Name: Izolacja i hodowla dorosłych nerwowych komórek macierzystych ze strefy podmodzelowej myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Naucz się izolować i hodować dorosłe nerwowe komórki macierzyste ze strefy podmodzelowej myszy. Ta precyzyjna metoda umożliwia badanie neurogenezy dorosłych i potencjalne zastosowania terapeutyczne w leczeniu chorób neurologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez Program Badań nad Mózgiem przez Narodową Fundację Badawczą (NRF), finansowany przez Koreańskie Ministerstwo Nauki, ICT, and Future Planning (Granty NRF-2015M3C7A1028790); oraz przez grant z Korea Health Technology R&D Project przez Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), finansowany przez Ministerstwo Zdrowia i Opieki Społecznej, Republiki Korei (HI14C3347).

1. Przygotowanie materiałów i podłoża hodowlanego
<ol>
	<li>W celu rozwarstwienia i dysocjacji SCZ owiń macierz mózgu, obosieczną żyletkę i kleszcze folią aluminiową, a następnie wysterylizuj je w autoklawie.</li>
	<li>Przygotuj 50 ml zimnego buforu PBS, aby umyć cały mózg myszy.</li>
	<li>Ustaw mikroskop preparacyjny i przygotuj narzędzia chirurgiczne wymagane do wypreparowania mózgu (autoklawowane nożyczki i kleszcze) oraz izolacji SCZ (strzykawka 1 ml, igła 30 G, matryca mózgowa i cienkie kleszcze).</li>
	<li>Przygotowanie podłoża N2:
	<ol>
		<li>Przygotuj pożywkę F-12/DMEM (+L-glutamina, + wodorowęglan sodu) z 2% suplementami B27, 1% N2 i 1% penicyliną-streptomycyną. 
		Uwaga: Pożywka wzrostowa składa się z pożywki N2 i czynników wzrostu (20 ng/ml oczyszczonego naskórkowego czynnika wzrostu (EGF) i 20 ng/ml zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF2)).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować bufor do trawienia (40 jednostek/ml papainy, 2,4 jednostki/ml dypazy II i 2% penicyliny-streptomycyny w PBS) do trawienia tkankowego.</li>
	<li>Przygotowanie płytki powlekającej i szkiełka nakrywkowego:
	<ol>
		<li>Przygotować poli-L-ornitynę (PLO; 0,01%) i lamininę (10 μg/ml rozpuszczoną w DH2O). W celu pokrycia płytek 6-dołkowych w celu utrzymania SCZ-aNSC w postaci monowarstwy lub szkiełek nakrywkowych o średnicy 18 mm do barwienia immunologicznego, należy je inkubować z PLO przez noc w temperaturze 4 °C. Następnie umyj je 3 razy za pomocą DH2O. Po ostatnim praniu pozostaw płytki i szkiełka nakrywkowe do wyschnięcia.</li>
		<li>Następnie inkubować płytki z lamininą przez noc w temperaturze 4 °C. Następnie umyj je 3 razy za pomocą DH2O. 
		Uwaga: Nie susz lamininy, co wpłynie na przyczepianie komórek. 
		Uwaga: Roztwory powłokowe mogą być ponownie użyte 3 razy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Izolacja i dysocjacja dorosłego SCZ
<ol>
	<li>Przed przygotowaniem hodowli umieść macierz mózgową i obosieczną maszynkę do golenia na lodzie. 
	Uwaga: Nie zamrażaj macierzy mózgowej, ponieważ mózg może się do niej przyłączyć.</li>
	<li>Uświęć mysz (w wieku 8 tygodni) przez uduszenie CO2 lub zwichnięcie szyjki macicy.
	<ol>
		<li>Odetnij głowę ostrymi nożyczkami po rozpyleniu 70% etanolu. Aby unieruchomić głowę, trzymaj mocno obie strony głowy. Przetnij skórę nożyczkami na linii środkowej w kierunku ogonowo-rostralnym. Sprzyja to całkowitemu usunięciu skóry z czaszki.</li>
		<li>Najpierw usuń ogonową część czaszki (tylną do lambdy), a następnie włóż kleszcze między czaszkę a mózg w grzbietowej pozycji linii środkowej. Chwyć lewą (lub prawą) kość ciemieniową i ostrożnie ją oderwij. Powtórz tę procedurę w celu usunięcia drugiej kości ciemieniowej. 
		Uwaga: Odłączenie nerwu wzrokowego i usunięcie opon mózgowych z mózgu ułatwia odłączenie mózgu od czaszki.</li>
		<li>Przenieś mózg do zimnego buforu PBS (25 ml) i przepłucz go dwukrotnie, aby usunąć nadmiar krwi.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść mózg w macierzy mózgowej na lodzie i wykonaj nacięcia koronalne, aby uzyskać plastry o grubości 1 mm. Przenieś wycinki mózgu (1 mm) zawierające obszary SCZ, które znajdują się w tylnej części mózgu, do zimnego PBS na plastikowej szalce Petriego o średnicy 35 mm. 
	Uwaga: Aby uzyskać równoległą płaszczyznę odcinków koronalnych, upewnij się, że szczelina mózgu znajduje się w linii środkowej macierzy mózgowej; Bardzo ważne jest, aby uniknąć niepotrzebnych zmian w sekcjach. 
	Uwaga: Uzyskaj plastry mózgu w odległości 2-3 mm za bregmą; pozwala to na oddzielenie SCZ od SVZ.</li>
	<li>Pod mikroskopem preparacyjnym o małym powiększeniu należy dokonać mikrosekcji SCZ z obszaru istoty białej kory i hipokampa za pomocą wygiętej igły 30G6,9. Następnie usuń obszary kory powyżej SCZ. Umieść wycięty obszar SCZ z plastrów na plastikowej szalce Petriego o średnicy 35 mm na lodzie bez zimnego PBS. 
	Uwaga: Zanieczyszczenie dodatkowych regionów zawierających dojrzałe neurony może wpływać na żywotność aNSC i tworzenie neurosfery, ponieważ ulegają one śmierci komórkowej w warunkach hodowli aNSC.</li>
	<li>Za pomocą wygiętej igły 30 G natychmiast posiekaj wycięte tkanki na małe kawałki. 
	Uwaga: Jeśli wypreparowanie tkanki SCZ wymaga dłuższego czasu, przed posiekaniem zanurz wypreparowane tkanki w zimnym PBS.</li>
	<li>Ponownie zawiesić rozdrobnioną tkankę w 1 ml buforu wytrawiającego, przenieść tkankę do probówki o pojemności 15 ml zawierającej 2 ml buforu do wytrawiania i inkubować przez 30 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. 
	Uwaga: Wstrząsaj probówką co 10 minut, aby dobrze wymieszać.</li>
</ol>
3. Hodowla dorosłych nerwowych komórek macierzystych pochodzących ze strefy podmodzelowej
<ol>
	<li>Delikatnie postukać w probówkę, aby oddzielić strawioną tkankę, a następnie odwirować probówkę o sile 145 x g przez 5 minut. Wyrzucić supernatant, ponownie zawiesić strawioną tkankę w 1 ml wstępnie podgrzanej pożywki N2 w celu wypłukania buforu wytrawiającego i delikatnie pipetować roztwór próbki maksymalnie 5 razy za pomocą pipety P1000. 
	Uwaga: Nadmierne rozcieranie za pomocą wąskiej końcówki pipety może zmniejszyć żywotność komórek i późniejszy wzrost.</li>
	<li>Odwirować probówkę o sile 145 x g przez 5 minut. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki N2.</li>
	<li>Przygotować 1 ml pożywki N2 na niepowlekanej płytce 6-dołkowej i dodać 1 ml zawieszonych komórek, aby uzyskać końcową objętość 2 ml.</li>
	<li>Dodaj EGF (20 ng/ml) i bFGF (20 ng/ml) do każdej studzienki. Delikatnie potrząśnij ręcznie 6-dołkową naczynią hodowlaną, aby wymieszać dodane czynniki wzrostu z posianymi komórkami. Przechowywać 6-dołkową płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 . </li>
	<li>Dodawaj EGF (20 ng/ml) i bFGF (20 ng/ml) do każdej studzienki codziennie przez 8 dni. Co trzeci dzień dodawać 200 μl pożywki N2, aby utrzymać około 2 ml objętości pożywki.</li>
</ol>
4. Pasaż NSC jako neurosfery i do kultur jednowarstwowych
<ol>
	<li>Zbierz neurosfery i przenieś je do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. 
	Uwaga: Liczba neurosfer (o średnicy >50 μm) na studzienkę z SCZ pojedynczego mózgu myszy wynosiła 64,3 ± 7,31, czyli mniej niż w SVZ (190,5 ± 6,33)9.</li>
	<li>Inkubować neurosfery z 0,5 ml buforu dysocjacyjnego przez 5 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C w celu dysocjacji neurosfer na pojedyncze komórki. Pierwotne neurosfery mogą być dysocjowane na pojedyncze komórki i utrzymywane przez kilka przejść jako kultury neurosfery lub monowarstwy. 
	Uwaga: Rozszerzanie SCZ-aNSC jako monowarstwy jest lepsze od neurosfer, ponieważ SCZ-aNSC mogą być pasażowane >10 razy w formacie kultury jednowarstwowej, ale <5 razy w formacie kultury neurosfery. 
	Uwaga: SCZ-aNSC wykazują silną agregację i trudno jest je rozdzielić na pojedyncze komórki. W związku z tym format hodowli neurosfery nie jest zalecany do rutynowej ekspansji komórek.</li>
	<li>Delikatnie pipetować roztwór próbki w górę i w dół pipetą P1000 mniej niż 5 razy i odwirować probówkę przy 145 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić neurosfery w 1 ml pożywki N2. 
	Uwaga: Nadmierne rozcieranie za pomocą wąskiej końcówki pipety może zmniejszyć żywotność komórek i późniejszy wzrost.</li>
	<li>Aby policzyć komórki, należy przygotować mieszaninę 1:1 zawiesiny komórek (10 μl) i 0,4% roztworu błękitu trypanowego, a następnie policzyć liczbę żywych komórek na hematocytometrze. Po pokryciu 6-dołkowej płytki PLO/lamininą, pokryj komórki w proporcji 2,5 x 105 komórek/ml 2 ml pożywki N2 dla każdej studzienki. 
	Uwaga: Zmiany gęstości komórek mogą wpływać na ich stan i potencjał różnicowania.</li>
	<li>Utrzymuj SCZ-aNSC z codziennym leczeniem czynnikami wzrostu (2 ml, 20 ng/ml) przez 5 dni, a następnie je przechodź.</li>
</ol>
5. Różnicowanie dorosłych nerwowych komórek macierzystych pochodzących ze strefy podmodzelowej
<ol>
	<li>Umieścić aNSC na 18 mm szkiełku nakrywkowym pokrytym PLO/laminininą z 1 x 105 komórek/ml w 1 ml N2 z czynnikami wzrostu (20 ng/ml) w celu różnicowania SCZ-aNSC.</li>
	<li>Następnego dnia, gdy komórki są mocno przymocowane do szkiełka nakrywkowego, wymień pożywkę wzrostową na N2, aby usunąć czynniki wzrostu.</li>
	<li>Po 6 dniach przemyj zróżnicowane komórki 1 ml PBS, aby usunąć resztki komórek i utrwalić je do barwienia immunologicznego. 
	Uwaga: BrdU może zostać włączony do nowo zsyntetyzowanego DNA proliferujących komórek. Dlatego, w razie potrzeby, BrdU (10 μg/ml) można dodać do żywych komórek przed ich utrwaleniem.</li>
</ol>
6. Immunologiczne barwienie dorosłych nerwowych komórek macierzystych i zróżnicowanych progenitorów
<ol>
	<li>W celu barwienia immunologicznego przemyj komórki PBS i utrwal je 4% PFA przez 20 minut w temperaturze pokojowej. 
	Uwaga: PFA jest wysoce toksyczny; Unikać kontaktu ze skórą i oczami.</li>
	<li>Usunąć 4% PFA, przepłukać utrwalone komórki PBS 3 razy, a następnie przechowywać je w temperaturze 4 °C, aż będą potrzebne do barwienia immunologicznego.</li>
	<li>Inkubować komórki na szkiełku nakrywkowym z roztworem blokującym (3% albuminy surowicy bydlęcej i 0,1% Triton X-100 w 1x PBS) przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotować przeciwciała pierwszorzędowe w świeżym roztworze blokującym i inkubować próbki przez noc w temperaturze 4 °C.
	<ol>
		<li>Barwienie immunologiczne aNSC
		<ol>
			<li>Wybarwić aNSC za pomocą przeciwciał anty-Nestin i anty-BrdU. Przed utrwaleniem dodać 20 μg BrdU do aNSC i inkubować je przez 2 godziny. Przeprowadzić etap denaturacji przy użyciu 2 N HCl przez 20 minut w temperaturze 37 °C przed wykonaniem etapu blokowania.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Barwienie immunologiczne zróżnicowanych komórek progenitorowych:
		<ol>
			<li>Użyj przeciwciał anty-O4, anty-bIII-tubuliny i przeciwko glejowemu fibrylarnemu białku kwasowemu (GFAP), aby oznaczyć zróżnicowanych przodków.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przemyć próbki PBS 3 razy i inkubować je z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z barwnikami fluorescencyjnymi (1:500) w roztworze blokującym przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie umyj próbki 3 razy za pomocą PBS. 
	Uwaga: Użyj przeciwciał drugorzędowych, które pasują do gospodarzy przeciwciał pierwszorzędowych. Hoechest33343 (1:2,000) służy do barwienia jądrowego.</li>
	<li>Dodaj roztwór montażowy do szkła przesuwnego i kontynuuj montaż. Obserwuj i zobrazuj próbkę pod mikroskopem konfokalnym na wielu długościach fali: FITC (488 nm), Cy3 (543 nm), Cy5 (647 nm) i Hoechest33343 (405 nm).</li>
</ol>

<ol><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+and+population+analyses+demonstrate+that+an+EGF-responsive+mammalian+embryonic+CNS+precursor+is+a+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Clonal and population analyses demonstrate that an EGF-responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell.</a> Developmental biology. 175, 1-3 (1996).</li>
<li>Babu, H., Cheung, G., Kettenmann, H., Palmer, T. D., Kempermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enriched+monolayer+precursor+cell+cultures+from+micro-dissected+adult+mouse+dentate+gyrus+yield+functional+granule+cell-like+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Enriched monolayer precursor cell cultures from micro-dissected adult mouse dentate gyrus yield functional granule cell-like neurons.</a> PloS one. 2, e388(2007).</li>
<li>Alvarez-Buylla, A., Garcia-Verdugo, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+in+adult+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis in adult subventricular zone.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 629-634 (2002).</li>
<li>Kempermann, G., Song, H., Gage, F. H. Neurogenesis in the Adult Hippocampus. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKempermann%2C+G+%22Cold+Spring+Harbor+perspectives+in+biology%22">Cold Spring Harbor perspectives in biology</a>. 7, a018812(2015).</li>
<li>Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mammalian neural stem cells.</a> Science. 287, 1433-1438 (2000).</li>
<li>Seri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition+and+organization+of+the+SCZ%3A+a+large+germinal+layer+containing+neural+stem+cells+in+the+adult+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Composition and organization of the SCZ: a large germinal layer containing neural stem cells in the adult mammalian brain.</a> Cereb Cortex. 16 Suppl 1, i103-i111 (2006).</li>
<li>Kim, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+the+spontaneous+production+but+massive+programmed+cell+death+of+new+neurons+in+the+subcallosal+zone+of+the+postnatal+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Evidence for the spontaneous production but massive programmed cell death of new neurons in the subcallosal zone of the postnatal mouse brain.</a> The European journal of neuroscience. 33, 599-611 (2011).</li>
<li>Kim, H. J., Kim, J. Y., Sun, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+changes+in+the+subcallosal+zone+neurogenesis+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemistry+international%22%5BJournal%5D)">Age-dependent changes in the subcallosal zone neurogenesis of mice.</a> Neurochemistry international. 61, 879-884 (2012).</li>
<li>Kim, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promotion+of+Cortical+Neurogenesis+from+the+Neural+Stem+Cells+in+the+Adult+Mouse+Subcallosal+Zone%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Promotion of Cortical Neurogenesis from the Neural Stem Cells in the Adult Mouse Subcallosal Zone.</a> Stem Cells. , (2015).</li>
<li>Nunes, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+isolation+of+multipotential+neural+progenitor+cells+from+the+subcortical+white+matter+of+the+adult+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Identification and isolation of multipotential neural progenitor cells from the subcortical white matter of the adult human brain.</a> Nature medicine. 9, 439-447 (2003).</li>
<li>Gould, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+widespread+is+adult+neurogenesis+in+mammals%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">How widespread is adult neurogenesis in mammals?</a> Nature reviews. Neuroscience. 8, 481-488 (2007).</li>
<li>Gage, F. H., Temple, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells%3A+generating+and+regenerating+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells: generating and regenerating the brain.</a> Neuron. 80, 588-601 (2013).</li>
<li>Shaker, M. R., Kim, J. Y., Kim, H., Sun, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+secondary+neural+tube-derived+embryonic+neural+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells+and+development%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of secondary neural tube-derived embryonic neural stem cells in vitro.</a> Stem cells and development. 24, 1171-1181 (2015).</li>
<li>Jensen, J. B., Parmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strengths+and+limitations+of+the+neurosphere+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Strengths and limitations of the neurosphere culture system.</a> Molecular neurobiology. 34, 153-161 (2006).</li>
<li>Suslov, O. N., Kukekov, V. G., Ignatova, T. N., Steindler, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cell+heterogeneity+demonstrated+by+molecular+phenotyping+of+clonal+neurospheres%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Neural stem cell heterogeneity demonstrated by molecular phenotyping of clonal neurospheres.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 14506-14511 (2002).</li>
<li>Richards, L. J., Kilpatrick, T. J., Bartlett, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+generation+of+neuronal+cells+from+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">De novo generation of neuronal cells from the adult mouse brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 8591-8595 (1992).</li>
<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li>
<li>Gritti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+and+fibroblast+growth+factors+behave+as+mitogenic+regulators+for+a+single+multipotent+stem+cell-like+population+from+the+subventricular+region+of+the+adult+mouse+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Epidermal and fibroblast growth factors behave as mitogenic regulators for a single multipotent stem cell-like population from the subventricular region of the adult mouse forebrain.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 19, 3287-3297 (1999).</li>
<li>Wachs, F. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficacy+of+clonal+growth+and+expansion+of+adult+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+investigation%3B+a+journal+of+technical+methods+and+pathology%22%5BJournal%5D)">High efficacy of clonal growth and expansion of adult neural stem cells.</a> Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 83, 949-962 (2003).</li>
<li>Xiong, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+time+for+passaging+neurospheres+based+on+primary+neural+stem+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Optimal time for passaging neurospheres based on primary neural stem cell cultures.</a> Cytotechnology. 63, 621-631 (2011).</li>
<li>Lee, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+Matrigel-based+culture+for+expansion+of+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Cells+and+Systems%22%5BJournal%5D)">Optimization of Matrigel-based culture for expansion of neural stem cells.</a> Animal Cells and Systems. 19, 175-180 (2015).</li>
<li>Guo, W., Patzlaff, N. E., Jobe, E. M., Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+multipotent+neural+stem+or+progenitor+cells+from+both+the+dentate+gyrus+and+subventricular+zone+of+a+single+adult+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse.</a> Nature protocols. 7, 2005-2012 (2012).</li>
<li>Walker, T. L., Kempermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+mouse%2C+two+cultures%3A+isolation+and+culture+of+adult+neural+stem+cells+from+the+two+neurogenic+zones+of+individual+mice%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+%28Journal+of+Visualized+Experiments%29%22%5BJournal%5D)">One mouse, two cultures: isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice.</a> JoVE (Journal of Visualized Experiments). , e51225(2014).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

W tym artykule opisano szczegółowy protokół generowania NSC z dorosłej myszy SCZ i utrzymywania ich dla różnych zastosowań. Istnieją trzy kluczowe etapy tworzenia systemu hodowli in vitro potrzebnego do oczyszczania i namnażania SCZ-NSC. Po pierwsze, ważne jest, aby upewnić się, że region SCZ jest precyzyjnie wypreparowany z innych potencjalnych regionów neurogennych (ryc. 1B). Grube i precyzyjne skrawki zawierające obszary SCZ uzyskano za pomocą matrycy mózgowej o odstępie 1 mm, a następnie cie...

NSC mają cechy samoodnawiania się i różnicowania wielu linii. Aby potwierdzić te właściwości, szeroko zastosowano system hodowli neurosfery. System hodowli neurosfery został opracowany na początku lat 90. i służył jako standardowy system hodowli komórek macierzystych1. W zależności od siły samoodnawiania, NSC stale się namnażają i wytwarzają masę komórkową w kulturze zawiesinowej. Uważa się, że liczba komórek i wielkość neurosfery są ściśle związane z właściwościami proliferacyjnymi NSC. Hodowle jednowarstwowe są również szeroko stosowane do utrzymywania i różnicowania NSC. W porównaniu z kulturą neurosferyczną, system hodowli jednowarstwowej zapewnia lepsze jednorodne utrzymanie i ekspansję NSC2. Te dwa dobrze rozwinięte systemy hodowli przyczyniły się do scharakteryzowania aNSC in vitro. 
NSC znajdują się w różnych obszarach mózgu, takich jak strefa podkomorowa (SVZ) komory bocznej i strefa subziarnista (SGZ) hipokampa3-5. Strefa podmodzelowa (SCZ) ogonowej podkorowej istoty białej jest rozpoznawana jako nowy region neurogenny6-8. Niedawno doniesiono, że SCZ-aNSC mają potencjał terapeutyczny w urazowym uszkodzeniu mózgu9. W porównaniu z innymi regionami neurogennymi, SCZ znajduje się wzdłuż podkorowej istoty białej. W ludzkim mózgu podkorowa istota biała zajmuje większy obszar niż w mózgu myszy10. Dlatego ważne jest zrozumienie charakterystyki SCZ-aNSC przy użyciu systemu hodowli in vitro, aby promować potencjalne wykorzystanie tych komórek do regeneracji neuronów. Wymagana jest precyzyjna sekcja pożądanego obszaru mózgu, aby wykluczyć możliwe zanieczyszczenie przez niepożądane obszary zawierające aktywne lub uśpione NSC. Na przykład aNSC w regionach nieneurogennych mogą być aktywowane i wytwarzać nowe komórki nerwowe w uszkodzonych mózgach lub podczas hodowli in vitro 11. Aby uzyskać NSC z SCZ, komórki pobrano z wycinków mózgu zawierających SCZ. Następnie przeprowadzono staranną mikrosekcję obszaru SCZ za pomocą cienkiej igły. Aby wygenerować neurosferę z SCZ, mikrowypreparowane fragmenty tkanki SCZ zostały zdysocjowane na pojedyncze komórki, a następnie wyhodowane jako zawiesina w obecności naskórkowego czynnika wzrostu (EGF) i podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF). Po utworzeniu neurosfer SCZ-aNSC mogą być również utrzymywane jako neurosfery lub monowarstwy do ekspansji. Procedura ta demonstruje również procesy barwienia immunologicznego za pomocą różnych markerów do wykrywania NSC i ich potomstwa po ich ekspansji i różnicowaniu w hodowli jednowarstwowej. W tym miejscu przedstawiono wizualny protokół systemu hodowli SCZ-aNSC. Protokół ten zawiera szczegółowe instrukcje dotyczące mikropreparacji obszaru SCZ oraz konserwacji i pasażowania komórek.

<table><tbody><tr><td><mocny>Średnie komponenty</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td>+L-glutamina, +Pióro wodorowęglanu sodu</td></tr><tr><td>/Strep</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Suplement N2</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>suplement Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td><silny>Czynnik wzrostu</silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R& D</td><td>233-FB</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Gibco</td><td>PHG0313</td><td></td></tr><tr><td>Buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS (10x)</td><td>BIOSOLUTION</td><td>BP007a</td><td>1x rozcieńczenie</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Dissociattion buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Roche</td><td>04-942-078-001</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington</td><td>3126</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>ICT</td><td>AT-104</td><td></td></tr><tr><td>Tool</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szczypce do drobnych</td><td>robin WPI</td><td>555229F</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>Storz</td><td>E3321-C</td><td></td></tr><tr><td>Macierz mózgu (1 mm)</td><td>RWD</td><td>68707</td><td></td></tr><tr><td>Maszynka do golenia obosieczna</td><td>DORCO</td><td>ST-300</td><td></td></tr><tr><td>30 G igła</td><td>SUNGSHIM</td><td>N1300</td><td></td></tr><tr><td><mocna>Materiały</mocna></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml tubki</td><td>SPL</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>Tubki 50 ml</td><td>SPL</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>35 mm szalka</td><td>SPL</td><td>10035</td><td>szalka Petriego</td></tr><tr><td>100 mm szalka</td><td>SPL</td><td>10090</td><td>szalka Petriego</td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe (18 mm)</td><td>Deckglaser</td><td>111580</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie 12-dołkowe</td><td>SPL</td><td>32012</td><td>niepowlekające</td></tr><tr><td>Naczynie 6-dołkowe</td><td>SPL</td><td>32006</td><td>niepowlekające</td></tr><tr><td><mocne>Materiały powłokowe</mocne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PLO</td><td>Sigma</td><td>P4957</td><td>0,01%</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Gibco</td><td>23017-015</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td><silne>Przeciwciała pierwszorzędowe&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nestin</td><td>Millipore</td><td>MAB353</td><td>mysz (1:1,000)</td></tr><tr><td>EGFR</td><td>Abcam</td><td>ab2430</td><td>królik (1:1,000)</td></tr><tr><td>DCX</td><td>Santa Cruz</td><td>SC8066</td><td>koza (1:500)</td></tr><tr><td>Tuj1</td><td>Sigma</td><td>T2200</td><td>królik (1:2,000)</td></tr><tr><td>GFAP</td><td>Invitrogen</td><td>13-0300</td><td>szczur (1:1,000)</td></tr><tr><td>O4</td><td>Mysz Millipore</td><td>MAB345</td><td>(1:500)</td></tr><tr><td>BrdU</td><td>Abcam</td><td>ab6326</td><td>Szczur (1:500)</td></tr><tr><td><silne>przeciwciała wtórne</silne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anty-myszy 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21202</td><td>1:500</td></tr><tr><td>anty-mysie cy3</td><td>Jackson</td><td>715-165-151</td><td></td></tr><tr><td>anty-mysz 647</td><td>Jackson</td><td>715-606-150</td><td></td></tr><tr><td>anty-królik 488</td><td>Alexa</td><td>A21206</td><td></td></tr><tr><td>anty-królik cy3</td><td>Jackson</td><td>711-165-152</td><td></td></tr><tr><td>anty-królik 647</td><td>Jackson</td><td>711-605-152</td><td></td></tr><tr><td>anty-koza 488</td><td>Alexa</td><td>A11055</td><td></td></tr><tr><td>anty-koza cy3</td><td>Jackson</td><td>705-165-147</td><td></td></tr><tr><td>anty-koza 647</td><td>Invitrogen</td><td>A21447</td><td></td></tr><tr><td>anty-szczur 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21208</td><td></td></tr><tr><td>anty-szczur cy3</td><td>Jackson</td><td>712-166-150</td><td></td></tr><tr><td>antyszczur 647</td><td>Jackson</td><td>712-605-153</td><td></td></tr><tr><td><silny>Materiały do barwienia immunologicznego</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Millipore</td><td>82-100-6</td><td>3% BSA z 0,1% Triton X-100 w PBS</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>usb</td><td>22686</td><td></td></tr><tr><td>4% PFA</td><td>Biosesang</td><td>P2031</td><td></td></tr><tr><td>Hoechest33342</td><td>Life Technology</td><td>H3570</td><td>Barwnik do barwienia jąder</td></tr></tbody></table>

izolacja i hodowla dorosłych nerwowych komórek macierzystych ze strefy podmodzelowej myszy

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Dorosłe nerwowe komórki macierzyste (aNSC) mogą być używane do regeneracji uszkodzonej tkanki mózgowej. NSC mają potencjał do różnicowania i proliferacji w trzech typach komórek: neuronach, astrocytach i oligodendrocytach. Identyfikacja regionów pochodnych aNSC i scharakteryzowanie właściwości aNSC ma kluczowe znaczenie dla potencjalnego zastosowania aNSC i wyjaśnienia ich roli w regeneracji neuronów. Niedawno doniesiono, że strefa podmodzelowa (SCZ), znajdująca się między istotą białą a hipokampem, zawiera aNSC i stale powoduje powstawanie neuroblastów. Niewielki odsetek aNSC z SCZ jest zróżnicowany w neurony; Większość komórek jest zróżnicowana w komórki glejowe, takie jak oligodendrocyty i astrocyty. Sugeruje się, że komórki te mają potencjał terapeutyczny w przypadku urazowego uszkodzenia kory mózgowej. Protokół ten szczegółowo opisuje proces generowania SCZ-aNSC z mózgu dorosłej myszy. Macierz mózgowa w odstępach 1 mm służy do uzyskania wycinków koronalnych zawierających SCZ i do precyzyjnego wypreparowania SCZ z całego mózgu. Sekcje SCZ są początkowo poddawane hodowli neurosfery. Dobrze rozwinięty system hodowli pozwala na weryfikację ich cech i może przyczynić się do wzrostu badań nad NSC. System hodowli neurosfery stanowi użyteczne narzędzie do określania proliferacji i zbierania prawdziwych NSC. Hodowla jednowarstwowa jest również systemem in vitro do oznaczania proliferacji i różnicowania. Co istotne, ten system hodowli zapewnia bardziej jednorodne środowisko dla NSC niż system hodowli neurosfery. Tak więc, wykorzystując dyskretny region mózgu, te systemy hodowli będą pomocne w poszerzaniu naszej wiedzy na temat aNSC i ich zastosowań terapeutycznych.

Zdefiniowanie systemu hodowli aNSC z nieznanego regionu neurogennego jest niezbędne dla zrozumienia tych komórek oraz opracowania możliwości ich wykorzystania w regeneracji mózgu12. Wiadomo, że NSCs na różnych etapach rozwoju lub w różnych regionach zachowują się odmiennie3,4. Niedawno zgłoszono, że komórki pochodzące z SCZ wykazują inny potencjał do różnicowania neuronalnego in vivo i in vitro w porównaniu do komórek pochodzących z SVZ7-9</sup...

Ustanowienie systemów hodowli do ekspansji dorosłych nerwowych komórek macierzystych (aNSC) pozwala na badanie i zastosowanie aNSC w terapii. Strefa podmodzelowa (SCZ) została niedawno uznana za nowy region tworzący neuroblasty u dorosłych myszy. W tym miejscu opisano metody izolacji, ekspansji i różnicowania SCZ-aNSC.

Izolacja i hodowla dorosłych nerwowych komórek macierzystych ze strefy podmodzelowej myszy

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Ogólnym celem tego systemu hodowli dorosłych komórek nerwowych jest izolacja dorosłych komórek macierzystych tkanki nerwowej ze strefy podwywołowatej oraz namnażanie tych komórek w nieprzylegających i przylegających systemach hodowli. Niniejszy materiał może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie dorosłych komórek macierzystych tkanki nerwowej, takie jak izolacja i hodowla komórek macierzystych tkanki nerwowej z niewielkich obszarów mózgu, np. ze strefy podwywołowatej. Główną zaletą tej techniki jest izolacja dorosłych komórek macierzystych tkanki nerwowej ze strefy podwywołowatej.Procedura jest prosta, lecz precyzyjna. Aby ją rozpocząć, należy wysterylizować w autoklawie matrycę do mózgu, dwustronną żyletkę oraz pęsetę. Następnie należy przygotować 50 ml zimnego PBS do przemywania mózgu myszy.Następnie należy przygotować mikroskop stereoskopowy oraz narzędzia chirurgiczne niezbędne do sekcji mózgu i izolacji SCZ. Przygotować pożywkę F-12 DMEM z dodatkiem 2% B-27, 1% N-2 oraz 1% penicyliny-streptomycyny. Następnie należy przygotować bufor trawienny do trawienia tkanek.Następnie przygotuj 0,01% Poly-L-Ornithine oraz lamininę. Po tym czasie pokryj sześć małych płytek do

isolation-culture-adult-neural-stem-cells-from-mouse-subcallosal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W tym filmie opisano metodę izolacji neuroprekursorów z rozwijającej się kory zarodków myszy. Przedstawiono procedurę usuwania zarodków z macicy, wycinania tkanki korowej oraz trawienia wyizolowanej kory mózgu.

Hodowla prekursorów neuronalnych komórek macierzystych myszy

Niniejszy protokół wideo demonstruje metodę testu neurosfer w celu generowania i namnażania neuralnych komórek macierzystych z obszaru okołokomorowego dorosłej myszy oraz dostarcza wskazówek technicznych pozwalających na uzyskanie powtarzalnych kultur neurosfer.

Izolacja i ekspansja dorosłych komórek macierzystych układu nerwowego myszy z wykorzystaniem testu neurosferowego

Niniejszy protokół wideo demonstruje zastosowanie testu neurosfer do izolacji i ekspansji komórek macierzystych mózgu z eminencji zwojowych mózgu myszy w 14. dniu embrionalnym.

Ustanowienie hodowli embrionalnych neuralnych komórek macierzystych myszy z wykorzystaniem testu neurosferowego

Film pokazuje proces izolacji i hodowli nerwowych komórek macierzystych ze strefy podmodzelowej mózgu myszy. Polega na rozwarstwieniu tkanek, dysocjacji enzymatycznej i wyhodowaniu ich za pomocą czynników różnicujących, aby rozwinęły się w dojrzałe komórki nerwowe.

Ten film demonstruje szczegółowy protokół izolowania ścian bocznych komór od mózgu dorosłej myszy i przeprowadzania enzymatycznej dysocjacji tkanek w celu uzyskania pojedynczych komórek. Komórki te są następnie poddawane specyficznym warunkom hodowli, które selektywnie zwiększają proliferację nerwowych komórek macierzystych i promują ich różnicowanie w kokultury oligodendrocytów i astrocytów.

Uzyskiwanie mieszanej kultury oligodendrocytów i astrocytów z dorosłych komórek macierzystych nerwowych myszy

Ten film demonstruje metodę izolowania komórek macierzystych z móżdżku myszy po urodzeniu i różnicowania ich w komórki nerwowe. Komórki macierzyste z izolowanej zawiesiny komórkowej są oczyszczane za pomocą kulek magnetycznych pokrytych przeciwciałami i są hodowane w celu utworzenia neurosfer. Neurosfery są następnie utrzymywane w pożywce różnicującej w celu wytworzenia komórek nerwowych.

Izolacja komórek macierzystych z poporodowego móżdżku myszy i różnicowanie w komórki nerwowe

Neuronalne komórki macierzyste pobrane z dorosłego mózgu są coraz częściej wykorzystywane w różnych zastosowaniach, począwszy od podstawowych badań nad rozwojem układu nerwowego, a skończywszy na odkrywaniu potencjalnych zastosowań klinicznych w medycynie regeneracyjnej. To sprawia, że rygorystyczna kontrola warunków izolacji i hodowli stosowanych do hodowli tych komórek ma kluczowe znaczenie dla uzyskania solidnych wyników eksperymentalnych.

Hodowla nerwowych komórek macierzystych z konwencjonalnych i niekonwencjonalnych regionów mózgu dorosłego gryzonia

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół jednoczesnego generowania kultur neuronalnych komórek prekursorowych, jako przylegających monowarstw lub neurosfer, ze strefy podkomorowej i zakrętu zębatego poszczególnych dorosłych myszy.

Jedna mysz, dwie kultury: izolacja i hodowla dorosłych nerwowych komórek macierzystych z dwóch stref neurogennych poszczególnych myszy

Opisujemy metodę opartą na Fluorescencyjnym Sortowaniu Komórek Aktywowanych (FACS) w celu izolacji nerwowych komórek macierzystych (NSC) i ich potomstwa ze strefy podkomorowej (SVZ) mózgu dorosłej myszy. Stosowany do transgenicznych myszy z fluorescencyjnym wskaźnikiem ubikwitynacji cyklu komórkowego (FUCCI), umożliwia badanie progresji cyklu komórkowego za pomocą obrazowania na żywo.

Sortowanie komórek nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych ze strefy podkomorowej dorosłej myszy i obrazowanie na żywo ich dynamiki cyklu komórkowego

Tutaj wprowadzamy nowatorską technikę mikrochirurgiczną do izolacji nerwowych komórek macierzystych z wyniosłości zwojowej zarodka myszy E13.

Izolacja i hodowla embrionalnych mysich nerwowych komórek macierzystych

Tutaj opisujemy system nukleofekcji zaprojektowany w celu zwiększenia efektywności dostarczania genów w rozszerzonych nerwowych komórkach macierzystych (NSC) wyizolowanych z dorosłej mysiej strefy podkomorowej. Wyniki pokazują, że metoda ta znacznie poprawia perturbację genów w NSC, przewyższając skuteczność tradycyjnych protokołów transfekcji i zwiększając wskaźnik przeżywalności komórek.

Izolacja, ekspansja i nukleofekcja nerwowych komórek macierzystych z dorosłej mysiej strefy podkomorowej

Naucz się izolować i hodować dorosłe nerwowe komórki macierzyste ze strefy podmodzelowej myszy. Ta precyzyjna metoda umożliwia badanie neurogenezy dorosłych i potencjalne zastosowania terapeutyczne w leczeniu chorób neurologicznych.

Izolacja i hodowla dorosłych nerwowych komórek macierzystych ze strefy podmodzelowej myszy

Przeglądaj więcej filmów