonić czaszkę i usuń tkankę nad czaszką za pomocą skalpela.</li>
		<li>Zrób dwa otwory w czaszce nożyczkami chirurgicznymi i umieść dwie druciane elektrody ECoG na prawym płacie czołowym (F2: +2,0 mm do bregma i +1,5 do linii środkowej) i lewym płacie ciemieniowym (P1: -3,0 mm do bregmy i -2,5 mm do linii środkowej).</li>
		<li>Oddziel skórę szyi i mięśnie i wprowadź dwie elektrody EMG do mięśnia szyi.</li>
		<li>Podłącz izolowane przewody z drutowych elektrod ECoG i elektrod EMG do końcówek żeńskich i do złącza 2,54 mm, a następnie przycementuj do czaszki za pomocą akrylu dentystycznego.</li>
		<li>Leczyć nacięcie miejscowo polisporyną (bacytracyny/siarczan polimyksyny B), aby zapobiec infekcji. Podawaj zwierzętom zarówno ibuprofen, jak i penicylinę G w wodzie przez tydzień po zabiegu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pozwolić wszystkim zwierzętom dojść do siebie przez siedem dni przed rozpoczęciem doświadczeń.</li>
	<li>Szczury lub myszy trzymane w pomieszczeniach trzymanych oddzielnie, w oddzielnych klatkach do nagrywania, w odizolowanym pomieszczeniu, w którym temperatura jest utrzymywana na poziomie 23 ± 1 °C, a rytm światło-ciemność (L:D) jest kontrolowany w cyklu 12:12 godzin (oświetlenie 40 W x 4 lampy). Zapewnij jedzenie i wodę ad libitum.</li>
	<li>Podłącz ECoG, EMG i termistor za pomocą linki do amplifiers tydzień po operacji, aby rozpocząć nagrania.</li>
</ol>
2. Ustalenie ogniskowej padaczki TLE, SE i spontanicznie nawracającej padaczki
<ol>
	<li>Dla szczurów
	<ol>
		<li>Podać 0,5 μl pilokarpiny (2,4 mg/μl) do lewego CeA przez kaniulę prowadzącą iniekcję za pomocą pompy do mikroiniekcji. Szybkość wstrzykiwania powinna być ustawiona na 0,2 μl/min w celu wywołania ogniskowego TLE.</li>
		<li>IP wstrzyknąć 300 mg/kg pilokarpiny w celu wywołania padaczki uogólnionej z nawracającym SE.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dla myszy
	<ol>
		<li>IP podaje PTZ (0,035 mg/g masy ciała myszy) w określonym punkcie ZT co drugi dzień. Pięć kolejnych wstrzyknięć spowoduje rozwój padaczki uogólnionej spontanicznie i nawracająco.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dla szczurów i myszy
	<ol>
		<li>Wzmocnij sygnały ECoG o 5 000 i przefiltruj pasmo analogowe w zakresie od 0,1 do 40 Hz.</li>
		<li>Użyj płytki konwertującej A/C, aby przekonwertować analogowe sygnały ECoGs na sygnały cyfrowe z częstotliwością próbkowania 128 Hz.</li>
		<li>Korzystaj z oprogramowania do oceny wizualnej i analizuj początek i czas trwania padaczki. Zmierz skalę czasu, aby przedstawić czas trwania.</li>
		<li>Zdefiniuj padaczkę ECoG na podstawie pojawienia się skoków padaczkowych o amplitudzie większej niż 2 mV i trwających dłużej niż 30 s13.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Klasyfikacja stanów czujności
<ol>
	<li>Dla szczurów
	<ol>
		<li>Określ stany czujności, korzystając z parametrów uzyskanych z ECoG, EMG, temperatury mózgu i lokomocji w ciągu 12-sekundowego epizodu zapisu. Podłącz ECoG, EMG i termistor za pomocą linki do amplifiers tydzień po operacji, aby rozpocząć nagrywanie. Oceń stany za pomocą niestandardowego oprogramowania zgodnie z krokami 3.1.5 - 3.1.7.</li>
		<li>Mierz aktywność lokomotoryczną za pomocą detektora ruchu na podczerwień, integruj sygnały co 1 s i przechowuj sygnały.</li>
		<li>Zmierz temperaturę kory mózgowej i zapisz sygnały.</li>
		<li>Klasyfikuj stany czujności zgodnie z naszymi wcześniej zdefiniowanymi kryteriami14.</li>
		<li>Oceń stan czuwania, korzystając z następujących cech: ECoG o małej amplitudzie z widmami o wysokiej częstotliwości, wyższą mocą delta (0,5 - 4,0 Hz) i niższą mocą theta (6,0 - 9,0 Hz), dominującą aktywnością lokomotoryczną, wysoką aktywnością EMG i stopniowo rosnącą temperaturą kory mózgowej.</li>
		<li>Oceń sen NREM, używając następujących cech: ECoG z dominacją fali delta o dużych amplitudach, zmniejszona aktywność EMG, obniżona temperatura kory mózgowej i brak aktywności lokomotorycznej.</li>
		<li>Oceń sen REM, korzystając z następujących cech: zmniejszona amplituda ECoG z dominującą częstotliwością theta, nagły wzrost temperatury kory mózgowej, minimalna aktywność EMG i niska aktywność lokomotoryczna z drganiami ciała.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dla myszy
	<ol>
		<li>Powtórz klasyfikację stanów czujności u myszy, jak przeprowadzoną u szczurów, z wyjątkiem tego, że termistor nie rejestruje temperatury kory mózgowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Wykonywanie akupunktury manualnej i EA u szczurów
<ol>
	<li>Szczur jest znieczulony do protokołu EA. </li>
	<li>Zlokalizuj punkt akupunktowy według anatomii i potwierdź niską impedancję skóry w akupunkcie. Światło po wykryciu niskiej impedancji skóry. Uwaga: Punkty akupunkturowe Fengchi znajdują się w odległości 3 mm od tylnej linii środkowej między dwoma uszami, na szyi.</li>
	<li>Włóż igły ze stali nierdzewnej do punktów akupunkturowych na głębokości 2 mm.</li>
	<li>Szarp wbite igły 10 razy co 5 minut.</li>
	<li>Za pomocą funkcjonalnego stymulatora elektrycznego dostarcz ciąg dwufazowych impulsów (każdy o czasie trwania 150 μs) o intensywności 1 mA do punktów akupunkturowych przez igłę.</li>
	<li>Wykonaj pozorowaną akupunkturę lub pozorowaną EA jako kontrolę.</li>
</ol>

<ol><li>Regesta, G., Tanganelli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+aspects+and+biological+bases+of+drug-resistant+epilepsies%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsy+Res%22%5BJournal%5D)">Clinical aspects and biological bases of drug-resistant epilepsies.</a> Epilepsy Res. 34 (2-3), 109-122 (1999).</li>
<li>Malow, B. A., Bowes, R. J., Lin, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predictors+of+sleepiness+in+epilepsy+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Sleep%22%5BJournal%5D)">Predictors of sleepiness in epilepsy patients.</a> Sleep. 20 (12), 1105-1110 (1997).</li>
<li>Stores, G., Wiggs, L., Campling, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleep+disorders+and+their+relationship+to+psychological+disturbances+in+children+with+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Child+Care+Health+Dev%22%5BJournal%5D)">Sleep disorders and their relationship to psychological disturbances in children with epilepsy.</a> Child Care Health Dev. 24 (1), 5-19 (1998).</li>
<li>Yi, P. L., Tsai, C. H., Lin, J. G., Lee, C. C., Chang, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kindling+stimuli+delivered+at+different+times+in+the+sleep-wake+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Sleep%22%5BJournal%5D)">Kindling stimuli delivered at different times in the sleep-wake cycle.</a> Sleep. 27 (2), 203-212 (2004).</li>
<li>Yi, P. L., Chen, Y. J., Lin, C. T., Chang, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occurrence+of+epilepsy+at+different+zeitgeber+times+alters+sleep+homeostasis+differently+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Sleep%22%5BJournal%5D)">Occurrence of epilepsy at different zeitgeber times alters sleep homeostasis differently in rats.</a> Sleep. 35 (12), 1651-1665 (2012).</li>
<li>Bazil, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleep+and+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Neurol%22%5BJournal%5D)">Sleep and epilepsy.</a> Semin Neurol. 22, 321-327 (2002).</li>
<li>Yi, P. L., Lu, C. Y., Jou, S. B., Chang, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+frequency+electroacupuncture+suppress+focal+epilepsy+and+improves+epilepsy-induced+sleep+disruptions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Sci%22%5BJournal%5D)">Low frequency electroacupuncture suppress focal epilepsy and improves epilepsy-induced sleep disruptions.</a> J Biomed Sci. 22, 49(2015).</li>
<li>Yi, P. L., Lu, C. Y., Cheng, C. H., Tsai, Y. F., Lin, C. T., Chang, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+amygdala+opioid+receptors+by+electroacupuncture+of+Feng-Chi+%28GB20%29+acupoints+exacerbates+focal+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Complement+Altern+Med%22%5BJournal%5D)">Activation of amygdala opioid receptors by electroacupuncture of Feng-Chi (GB20) acupoints exacerbates focal epilepsy.</a> BMC Complement Altern Med. 13, 290(2013).</li>
<li>Yi, P. L., Lu, C. Y., Cheng, C. H., Tsai, Y. F., Lin, C. T., Chang, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amygdala+opioid+receptors+mediate+the+electroacupuncture-induced+deteriortation+of+sleep+disruptions+in+epilepsy+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Sci%22%5BJournal%5D)">Amygdala opioid receptors mediate the electroacupuncture-induced deteriortation of sleep disruptions in epilepsy rats.</a> J Biomed Sci. 20, 85(2013).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Rat+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates+%284th+edition%29%22">The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates (4th edition)</a>. , Academic Press. San Diego. (1998).</li>
<li>Siu, F. K. W., Lo, S. C. L., Leung, M. C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electro-acupuncture+potentiates+the+disulphide-reducing+activities+of+thioredoxin+system+by+increasing+thioredoxin+expression+in+ischemia-reperfused+rat+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Electro-acupuncture potentiates the disulphide-reducing activities of thioredoxin system by increasing thioredoxin expression in ischemia-reperfused rat brains.</a> Life Sci. 77 (4), 386-399 (2005).</li>
<li>Yi, P. L., Tsai, C. H., Lin, J. G., Liu, H. J., Chang, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+electroacupuncture+at+%27Anmian%27+%28extra%29+acupoints+on+sleep+activities+in+rats%3A+the+implication+of+the+caudal+nucleus+tractus+solitaries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Sci%22%5BJournal%5D)">Effects of electroacupuncture at 'Anmian' (extra) acupoints on sleep activities in rats: the implication of the caudal nucleus tractus solitaries.</a> J Biomed Sci. 11 (5), 579-590 (2004).</li>
<li>Jou, S. B., Kao, I. F., Yi, P. L., Chang, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+stimulation+of+left+anterior+thalamic+nucleus+with+high-frequency+and+low-intensity+currents+reduces+the+rate+of+pilocarpine-induced+epilepsy+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Seizure%22%5BJournal%5D)">Electrical stimulation of left anterior thalamic nucleus with high-frequency and low-intensity currents reduces the rate of pilocarpine-induced epilepsy in rats.</a> Seizure. 22 (3), 221-229 (2012).</li>
<li>Chang, F. C., Opp, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+corticotropin-releasing+hormone+receptors+reduces+spontaneous+waking+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Regul+Integr+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Blockade of corticotropin-releasing hormone receptors reduces spontaneous waking in the rat.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 275 (3), Pt 2 793-802 (1998).</li>
<li>Cheng, C. H., Yi, P. L., Lin, J. G., Chang, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+opiates+in+the+nucleus+tractus+solitaries+mediate+electroacupuncture-induced+sleep+activities+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Evid+Based+Complement+Alternat+Med%22%5BJournal%5D)">Endogenous opiates in the nucleus tractus solitaries mediate electroacupuncture-induced sleep activities in rats.</a> Evid Based Complement Alternat Med. 2011, 159209(2011).</li>
<li>Tsui, P., Leung, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+effectiveness+between+manual+acupuncture+and+electro-acupuncture+on+patients+with+tennis+elbow%5BTitle%5D)+AND+%22Acupunct+Electrother+Res%22%5BJournal%5D)">Comparison of the effectiveness between manual acupuncture and electro-acupuncture on patients with tennis elbow.</a> Acupunct Electrother Res. 27 (2), 107-117 (2002).</li>
<li>Napadow, V., Makris, N., Liu, J., Kettner, N. W., Kwong, K. K., Hui, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+electroacupuncture+versus+manual+acupuncture+on+the+human+brain+as+measured+by+fMRI%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Brain+Mapp%22%5BJournal%5D)">Effects of electroacupuncture versus manual acupuncture on the human brain as measured by fMRI.</a> Hum Brain Mapp. 24 (3), 193-205 (2005).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wybór wykonalnego modelu zwierzęcego padaczki jest niezbędny dla każdego celu eksperymentalnego. Jednym z naszych celów jest wyjaśnienie wpływu EA na tłumienie padaczki. EA jest medycyną alternatywną, która może wykazywać działanie terapeutyczne w padaczce i została udokumentowana w starożytnej literaturze chińskiej. Brakuje jednak dowodów naukowych, które by to potwierdzały. Aby określić wpływ EA na padaczkę, skupiliśmy się przede wszystkim na wpływie EA na łagodną padaczkę ogniskową, a nie na ciężkim napadzie uogólnion...

Epilepsja to powszechne zaburzenie neurologiczne, w którym nawracające napady występują przez całe życie pacjenta. Większość nawrotów padaczkowych może być dobrze kontrolowana przez leki przeciwpadaczkowe (AED). Jednak u około 30% pacjentów z padaczką rozwija się padaczka oporna na leczenie1. Padaczka powoduje zaburzenia snu, które mogą dodatkowo nasilać nawroty. Dowody wskazują, że padaczka może zakłócać sen w nocy lub powodować nadmierną senność w ciągu dnia2,3. Nasze wcześniejsze badania wskazują ponadto, że padaczka występująca w czasie zeitgeber (ZT) 0, czyli na początku okresu światła w cyklu światło:ciemność, skraca sen; Pośredniczy w tym hormon uwalniający kortykotropinę (CRH), czynnik homeostatyczny. Padaczka w ZT13 (początek okresu ciemności) zwiększa ekspresję innego czynnika homeostatycznego, interleukiny-1 (IL-1), który wydłuża sen. Rytm okołodobowy snu ulega zmianie, gdy padaczka występuje w ZT6, w środku okresu świetlnego4,5. Z drugiej strony, problemy ze snem dodatkowo nasilają postęp i nawrót padaczki6. Na podstawie powyższych dowodów staramy się wskazać optymalną metodę terapeutyczną, która pozwoli jednocześnie kontrolować padaczkę i zapobiegać zaburzeniom snu u pacjentów z padaczką. Wcześniej odkryliśmy, że elektroakupunktura (EA) z częstotliwością stymulacji 10 Hz, w której pewna ilość prądu jest dostarczana do punktu akupunkturowego przez igłę ze stali nierdzewnej, skutecznie tłumi aktywność padaczkową elektrokortykogramu (ECoG) i zaburzenia snu wywołane padaczką7. EA z częstotliwością stymulacji 100 Hz dodatkowo pogarsza aktywność epilepsyjną i zakłócenia snu u szczurów8,9. Ten udany eksperyment zależy od trzech czynników: po pierwsze, wykonalnego modelu zwierzęcego epileptyka; po drugie, metoda rejestracji i analizy snu gryzoni; i po trzecie, dokładne wykonanie akupunktury i dokładność lokalizacji punktów akupunkturowych.
Epilepsja została podzielona na dwa główne typy: padaczkę ogniskową i padaczkę uogólnioną. Interesuje nas ogniskowa padaczka skroniowa (TLE), padaczka uogólniona, stan padaczkowy (SE) oraz nawroty padaczki spontanicznie uogólnionej. W związku z tym stosuje się różne manipulacje, aby stworzyć odpowiednie modele padaczkowe dla naszych eksperymentów. W celu ustalenia ogniskowego TLE podaje się małą dawkę pilokarpiny do lewego centralnego jądra ciała migdałowatego (CeA). Aby zweryfikować ten model, sześć elektrod ECoG jest wszczepionych w płat czołowy (F1 i F2), ciemieniowy (P1 i P2) i potyliczny (O1 i O2) zarówno w lewej, jak i prawej półkuli, a kolejne dwie elektrody referencyjne (R1 i R2) są umieszczane nad móżdżkiem w obu półkulach. Dodatkowa kaniula prowadząca do mikroiniekcji jest chirurgicznie wszczepiana do lewego CeA (AP, 2,8 mm od bregma; ML, 4,2 mm; DV, 7,8 mm względem bregma). Współrzędne zostały zaczerpnięte z atlasu szczurów Paxinos i Watson10. Jeśli ogniskowe TLE zostanie pomyślnie wywołane, tylko zapis z elektrody na lewej korze ciemieniowej (P1), która znajduje się w pobliżu lewego CeA, powinien uzyskać dominujące ECoG padaczkowe, bez istotnych ECoG padaczkowych zarejestrowanych z innych elektrod ECoG. Dootrzewnowe (IP) wstrzyknięcia pilokarpiny szczurom wywołują padaczkę uogólnioną i SE, ale może to być śmiertelne. Pięć wstrzyknięć IP pentylenotetrazolu (PTZ) w jednodniowym odstępie między każdym wstrzyknięciem skutecznie indukuje spontaniczną uogólnioną padaczkę u myszy, a także zapewnia przeżycie myszy. Dwie przewodowe elektrody ECoG są wszczepiane do kory czołowej i ciemieniowej u myszy w celu odbierania sygnałów ECoG i weryfikacji spontanicznie nawrotu padaczki.
Polisomnografia (PSG) to kompleksowa metoda rejestrowania zmian fizjologicznych, które zachodzą podczas snu, i może obiektywnie klasyfikować sen na różne etapy snu bez szybkich ruchów gałek ocznych (NREM) i szybkich ruchów gałek ocznych (REM). PSG rejestruje parametry funkcji organizmu, w tym fale mózgowe (elektroencefalogram, EEG), ruchy gałek ocznych (elektrookulogram, EOG), tony mięśni szkieletowych (elektromiogram, EMG), rytmy serca (elektrokardiogram, EKG) oraz poziom tlenu we krwi i parametry oddechowe. U szczurów rejestrujemy ECoG, EMG, temperaturę kory mózgowej i aktywność lokomotoryczną, aby sklasyfikować stany czujności na czuwanie, sen NREM i sen REM. Analizę snu u myszy przeprowadza się za pomocą ECoG, EMG i wyników aktywności lokomotorycznej. Szczurom wszczepia się chirurgicznie trzy elektrody śrubowe ECoG w czołowej, ciemieniowej i przeciwległej korze móżdżku za pomocą chirurgii stereotaktycznej. Określenie stanów czujności (czuwanie, sen NREM i sen REM) po akwizycji odbywa się na podstawie parametrów uzyskanych z ECoGs, EMG, temperatury mózgu i aktywności lokomotorycznej. Szczegółowe kryteria kategoryzacji zachowania zwierzęcia zarówno u szczurów, jak i myszy opisano w protokole.
Zarówno szczury, jak i myszy muszą być znieczulone niską dawką zoletilu (25 mg/kg), która stanowi połowę dawki środków znieczulających zwykle podawanych podczas operacji stereotaktycznej, przed wykonaniem manualnej akupunktury lub EA. Taka dawka pozwala zwierzętom obudzić się od 30 do 35 minut po wstrzyknięciu. Na początku okresu ciemności wykonuje się akupunkturę manualną lub EA, ze stałym okresem czasu wynoszącym 30 minut, a każde zwierzę jest kolejno leczone przez dwa do trzech dni. Stymulujące prądy EA są dostarczane do określonego punktu akupunkturowego za pomocą igły ze stali nierdzewnej, która jest wprowadzana do punktu akupunkturowego. Prąd bodźca to ciąg dwufazowych impulsów kwadratowych, w których czas trwania impulsu wynosi 150 ms, a intensywność stymulacji 1 mA. Jeśli do akupunktury manualnej używa się suchej igły, igła wprowadzona do akupunkturów jest drgana 10 razy co 5 minut. Trudną częścią akupunktury manualnej lub EA jest zlokalizowanie punktów akupunkturowych u gryzoni. Lokalizacja punktów akupunkturowych u szczurów lub myszy jest podobna do ich anatomicznej lokalizacji u ludzi. Na przykład obustronne punkty akupunkturowe Fengchi znajdują się w odległości 3 mm od tylnej linii środkowej na szyi, między dwoma uszami, co jest podobne do ich anatomicznego położenia u ludzi11. Co więcej, punkty akupunkturowe o niskiej impedancji na skórze mogą być dodatkowo potwierdzone. Udawana akupunktura lub pozorowana manipulacja EA jest niezbędna do akupunktury lub eksperymentów EA. Akupunktura pozorowana lub pozorowana EA powinna być wykonywana w nieakupunkturowym znajdującym się w pobliżu punktu akupunkturowego, na przykład w pobliżu pachy12.
Aby skutecznie zbadać wpływ akupunktury lub EA na epilepsję i zaburzenia snu wywołane padaczką, muszą być spełnione następujące czynniki: wykonalny model zwierzęcy epilepsji, dokładna analiza epileptycznych ECoG i nawrotów padaczki, metoda klasyfikacji stanów czujności oraz dokładne działanie akupunktury lub EA u gryzoni.

<table><tbody><tr><td>Drugs</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zoletil</td><td>Virbac</td><td></td><td>50 mg/kg i.p.</td></tr><tr><td>pilokarpina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6503</td><td>300 mg/kg i.p.; 1,2 mg mikroiniekcja</td></tr><tr><td>PTZ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6500</td><td>0,035 mg/mysz</td></tr><tr><td>polisporyna</td><td>Pfizer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Surgery</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ECoG</td><td>Tworzywa sztuczne Jedna</td><td>elektroda śrubowa</td><td>E363/20</td> dla szczurów</tr><tr><td>Cokół</td><td>Plastics One</td><td>MS363</td><td></td></tr><tr><td>Kaniula</td><td>Plastics One</td><td>C315G/spc</td><td></td></tr><tr><td>Termistor</td><td>Omega Engineering</td><td>44008</td><td></td></tr><tr><td>Dentystyczny akrylowy</td> instrument stereotaktyczny <td>Tempron</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Stoelting</td><td></td><td>Ramiona duralowe</td></tr><tr><td><mocne>Urządzenia rejestrujące</mocne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ECoG wzmacniacz</td><td>Colbourn Instruments</td><td>V75-01</td><td></td></tr><tr><td>Płyta A/D</td><td>National Instruments</td><td>NI PCI-6033E</td><td></td></tr><tr><td>Detektory ruchu na podczerwień</td><td>Biobserve GmbH</td><td>wykonane</td><td></td>na zamówienie</tr><tr><td>oprogramowanie ICELUS</td><td>G-System</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AxoScope 10</td><td>Urządzenia molekularne</td><td></td><td></td></tr><tr><td><silne>Potrzeby akupunktury</silne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Igły ze stali nierdzewnej</td><td>Shanghai Yanglong Medical Articles Co.</td><td>32 x 1"</td><td></td></tr><tr><td>Funkcje: Stymulator elektryczny</td><td>I.T.O., Japan</td><td>Trio 300</td><td></td></tr><tr><td>AcuPen</td><td>Lhasa OMS</td><td>Pointer Excel II</td><td></td></tr></tbody></table>

manipulacja elektrokortykogramem padaczkowym (ecog) i snem u szczurów i myszy za pomocą akupunktury

Manipulation of Epileptiform Electrocorticograms (ECoGs) and Sleep in Rats and Mice by Acupuncture

Starożytna literatura chińska udokumentowała, że akupunktura ma skuteczne działanie terapeutyczne na epilepsję i bezsenność. Istnieje jednak niewiele badań, które ujawniłyby możliwe mechanizmy stojące za tymi efektami. Aby zbadać wpływ akupunktury na padaczkę i sen, należy zająć się kilkoma kwestiami. Pierwszym z nich jest identyfikacja punktów akupunkturowych, które odpowiadają między ludźmi, szczurami i myszami. Ponadto należy określić głębokość wprowadzenia igły do akupunktury, stopień skręcenia igły w manualnej akupunkturze igłowej oraz parametry stymulacji elektroakupunktury (EA). Aby ocenić wpływ akupunktury na padaczkę i sen, wymagany jest wykonalny model padaczki u gryzoni. Podajemy pilokarpinę do lewego centralnego jądra ciała migdałowatego (CeA) w celu symulacji ogniskowej padaczki skroniowej (TLE) u szczurów. Dootrzewnowe wstrzyknięcie pilokarpiny indukuje padaczkę uogólnioną i stan padaczkowy (SE) u szczurów. Pięć wstrzyknięć IP pentylenotetrazolu (PTZ) w jednodniowym odstępie między każdym wstrzyknięciem skutecznie indukuje spontaniczną padaczkę uogólnioną u myszy. Zapisy elektrokortykogramów (ECoG), elektromiogramów (EMG), temperatury mózgu i aktywności lokomotorycznej są wykorzystywane do analizy snu u szczurów, podczas gdy ECoG, EMG i aktywność lokomotoryczna są wykorzystywane do analizy snu u myszy. Elektrody ECoG są wszczepiane do czołowej, ciemieniowej i przeciwległej kory potylicznej, a termistor jest wszczepiany nad korą mózgową za pomocą chirurgii stereotaktycznej. Elektrody EMG są wszczepiane w mięśnie szyi, a detektor podczerwieni określa aktywność lokomotoryczną. Kryteria kategoryzacji etapów czujności, w tym czuwania, snu z szybkimi ruchami gałek ocznych (REM) i snu bez fazy REM (NREM), opierają się na informacjach z ECoG, EMG, temperatury mózgu i aktywności lokomotorycznej. Szczegółowe kryteria klasyfikacji znajdują się w tekście.

Istnieją różne modele szczurze i mysie, które odpowiadają potrzebom różnych typów epilepsji. W celu wywołania ogniskowej TLE, do lewego CeA podaje się 0,5 µL pilocarpiny (2,4 mg/µL). Przeważające epileptiformne zapisy ECoG uzyskuje się z elektrody ECoG znajdującej się w płacie ciemieniowym lewej półkuli (Rysunek 1A: b), natomiast rzadkie aktywności epilepticzne są rejestrowane przez pozostałe elektrody ECoG (Rysunek 1A: a, c</stro...

Ten artykuł demonstruje skuteczność akupunktury, modeli epilepsji i analizy snu u gryzoni. Opisano procedurę akupunktury i identyfikację punktów akupunkturowych. Pilokarpina lub pentylenotetrazol (PTZ) jest stosowany w celu wywołania padaczki. Do analizy snu wykorzystuje się elektrokortykogram (ECoG), elektromiogram (EMG), temperaturę mózgu i zapisy aktywności lokomotorycznej.

Manipulacja elektrokortykogramem padaczkowym (ECoG) i snem u szczurów i myszy za pomocą akupunktury

Ancient Chinese literature has documented that acupuncture possesses efficient therapeutic effects on epilepsy and insomnia. There is, however, little ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ocena epilepsji, snu oraz efektów akupunktury w modelu zwierzęcym. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny neuronauki dotyczące tego, jak wywołać epilepsję, analizować sen i przeprowadzać akupunkturę w modelu małego zwierzęcia. Główną zaletą tej techniki jest fakt, że boczne elektrody korowe oraz boczne elektrody myogramu mogą zostać szybko i łatwo implantowane za pomocą chirurgii stereotaktycznej.Procedurę tę zademonstruje Yi-Jou Wu, student studiów magisterskich z mojego laboratorium. Po potwierdzeniu odpowiedniej głębokości sedacji poprzez brak reakcji na uciśnięcie palca u nogi, należy nałożyć maść do oczu szczurowi rasy Spregg Dolly w wieku od sześciu do ośmiu tygodni i o masie od 250 do 350 gramów z pierwszej grupy. Użyj trymera, aby usunąć sierść z górnej części czaszki.Zdezynfekuj skórę poprzez sekwencyjne aplikacje roztworu powidon-jodu oraz 75% etanolu, a następnie podaj antybiotyk w zastrzyku, aby zapobiec infekcji. Następnie zamocuj zwierzę w aparacie stereotaktycznym i umieść pręt uszny w kanale słuchowym. Za pomocą skalpela wykonaj nacięcie w linii środkowej w kierunku ogonowym wzdłuż czaszki między usz

manipulation-epileptiform-electrocorticograms-ecogs-sleep-rats-mice

Research

JoVE Journal

Behavior

Zachowanie

Źródło: Kodani, S., et.al. Manipulacja optogenetyczna obwodów neuronalnych podczas monitorowania stanów snu/czuwania u myszy. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film pokazuje optogenetyczną manipulację obwodami neuronalnymi zaangażowanymi w przejście ze snu do czuwania u myszy. Zabieg polega na chirurgicznym wszczepieniu światłowodu i elektrod do mózgu i mięśni, aby umożliwić stymulację światłem i zapis elektrofizjologiczny. Dostarczając światło w celu aktywacji światłoczułych kanałów kationowych w...

Manipulacja optogenetyczna obwodów neuronowych w celu przejścia ze snu do czuwania u myszy

Ten film demonstruje protokół wszczepienia elektrody elektroencefalogramu (EEG) i elektromiogramu (EMG) znieczulonej myszy. Proces polega na zabezpieczeniu myszy na stereotaktycznej ramie, wykonaniu nacięcia w linii środkowej czaszki, wywierceniu otworów na elektrody i zamocowaniu zespołu elektrod do nagrywania sygnału. Po powrocie do zdrowia zachowanie myszy podczas snu i czuwania jest analizowane przy użyciu zarejestrowanych sygnałów.

Analiza zachowań związanych ze snem u myszy za pomocą elektroencefalogramu i zapisów elektromiogramu

Ten film demonstruje metodę zapisu EEG w wysokiej rozdzielczości w szczurzym modelu padaczki ogniskowej. Przedstawiono w nim etapy przygotowania szczura, podłączenia wielokanałowej mini-czapki EEG do skóry głowy szczura i zarejestrowania EEG w celu identyfikacji zdarzeń związanych z napadami charakterystycznych dla modelu padaczki.

Zapis elektroencefalograficzny w szczurzym modelu padaczki ogniskowej

Ten film pokazuje elektroencefalograficzny (EEG) zapis napadów padaczkowych u szczurów z padaczką. Szczur z elektrodami wszczepionymi w brzuszny hipokamp podłącza się do systemu rejestracji EEG i umieszcza w komorze z pleksi. Szczur może się swobodnie poruszać, podczas gdy aktywność mózgu jest rejestrowana w celu monitorowania występowania napadów.

Elektroencefalograficzny zapis napadów padaczkowych u szczurów z padaczką

Zapis elektroencefalogramu (EEG) i elektromiogramu (EMG) u swobodnie zachowujących się myszy jest kluczowym krokiem do skorelowania zachowania i fizjologii ze snem i czuwaniem. Opisany w niniejszym dokumencie protokół eksperymentalny zapewnia przewodowy system do pozyskiwania zapisów EEG i EMG u myszy.

Procedura rejestracji poligraficznej do pomiaru snu u myszy

Napad elektrowstrząsowy (ECS) to eksperymentalny model terapii elektrowstrząsowej w ciężkiej depresji. ECS globalnie stymuluje aktywność hipokampa, prowadząc do synaptogenezy i plastyczności synaptycznej. W tym miejscu opisujemy metody indukcji ECS u szczurów i subkomórkowego frakcjonowania ich hipokampów w celu zbadania zmian w białkach synaptycznych wywołanych napadami.

Napady elektrowstrząsowe u szczurów i frakcjonowanie ich hipokampów w celu zbadania wywołanych napadami zmian w białkach o gęstości postsynaptycznej

Tutaj opisujemy metody optogenetycznej manipulacji poszczególnych typów neuronów podczas monitorowania stanów snu/czuwania u myszy, przedstawiając jako przykład naszą niedawną pracę nad jądrem łożyska prążka końcowego.

Manipulacja optogenetyczna obwodów nerwowych podczas monitorowania stanów snu/czuwania u myszy

Ten artykuł opisuje protokół do manipulowania celami molekularnymi w korze mózgowej za pomocą wirusów związanych z adenowirusami oraz do monitorowania efektów tej manipulacji podczas czuwania i snu za pomocą zapisów elektrokortykograficznych.

Zapis elektrokortykograficzny obszarów kory mózgowej manipulowanych za pomocą wirusa związanego z adenowirusem skierowanym przeciwko kofilinie u myszy

Tutaj prezentujemy protokół skutecznego i szybkiego elektroakupunktury (EA) u myszy lub młodych szczurów przy użyciu trójwymiarowego (3D) wydrukowanego uchwytu. Technika ta pozwala na jednoczesną operację na wielu zwierzętach, oszczędzając czas i zwiększając wydajność eksperymentów.

Masowa operacja elektroakupunktury u myszy lub młodych szczurów

Protokół ten został opracowany, aby stworzyć niezawodny i łatwo dostępny system do rejestrowania swobodnie poruszającego się EEG gryzoni.

Opłacalny i minimalnie inwazyjny protokół do przewlekłej wielomiejscowej elektroencefalografii u swobodnie poruszających się myszy

Poznaj metodę akupunktury w badaniach padaczki i snu u szczurów i myszy. Technika obejmuje implantację elektrod ECoG/EMG oraz analizę elektrokortykogramu padaczkowego w modelach zwierzęcych.

Manipulacja elektrokortykogramem padaczkowym (ECoG) i snem u szczurów i myszy za pomocą akupunktury

Przeglądaj więcej filmów