Name: Znakowanie ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z rakiem piersi za pomocą identyfikowalnych reporterów do badań wzrostu guza i przerzutów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Poznaj metodę znakowania ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z rakiem piersi przy użyciu reporterów fluorescencyjnych i lucyferazy. Technika ta umożliwia śledzenie wzrostu guza i przerzutów w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują dr Darrelowi Kottonowi z Boston University za dostarczenie wektora pHAGE-EF1aL-dsRed-UBC-GFP-W oraz protokołów produkcji lentiwirusa o wysokim mianie, wykorzystywanych w tych badaniach. Praca ta została sfinansowana przez DOD BCRP W81XWH-11-1-0101 (DMC), ACS IRG # 57-001-53 (DMC), NCI K22CA181250 (DMC) i R01 CA140985 (CAS). Grant NCI P30CA046934 Center wspierał obrazowanie in vivo i hodowle tkankowe na University of Colorado AMC.

<ol><li>Jin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+human+tumour+tissue+xenografts+in+immunodeficient+mice%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transl+Oncol%22%5BJournal%5D)">Patient-derived human tumour tissue xenografts in immunodeficient mice: a systematic review.</a> Clin Transl Oncol. 12 (7), 473-480 (2010).</li>
<li>Siolas, D., Hannon, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+tumor+xenografts%3A+transforming+clinical+samples+into+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models.</a> Cancer Res. 73 (17), 5315-5319 (2013).</li>
<li>DeRose, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+grafts+derived+from+women+with+breast+cancer+authentically+reflect+tumor+pathology%2C+growth%2C+metastasis+and+disease+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes.</a> Nat Med. 17 (11), 1514-1520 (2011).</li>
<li>Kabos, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+luminal+breast+cancer+xenografts+retain+hormone+receptor+heterogeneity+and+help+define+unique+estrogen-dependent+gene+signatures%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+cancer+research+and+treatment%22%5BJournal%5D)">Patient-derived luminal breast cancer xenografts retain hormone receptor heterogeneity and help define unique estrogen-dependent gene signatures.</a> Breast cancer research and treatment. 135 (2), 415-432 (2012).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+renewable+tissue+resource+of+phenotypically+stable%2C+biologically+and+ethnically+diverse%2C+patient-derived+human+breast+cancer+xenograft+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A renewable tissue resource of phenotypically stable, biologically and ethnically diverse, patient-derived human breast cancer xenograft models.</a> Cancer Res. 73 (15), 4885-4897 (2013).</li>
<li>Lum, D. H., Matsen, C., Welm, A. L., Welm, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+human+primary+tumorgraft+models%3A+comparisons+with+traditional+oncology+preclinical+models+and+the+clinical+relevance+and+utility+of+primary+tumorgrafts+in+basic+and+translational+oncology+research%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Overview of human primary tumorgraft models: comparisons with traditional oncology preclinical models and the clinical relevance and utility of primary tumorgrafts in basic and translational oncology research.</a> Curr Protoc Pharmacol. , (2012).</li>
<li>Marangoni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+model+of+patient+tumor-derived+breast+cancer+xenografts+for+preclinical+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A new model of patient tumor-derived breast cancer xenografts for preclinical assays.</a> Clin Cancer Res. 13 (13), 3989-3998 (2007).</li>
<li>Garrido-Laguna, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+engraftment+in+nude+mice+and+enrichment+in+stroma-+related+gene+pathways+predict+poor+survival+and+resistance+to+gemcitabine+in+patients+with+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Tumor engraftment in nude mice and enrichment in stroma- related gene pathways predict poor survival and resistance to gemcitabine in patients with pancreatic cancer.</a> Clin Cancer Res. 17 (17), 5793-5800 (2011).</li>
<li>Landis, M. D., Lehmann, B. D., Pietenpol, J. A., Chang, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+breast+tumor+xenografts+facilitating+personalized+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Patient-derived breast tumor xenografts facilitating personalized cancer therapy.</a> Breast Cancer Res. 15 (1), 201(2013).</li>
<li>Norum, J. H., Andersen, K., Sorlie, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lessons+learned+from+the+intrinsic+subtypes+of+breast+cancer+in+the+quest+for+precision+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Surg%22%5BJournal%5D)">Lessons learned from the intrinsic subtypes of breast cancer in the quest for precision therapy.</a> Br J Surg. 101 (8), 925-938 (2014).</li>
<li>Tentler, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+tumour+xenografts+as+models+for+oncology+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development.</a> Nat Rev Clin Oncol. 9 (6), 338-350 (2012).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+xenografts+of+triple-negative+breast+cancer+reproduce+molecular+features+of+patient+tumors+and+respond+to+mTOR+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Patient-derived xenografts of triple-negative breast cancer reproduce molecular features of patient tumors and respond to mTOR inhibition.</a> Breast Cancer Res. 16 (2), R36(2014).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+from+human+breast+tumors+are+involved+in+spontaneous+metastases+in+orthotopic+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells from human breast tumors are involved in spontaneous metastases in orthotopic mouse models.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (42), 18115-18120 (2010).</li>
<li>Kang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cancer+stem+cell+metastasis+in+xenograft+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of cancer stem cell metastasis in xenograft animal models.</a> Methods Mol Biol. 568, 7-19 (2009).</li>
<li>Thibaudeau, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mimicking+breast+cancer-induced+bone+metastasis+in+vivo%3A+current+transplantation+models+and+advanced+humanized+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Rev%22%5BJournal%5D)">Mimicking breast cancer-induced bone metastasis in vivo: current transplantation models and advanced humanized strategies.</a> Cancer Metastasis Rev. 33 (2-3), 721-735 (2014).</li>
<li>Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+advanced+spontaneous+metastasis+for+experimental+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics.</a> Nat Rev Cancer. 11 (2), 135-141 (2011).</li>
<li>Powell, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+deficiency+linked+to+B+cell+translocation+gene+2+%28BTG2%29+loss+enhances+metastatic+potential+by+promoting+tumor+growth+in+primary+and+metastatic+sites+in+patient-derived+xenograft+%28PDX%29+models+of+triple-negative+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">p53 deficiency linked to B cell translocation gene 2 (BTG2) loss enhances metastatic potential by promoting tumor growth in primary and metastatic sites in patient-derived xenograft (PDX) models of triple-negative breast cancer.</a> Breast Cancer Res. 18 (1), (2016).</li>
<li>DeRose, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+models+of+human+breast+cancer%3A+protocols+for+in+vitro+and+in+vivo+applications+in+tumor+biology+and+translational+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Patient-derived models of human breast cancer: protocols for in vitro and in vivo applications in tumor biology and translational medicine.</a> Curr Protoc Pharmacol. , (2013).</li>
<li>Wang, X., McManus, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirus+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Lentivirus production.</a> J Vis Exp. (32), (2009).</li>
<li>Indumathi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+depletion+of+stromal+vascular+fractions+isolated+from+human+adipose+tissue%3A+a+novel+approach+towards+cell+enrichment+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Lineage depletion of stromal vascular fractions isolated from human adipose tissue: a novel approach towards cell enrichment technology.</a> Cytotechnology. 66 (2), 219-228 (2014).</li>
<li>Hines, W. C., Yaswen, P., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+breast+cancer+requires+identification+and+correction+of+a+critical+cell+lineage-dependent+transduction+bias%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Modelling breast cancer requires identification and correction of a critical cell lineage-dependent transduction bias.</a> Nat Commun. 6, 6927(2015).</li>
<li>Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+bone+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Models of bone metastasis.</a> J Vis Exp. (67), e4260(2012).</li>
<li>Kang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+TGFbeta+Signaling+in+Mouse+Models+of+Cancer+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging TGFbeta Signaling in Mouse Models of Cancer Metastasis.</a> Methods Mol Biol. 1344, 219-232 (2016).</li>
<li>Jenkins, D. E., Hornig, Y. S., Oei, Y., Dusich, J., Purchio, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescent+human+breast+cancer+cell+lines+that+permit+rapid+and+sensitive+in+vivo+detection+of+mammary+tumors+and+multiple+metastases+in+immune+deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Bioluminescent human breast cancer cell lines that permit rapid and sensitive in vivo detection of mammary tumors and multiple metastases in immune deficient mice.</a> Breast Cancer Res. 7 (4), R444-R454 (2005).</li>
<li>Lawson, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+reveals+a+stem-cell+program+in+human+metastatic+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis reveals a stem-cell program in human metastatic breast cancer cells.</a> Nature. 526 (7571), 131-135 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Kluczowe kroki w protokole:
Zastosowanie cząstek lentiwirusowych o wysokim mianie (>108 TU/ml) jest kluczowym krokiem w kierunku powodzenia tego protokołu, ponieważ umożliwia dokładną kontrolę składu pożywki podczas transdukcji in vitro . Chociaż wiele metod produkcji cząstek wirusa o wysokim mianie zostało dobrze opisanych18,19; W protokole tym wykorzystuje się cząsteczki lentiwirusowe wytwarzane zgodnie z opisem szczegółowo na <a href="http://w...

Rozwój ksenoprzeszczepów nowotworowych pochodzących od pacjentów (PDX), gdzie chirurgicznie wycięte próbki guza są bezpośrednio wszczepiane do myszy z obniżoną odpornością, oferuje kilka zalet w porównaniu ze standardowymi modelami ksenoprzeszczepów linii komórkowych i stanowi duży postęp w badaniach nad rakiem1,2. PDX mogą być utrzymywane i rozwijane przez kolejne pasaże przy minimalnej zmianie cech genetycznych i biologicznych guza wyhodowanego przy pierwszym pasażu; i dokładniej odzwierciedlają niejednorodność guza niż ksenoprzeszczepy pochodzące z ludzkich linii komórek nowotworowych3-8. Modele te są obecnie szeroko stosowane jako platforma do personalizacji terapii nowotworów9,10, jako platforma przedkliniczna w opracowywaniu leków6,11 oraz jako narzędzie eksperymentalne do badania biologii nowotworów4,12.
Większość PDX jest wszczepiana i rozmnażana podskórnie, co umożliwia pomiar wzrostu guza w czasie za pomocą suwmiarki. Jednak choroba z przerzutami była trudniejsza do modelowania przy użyciu PDX. W szczególności w przypadku raka piersi opisano ksenoprzeszczepy ze zdolnością przerzutową do różnych narządów3,5,13, ale częstość spontanicznego rozsiewu do miejsc przerzutów jest niezwykle niska. Tam, gdzie podano, identyfikacja i kwantyfikacja obciążenia przerzutami opiera się na pracochłonnym badaniu histologicznym narządów docelowych po sekcji zwłok. Linie komórek nowotworowych wykazujące ekspresję genów bioluminescencyjnych (lucyferaza, Luc) lub fluorescencyjnych (zielone białko fluorescencyjne, GFP) są powszechnie stosowane w eksperymentalnych modelach przerzutów raka piersi do mózgu, płuc, kości i wątroby po wstrzyknięciu dosercowym, żylnym ogonowym, udowym i śledziony14-16. Chociaż modele te omijają rozprzestrzenianie się z guzów pierwotnych, są cenne dla badania mechanizmów tropizmu narządów i kolonizacji przerzutów. Jednak komórki pochodzące z pierwotnych guzów pacjenta i PDX mogą mieć niskie wskaźniki transfekcji lub transdukcji przy użyciu standardowych procedur. Jedną z alternatyw jest ustanowienie linii komórkowych pochodzących z PDX in vitro17, które można następnie znakować przy użyciu konwencjonalnych protokołów hodowli tkankowych. Takie podejście nie jest jednak odpowiednie do znakowania większości PDX, dla których wyprowadzenie linii komórkowej jest trudne i może zmienić fenotyp komórek. W tym miejscu przedstawiamy protokół transdukcji komórek nowotworowych zdysocjowanych PDX za pomocą wektorów lentiwirusowych odpowiednich do obrazowania in vivo. Ponadto opisujemy eksperymentalne przerzuty za pomocą wstrzyknięcia dosercowego zdysocjowanych komórek PDX znakowanych luc-GFP u myszy z obniżoną odpornością.
Podstawowy protokół transdukcji organoidów zdysocjowanych PDX z ekspresją genu wykazującego ekspresję lentiwirusa został wcześniej opisany 18. W obecnym protokole opisujemy dodatkowe metody wzbogacania ludzkich komórek nowotworowych i uzyskania niemal 100% skuteczności transdukcji, a także zastosowanie znakowanych PDX do wykrywania eksperymentalnych przerzutów raka piersi. Protokół ten można dostosować do znakowania wielu typów nowotworów PDX za pomocą różnych markerów luminescencyjnych i fluorescencyjnych, a także modulacji ekspresji genów (tj. knockdown shRNA genów będących przedmiotem zainteresowania).

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12 (1:1)</td><td>Hyclon</td><td>SH30023.01</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>BD Biosciences</td><td>354060</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>BD Biosciences</td><td>354001</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>Sigma</td><td>H4784</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco/Thermo Fisher</td><td>17504-44</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyki przeciwgrzybicze</td><td>Hyclon</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Accumax</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AM-105-500</td><td>Bufor wytrawiający</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>HBSS Red Ca2+/Mg2+ za darmo</td><td>Hyklon</td><td>SH30031.02</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30258.01</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex Cultrex</td><td></td><td>3433-005-01</td><td>Ekstrakt z matrycy piwnicznej (BME)</td></tr><tr><td>30 &#176; Wytrząsarka C</td><td>NewBrunswick Scientific CO. INC</td><td>Series 25 Wytrząsarka</td><td></td>inkubatora</tr><tr><td>70 &#956; m filtry</td><td>Falcon</td><td>7352350</td><td></td></tr><tr><td>skalpele</td><td>Fisher</td><td>22079690</td><td></td></tr><tr><td>Klorheksydyna środek dezynfekujący</td><td>Durvet&nbsp;</td><td>NDC# 30798-624-35</td><td></td></tr><tr><td>Czerwona krew&nbsp; odczynnik do lizy komórek</td><td>Sigma</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>Neuraminidaza</td><td>Sigma</td><td>N7885-1UN</td><td></td></tr><tr><td>EpCAM (CD326+) mikrogranulki*</td><td>Miltenyil Biotec</td><td>130-061-101</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do zmniejszania liczby komórek linii, mysz*</td><td>Miltenyil Biotec</td><td>130-090-858</td><td></td></tr><tr><td>Separator MiniMACS&nbsp;</td><td>Miltenyil Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>Mini MACS Stojak magnetyczny</td><td>Miltenyil Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Kolumny MS</td> Można stosować kolumny <td>Miltenyil Biotec</td><td>130-042-201</td><td>MS lub LS, dostosuj do liczby komórek.</td></tr><tr><td>Illumatool Przestrajalny system świetlny</td><td>Badania Narzędzia</td><td>Różne</td><td>Do obrazowania fluorescencyjnego in vivo</td></tr><tr><td>Urządzenie do obrazowania IVIS200 ksenogenu</td><td></td><td>Różne</td><td>Do obrazowania luminescencji in vivo</td></tr><tr><td>Ludzki klon cytokeratyny MNF116 Przeciwciało monoklonalne</td><td>DAKO</td><td>M0821</td><td>Pan-cytokeratyna&nbsp;</td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko receptorowi naskórkowego czynnika wzrostu</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>4267S</td><td>EGFR</td></tr></tbody></table>

znakowanie ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z rakiem piersi za pomocą identyfikowalnych reporterów do badań wzrostu guza i przerzutów

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

Wykorzystanie modeli przedklinicznych do badania biologii nowotworów i odpowiedzi na leczenie jest kluczowe dla badań nad rakiem. Istniejące od dawna ludzkie linie komórkowe i wiele transgenicznych modeli myszy często nie są w stanie podsumować kluczowych aspektów nowotworów złośliwych u ludzi. W związku z tym opracowywane są alternatywne modele, które lepiej reprezentują heterogeniczność guzów pacjentów i ich przerzutów. Modele ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów (PDX), w których chirurgicznie wycięte próbki guza są wszczepiane myszom z obniżoną odpornością, stały się atrakcyjną alternatywą, ponieważ mogą być przeszczepiane przez wiele pokoleń i skuteczniej odzwierciedlają heterogeniczność guza niż ksenoprzeszczepy pochodzące z ludzkich linii komórkowych raka. Ograniczeniem w stosowaniu PDX jest to, że są one trudne do transfekcji lub transdukcji w celu wprowadzenia identyfikowalnych reporterów lub manipulowania ekspresją genów. Obecny protokół opisuje metody transdukcji zdysocjowanych komórek nowotworowych z PDX o wysokiej wydajności transdukcji oraz zastosowanie znakowanych PDX do eksperymentalnych modeli przerzutów raka piersi. Protokół demonstruje również zastosowanie znakowanych PDX w eksperymentalnych modelach przerzutów do badania procesu kolonizacji narządów kaskady przerzutowej. Przerzuty do różnych narządów można łatwo zwizualizować i określić ilościowo za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego u żywych zwierząt lub ekspresji GFP podczas sekcji i w wyciętych narządach. Metody te stanowią potężne narzędzie do rozszerzenia zastosowania wielu typów PDX do badań nad przerzutami.

Niniejsza metoda opisuje transdukcję komórek raka piersi wyizolowanych z modeli PDX przy użyciu lentiwirusem wektorów o wysokim mianie pSIH1-H1-copGFP-T2A-puro oraz pHAGE-EF1aL-luciferase-UBC-GFP-W. Wektory te wykazują ekspresję markera fluorescencyjnego, który umożliwia oszacowanie wydajności transdukcji in vitro już 24 h po infekcji (Rysunek 1a). W większości przypadków PDX ekspresja GFP jest opóźniona do 72 h po infekcji (Rysunek 1b), kiedy to...

Opisujemy metodę stabilnego znakowania ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów (PDX) cząstkami lentiwirusowymi wyrażającymi białko zielonej fluorescencji i reportery lucyferazy. Metoda ta pozwala na śledzenie wzrostu PDX w miejscu pierwotnym, a także wykrywanie spontanicznych i eksperymentalnych przerzutów za pomocą systemów obrazowania in vivo.

Znakowanie ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z rakiem piersi za pomocą identyfikowalnych reporterów do badań wzrostu guza i przerzutów

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu transdukcji jest stabilne wprowadzenie genów reporterowych do ksenograftów pochodzących od pacjentów (PDX), aby ułatwić ich wykorzystanie w modelach przerzutów eksperymentalnych i spontanicznych. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w badaniach nad nowotworami, takie jak zakres przerzutów pozaskórnych z ksenograftów pochodzących od pacjentów. Główną zaletą tej techniki jest możliwość śledzenia znakowanych PDX za pomocą obrazowania in vivo, co ułatwia ocenę zorganizowanych, specyficznych przerzutów bez konieczności przeprowadzania rozległych analiz histologicznych po śmierci.Protokół ten zaprezentuje Jessica Finlay-Schultz, pracownik postdoktorski, która rutynowo stosuje tę metodę do znakowania ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z rakiem piersi. Stosując technikę aseptyczną, należy rozpocząć od nacięcia skalpelem skóry wokół guza. Następnie, odciągając skórę pęsetą, należy za pomocą czystego skalpela oddzielić skórę od guza.Gdy guz zostanie całkowicie odsłonięty, należy użyć czystego zestawu pęsety i skalpela, aby przenieść tkankę do 5 ml medium płuczącego na lodzie. Następnie należy odlać medium i dwukrotnie wypłukać guz 10 ml HBSS uzupełnionego o HEPES. Wypłukany guz należy umieścić w sterylnym, wcześniej zważonym 60 cm naczyniu hodowlanym, a następnie zważyć naczynie, aby oszacować masę guza.Za pomocą skalpela należy przeciąć guza na pół. Następnie z jednej z połówek należy wyciąć krążek o średnicy trzech milimetrów i umieścić go w 10% formalinie na 24 godziny. Do pozostałej części guza należy dodać 200 µl HBSS z HEPES, a następnie za pomocą pęsety i czystego skalpela rozdrobić tkankę na jak najmniejsze kawałki.Przenieś fragmenty do sterylnej probówki stożkowej o pojemności 50 ml i dodaj co najmniej 1 ml buforu do trawienia, uzupełnionego o środki przeciwgrzybicze i antybiotyki, na każde 100 mg guza. Po trzech godzinach w temperaturze 30 °C i przy 125 do 200 obrotach na minutę dodaj 35 ml medium płuczącego, aby przerwać trawienie, a otrzymaną zawiesinę tkankową przefiltruj przez nylonowy sito o oczkach 70 µm do nowej probówki stożkowej o pojemności 50 ml w celu usunięcia nietrawionych fragmentów tkanki. Zbierz komórki poprzez wirowanie, a osad resuspenduj w 1 ml buforu do lizy erytrocytów na pięć minut w temperaturze pokojowej.Po zakończeniu lizy przywrócić toniczność, dodając 10 ml buforu do płukania, a następnie przefiltrować komórki przez filtr 40 µm, aby usunąć ewentualne skupiska. Ponownie odwirować komórki i zawiesić osad w 5 ml buforu do płukania w lodzie. Następnie policzyć liczbę żywych komórek metodą wykluczania błękitu trypanu.Aby wzbogacić populację ludzkich komórek raka nabłonkowego poprzez usuwanie komórek linii lineage plus Mel, przenieś do nowej probówki polipropylenowej o pojemności 5 ml do 1 × 10⁷ komórek i dodaj do nich 2 ml buforu do wzbogacania frakcji nabłonkowej. Odwirowuj komórki, a następnie za pomocą pipety całkowicie usuń nadsącz. Następnie zawieś osad w 40 µl lodowatego buforu do wzbogacania frakcji nabłonkowej i dodaj 10 µl koktajlu przeciwciał z biotyną na każde 1 × 10⁷ komórek.Wymieszać delikatnie za pomocą pipety i inkubować zawiesinę komórkową przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Po zakończeniu inkubacji komórki zmieszać z 30 µL buforu do wzbogacania frakcji nabłonkowej na każde 1×10⁷ komórek. Następnie dodać 20 µL mikrokulek z antybiotyną, delikatnie mieszając.Po 15 minutach w temperaturze 4°C przemyj komórki 3 mL zimnego buforu do wzbogacania frakcji nabłonkowej, a następnie ostrożnie odessij nadsącz. Ponownie zawieś osad w 500 µL buforu do wzbogacania frakcji nabłonkowej na lodzie i umieść kolumnę w separatorze magnetycznym. Przepłucz kolumnę 0,5 mL buforu do wzbogacania frakcji nabłonkowej.Następnie należy umieścić nową polipropylenową probówkę do zbierania pod kolumną. Potem powoli należy nanieść znakowane komórki na kolumnę. Zbieramy odciek wzbogaconej, nieznakowanej frakcji komórek nowotworowych, negatywnej pod względem linii komórkowych, a następnie płuczemy kolumnę trzy razy 500 µL świeżego buforu do wzbogacania nabłonka.Aby przeprowadzić transdukcję komórek nowotworowych, odwirować wyizolowane komórki w celu ich ponownego zawieszenia w 2 ml medium do mammosfer. Po dokonaniu obliczeń ilości komórek, ponownie odwirować komórki, a osad zawiesić w 2 ml medium do mammosfer uzupełnionego o 20 µL polybrene. Następnie w studzienkach sześciodołkowej płytki hodowlanej o ultra niskiej adhezji wysiać 2 × 10⁵ żywych komórek nowotworowych na studzienkę i dodać do komórek cząstki lentiwirusowe przy wielokrotności zakażenia (MOI) równej 10.Zakręć płytką, aby wymieszać wirusa z komórkami. Następnie inkubuj kokultury w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide przez maksymalnie 96 hours. Po pierwszych 24 hours dodaj 500 µL świeżego pożywki do mammosfer.Gdy co najmniej 10% komórek wykazuje pozytywny sygnał GFP, przenieś przetransdukowane komórki z co najmniej jednej studzienki do 15 mililitrowej probówki stożkowej w temperaturze 0°C, a następnie przemyj studzienkę jednym mililitrem pożywki do mammosfer. Połącz płuczkę z komórkami i odwiruj komórki nowotworowe w 10 mililitrach HBSS z dodatkiem HEPES. Na koniec resuspenduj komórki w 50 mikrolitrach ekstraktu macierzy podstawnej w temperaturze 0°C.Następnie należy przenieść osadzone komórki do strzykawki insulinowej o pojemności 0,5 mililitra w celu reimplantacji. Niektóre wektory w fiolkach o wysokim mianie wykazują ekspresję markera fluorescencyjnego, co pozwala na oszacowanie wydajności transdukcji in vitro już 24 godziny po infekcji. W przypadku większości modeli PDX ekspresja GFP będzie opóźniona do 72 godzin po infekcji.W tym momencie powszechnie obserwuje się tworzenie agregatów komórkowych. Po zawieszeniu w macierzy zewnątrzkomórkowej i reimplantacji, znakowane komórki nowotworowe regenerują guzy, które można śledzić za pomocą bioluminescencji lub fluorescencji. Prawidłowo znakowany model PDX będzie w niemal 100% GFP-dodatni w pierwszym pokoleniu po transdukcji i pozostanie taki w kolejnych pasażach.Jednak niektóre modele PDX wykazują niejednorodne rozmieszczenie komórek GFP-dodatnich, co wskazuje na suboptimalną transdukcję in vitro. Barwienie immunohistochemiczne tkanki nowotworowej ujawnia, że ekspresja kluczowych markerów, takich jak receptor epidermalnego czynnika wzrostu oraz pan-cytokeratyny, zostaje zachowana nawet po kilku pasażach i reimplantacjach. Eksperymentalne modele przerzutowania stanowią alternatywę do badania tropizmu narządowego i etapów kolonizacji narządów w kaskadzie przerzutniczej.Rzeczywiście, przetransdukowany model PDX wstrzyknięty w dawce 2,5 × 10⁵ komórek na mysz tworzy przerzuty w wątrobie, które można łatwo zidentyfikować za pomocą obrazowania lucyferazy in vivo, a także w płucach, które można zwizualizować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej ex vivo. Po opanowaniu techniki, dysocjacja i znakowanie modeli PDX zajmuje około 4 godzin.Rzeczywisty wzrost guza może trwać od 8 do 12 tygodni, w zależności od rodzaju guza i zastosowanego systemu. Przy próbie wykonania tej procedury ważne jest użycie wirusa o wysokim mianie z genem reporterowym, co pozwala na monitorowanie zarówno wydajności transfekcji, jak i wzrostu guza in vivo. Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak badania przerzutowania in vivo, aby odpowiedzieć na inne pytania dotyczące progresji guza, przerzutów oraz odpowiedzi na leczenie.Technika ta otwiera przed badaczami raka piersi drogę do eksploracji wielu aspektów progresji nowotworu z wykorzystaniem nowoczesnych modeli PDX, które lepiej oddają heterogeniczność guza. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak znakować dysocjowane komórki nowotworowe za pomocą cząsteczek lentiwirusowych o wysokim mianie. Pozwoli to zarówno na śledzenie komórek nowotworowych in vivo, jak i na potencjalną manipulację ekspresją interesujących genów.Należy pamiętać, że praca z cząsteczkami lentiwirusowymi może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać odpowiednich środków ostrożności.

labeling-breast-cancer-patient-derived-xenografts-with-traceable

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Dyfuzyjna tomografia fluorescencyjna oferuje stosunkowo niskokosztowe i potencjalnie wysokoprzepustowe podejście do przedklinowego obrazowania guzów in vivo. Przedstawiono metodologię zbierania danych optycznych, kalibracji i rekonstrukcji obrazu dla bezkontaktowego systemu w dziedzinie czasu sterowanego tomografią komputerową, z wykorzystaniem fluorescencyjnego celowania w biomarker nowotworowy – receptor Epidermal Growth Factor Receptor w modelu glejaka u myszy.

Tomografia dyfuzyjna fluorescencji w dziedzinie czasu sterowana tomografią komputerową u małych zwierząt w celu lokalizacji biomarkerów nowotworowych

Poniższy film opisuje technikę transdukcji do znakowania (ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjenta) komórek nowotworowych PDX, która jest używana do wprowadzania do komórki nowotworowej in vitro wirusa lentiwirusa wyrażającego białko zielonej fluorescencji i reportery lucyferazy.

Transdukcja w celu znakowania komórek nowotworowych PDX: wprowadzenie markera fluorescencyjnego eksprymującego lentiwirusa do komórki nowotworowej in vitro

Ten manuskrypt szczegółowo opisuje metodę używaną do generowania ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z rakiem prostaty (PDX) z krążących komórek nowotworowych (CTC). Generowanie modeli PDX z CTC zapewnia alternatywny model eksperymentalny do badania raka prostaty; Najczęściej diagnozowany nowotwór i częsta przyczyna zgonów z powodu raka u mężczyzn.

Generowanie modeli ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z rakiem prostaty z krążących komórek nowotworowych

Przerzuty raka jajnika charakteryzują się licznymi rozlanymi zmianami wewnątrzotrzewnowymi, tak że dokładne wizualne określenie obciążenia guzem jest trudne.  W niniejszym artykule opisano metodę ilościowego oznaczania obciążenia guzem przerzutowym in situ i ex vivo przy użyciu komórek nowotworowych znakowanych białkiem czerwonej fluorescencji (RFP) i obrazowania optycznego.

Kwantyfikacja przerzutów do raka jajnika do zatrzewnej

Tutaj opisujemy model i podejście do badania funkcji makrofagów pęcherzyków płucnych w przerzutach raka. Aby zademonstrować rolę tych komórek w przerzutach, wykorzystano syngeniczny (4T1) model raka piersi w połączeniu z wyczerpaniem makrofagów pęcherzykowych za pomocą liposomów klodronianowych.

Badanie roli makrofagów pęcherzykowych w przerzutach raka piersi

Opisujemy protokół przedklinicznego śledzenia in vivo przerzutów nowotworowych. Opiera się on na reporterze radionuklidowo-fluorescencyjnym łączącym symporter jodku sodu, wykrywany przez nieinwazyjny [18F]tetrafluoroboran-PET, oraz białko fluorescencyjne w celu usprawnionego potwierdzenia ex vivo. Metoda ma zastosowanie do przedklinicznego śledzenia komórek in vivo poza biologią guza.

Obrazowanie genu reporterowego radionuklidowo-fluorescencyjnego w celu śledzenia progresji guza w modelach guzów gryzoni

Tutaj prezentujemy protokół wykorzystania wspomaganego ultradźwiękami wstrzykiwania komórek nerwiaka zarodkowego (NB) i mięsaka Ewinga (ES) (ustalone linie komórkowe i komórki nowotworowe pochodzące od pacjenta) w biologicznie istotnych miejscach do tworzenia wiarygodnych modeli przedklinicznych do badań nad rakiem.

Wykorzystanie implantacji komórkowej sterowanej tkankami pod kontrolą ultradźwięków do ustalenia biologicznie istotnych ksenoprzeszczepów nowotworowych z przerzutami

Ta praca wstępnie ustawia zaawansowany protokół do dokładnej oceny obciążenia guza poprzez detekcję zielonego białka fluorescencyjnego i sygnałów bioluminescencji, a także integrację ilościowej techniki wykrywania molekularnego.

Badanie potrójnie ujemnego raka piersi przy użyciu ortotopowego modelu raka piersi

Tutaj prezentujemy protokół do testowania skuteczności terapii celowanych, wybranych na podstawie składu genomowego guza. Protokół opisuje identyfikację i walidację strukturalnych rearanżacji DNA, wszczepianie guzów pacjentów myszom oraz testowanie odpowiedzi na odpowiednie leki.

Testowanie terapii celowanych w nowotworach z wykorzystaniem analizy zmian strukturalnych DNA i ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów

Manuskrypt opisuje metodologię ustalania oraz monitorowania wzrostu podłużnego spontanicznych przerzutów do płuc z ortotopowo wstrzykiwanych guzów piersi, które mogą być interwencyjne na wszystkich etapach kaskady przerzutowej.

In vivo (in vivo) Obrazowanie w celu pomiaru spontanicznych przerzutów do płuc komórek guza piersi wstrzykniętych ortotopowo

Ten protokół opisuje skuteczną, niechirurgiczną metodę ortotopowego wszczepiania ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z rakiem piersi u myszy. Technika ta polega na enzymatycznej dysocjacji guza, a następnie bezpośrednim wstrzyknięciu do poduszek tłuszczowych sutka, co umożliwia implantację o wysokiej przepustowości. Kompleksowa walidacja zapewnia wierność modelu, ułatwiając rygorystyczne badania nad różnymi podtypami raka piersi.

Wysokoprzepustowa dysocjacja i ortotopowa implantacja ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z rakiem piersi

Poznaj metodę znakowania ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z rakiem piersi przy użyciu reporterów fluorescencyjnych i lucyferazy. Technika ta umożliwia śledzenie wzrostu guza i przerzutów w czasie rzeczywistym.

Znakowanie ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z rakiem piersi za pomocą identyfikowalnych reporterów do badań wzrostu guza i przerzutów (Wideo) | JoVE Journal

Znakowanie ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z rakiem piersi za pomocą identyfikowalnych reporterów do badań wzrostu guza i przerzutów

Przeglądaj więcej filmów