Name: Model iniekcji żyły wrotnej do badania przerzutów raka piersi do wątroby (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Poznaj metodę iniekcji żyły wrotnej do badania przerzutów raka piersi do wątroby u myszy. Technika umożliwia szczegółowe obserwacje ekstrawazacji komórek nowotworowych w mikrośrodowisku wątroby.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Alexandrze Quackenbush za pomoc w zabiegach chirurgicznych podczas kręcenia protokołu wideo, Hadley Holden za wsparcie histologiczne, Sonali Jindal za wkład w temat nowotworów i patologii wątroby podczas opracowywania metody oraz Breannie Caruso za krytyczną recenzję manuskryptu. Komórki guza sutka D2A1 i D2.OR były prezentem od dr Ann Chambers, komórki nowotworowe D2A1-GFP były prezentem od dr Jeffreya Greena, a komórki nowotworowe 4T1 były prezentem od dr Heide Ford. Do obrazowania wykorzystano rdzeń do zaawansowanej mikroskopii świetlnej OHSU w Jungers Center. Praca zawarta w tym manuskrypcie jest finansowana przez NIH/NCI NRSA F31CA186524 (do ETG) i NIH/NCI 5R01CA169175 (do PS).

Wszystkie procedury na zwierzętach opisane w tym artykule zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Zdrowia i Nauki w Oregonie.
1. Przygotowanie pola operacyjnego i narzędzi
<ol>
	<li>Przygotować nożyczki, kleszcze i hemostat przez autoklawowanie w temperaturze 124 °C przez 30 minut, 1 - 2 dni przed planowanymi operacjami. Zapewnij dostęp do autoklawowanej lub sterylnej ściółki, klatek i żywności do rekonwalescencji pooperacyjnej.</li>
	<li>Przygotuj aseptyczne pole operacyjne, najlepiej w okapie z przepływem laminarnym.
	<ol>
		<li>Przetrzyj wszystkie powierzchnie obszaru operacyjnego 10% wybielaczem, w tym poduszkę grzewczą, źródło światła, rurkę anestezjologiczną i stożek nosowy oraz wszelkie inne części sali operacyjnej, które będą znajdować się w bliskiej odległości od zabiegu chirurgicznego podczas jego wykonywania.</li>
		<li>W aseptycznym obszarze operacyjnym umieścić oczyszczoną poduszkę grzewczą ze sterylną serwetarą, źródłem światła, rurką anestezjologiczną i nosem, strzykawkami insulinowymi, strzykawkami 1 ml, bupiwakainą, sztucznymi łzami, sterylną solą fizjologiczną, 2 x 2" sterylne gąbki z gazy, 4 x 4" sterylna gaza, gaza hemostatyczna pocięta na 0,5 - 1 cm2 sztuki, nożyczki, kleszcze, hemostat, 4-0 szwy vicryl ze stożkową igłą, i 50 ml 2% glukonianu chlorheksydyny w autoklawowanym pojemniku.</li>
		<li>Upewnij się, że w tej przestrzeni jest miejsce na przygotowane komórki nowotworowe przechowywane na lodzie.</li>
		<li>Na stole przylegającym do pola operacyjnego przygotuj obszar rekonwalescencji za pomocą drugiej poduszki grzewczej i wyczyść klatki sterylnym posłaniem. 
		UWAGA: W tym obszarze można również przechowywać przedmioty, takie jak sterylizator koralików.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Wstrzyknięcie żyły wrotnej
<ol>
	<li>Na godzinę przed planowanym wstrzyknięciem należy potraktować samice myszy Balb/c w wieku 8 - 15 tygodni 100 μl 0,015 mg/ml buprenorfiny podskórnie w celu leczenia bólu. 
	UWAGA: Ten protokół wstrzyknięcia może być zastosowany do dowolnego szczepu samicy lub samca myszy w każdym wieku, przy użyciu odpowiednich linii komórkowych do zmian w szczepie.</li>
	<li>Przygotuj komórki nowotworowe do wstrzyknięcia w oparciu o protokoły dla wybranej linii komórkowej lub eksplantatu guza. Przed podaniem należy przetestować wszystkie linie komórek nowotworowych pod kątem obecności mysich patogenów, aby zmniejszyć ryzyko wprowadzenia takich patogenów do kolonii zwierząt.
	<ol>
		<li>W przypadku syngenicznych linii komórek nowotworowych Balb / c, w tym komórek nowotworowych D2A1, D2.OR i 4T1, rozmrozić komórki na 10 cm płytce do hodowli tkankowej 3 dni przed wstrzyknięciem, tak aby następnego dnia komórki osiągnęły ~ 90 - 100% konfluencji.</li>
		<li>1 dzień po rozmrożeniu komórek nowotworowych przemyć komórki raz solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS) i trypsynizować zbiegające się komórki nowotworowe za pomocą 2 ml 0,05% trypsyny w temperaturze 37 °C przez 5 min. Dodać 8 ml kompletnej pożywki (DMEM o wysokiej zawartości glukozy, 10% płodowej surowicy bydlęcej, 2 mM L-glutaminy i 1x penicylina/streptomycyna) i przejść 1:10 do świeżego 10 cm naczynia z 10 ml kompletnej pożywki.</li>
		<li>W dniu wstrzyknięć przemyj komórki raz 1x PBS i trypsynizuj zgodnie z powyższym opisem.</li>
		<li>Zawiesić trypsynizowane komórki w 8 ml kompletnej pożywki, wirować przez 5 minut w temperaturze 1 500 x g, usunąć pożywkę i ponownie zawiesić w 5 ml 1x PBS.</li>
		<li>Policz komórki na hemocytometrze przy użyciu wykluczenia błękitu trypanowego w celu oceny żywotności. Zawiesić komórki do wstrzykiwań w 1x PBS o określonym stężeniu i objętości. 
		UWAGA: Zalecane jest 5 - 10 μl, ponieważ mniejsze objętości iniekcji zapobiegają niepotrzebnemu uszkodzeniu wątroby.</li>
		<li>Utrzymuj komórki na lodzie przez cały czas trwania wstrzyknięć. Po zakończeniu wstrzykiwań należy zwrócić próbkę komórek do laboratorium i umieścić w hodowli w kompletnych pożywkach na 1 dzień, aby zapewnić żywotność.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść mysz w znieczuleniu z 2 - 2,5% izofluranem (2-chloro-2-(difluorometoksy)-1,1,1-trifluoro-etanem) podawanym w tlenie. Utrzymuj temperaturę ciała za pomocą poduszki grzewczej. Zapewnij całkowite znieczulenie, oceniając reakcję na uszczypnięcie palca u nogi, a następnie utrzymuj znieczulenie na poziomie 2 - 2,5% izofluranu. 
	UWAGA: Ważne jest, aby monitorować częstość oddechów zwierząt i odpowiednio dostosowywać natężenie przepływu izofluranu przez cały czas trwania zabiegu.</li>
	<li>Umieść niewielką ilość sztucznych łez lub maści weterynaryjnej na każdym oku, aby uniknąć nadmiernego wysuszenia oczu podczas zabiegu chirurgicznego.</li>
	<li>Ułóż mysz w pozycji leżącej, na plecach z odsłoniętym brzuchem.</li>
	<li>Usuń włosy z brzusznej lewej strony gryzonia od drugiego żebra w dół do 4. pachwinowego brodawki sutkowej, przecierając ten obszar depilacją chemiczną. Pozostaw depilator na 1-2 minuty, a następnie całkowicie usuń za pomocą gazy iH2O. Ten krok można wykonać 1-2 dni wcześniej, aby zaoszczędzić czas, jeśli planowane są liczne operacje.</li>
	<li>Weź jedną sterylną gąbkę z gazy 2 x 2" (nasączoną 2% chlorheksydyną) i wytrzyj mysz w miejscu depilacji. Wysterylizuj całe otoczenie, w tym ogon, aby zminimalizować zanieczyszczenie bakteryjne narzędzi.</li>
	<li>Przetrzyj miejsce depilacji i okolice wacikiem nasączonym alkoholem.</li>
	<li>Powtórz jeszcze raz kroki z 2% chlorheksydyną i alkoholem, a na koniec przetrzyj je ostatnim wycieraniem chlorheksydyną, co daje w sumie trzy razy 2% chlorheksydynę i dwa płyny nasączone alkoholem. Wykonaj ostatnie przetarcie chlorheksydyną tak, aby substancja chemiczna nie kapała wokół pola operacyjnego, aby uniknąć dostania się chlorheksydyny na narządy wewnętrzne. UWAGA: Stosowanie dużych ilości chlorheksydyny i alkoholu na skórę i otaczającą sierść może spowodować znaczny spadek temperatury ciała. Nie wycieraj nadmiarem głośności podczas czynności 2.7-2.9. Utrzymuj temperaturę ciała za pomocą poduszki grzewczej.</li>
	<li>Używając sterylnych rękawiczek i wysterylizowanego skalpela ze sterylnym ostrzem, wykonaj pojedyncze 1-calowe nacięcie w skórze między płaszczyzną środkową i strzałkową po lewej stronie myszy, zaczynając tuż poniżej żeber i kończąc tuż nad płaszczyzną czwartego smoczka pachwinowego gruczołu sutkowego.</li>
	<li>Używając autoklawowanych lub sterylizowanych koralikami nożyczek i kleszczy, wykonaj podobne 1-calowe nacięcie w otrzewnej. Unikaj wrzynania się w poduszeczkę tłuszczową sutka i upewnij się, że nie przecinasz jelit, wątroby ani przepony.</li>
	<li>Umieść gazik o wymiarach 4 x 4 cale nasączony sterylną solą fizjologiczną po lewej stronie myszy, w miejscu, w którym wykonano nacięcie, tak aby narządy wewnętrzne można było umieścić na gazie i nie stykać się z otaczającą skórą lub obszarem operacyjnym.</li>
	<li>Przygotuj komórki nowotworowe, pipetując kilka razy w górę iw dół, ponieważ komórki nowotworowe osiądą podczas przygotowania myszy. Przygotuj strzykawkę z wyjmowaną igłą o pojemności 25 μl i igłę o rozmiarze 32 z komórkami nowotworowymi. Wcisnąć strzykawkę, aż komórki nowotworowe znajdą się na końcu igły, a tłok znajdzie się w objętości odpowiedniej do wstrzyknięcia; Unikać wstrzykiwania pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Przetrzeć zewnętrzną stronę igły sterylnym wacikiem nasączonym alkoholem, aby usunąć wszelkie zewnętrzne komórki nowotworowe. Należy zachować ostrożność, aby uniknąć ukłuć igłą.</li>
	<li>Przytrzymaj środkową stronę nacięcia, w tym skórę i wyściółkę otrzewnej, na bok za pomocą kleszczy i za pomocą sterylnego bawełnianego wacika ostrożnie wyciągnij jelito grube i cienkie, umieszczając je na sterylnej gazie nasączonej sterylną solą fizjologiczną. Wyciągnij jelito grube i cienkie, aż zostanie uwidoczniona żyła wrotna.</li>
	<li>Przykryj narządy wewnętrzne gazą nasączoną solą fizjologiczną, aby utrzymać wewnętrzną wilgotność i sterylność.</li>
	<li>Poproś asystenta, również w sterylnych rękawiczkach, aby delikatnie przytrzymał jelita owinięte gazą nasączoną solą fizjologiczną za pomocą sterylnego wacika z bawełnianą końcówką, aby całkowicie odsłonić żyłę wrotną. Dodatkowo może być konieczne użycie autoklawowanego hemostatu lub kleszczy, aby odsunąć tkankę na bok po środkowej stronie nacięcia.</li>
	<li>Wbić igłę załadowaną komórkami nowotworowymi ~ 3 - 5 mm do żyły wrotnej ~ 10 mm poniżej wątroby pod kątem < 5° do żyły, skosem skierowanym do góry. Powoli wstrzyknąć pełną objętość zawierającą komórki nowotworowe. Pozwól, aby krew przepływała przez główkę igły przez kilka sekund, aby uniknąć cofania się komórek nowotworowych z żyły. Należy zminimalizować przesuwanie igły w żyle podczas wstrzyknięcia. Również w tym przypadku należy zachować ostrożność, aby uniknąć ukłucia igłą. 
	UWAGA: Wizualizacja żyły wrotnej odbywa się bez powiększenia, jednak w razie potrzeby można użyć mikroskopu stereoskopowego.</li>
	<li>Wyjmij igłę, jednocześnie umieszczając sterylny aplikator z bawełnianą końcówką na żyle z naciskiem. Gdy asystent nadal trzyma jelita na boku, umieść jeden kawałek gazy hemostatycznej o grubości 0,5 - 1cm2 na miejscu wstrzyknięcia na żyle. 
	UWAGA: Próbowano również zastosować proszek hemostatyczny na tym etapie protokołu, ale nie był skuteczny w zatrzymywaniu utraty krwi żylnej po wstrzyknięciu.</li>
	<li>Przytrzymaj gazę hemostatyczną w miejscu wstrzyknięcia, uciskając aplikator z jałową bawełnianą końcówką przez 5 minut.</li>
	<li>Oceń zamknięcie żyły, ostrożnie podnosząc gazę hemostatyczną, jeśli gaza przyklei się do otaczającej tkanki, można użyć niewielkiej ilości sterylnej soli fizjologicznej do namoczenia i podniesienia gazy.</li>
	<li>Jeśli w tym czasie nastąpi utrata krwi, umieść dodatkowy kawałek gazy hemostatycznej w miejscu pod ciśnieniem na dodatkowe 5 minut. Gdy przepływ krwi całkowicie ustaje, usuń gazę z myszy. 
	UWAGA: Utrata krwi podczas zabiegu chirurgicznego musi być dokładnie oceniona, a jeśli całkowita dopuszczalna objętość utraty krwi zostanie osiągnięta lub przekroczona (w oparciu o standardowe procedury operacyjne dla instytucjonalnych komisji rewizyjnych badacza), mysz musi zostać poddana eutanazji w znieczuleniu przez perfuzję serca.</li>
	<li>Gdy miejsce wstrzyknięcia zostanie uznane za nienaruszone, a krew nie opuszcza miejsca wstrzyknięcia, należy delikatnie umieścić narządy wewnętrzne z powrotem w jamie brzusznej.</li>
	<li>Zszyj wyściółkę otrzewnej, a następnie skórę sterylnym szwem vicryl 4-0 i igłą stożkową, używając prostego ciągłego lub przerywanego wzoru szwów. Zazwyczaj zamknięcie nacięcia wymaga założenia 10-15 szwów.</li>
	<li>Wstrzyknąć 100 μl bupiwakainy (5 mg/ml) w miejsce nacięcia w celu miejscowego leczenia bólu za pomocą strzykawki insulinowej. Wstrzyknąć podskórnie 0,5 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z igłą o rozmiarze 26 w celu nawodnienia. Operacje trwają 15 - 25 minut.</li>
	<li>Aby utrzymać sterylne warunki przez cały czas trwania zabiegu, należy upewnić się, że wszystkie narzędzia i materiały mające kontakt z myszą, w tym dłonie w rękawiczkach, są odpowiednio czyszczone przed kontaktem. Jeśli to możliwe, używaj sterylnych materiałów i rękawic lub minimalnie używaj 70% roztworu etanolu lub 10% roztworu wybielacza do czyszczenia.</li>
	<li>Jeśli w jednej sesji planowanych jest wiele operacji, należy przerobić początkowy obszar operacyjny za pomocą świeżej sterylnej serwety, strzykawek insulinowych, strzykawek 1 ml, sterylnej soli fizjologicznej, 2 x 2" sterylnych gąbek z gazy, 4 x 4" sterylnej gazy, gazy hemostatycznej pociętej na 0,5 - 1 cm2 części, 4-0 szwów vicryl z igłą stożkową i 2% chlorheksydyny. Wysterylizuj nożyczki, kleszcze i hemostat koralikami między operacjami i pozwól im odpowiednio ostygnąć przed ponownym użyciem.</li>
</ol>
3. Rekonwalescencja, monitorowanie zdrowia gryzoni i analizy punktów końcowych
<ol>
	<li>Po zakończeniu zabiegu chirurgicznego utrzymuj myszy na poduszce grzewczej w celu powrotu do zdrowia w czystych klatkach bez ściółki przez co najmniej 20 minut. Myszy zwykle potrzebują 2-4 minut, aby obudzić się ze znieczulenia.</li>
	<li>Nie należy zwracać zwierzęcia, które przeszło operację, do wspólnego zamieszkiwania z innymi zwierzętami, dopóki w pełni nie wyzdrowieje ze znieczulenia. Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki, gdy odzyskuje przytomność i monitoruj, dopóki zwierzę nie odzyska zdolności do utrzymania się w pozycji leżącej mostka.</li>
	<li>Podawać myszom 0,05 - 0,1 mg/kg buprenorfiny w celu leczenia bólu co 6-12 godzin po operacji, do 72 godzin.</li>
	<li>Codziennie sprawdzaj szwy, aby upewnić się, że pozostają nienaruszone podczas gojenia. W przypadku, gdy szwy się odczepią, umieść mysz pod narkozą, usuń pozostałe szwy i wymień. W przypadku infekcji lub stanu zapalnego skonsultuj się z personelem weterynaryjnym. 
	UWAGA: W przypadku tego protokołu nie wystąpiła infekcja ani stan zapalny.</li>
	<li>W przypadku badań nad przerzutami należy wykonywać codzienne kontrole stanu zdrowia, dopóki nie zaobserwuje się zewnętrznych objawów choroby z przerzutami, w tym między innymi: >10% utraty/przyrostu masy ciała, niechlujstwa, utraty uwagi do otoczenia, obrzęku brzucha/wodobrzusza, bladych oczu i uszu lub zgarbionej pozycji. 
	UWAGA: Codzienne kontrole stanu zdrowia są szczególnie ważne podczas opracowywania modelu do użytku z nową linią komórkową lub stężeniem komórek, dopóki oś czasu przerzutów nie zostanie dobrze poznana.</li>
	<li>W punkcie końcowym badania poddać myszy eutanazji przez wdychanie CO2 , a następnie zwichnięcie szyjki macicy. 
	UWAGA: Można zastosować alternatywne metody eutanazji zatwierdzone przez komisję nadzorczą badaczy, w tym perfuzję z 1x PBS w znieczuleniu. Perfuzja wątroby odbywa się poprzez kaniulowanie żyły wrotnej, przecięcie żyły głównej dolnej i przepchnięcie 1x PBS przez naczynia krwionośne wątroby z szybkością 4 ml / min przez 1 - 2 minuty w celu usunięcia krążącej krwi i leukocytów. 
	UWAGA: W zależności od punktu końcowego badania, linii komórkowej i zastosowanego stężenia, jawne przerzuty do wątroby mogą, ale nie muszą być widoczne podczas sekcji zwłok. Zmiany mikroprzerzutowe mogą ujawnić się w analizie histologicznej wątroby. Punkty końcowe będą się różnić w zależności od projektu badania.</li>
	<li>Wyciągnij wątrobę nożyczkami i kleszczami, najpierw usuwając woreczek żółciowy, a następnie przecinając żyłę główną dolną górną nad wątrobą. Przeciąć żyłę główną, żyłę wrotną i tętnicę wątrobową dolną do wątroby.</li>
	<li>Delikatnie wyjmij całą wątrobę i umyj 5x w 1x PBS.</li>
	<li>Podziel wątrobę na lewy, prawy, środkowy i ogoniasty płat.</li>
	<li>Formalina utrwala wątrobę w 10% neutralnej buforowanej formalinie przez 48 godzin, wstrząsając w temperaturze pokojowej. Przetwarzaj tkanki za pomocą szeregu alkoholi o rosnącym stężeniu i ksylenu; Parafina zatapia utrwaloną tkankę71, 
	UWAGA: Alternatywnie, wątroba może zostać zamrożona błyskawicznie, umieszczając tkankę w formule kriomoldu o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) i zamrażając na granulkach suchego lodu zanurzonych w 95% etanolu.
	<ol>
		<li>Za pomocą mikrotomu pociąć blok tkanki zatopionej w parafinie tak, aby ujawnił się rozmiar tkanki przypominającej główkę zapałki.</li>
		<li>Wytnij pięć odcinków szeregowych o grubości 4 mikronów, co stanowi pierwszy poziom analizy.</li>
		<li>Przetnij 250 mikronów tkanki, wyrzuć te skrawki do odpadów.</li>
		<li>Przy 250 mikronach wytnij drugi poziom pięciu 4-mikronowych sekcji szeregowych.</li>
		<li>W razie potrzeby powtórz czynność, aby przeciąć całą wątrobę. Hematoksylina i eozyna barwią pierwszą sekcję każdego poziomu w celu oceny przerzutów72, 
		UWAGA: W przypadku tkanek zamrożonych metodą zatrzaskową należy użyć kriostatu do cięcia skrawków. 
		UWAGA: Wykrycie choroby mikroprzerzutowej będzie wymagało barwienia specyficznego dla komórek nowotworowych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuń myszy z badania, jeśli w miejscu nacięcia występuje wzrost guza, ponieważ wskazuje to na wyciek komórek nowotworowych do jamy otrzewnej po wstrzyknięciu. 
	UWAGA: Ten problem nie został zaobserwowany.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia i deklarują brak konkurencyjnych interesów finansowych.

Model iniekcji żyły wrotnej myszy Balb/c pozwala na badanie zmian w raku sutka w wątrobie przy braku zakłócających przerzutów wielonarządowych i u w pełni kompetentnego immunologicznie gospodarza. Nasz protokół jest postępem w stosunku do wcześniej opublikowanych procedur chirurgicznych, które umożliwiają dostęp do żyły wrotnej w celu wstrzyknięcia komórek nowotworowych bezpośrednio do wątroby16,55,56. Jednym z postępów, które poczyniliśmy, jest znaczne zmniejszenie liczby wstrzykiwanych komórek nowotworowych z ≥ 1 x 105 komórek/wstrzyknięcie16,55,56 do ≤ 10 000 komórek nowotworowych/wstrzyknięcie. Rozszerzyliśmy również model do badania przerzutów raka piersi do wątroby. Korzystając z tego protokołu, dwie linie komórkowe raka sutka o znanym potencjale przerzutowym rozwijają przerzuty do wątroby z krótszym opóźnieniem niż bardziej spokojna linia komórkowa guza sutka. Ponadto, we wczesnych punktach czasowych, komórki nowotworowe są rozmieszczone w miąższu wątroby jako pojedyncze lub małe grupy pojedynczych komórek po wstrzyknięciu komórek nowotworowych. Model jest gotowy, aby odpowiedzieć na pytania dotyczące skuteczności przerzutów, w tym wynaczynienia komórek nowotworowych, przeżycia komórek, uśpienia i proliferacji – wszystkich fenotypów, które przyczyniają się do rozwoju choroby mikroprzerzutowej i jawnej przerzutowej w wątrobie.
Ważne jest, aby przed rozpoczęciem badań wziąć pod uwagę wiele aspektów protokołu iniekcji żyły wrotnej. Zdecydowanie zaleca się staranne decydowanie o liniach komórkowych, koncentracji komórek, całkowitej liczbie komórek i punktach końcowych zainteresowania w oparciu o mniejsze badania eksploracyjne. Co więcej, wykorzystanie kompetentnych immunologicznie gospodarzy i syngenicznych linii komórkowych ma ogromne znaczenie dla zrozumienia interakcji gospodarz-komórka nowotworowa. Nowo opracowana mysz ze "świecącą głową", która wyraża eGFP i lucyferazy z przedniego płata przysadki mózgowej, jest ważnym narzędziem do eliminowania odpowiedzi gospodarza na egzogenne eGFP i lucyferazę, białka często używane do oznaczania linii guza sutka75. Użycie myszy ze "świecącą głową" i syngenicznie znakowanych komórek nowotworowych ułatwi łatwą identyfikację pojedynczych komórek rozsianych i ognisk mikroprzerzutowych przez IHC bez obaw o reakcje zapalne na eGFP lub lucyferazy. Podobnie, zdecydowanie zaleca się staranne wybieranie strategii leczenia bólu, aby zapewnić minimalny wpływ leczenia przeciw- lub pronowotworowego. Kluczowe kroki w tym protokole obejmują utrzymanie sterylnych warunków podczas operacji, aby upewnić się, że nie dojdzie do infekcji, ponieważ zakłóci to wszelkie wyniki. Ważne jest również, aby igła była prawidłowo umieszczona w żyle wrotnej, aby zapewnić dostarczenie komórek nowotworowych do wątroby. Praktykowanie protokołu z barwnikami, takimi jak atrament indyjski, pomoże w rozwiązaniu tego problemu. Wzrost guza w miejscu nacięcia skóry jest najlepszym wskaźnikiem, że doszło do nieprawidłowego umieszczenia igły. Wreszcie, bardzo ważne jest, aby utrata krwi z żyły wrotnej była odpowiednio kontrolowana i całkowicie ustała przed zszyciem zwierzęcia. Stosowanie gazy hemostatycznej znacznie zmniejsza ryzyko niekontrolowanej utraty krwi z żyły wrotnej po wstrzyknięciu. W naszych rękach śmiertelność związana z procedurą z powodu utraty krwi z żyły wrotnej po wstrzyknięciu została zmniejszona z 30% do 2% myszy przy użyciu gazy hemostatycznej.
Ważne jest, aby pamiętać, że model iniekcji żyły wrotnej nie replikuje pełnej kaskady przerzutowej, ale ogranicza się do badania wynaczynienia komórek nowotworowych, interakcji komórka nowotworowa - nisza po wynaczynieniu i wzroście guza. Pilnie potrzebne są modele, które dokładnie odwzorowują pełną kaskadę przerzutów do wątroby, taką jak ma to miejsce u pacjentów. Dodatkowym ograniczeniem modelu iniekcji żyły wrotnej jest to, że jest on zaburzony przez wpływ operacji na gospodarza, przy czym gojenie się ran wpływa na postęp choroby76,77.
Model iniekcji żyły wrotnej stanowi ulepszenie w stosunku do innych modeli iniekcji do badania przerzutów do wątroby, w tym modeli wewnątrzsercowych i wewnątrzśledzionowych. W szczególności model iniekcji żyły wrotnej pozwala na badanie szerszego zakresu progresji choroby niż model wewnątrzsercowy, który często jest ograniczony przez współistniejące przerzuty w innych tkankach. Co więcej, model żyły wrotnej nie jest skomplikowany przez usunięcie śledziony, jak ma to miejsce w modelu wewnątrzśledzionowym.
Model iniekcji żyły wrotnej może okazać się użytecznym narzędziem do badania przerzutów do wątroby w ogóle. Przerzuty do wątroby są najczęstszym miejscem przerzutów w gruczolakorakach ogółem, ze szczególnie wysokimi wskaźnikami w przypadku raka trzustki (85% przerzutów do wątroby), gruczolakoraka jelita grubego i odbytnicy (>70%), a także żołądka i przełyku (>30%)1. Chociaż spontaniczne i ortotopowe modele guzów pierwotnych gruczolakoraka trzustki i jelita grubego łatwiej dają przerzuty do wątroby78,79, model iniekcji żyły wrotnej może okazać się przydatny do zrozumienia procesu przerzutowego tych nowotworów, ponieważ kontrolowane dostarczanie komórek nowotworowych pozwala na ocenę biochemiczną, molekularną i histologiczną w określonym czasie po przybyciu komórek nowotworowych. Podsumowując, model iniekcji żyły wrotnej stanowi istotną poprawę w stosunku do dostępnych modeli przerzutów raka piersi do wątroby i może mieć również zastosowanie do pola przerzutów do wątroby w ogóle.

Rak piersi z przerzutami do wątroby
Wątroba jest częstym miejscem przerzutów raka piersi, wraz z kośćmi i płucami1-3. Przerzuty do wątroby u pacjentek z rakiem piersi są niezależnym czynnikiem prognostycznym dla bardzo złych wyników4,5, ponieważ mediana przeżycia pacjentek z rakiem piersi z przerzutami do wątroby wynosi od 4,8 do 15 miesięcy6-9. Natomiast u pacjentek z rakiem piersi z przerzutami do płuc lub kości mediana przeżycia wynosi odpowiednio od 9 do 27,4 miesiąca (8,9 i od 16,3 do 56 miesięcy) (8,10-12 miesięcy). Przerzuty to wieloetapowy proces, określany jako kaskada przerzutowa, który rozpoczyna się od rozsiewu komórek nowotworowych w guzie pierwotnym, a kończy się śmiertelnością pacjenta z powodu wysiewu i wyrastania krążących komórek nowotworowych w odległym narządzie13-15. Modele przerzutów u gryzoni ujawniły, że kaskada przerzutów jest wyjątkowo nieefektywna, a tylko 0,02 - 10% krążących komórek nowotworowych tworzy jawne przerzuty16,17. Jednym z głównych wąskich gardeł nieskuteczności przerzutów są unikalne mikrośrodowiska tkankowe w miejscach wtórnych, zwane niszami przerzutowymi18, co podkreśla znaczenie zrozumienia przerzutów specyficznych dla danego miejsca. Nisza przerzutowa jest unikalna dla miejsca nawrotu i częściowo charakteryzuje się odkładaniem się odrębnych białek macierzy zewnątrzkomórkowej19,20, infiltracją różnych populacji komórek odpornościowych21-23 i zmienioną homeostazą tkanek, w tym rozregulowaną produkcją licznych cytokin, chemokin i czynników wzrostu15,18,24,25. W ten sposób zrozumienie specyficznej tkankowo niszy przerzutów poprzedza zrozumienie, jak celować w chorobę przerzutową. Brakuje jednak solidnych modeli przerzutów do wątroby. Co więcej, ulepszone modele przerzutów do wątroby będą miały zasadnicze znaczenie dla identyfikacji nowych celów i skutecznych metod leczenia pacjentek z rakiem piersi z przerzutami do wątroby.
Sprawdzone modele do badania przerzutów raka piersi do wątroby
Obecnie dostępne modele do badania przerzutów raka piersi do wątroby obejmują ksenografty ludzkich komórek rakowych u myszy z obniżoną odpornością. Modele te zazwyczaj wykorzystują dobrze zbadane linie komórkowe ludzkiego raka piersi, takie jak MCF-7 i MDA-MB-231 oraz mysi gospodarze Nude, Rag1-/- lub SCID z obniżoną odpornością26-29. Modele ksenoprzeszczepów mają tę zaletę, że obejmują linie komórek nowotworowych pochodzenia ludzkiego, jednak biorąc pod uwagę niedawne uznanie dla komórek odpornościowych w przerzutach30-32 i oporności terapeutycznej33-35, badanie przerzutów u w pełni kompetentnego immunologicznie gospodarza ma kluczowe znaczenie. Modele do badania przerzutów raka piersi do wątroby u gospodarzy kompetentnych immunologicznie obejmują ortotopowe wstrzykiwanie syngenicznych komórek nowotworowych (np. linii komórkowych 4T1 i D2A1) do poduszeczki tłuszczowej sutka, z chirurgiczną resekcją guza pierwotnego lub bez niej, a następnie ocenę przerzutów36-38. Warto zauważyć, że częstość przerzutów do wątroby z modeli przeszczepów ortotopowych jest bardzo niska lub nie występuje wcale w porównaniu z innymi miejscami przerzutów, takimi jak płuca39,40, lub występuje po ustaleniu przerzutów do płuc, co komplikuje badanie przerzutów specyficznych dla wątroby37,39.
Eksplantaty guza ze spontanicznie genetycznie modyfikowanych modeli raka piersi mogą być ponownie wstrzykiwane do poduszeczek tłuszczowych ssaków naiwnych gospodarzy jako syngeniczne komórki nowotworowe. Na przykład niedawno doniesiono, że spontaniczne guzy myszy K14CreECadf / fP53f / f, które modelują inwazyjnego raka zrazikowego piersi, rozwijają guzy po ortotopowym wstrzyknięciu do gospodarzy typu dzikiego. Po chirurgicznej resekcji tych guzów po osiągnięciu 15 mm2, u 18% myszy doszło do przerzutów do wątroby40,41. Trzecie podejście do modelowania przerzutów do wątroby wykorzystuje spontaniczne przerzuty u genetycznie zmodyfikowanych myszy. Do tej pory doniesienia o spontanicznych mysich modelach przerzutów raka piersi, które łatwo rozprzestrzeniają się do wątroby, są rzadkie. Wyjątki obejmują H19-IGF2, p53fp/fp MMTV-Cre Wap-Cre i K14CreECadf/fP53f/f genetycznie modyfikowane modele myszy, w których przerzuty do wątroby rozwijają się u niewielkiego odsetka myszy38,41-43. Tak więc, podczas gdy genetycznie modyfikowane modele myszy ułatwiają badanie wszystkich etapów kaskady przerzutowej, dostarczając potężnych i klinicznie istotnych modeli, są one ograniczone ze względu na niskie wskaźniki przerzutów do wątroby38.
Kilka modeli przerzutów omija początkowe etapy kaskady przerzutowej, w tym rozsiewanie komórek nowotworowych z guza pierwotnego i wewnątrznaczynienie. Modele te pozwalają na badanie późniejszych etapów kaskady przerzutowej, od wynaczynienia do powstania guzów w miejscach wtórnych. Model iniekcji dosercowej dostarcza komórki nowotworowe do lewej komory, która rozprowadza komórki nowotworowe do układu krążenia przez aortę. Wstrzyknięcie dosercowe wymaga obrazowania miejsca wstrzyknięcia pod kontrolą USG lub innych metod obrazowania, takich jak bioluminescencja komórek znakowanych lucyferazy, w celu potwierdzenia udanego wstrzyknięcia. Wstrzyknięcie komórek nowotworowych przez lewą komorę może spowodować przerzuty do kości, mózgu, płuc i/lub wątroby, między innymi44-48. Z powodu przerzutów wielonarządowych, myszy te często muszą zostać poddane eutanazji przed rozwojem jawnych przerzutów do wątroby, negując zdolność do pełnego zbadania wzrostu przerzutów w wątrobie. Alternatywnym podejściem, które znacznie minimalizuje rozwój przerzutów wielomiejscowych, jest model iniekcji dośledzionowej. Wstrzyknięcie dośledzionowe dostarcza komórki nowotworowe przez żyłę śledzionową, która łączy się z żyłą krezkową górną, tworząc żyłę wrotną49,50. Zwierzęta mogą być monitorowane pod kątem rozrostu zmian przerzutowych w wątrobie, ponieważ powstawanie przerzutów w innych miejscach jest rzadkie, w wyniku czego ogólny stan zdrowia zwierzęcia jest utrzymany49,50. Należy jednak zauważyć, że model wewnątrzśledzionowy wymaga splenektomii, aby uniknąć guzów śledziony49,50, procedury, która wpływa na funkcje odpornościowe. Na przykład uszkodzenie reperfuzyjne niedokrwienne mięśnia sercowego charakteryzuje się naciekaniem podzbiorów monocytów Ly6C +, które pochodzą ze śledziony i są odpowiedzialne za aktywność fagocytarną i proteolityczną podczas gojenia się ran po niedokrwieniu51,52. W przypadku splenektomii obserwuje się zmniejszenie populacji monocytów, które pomagają w gojeniu się ran52. Ponadto wykazano, że splenektomia zmniejsza wzrost guza pierwotnego i przerzuty do płuc w modelu niedrobnokomórkowego raka płuca, w szczególności poprzez zmniejszenie liczby krążących i wewnątrzguzowych komórek monocytowych mieloidalnych CCR2 + CD11b + Ly6C + 53. Ponadto splenektomia po wstrzyknięciu dośledzionowym komórek raka jelita grubego spowodowała obniżenie poziomu przeciwnowotworowych komórek NK w krezkowych węzłach chłonnych i zwiększenie przerzutów do wątroby54. Podsumowując, odkrycia te sugerują, że splenektomia upośledza rolę układu odpornościowego, co z kolei ma konsekwencje dla losu komórek przerzutowych.
Model iniekcji żyły wrotnej z przerzutami do wątroby
Aby zbadać przerzuty raka piersi do wątroby u w pełni kompetentnego immunologicznie gospodarza, w warunkach, w których myszy nie są zagrożone z powodu przerzutów wielonarządowych, opracowano model iniekcji żyły wrotnej. Modele iniekcji wewnątrzwrotnej były wcześniej wykorzystywane do badania przerzutów do wątroby linii komórkowychjelita grubego 55,56 i czerniaka16; W tym miejscu opisano zastosowanie iniekcji wewnątrzwrotnej do modelowania przerzutów do komórek nowotworowych sutka. Model ten może być wykorzystany do badania późniejszych etapów kaskady przerzutów, w tym wynaczynienia i wysiewu komórek raka piersi, decyzji o losie komórek nowotworowych dotyczących śmierci/proliferacji/uśpienia oraz wzrostu do jawnych zmian. W tym modelu syngeniczne linie komórkowe guza sutka są wstrzykiwane przez żyłę wrotną kompetentnych immunologicznie samic myszy Balb / c, metoda, która dostarcza komórki nowotworowe najpierw i bezpośrednio do wątroby bez usuwania śledziony. Aby opracować ten model, wykorzystano cztery linie komórek guza sutka, które mają zdolność przerzutową od niskiej do wysokiej: D2.OR, D2A1 i 4T1, a także wykorzystano D2A1 znakowane zielonym białkiem fluorescencyjnym (D2A1-GFP) w celu zbadania wczesnych punktów czasowych po wstrzyknięciu komórek nowotworowych. 4T1 to wysoce przerzutowa linia komórkowa pochodząca z guza 410.4, która spontanicznie powstała u samicy myszy MMTV+ Balb / c36,37 i daje przerzuty do płuc, wątroby, mózgu i kości z guzów pierwotnych poduszeczki tłuszczowej sutka39,57,58. Komórki nowotworowe D2A1 również pierwotnie pochodziły z spontanicznego guza sutka powstającego w gospodarzu Balb / c po przeszczepie hiperplastycznych komórek guzków pęcherzykowych D2 i potwierdzono, że są przerzutowe z guza pierwotnego do płuc59,60. Komórki nowotworowe D2.OR są nieprzerzutową linią siostrzaną do linii D2A1 i chociaż uciekają z guza pierwotnego i docierają do miejsc wtórnych, rzadko tworzą odległe przerzuty60,61.
Dodatkowo, ważne jest, aby unikać powszechnie stosowanych leków przeciwbólowych, w tym niesteroidowych leków przeciwzapalnych (NLPZ) podczas lub po zabiegu chirurgicznym. NLPZ mają działanie przeciwnowotworowe w niektórych nowotworach piersi62-65, a niektóre klasy NLPZ zwiększają ryzyko hepatotoksyczności66,67, potencjalnie zagrażając badaniu przerzutów do wątroby i niszy przerzutów do wątroby. Ponadto badania sugerują, że NLPZ bezpośrednio wpływają na mikrośrodowisko tkanek, redukując proprzerzutowe białka macierzy zewnątrzkomórkowej tenascynę-C68 i kolagen fibrylarny62,65. Alternatywnie, zastosowanie pochodnej opioidów, buprenorfiny, zastosowano ze względu na jej skuteczność w leczeniu bólu u gryzoni69 oraz ze względu na brak dowodów na to, że opioidy mają działanie przeciwnowotworowe70. Ten model iniekcji żyły wrotnej został zoptymalizowany pod kątem mniejszych objętości wstrzyknięć wynoszących 5 - 10 μl, aby uniknąć niepotrzebnego uszkodzenia wątroby. Model został również zoptymalizowany pod kątem igieł o mniejszej średnicy (≥ 32 mm) i użycia gazy hemostatycznej bezpośrednio po wstrzyknięciu, aby zminimalizować utratę krwi podczas zabiegu. W przeciwieństwie do tych zoptymalizowanych parametrów iniekcji, liczba komórek powinna być określana indywidualnie, w oparciu o potencjał rakotwórczy linii komórkowej. Jednak w przypadku badań długoterminowych zaleca się rozpoczęcie od ≤ 10 000 komórek/wstrzyknięcie. W przypadku krótszych punktów końcowych (np. 24 godziny po wstrzyknięciu) można użyć znacznie więcej komórek nowotworowych (np. 1 x 105 - 1 x 106), jeśli jest to uzasadnione. Podsumowując, opisany tutaj model iniekcji żyły wrotnej stanowi przydatne narzędzie do badania przerzutów raka piersi do wątroby i omija szereg ograniczeń innych modeli przerzutów do wątroby. Model ten ułatwia badania nad wynaczynieniem komórek nowotworowych, siewem, wczesnymi decyzjami losu dotyczącymi przeżycia, proliferacji i spoczynku oraz przerzutowym wzrostem u mysich gospodarzy kompetentnych immunologicznie.

<table><tbody><tr><td>Strzykawka 1 ml z igłą o rozmiarze 26</td><td>Strzykawka BD</td><td>309597</td><td>Do podskórnego wstrzykiwania buprenorfiny; zachowaj ostrożność, ostre</td></tr><tr><td>Pady nasączone alkoholem</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-669-62</td><td>Do czyszczenia brzucha przed nacięciem chirurgicznym</td></tr><tr><td>Gąbki uniwersalne, sterylne</td><td>Kendall</td><td>8044</td><td>4 "x 4", użyj zanurzone w sterylnym soli fizjologicznej, aby chronić i nawodnić jelito grube i cienkie podczas chirurgia</td></tr><tr><td>Sztuczne łzy</td><td>Rugby</td><td>370114</td><td>Olej mineralny 15%, wazelina biała 83%; stosować do ochrony oczu podczas operacji</td></tr><tr><td>Buprenorfina HCl, 0,3 mg/ml</td><td>Mfg. przez Reckitt Benckiser</td><td>NDC-12496-0757-1</td><td>Stosować w dawce 0,05 - 0,1 mg/kg masy ciała, 1 - 2x dziennie przez 72 godziny, wstrzykiwany podskórnie</td></tr><tr><td>Chlorowodorek bupiwakainy, 0,5% (5 mg / ml)</td> <td>Mfg. firmy Humira Inc</td><td>NDC-04091163-01</td><td>Stosować w dawce 0,5%, 1x bezpośrednio po zabiegu, 10 &mu; l wstrzykiwany podskórnie w miejscu nacięcia&nbsp;</td></tr>przeciwciało <tr><td>anty-CD45</td><td>BD Pharmingen</td><td>550539</td><td>Zastosowanie w immunofluorescencji multipleksowej w celu wykluczenia leukocytów w identyfikacji ognisk przerzutowych</td></tr><tr><td>Celox&trade; Szybka gaza hemostatyczna</td><td>Medtrade Products Ltd.</td><td>FG08839011</td><td>Pokrój na 5 mm i sup2; kawałki, użyj do zatrzymania przepływu krwi z żyły wrotnej za pomocą ciśnienia po wstrzyknięciu</td></tr><tr><td>Depilacja</td><td></td><td></td> chemiczna <td>Służy do usuwania włosów z obszaru chirurgicznego; wielu dostawców</td></tr><tr><td>Chlorheksydyna, 2% roztwór</td><td>Vet One</td><td>1CHL008</td><td>Zachowaj ostrożność, nie dostajesz chlorheksydyny do błon śluzowych lub uszu myszy</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-CK18</td><td>Abcam</td><td>ab53118</td><td>Stosować w immunofluorescencji multipleksowej do identyfikacji ognisk przerzutowych</td></tr><tr><td>Aplikatory z bawełnianą końcówką, sterylne</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-114</td><td>6-calowy drewniany trzonek 2 szt./koperta</td></tr><tr><td>DMEM, hyklon o wysokiej zawartości glukozy</td><td></td><td>SH30243.01</td><td>Baza do hodowli komórkowych do stosowania z liniami komórkowymi guza sutka D2A1, D2.OR i 4T1</td></tr><tr><td>Sterylizator</td><td></td><td></td> <td>suchych szklanych kulekUżywaj między operacjami do sterylizacji narzędzi ze stali nierdzewnej, zachowaj ostrożność, bardzo gorące; wielu dostawców</td></tr><tr><td>Etanol, roztwór</td><td></td><td></td> 70% <td>Zachowaj ostrożność łatwopalny; służy do czyszczenia obszaru operacyjnego w razie potrzeby; wielu dostawców</td></tr><tr><td>Hyklon</td><td>surowicy bydlęcej płodu</td><td>SH30071.03</td><td>Dodatek do pożywki do hodowli komórkowych do stosowania z liniami komórkowymi guza sutka D2A1, D2.OR i 4T1, stosować w stężeniu 10% w DMEM gaza o wysokiej zawartości glukozy</td></tr><tr><td>, sterylny</td><td>Kendall</td><td>2146</td><td>2 "x 2", użyć zanurzonego w 2% roztworze chlorheksydyny do czyszczenia brzucha przed nacięciem chirurgicznym</td></tr><tr><td>przeciwciało anty-Green Fluorescencyjne białko</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA0702</td><td>Służy do barwienia dla oznaczonych GFP D2A1 lub innych linii komórkowych guza sutka</td></tr><tr><td>L-Glutamina 200 mM (100x)</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>Dodatek do pożywek do hodowli komórkowych do stosowania z liniami komórkowymi guza sutka D2A1, D2.OR i 4T1, stosować przy 2 mM (1x) w DMEM Podkładka grzewcza o wysokim poziomie glukozy</td></tr><tr><td>, x 2 - 3</td><td></td><td></td><td>Służy do utrzymania ciepła ciała podczas operacji i rekonwalescencji; wielu dostawców</td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>Hausser Scientific</td><td>1483</td><td>Do stosowania w hodowli komórkowej do liczenia komórek</td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td></td><td></td> hemostatyczne <td>Stal nierdzewna; wielu dostawców</td></tr><tr><td>przeciwciało anty-Heppar-1</td><td>Dako</td><td>M7158</td><td>Stosować w immunofluorescencji multipleksowej w celu wykluczenia hepatocytów w identyfikacji ognisk przerzutowych</td></tr><tr><td>Strzykawka insulinowa, 0,3 ml, BD o rozmiarze 29</td><td> &nbsp;</td><td>324702</td><td>Do wstrzykiwań bupiwakainy w miejscu szwu; należy zachować ostrożność, ostry</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Piramal</td><td>NDC-66794-017-25</td><td>podawany w dawce 2,5%</td></tr> <tr><td>parownika izofluranu</td><td>VetEquip</td><td>911103</td><td>Zachowaj ostrożność, odparowuje gazy znieczulające</td></tr><tr><td>Źródło</td><td></td><td></td> światła <td>Służy do wizualizacji pola operacyjnego; wielu dostawców</td></tr><tr><td>Neutralna buforowana formalina, 10%</td> <td>Anatech Ltd.</td><td>135</td><td>Stosować ostrożnie, toksycznie; stosować jako utrwalacz tkankowy do punktów końcowych przerzutów i oceny obciążenia przerzutami za pomocą histologii</td></tr><tr><td>Opal&trade; 4-kolorowy zestaw fIHC</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>NEL794001KT</td><td>Stosować do multipleksowej immunofluorescencji Heppar-1 / CD45 / CK18 w celu wykrycia przerzutów w mysiej</td></tr><tr><td>wątrobie Nożyczki</td><td></td><td></td> operacyjne <td>Stal nierdzewna; Używaj ostrożności, ostry; wielu dostawców</td></tr><tr><td>Penicylina / Streptomycyna, 100x</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td>Dodatek do pożywki do hodowli komórek do stosowania z liniami komórkowymi guza sutka D2A1, D2.OR i 4T1, stosować w dawce 1x w DMEM Sól</td></tr><tr><td>fizjologiczna buforowana fosforanami o wysokiej zawartości glukozy</td><td></td><td></td><td>Stosować w 1x do ponownego zawieszania komórek nowotworowych przed wstrzyknięciem, wielu dostawców</td></tr><tr><td>Wyjmowana strzykawka igłowa, 25 i mu; l, Model 1702</td><td>Hamilton</td><td>7654-01</td><td>Do wstrzykiwania żyły wrotnej; zachowaj ostrożność, szczególnie podczas pracy z igłami załadowanymi komórkami nowotworowymi, ostrymi, gdy igła jest przymocowana</td></tr><tr><td>Rękojeść</td><td></td><td></td> skalpela <td>Stal nierdzewna; wielu dostawców</td></tr><tr><td>Ostrze skalpela, #15</td><td></td><td></td><td>Stal węglowa, sterylne, rozmiar 15; wielu dostawców</td></tr><tr><td>Małe wyjmowane igły do piasty, rozmiar 32 Hamilton</td><td></td><td>7803-04</td><td>Do iniekcji żyły wrotnej, długość 1", styl punktowy 4, 12&deg; można również używać igieł wielokrotnego użytku o rozmiarze od 33 do 34; Zachowaj ostrożność, szczególnie podczas pracy z igłami załadowanymi komórkami nowotworowymi, ostrymi</td></tr><tr><td>Podchloryn</td><td></td><td></td> sodu <td>Używaj ostrożności,; stosować w dawce 10% do dezynfekcji miejsca pracy i powierzchni, wielu dostawców</td></tr><tr><td>Sterylny roztwór soli fizjologicznej</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td>0,9% roztwór NaCl; alternatywnie może być domowej roboty i sterylnie filtrowany</td></tr><tr><td>Rękawice chirurgiczne, sterylne</td><td></td><td></td><td>Wielu dostawców</td></tr><tr><td>Szwy sterylne&nbsp;</td><td>Ethicon</td><td>J310H</td><td>4-0 27" powlekany vicryl z igłą 22 mm 1/2c stożkową ze stopu etystopu; Zachowaj ostrożność, sharp</td></tr><tr><td>Przenośna maszyna anestezjologiczna</td><td>VetEquip</td><td>901801</td><td>Używaj z parownikiem izofluranowym do znieczulenia myszy</td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td></td><td></td> opatrunkowe do kciuków <td>Stal nierdzewna, ząbkowana, stępiona; wielu dostawców</td></tr><tr><td>Zasłony na ręczniki, sterylne&nbsp;</td><td>Dynarex</td><td>4410</td><td>18" x 26", do pokrycia poduszki grzewczej i zapewnienia sterylnego miejsca pracy podczas operacji</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Life Technologies</td><td>T10282</td><td>Do stosowania w hodowli komórkowej w celu oceny żywotności należy stosować 1:1 z komórkami w 1x PBS</td></tr><tr><td>Trypsin / EDTA, 0,05% (1x)</td> <td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>Stosować w hodowli komórkowej do odłączania komórek nowotworowych od płytek do hodowli tkankowych</td></tr></tbody></table>

model iniekcji żyły wrotnej do badania przerzutów raka piersi do wątroby

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

Rak piersi jest główną przyczyną zgonów związanych z rakiem wśród kobiet na całym świecie. Przerzuty do wątroby są zaangażowane w ponad 30% przypadków z przerzutami raka piersi i skutkują słabymi wynikami z medianą przeżycia wynoszącą zaledwie 4,8 - 15 miesięcy. Obecne modele gryzoni z przerzutami raka piersi, w tym ksenoprzeszczep pierwotnych komórek nowotworowych i spontaniczne modele nowotworów, rzadko dają przerzuty do wątroby. Modele iniekcji dosercowej i dośledzionowej powodują przerzuty do wątroby, jednak modele te mogą być mylone przez współistniejące przerzuty do miejsca wtórnego lub przez osłabioną odporność z powodu usunięcia śledziony, aby uniknąć wzrostu guza w miejscu wstrzyknięcia. Aby zaspokoić zapotrzebowanie na ulepszone modele przerzutów do wątroby, opracowano metodę wstrzykiwania żyły wrotnej myszy, która dostarcza komórki nowotworowe najpierw i bezpośrednio do wątroby. Model ten dostarcza komórki nowotworowe do wątroby bez powikłań związanych z równoczesnymi przerzutami do innych narządów lub usunięciem śledziony. Zoptymalizowany protokół żyły wrotnej wykorzystuje małe objętości iniekcji 5 - 10 μl, ≥ igieł o rozmiarze 32 i gazę hemostatyczną w miejscu wstrzyknięcia w celu kontroli utraty krwi. Przetestowano metodę iniekcji żyły wrotnej u samic myszy Balb/c przy użyciu trzech syngenicznych linii guza sutka o różnym potencjale przerzutowym; komórki 4T1 o wysokich przerzutach, komórki D2A1 o umiarkowanych przerzutach i komórki D2.OR o niskim przerzutach. Stężenie ≤ 10 000 komórek/wstrzyknięcie powoduje opóźnienie ~ 20 - 40 dni w przypadku rozwoju przerzutów do wątroby z wyższymi przerzutami linii 4T1 i D2A1 oraz > 55 dni w przypadku mniej agresywnej linii D2.OR. Model ten stanowi ważne narzędzie do badania przerzutów raka piersi do wątroby i może mieć zastosowanie do innych nowotworów, które często dają przerzuty do wątroby, w tym gruczolakoraka jelita grubego i trzustki.

Model wstrzykiwania do żyły wrotnej, w którym komórki nowotworowe są dostarczane bezpośrednio do wątroby za pomocą zabiegu chirurgicznego, umożliwia wstrzyknięcie komórek nowotworowych do żyły wrotnej. W warunkach antyseptycznych, u znieczulonej myszy, wykonuje się ok. 1-calowe cięcie chirurgiczne po lewej stronie myszy pomiędzy płaszczyznami środkową a strzałkową, zaczynając tuż powyżej poziomu sutka czwartej gruczołu mlekowego pachwinowego i kończąc tuż poniżej żeber. Jelita grube i cienkie są delikatnie wysuwane przez nacięcie w celu wizualizacji żyły wrotnej (Rysunek 1A). Prawidłowa identyfikacja anatomiczna żyły wrotnej oraz pomyślne wstrzyknięcie wewnątrzportalne można potwierdzić, ćwicząc protokół wstrzykiwania za pomocą tuszu indyjskiego lub podobnego barwnika. Prawidłowe wstrzyknięcie przez żyłę wrotną spowoduje natychmiastowe i specyficzne dostarczenie tuszu do wątroby i nie spowoduje rozprzestrzenienia się tuszu indyjskiego do płuc (Rysunek 1B). Ponadto, przy użyciu komórek guza piersi myszy D2A1 znakowanych GFP, rozprzestrzenienie komórek nowotworowych w całej wątrobie jest widoczne dziewięćdziesiąt minut po wstrzyknięciu, co potwierdza dostarczenie komórek do wątroby poprzez żyłę wrotną (Rysunek 1C). Przy większym powiększeniu staje się jasne, że 90 min po wstrzyknięciu komórki nowotworowe znajdują się w obrębie sinusoid oraz w miąższu wątroby w bliskim sąsiedztwie triad wrotnych, gdzie krew z żyły wrotnej wpływa do wątroby (Rysunek 1C). Dane te sugerują, że w 90 min po wstrzyknięciu komórek nowotworowych zachodzi aktywna ekstrawasacja komórek nowotworowych. Podsumowując, dane te potwierdzają, że model wstrzykiwania do żyły wrotnej dostarcza objętość wstrzykniętej substancji bezpośrednio do wątroby, przy czym tusz lub komórki nowotworowe rozprzestrzeniają się w całej wątrobie, bez zauważalnego transportu objętości wstrzykniętej do płuc.
Aby ocenić odporność modelu wstrzykiwania do żyły wrotnej, przetestowano trzy oddzielne syngeneiczne linie komórek nowotworowych gruczołu mlekowego myszy u dorosłych samic myszy Balb/c. Linie nowotworowe gruczołu mlekowego wybrano na podstawie ich opisanego zachowania w modelach poduszki tłuszczowej gruczołu mlekowego; obejmują one wysoce agresywną i przerzutową linię komórkową 4T1, mniej agresywną linię przerzutową D2A1 oraz linię o niskim potencjale przerzutowym lub nieprzerzutową D2.OR37,61,73,74. Przetestowano dawki 2 000 oraz 10 000 komórek na wstrzyknięcie, nie stwierdzając istotnych różnic w czasie rozwoju jawnych przerzutów przy tych niskich stężeniach komórek. W badaniach tych wykorzystano zastępcze markery przerzutowania, takie jak brak pielęgnacji, bladość i utrata masy ciała, aby uzasadnić przeprowadzenie nekropsji, podczas której obecność lub brak przerzutów do wątroby potwierdzono poprzez ocenę wizualną wątroby i innych organów w celu potwierdzenia podania wewnątrz wrotnego. Dane te potwierdzają wcześniejsze doniesienia, że linie komórkowe 4T1 i D2A1 reprezentują bardziej agresywne linie nowotworowe gruczołu mlekowego, ponieważ obserwuje się krótszy czas przeżycia wolnego od przerzutów w porównaniu z myszami, którym wstrzyknięto mniej agresywną linię D2.OR (Ryc. 2A). U myszy, którym wstrzyknięto komórki nowotworowe 4T1 lub D2A1, jawne przerzuty do wątroby rozwinęły się około 30–40 dni po wstrzyknięciu, a u niektórych przerzuty pojawiły się już 18 dni po wstrzyknięciu (Ryc. 2A), podczas gdy tylko u jednej myszy po wstrzyknięciu komórek D2.OR rozwinęły się jawne przerzuty do wątroby do końca badania, który przypadał na 60–65 dni po wstrzyknięciu komórek nowotworowych. Przerzuty potwierdzono następnie poprzez wykonanie seryjnych przekrojów wątroby w odstępach 250 µm i analizę preparatów barwionych hematoksyliną i eozyną (H&amp;E) (Ryc. 2B-D).
Oprócz wykrywania jawnych zmian przerzutowych w wątrobie myszy, model żyły wrotnej może być również wykorzystywany do badania wcześniejszych zdarzeń w kaskadzie przerzutowania, w tym wykrywania pojedynczych komórek/zbiorów komórek po ekstrawazacji oraz tworzenia się zmian mikroprzzerzutowych. Do wykrywania komórek guzów piersi 4T1, D2A1 i D2.OR w wątrobie, gdy występują one jako pojedyncze komórki lub zmiany mikroprzzerzutowe, zastosowano multipleksowe barwienie immunofluorescencyjne, ponieważ barwienie H&amp;E jest niewystarczające do potwierdzenia obecności małych zmian. Rysunek 3A przedstawia reprezentatywną wątrobę myszy Balb/c z domniemanym ogniskiem mikroprzzerzutowym komórek nowotworowych D2A1, które są dodatnie pod kątem keratyny nabłonkowej CK18, ujemne pod kątem pan-immunologicznego markera CD45 i ujemne pod kątem markera hepatocytów Heppar-1. Hepatocyty również barwią się dodatnio na CK18, co wymusza zastosowanie Heppar-1 w tym panelu barwień. Ważną uwagą jest fakt, że nabłonek przewodów żółciowych i komórki progenitorowe wątroby barwią się dodatnio na CK18, co wymaga starannego odróżnienia komórek nowotworowych od przewodów żółciowych, szczególnie podczas oceny obszarów okołowrotnych (Rysunek 3A). Alternatywą dla multipleksowej immunofluorescencji w identyfikacji pojedynczych komórek rozsianych i ognisk mikroprzzerzutowych jest wykorzystanie syngeneicznych linii guzów piersi znakowanych wzmocnionym zielonym białkiem fluorescencyjnym (eGFP) i/lub lucyferazą oraz przeprowadzenie IHC dla tego znacznika (Rysunek 1C). Ze względu na immunogenność eGFP, lucyferazy i innych białek, niezbędne jest stosowanie modeli mysich tolerancyjnych na te białka, takich jak nowoczesna mysz immunokompetentna „glowing head”, która wykazuje ekspresję eGFP i lucyferazy w przednim płacie przysadki mózgowej75. Do identyfikacji zmian makroprzerzutowych nieznakowanych linii syngeneicznych, takich jak linia nowotworowa D2A1, idealna jest multipleksowa immunofluorescencja CK18/Heppar-1/CD45 (Rysunek 3B). 
<img alt="Schemat wstrzyknięcia do żyły wrotnej wątroby oraz wyniki dla PBS i tuszu chińskiego w wątrobie, analiza histologiczna wątroby." src="/files/ftp_upload/54903/54903fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Wstrzyknięcie do żyły wrotnej dostarcza komórki nowotworowe bezpośrednio do wątroby. A) Wstrzyknięcie do żyły wrotnej; nacięcie wykonuje się pomiędzy medianą a lewym płaszczyzną strzałkową, od powyżej płaszczyzny czwartej suteczki gruczołu piersiowego pachwinowego, kończąc tuż poniżej klatki piersiowej. B) Wątroba myszy Balb/c po wstrzyknięciu PBS (lewo). Po wstrzyknięciu tuszu chińskiego przez żyłę wrotną, wątroba (środek), ale nie płuco (prawo), przyjmuje tusz. C) Reprezentatywne obrazy cienkich przekrojów komórek nowotworowych gruczołu piersiowego myszy D2A1 znakowanych GFP w wątrobie myszy Balb/c w 90 min po wstrzyknięciu 1 x 106 komórek nowotworowych przez żyłę wrotną. Wątroby utrwalono w formalinie, zatopiono w parafinie, pocięto i zabarwiono przeciwciałem anty-GFP w celu wykrycia komórek nowotworowych. Górny panel pokazuje ciemnobrązowe zabarwione komórki nowotworowe (strzałki) rozproszone w całej wątrobie, gwiazdka oznacza nieswoiste zabarwienie hepatocytów wokół żył centralnych; pasek skali = 300 µm. Dolne panele pokazują reprezentatywne obrazy komórek nowotworowych w 90 min po wstrzyknięciu, wciąż ściśle powiązanych z naczyniami krwionośnymi; pasek skali = 50 µm. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54903/54903fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres Kaplana-Meiera, obrazy histologiczne; przeżycie bez przerzutów, analiza guzów 4T1, D2A1, D2.OR." src="/files/ftp_upload/54903/54903fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Rozrost linii komórkowych guza gruczołu piersiowego myszy w wątrobie po wtryskiwaniu do żyły wrotnej. A) Krzywa Kaplana-Meiera przedstawiająca wskaźniki przeżycia bez przerzutów u myszy, którym wstrzyknięto 2 000–10 000 komórek linii 4T1, D2A1 lub D2.OR guza gruczołu piersiowego myszy. Myszy po wstrzyknięciu komórek nowotworowych monitorowano pod kątem objawów przerzutów, w tym braku pielęgnacji, bladości oczu oraz zmian masy ciała. Przerzuty potwierdzono podczas nekropsji oraz za pomocą barwienia H&amp;E na przekrojach histologicznych wątroby. N= 2 4T1 2 000 komórek; 2 4T1 10 000 komórek. N= 2 D2A1 2 000 komórek; 3 D2A1 10 000 komórek. N= 3 D2.OR 2 000 komórek; 3 D2.OR 10 000 komórek. Reprezentatywne obrazy H&amp;E przedstawiające B) zmiany 4T1 w 21. dniu po wstrzyknięciu 10 000 komórek, C) zmiany D2A1 w 26. dniu po wstrzyknięciu 10 000 komórek nowotworowych oraz D) zmiany D2.OR w 59. dniu po wstrzyknięciu 10 000 komórek; paski skali = 75 µm. Podobne zmiany zaobserwowano po wstrzyknięciu 2 000 komórek nowotworowych 4T1 lub D2A1. Nie wykryto zmian po wstrzyknięciu 2 000 komórek D2.OR. W żadnej z badanych myszy nie stwierdzono przerzutów do innych narządów ani w miejscu nacięcia chirurgicznego. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54903/54903fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna tkanki wątroby; markery DAPI, CD45, Heppar-1, CK18; identyfikacja komórek." src="/files/ftp_upload/54903/54903fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Detekcja pojedynczych komórek i zmian przerzutowych w wątrobie myszy z wykorzystaniem multipleksowej immunofluorescencji. A) Reprezentatywny obraz multipleksowej immunofluorescencji komórek nowotworowych D2A1 w wątrobie myszy Balb/c 90 min po wstrzyknięciu w modelu wstrzyknięcia do żyły wrotnej. Barwienia wykonano przy użyciu zestawu multipleksowego. Od lewej do prawej przedstawiono: DAPI; CD45 do znakowania leukocytów; Heppar-1 do znakowania hepatocytów; oraz CK18 do znakowania komórek nowotworowych, hepatocytów i nabłonka przewodów żółciowych. Obraz złożony przedstawia domniemaną grupę komórek nowotworowych D2A1 CK18+Heppar-1-CD45- ściśle powiązanych z triadą wrotną. Strzałka = komórki nowotworowe D2A1, gwiazdka = nabłonek przewodów żółciowych; pasek skali = 25 µm. B) Reprezentatywna jawna zmiana przerzutowa D2A1 z zastosowaniem tego samego panelu barwień co w A. Komórki nowotworowe są CK18+, podczas gdy sąsiednie hepatocyty są CK18+Heppar-1+; pasek skali = 25 µm. Obrazy zarejestrowano za pomocą mikroskopu z obiektywami 20 x 0,8, 40 x 1,3 i 60 x 1,4 oraz kamerą CCD, korzystając z oprogramowania mikroskopu. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54903/54903fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>

Procedura chirurgiczna została opracowana w celu dostarczenia komórek guza sutka do mysiej wątroby poprzez wstrzyknięcie do żyły wrotnej. Model ten umożliwia badanie późnych stadiów przerzutów do wątroby u w pełni kompetentnego immunologicznie gospodarza, w tym wynaczynienia komórek nowotworowych, siewu, przeżycia i przerzutowego wzrostu w wątrobie.

Model iniekcji żyły wrotnej do badania przerzutów raka piersi do wątroby

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Ogólnym celem tej procedury jest dostarczenie komórek nowotworowych bezpośrednio do mysiej wątroby w celu eksperymentalnego modelowania przerzutów raka piersi do wątroby. Metodę tę można wykorzystać do badania późniejszych etapów kaskady przerzutów w wątrobie myszy. W tym wynaczynienie komórek raka piersi, wysiew, śmierć, proliferacja i uśpienie, a także wzrost.Główną zaletą tej techniki jest to, że dostarcza komórki nowotworowe bezpośrednio do wątroby bez usuwania śledziony lub jednoczesnych przerzutów wielonarządowych. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ wstrzyknięcie do żyły wrotnej wymaga precyzyjnych manipulacji, które opierają się na bezpośrednim nadzorze anatomicznym. W tej procedurze pomoże mi Alexandra Quackenbush, doktorantka w laboratorium Pepershadine.Przed rozpoczęciem zabiegu należy przetrzeć wszystkie powierzchnie pola operacyjnego 10% wybielaczem. Na godzinę przed wstrzyknięciem potraktuj podskórnie 8 do 15-tygodniowych samic myszy balb/c 100 mikrolitrami środka przeciwbólowego w celu złagodzenia bólu. Nałóż maść na oczy zwierzęcia.Następnie ułóż myszy w pozycji leżącej na plecach i potwierdź odpowiedni poziom sedacji poprzez uszczypnięcie palca. Następnie zdezynfekuj chirurgiczne i otaczające je obszary zwierzęcia, w tym ogon, za pomocą trzech naprzemiennie sterylnych chusteczek nasączonych gazą 2% chlorheksydyny i dwóch chusteczek nasączonych alkoholem. Po ostatnim przetarciu chlorheksydyną użyj sterylnego skalpela, aby wykonać jednocalowe nacięcie w skórze między płaszczyzną środkową i strzałkową po lewej stronie myszy, zaczynając tuż poniżej żeber i kończąc nad czwartym smoczkiem gruczołu pachwinowego, a następnie wykonaj podobne jednocalowe nacięcie przez otrzewną.Teraz kilkakrotnie odpipetuj komórki nowotworowe w górę iw dół, aby ponownie zawiesić roztwór komórkowy, i załaduj 25-mikrolitrową strzykawkę z wyjmowaną igłą, wyposażoną w igłę o rozmiarze 32, z 10 mikrolitrami komórek. Naciskać tłok do momentu, gdy komórki znajdą się na końcu igły, a tłok osiągnie objętość odpowiednią do wstrzyknięcia. Przetrzeć zewnętrzną część załadowanej igły sterylnym wacikiem nasączonym alkoholem, aby usunąć wszelkie zewnętrzne komórki nowotworowe, uważając, aby uniknąć ukłucia igłą.Następnie, przytrzymując kleszczami skórę i błonę środkową środkowej strony nacięcia, za pomocą sterylnego wacika ostrożnie przenieś jelito grube i cienkie na sterylną gazę nasączoną sterylną solą fizjologiczną. Przykryj narządy wewnętrzne gazą nasączoną solą fizjologiczną, aby utrzymać wewnętrzną wilgotność i sterylność. Gdy żyła wrotna jest widoczna, poproś asystenta, aby delikatnie przytrzymał jelita z drogi, aby odsłonić żyłę wrotną za pomocą sterylnego bawełnianego wacika i włóż igłę od trzech do pięciu milimetrów do żyły wrotnej, około 10 milimetrów poniżej wątroby, pod kątem mniejszym niż 5 stopni, skośnie do góry.Powoli wstrzyknij pełną objętość komórek nowotworowych, pozwalając krwi przepływać przez główkę igły przez kilka sekund, aby uniknąć cofania się komórek nowotworowych z żyły. Ponieważ niezbędna jest właściwa wizualizacja, dostęp i wstrzyknięcie do żyły wrotnej, przed próbą wstrzyknięcia należy upewnić się, że ustawienie żyły wrotnej w stosunku do igły jest zadowalające. Po wstrzyknięciu wszystkich komórek należy usunąć igłę, jednocześnie delikatnie uciskając żyłę sterylnym aplikatorem z bawełnianą końcówką.Następnie użyj nowego sterylnego aplikatora z bawełnianą końcówką, aby przytrzymać kawałek gazy hemostatycznej o powierzchni od 0,5 do jednego centymetra kwadratowego nad miejscem wstrzyknięcia. Po pięciu minutach ostrożnie podnieś gazę, aby ocenić zamknięcie żyły. Gdy przepływ krwi całkowicie ustaje, usuń gazę i wróć do jelit do jamy brzusznej.Używając prostego ciągłego lub przerywanego wzoru szwów, zamknij błonę śluzową otrzewnej sterylnym czteroma zerowymi szwami vicryl i zwężaj się. Po zamknięciu skóry w ten sam sposób wstrzyknąć 100 mikrolitrów środka znieczulającego miejscowo wzdłuż miejsca nacięcia, a następnie podać podskórnie 0,5 mililitra sterylnej soli fizjologicznej. Dokładną anatomiczną identyfikację żyły wrotnej i udane wstrzyknięcie do wnętrza wrotnego można potwierdzić, ćwicząc protokół iniekcji z tuszem indyjskim lub podobnym barwnikiem.Przy prawidłowym wstrzyknięciu przez żyłę wrotną, w wyniku czego atrament jest natychmiast i specyficznie dostarczany do wątroby bez rozprzestrzeniania się do płuc. Korzystając z mysich komórek nowotworowych pamięci oznaczonych GFP, rozproszenie komórek nowotworowych w wątrobie jest widoczne po 90 minutach od wstrzyknięcia, potwierdzając pomyślne dostarczenie żyły wrotnej do wątroby. Komórki nowotworowe znajdują się w sinusoidach, a także w miąższu wątroby w bliskim sąsiedztwie triad wrotnych, gdzie krew z żyły wrotnej dostaje się do wątroby, co sugeruje, że w tym czasie ma miejsce aktywne wynaczynienie komórek nowotworowych.Jak wykazano na podstawie tych krzywych przeżycia, adoptywny transfer żyły wrotnej agresywnych linii komórkowych guza sutka skutkuje krótszymi wskaźnikami przeżycia bez przerzutów w porównaniu z myszami, którym wstrzyknięto mniej agresywną linię komórek nowotworowych. Przerzuty od tych zwierząt można potwierdzić poprzez przecięcie przez wątrobę na poziomie 250 mikronów, a następnie analizę H&E próbek. Ponadto analiza immunofluorescencyjna jest przydatna do analizy zmian mikro i makro przerzutowych nieoznakowanych linii syngennych, takich jak linia guza D2A1, która jest CD45 ujemna, Heppar-1 ujemna i CK18 dodatnia, jak pokazano na tych reprezentatywnych obrazach.Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu 12-14 minut na mysz, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać, aby poświęcić niezbędny czas na prawidłową wizualizację i dostęp do żyły wrotnej przed próbą wstrzyknięcia. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak obrazowanie przyżyciowe po wstrzyknięciu komórek nowotworowych, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące interakcji komórek nowotworowych ze środowiskiem lubramicro.Wraz z rozwojem technika ta pozwala naukowcom zajmującym się przerzutami badać późniejsze etapy kaskady przerzutowej różnych nowotworów u myszy. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, gdzie wykonać nacięcie chirurgiczne, jak delikatnie przesunąć narządy wewnętrzne, aby uzyskać dostęp do żyły wrotnej i jak przeprowadzić wstrzyknięcie wewnątrz wrotnej. Nie zapominaj, że praca ze strzykawkami załadowanymi komórkami nowotworowymi może być niebezpieczna i że należy podjąć środki ostrożności, aby uniknąć ukłuć igłą podczas wykonywania tej procedury.

a-portal-vein-injection-model-to-study-liver-metastasis-breast

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Niniejszy artykuł opisuje procedurę indukcji ortotopowych bioluminescencyjnych guzów wątroby u myszy oraz późniejszą analizę wzrostu guza ograniczonego do wątroby przy użyciu obrazowania luminescencyjnego całego ciała żywych zwierząt.

Mysi model bioluminescencyjnych guzów wątroby

Ten film opisuje zabieg chirurgiczny polegający na dostarczeniu komórek guza sutka do mysiej wątroby poprzez wstrzyknięcie do żyły wrotnej. Model ten pozwala na badanie późnych stadiów przerzutów do wątroby.

Wstrzyknięcie żyły wrotnej: metoda badania przerzutów raka do wątroby

Ten film opisuje technikę wstrzykiwania oznaczonych komórek rakowych za pomocą iniekcji żyły ogonowej do modelu mysiego. Ponadto monitorujemy powstawanie i wzrost przerzutów raka piersi za pomocą obrazowania żywych zwierząt w czasie rzeczywistym.

Wstrzyknięcie żyły ogonowej: metoda podawania komórek rakowych do badań przerzutowych w modelu mysim

Przedkliniczny, mysi model przerzutów do wątroby wykonany techniką iniekcji hemispleen.

Przedkliniczny mysi model przerzutów do wątroby

Zdolność klonów przerzutowych do kolonizacji odległych miejsc zależy od ich zdolności do proliferacji i/lub zdolności do przetrwania w mikrośrodowisku gospodarza bez znaczącej proliferacji. W tym miejscu przedstawiamy model zwierzęcy, który umożliwia ilościową wizualizację obu typów kolonizacji wątroby przez klony z przerzutami.

Zaawansowany zwierzęcy model przerzutów jelita grubego w wątrobie: techniki obrazowania i właściwości klonów z przerzutami

Szczegółowo opisujemy klinicznie istotny model raka jelita grubego z przerzutami do wątroby (CRLM) oraz wpływ reperfuzji niedokrwienia wątroby (I/R) na wzrost guza i przerzuty. Model ten może pomóc w lepszym zrozumieniu mechanizmów leżących u podstaw indukowanego przez operację wzrostu przerzutów do wątroby.

Mysi model przerzutowych guzów wątroby w warunkach uszkodzenia reperfuzyjnego niedokrwiennego

Ta praca wstępnie ustawia zaawansowany protokół do dokładnej oceny obciążenia guza poprzez detekcję zielonego białka fluorescencyjnego i sygnałów bioluminescencji, a także integrację ilościowej techniki wykrywania molekularnego.

Badanie potrójnie ujemnego raka piersi przy użyciu ortotopowego modelu raka piersi

Dożylne wstrzykiwanie komórek rakowych jest często stosowane w badaniach nad przerzutami, ale obciążenie guzem przerzutowym może być trudne do analizy. W tym artykule demonstrujemy model przerzutów do iniekcji żyły ogonowej i uwzględniamy nowatorskie podejście do analizy wynikającego z przerzutowego obciążenia guzem płuc.

Analiza patologiczna przerzutów do płuc po bocznym wstrzyknięciu komórek nowotworowych do żyły ogonowej

Opisujemy mysi model raka piersi z przerzutami do mózgu generowanymi przez wstrzyknięcie do żyły ogonowej endogennej linii komórkowej zapalnego raka piersi z amplifikacją HER2.

Modelowanie przerzutów do mózgu poprzez wstrzyknięcie do żyły ogonowej komórek zapalnego raka piersi

Wstrzyknięcie organoidów raka jelita grubego (CRC) do żyły wrotnej powoduje przerzuty do wątroby bogate w zręb. Ten mysi model przerzutów do wątroby CRC stanowi użyteczne narzędzie do badania interakcji guz-zręb i opracowywania nowych terapii ukierunkowanych na zręb, takich jak terapie genowe za pośrednictwem wirusa związanego z adenowirusem.

Wstrzyknięcie do żyły wrotnej organoidów raka jelita grubego w celu zbadania zrębu z przerzutami do wątroby

Manuskrypt opisuje metodologię ustalania oraz monitorowania wzrostu podłużnego spontanicznych przerzutów do płuc z ortotopowo wstrzykiwanych guzów piersi, które mogą być interwencyjne na wszystkich etapach kaskady przerzutowej.

In vivo (in vivo) Obrazowanie w celu pomiaru spontanicznych przerzutów do płuc komórek guza piersi wstrzykniętych ortotopowo

Poznaj metodę iniekcji żyły wrotnej do badania przerzutów raka piersi do wątroby u myszy. Technika umożliwia szczegółowe obserwacje ekstrawazacji komórek nowotworowych w mikrośrodowisku wątroby.

Model iniekcji żyły wrotnej do badania przerzutów raka piersi do wątroby

Przeglądaj więcej filmów