Badanie porównawcze metod dostarczania leków ukierunkowanych do ucha wewnętrznego myszy: pęcherzyk a wstrzyknięcie przezbębenkowe
8 marca 2017
Opisano tutaj i porównano dwa podejścia mikrochirurgiczne do miejscowego dostarczania leków do ucha wewnętrznego pod względem wpływu na parametry słuchu, cytoarchitekturę ślimaka i ekspresję markerów stanu zapalnego.
Ogólnym celem tej pracy jest opisanie i porównanie dwóch podejść mikrochirurgicznych do miejscowego dostarczania leków do ucha wewnętrznego pod względem wpływu na parametry słuchu i markery cytoarchitektury ślimaka. Procedury te mogą pomóc nam odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie słuchu, zwłaszcza w rozwoju badań prochemicznych na zwierzętach. Główną zaletą tych technik jest to, że są minimalnie inwazyjne.
A to pozwala substancji dotrzeć dydaktycznie do ucha wewnętrznego. Zastosowanie tych technik rozciąga się na terapię ubytku słuchu, ponieważ jego zabiegi mikrochirurgiczne są odpowiednie do suchego dostarczania do ucha środkowego. Pokojowa demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ pęcherzykowa stopomia i iniekcja przezbębenkowa są trudne do nauczenia i wymagają wiedzy anatomicznej oraz przeszkolenia chirurgicznego.
Na początek umieść zatyczkę do uszu w uchu przeciwległym znieczulonej myszy, aby uzyskać głównie odpowiedzi monofoniczne. Następnie umieść mysz w pozycji leżącej na poduszce grzewczej w komorze tłumiącej dźwięk. Umieść dodatnią podskórną elektrodę igłową ze stali nierdzewnej w skórze głowy między uszami nad wierzchołkiem czaszki.
Umieść elektrodę odniesienia w okolicy ślinianki przyusznej poniżej małżowiny usznej. Następnie umieść elektrodę masową w okolicy kończyny tylnej, ogonowej lub tylnej. Sprawdź impedancję elektryczną elektrod dodatnich i ujemnych.
Upewnij się, że impedancja jest mniejsza niż trzy kiloomy. Umieść wstępnie napełniony głośnik w stałej odległości przodem do wybranego ucha, tak aby środek głośnika był wyrównany z zewnętrznym kanałem słuchowym. Upewnij się, że między głośnikiem a uchem nie ma żadnych przeszkód i że małżowina uszna jest całkowicie otwarta.
Podłącz wyjście cyfrowo-analogowej stacji roboczej do wybranego głośnika. Stosowane są tutaj głośniki wolnego pola. Podłącz wzmacniacz o niskim poziomie szumów i dobrym stosunku sygnału do szumu do wejścia analogowo-cyfrowego.
Następnie rozpocznij proces dostarczania bodźców akustycznych do zewnętrznego przewodu słuchowego za pomocą wstępnie ustawionych bodźców lub nowych sygnałów zaprojektowanych za pomocą odpowiedniego oprogramowania. Prezentuj bodźce, zaczynając od wysokiego natężenia i zmniejszając intensywność w krokach co pięć do 10 decybeli. Rejestruj reakcję elektryczną w ciągu pierwszych 10 milisekund po stymulacji, ponieważ wywołane reakcje ABR pojawiają się po sześciu do ośmiu milisekundach.
Użyj oprogramowania, aby określić próg ABR zgodnie z opisem w pisemnej części protokołu. Po podaniu znieczulenia zgodnie z zatwierdzonymi protokołami należy sprawdzić, czy osiągnięto chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia przy braku reakcji na uszczypnięcie palca u nogi i przy regularnym oddychaniu. Użyj maszynki do strzyżenia, aby usunąć sierść na brzusznej powierzchni szyi i chroń oczy przed zapaleniem rogówki za pomocą żelu na bazie hydroksy-propylometylocelulozy.
Umieść mysz w sterylnym obszarze operacyjnym w pozycji odleżynowej na plecach. Oczyść skórę roztworem antyseptycznym na bazie jodonu i przykryj sterylnym serwetem. Po użyciu skalpela do wykonania dwucentymetrowego podłużnego nacięcia od żuchwy do obojczyka, spójrz przez mikroskop chirurgiczny i zidentyfikuj gruczoły podżuchwowe.
Oddziel oba gruczoły podżuchwowe kleszczami, wycofaj je i zlokalizuj początek mięśnia dwubrzuścowego w nerwie twarzowym. Następnie wykonaj nożyczkami nacięcie w początkowym miejscu mięśnia dwubrzuścowego i cofnij go brzusznie, odsłaniając leżący pod spodem dolny przyśrodkowy aspekt pęcherza bębenkowego. Następnie użyj igły o rozmiarze 27, aby wywiercić w bulla i stworzyć otwór.
Oczyść krew z wierconego obszaru za pomocą wchłanialnej gąbki żelatynowej. Zlokalizuj tętnicę strzemiączkową w okrągłej błonie okiennej, którą do niej przytulisz. Za pomocą cewnika o rozmiarze 34 i szklanej mikrostrzykawki powoli wstrzyknij od trzech do pięciu mikrolitrów roztworu nośnika przez pęcherzyk i bezpośrednio do okrągłej wnęki okiennej, aby ją wypełnić.
Uszczelnij pęcherzową stopę jedną lub dwiema kroplami kleju tkankowego. Przywróć gruczoły podżuchwowe do ich początkowej pozycji i zamknij nacięcia skóry jedwabnym szwem chirurgicznym 5-0. Wokół nacięcia należy nałożyć środek antyseptyczny na bazie jodonu lub chlorheksydyny, aby uniknąć zakażenia rany.
Trzymaj mysz na poduszce grzewczej, dopóki nie odzyska wystarczającej świadomości, aby utrzymać pozycję leżącą mostka. Zwierzę należy zwrócić do klatki domowej dopiero po jego całkowitym wyzdrowieniu. Umieść mysz w bocznej pozycji odleżynowej i przygotuj się w septycznym obszarze chirurgicznym poniżej zewnętrznego przewodu słuchowego, jak pokazano wcześniej.
Po wykonaniu 0,5 centymetrowego nacięcia podłużnego w pionowej części przewodu słuchowego zewnętrznego należy zlokalizować błonę bębenkową za pomocą mikroskopu operacyjnego. Zidentyfikuj górne pars flaccida w dolnej pars tensa, która jest podzielona na przednią i tylną część za pomocą uchwytu młoteczka. Następnie należy wykonać małą myringostomię w ogonowej części pars Flacida i dodatkowe nacięcie w pars tensa błony bębenkowej, aby umożliwić ewakuację powietrza podczas wstrzyknięcia.
Użyj szklanej mikrostrzykawki podłączonej do cewnika o rozmiarze 34, aby delikatnie wstrzyknąć od 10 do 15 mikrolitrów nośnika przez pars flaccida, w pobliżu okrągłej wnęki okiennej, aż ucho środkowe będzie wyraźnie pełne. Zamknij nacięcia skóry jedwabnym szwem chirurgicznym 5-0 i wyczyść zgodnie z wcześniejszym opisem. Ten wykres przedstawia progi ABR u samców 8-tygodniowych myszy C57BL / 6J w odpowiedzi na bodźce kliknięcia przed operacją oraz siedem, 14 i 28 dni po mikrochirurgii.
Dane dotyczące pęcherzowej estomii są wyświetlane na pomarańczowo, dane dotyczące wstrzyknięć przezbębenkowych są wyświetlane na niebiesko, a dane dotyczące zwierząt nieoperowanych są wyświetlane na szaro. Ten wykres przedstawia progi ABR w odpowiedzi na bodźce tonalne w zakresie od 8 do 40 kiloherców w tym samym okresie czasu po mikrooperacji. Również w tym przypadku nie zaobserwowano istotnych różnic między pęcherzykami stomijnymi a dostępem przezbębenkowym.
Badania morfologiczne wykazują, że scala media nie wykazuje zmian po dostarczeniu nośnika przez pęcherzyk lub wstrzyknięcie przezbębenkowe, co wskazuje, że żadna z procedur sama w sobie nie powoduje uszkodzenia. Przystępując do zabiegu pęcherzowej ostomii, należy pamiętać o zapoznaniu się z krytyczną i anatomiczną strukturą otaczającą ucho środkowe i wewnętrzne gryzoni. Po tych procedurach można zastosować inne techniki.
Na przykład pobieranie próbek w Berlinie do badań farmakokinetycznych Po ich opracowaniu, techniki te torują drogę naukowcom zajmującym się neuronauką słuchową do zbadania potencjalnych terapii miejscowych na modelach zwierzęcych, głównie na gryzoniach. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak podawać leki do ucha środkowego i jak oceniać słuch u gryzoni.
Przegląd
Niniejsze badanie opisuje i porównuje dwa podejścia mikrochirurgiczne do miejscowego dostarczania leków do ucha wewnętrznego, koncentrując się na ich wpływie na parametry słuchu oraz cytoarchitekturę ślimaka.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Otolaryngologia
- Farmakologia
Wprowadzenie
- Lokalne dostarczanie leków do ucha wewnętrznego ma kluczowe znaczenie w leczeniu niedosłuchu.
- Techniki małoinwazyjne mogą poprawić efekty terapeutyczne.
- Zrozumienie wpływu na struktury ślimaka jest niezbędne do opracowania skutecznych metod leczenia.
- Poprzednie metody posiadają ograniczenia, które nowe podejścia mają na celu wyeliminować.
Cel badania
- Ocena skuteczności technik bulostomii oraz iniekcji przezbłonkowej.
- Ocena ich wpływu na funkcję słuchu i stan zdrowia ślimaka.
- Przedstawienie szczegółowego protokołu dla tych technik mikrochirurgicznych.
Zastosowane metody
- Do procedur chirurgicznych wykorzystano modele zwierzęce (myszy C57BL/6J).
- Przeprowadzono oceny elektrofizjologiczne w celu pomiaru potencjałów wywołanych pnia mózgu (ABR).
- Wykonano analizę histologiczną w celu oceny cytoarchitektury ślimaka.
- Przeprowadzono analizę porównawczą dwóch technik chirurgicznych.
Główne wyniki
- Nie zaobserwowano istotnych różnic w progach ABR pomiędzy obiema technikami.
- Morfologia ślimaka pozostała nienaruszona po obu procedurach.
- Obie metody wykazały skuteczność w dostarczaniu czynników terapeutycznych.
Wnioski
- Zarówno bulostomia, jak i wtryskiwanie przezbłonowe są skutecznymi metodami dostarczania leków do ucha wewnętrznego.
- Techniki te mogą zostać wykorzystane w przyszłych badaniach nad słuchem oraz w terapiach.
- Niezbędne są dalsze badania w celu optymalizacji tych podejść pod kątem zastosowań klinicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Precyzyjne i małoinwazyjne podawanie leków do ucha wewnętrznego stanowi krytyczne wyzwanie w przedklinicznych badaniach słuchu, co bezpośrednio wpływa na wiarygodność prognostyczną modeli translacyjnych w terapiach utraty słuchu. Niniejsza ewaluacja porównawcza bullostomii i iniekcji przezbłonnnej u myszy dostarcza informacji niezbędnych do wczesnej walidacji celów terapeutycznych oraz wspiera dostosowane do ryzyka wdrażanie strategii lokalnego podawania leków. Koncentracja badania na zachowaniu funkcji i morfologii zapewnia istotność wyników dla decyzji procesowych w rozwoju leków otologicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia rygorystyczną ocenę miejscowego wpływu leku na funkcję słuchu i strukturę ślimaka
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez izolację zmiennych związanych z dostarczaniem preparatu w modelach przedklinicznych
- Ułatwia funkcjonalną walidację celu poprzez ilościowe punkty końcowe ABR oraz analizy histologiczne
Przesiewanie i opracowanie testu
- Zapewnia zwalidowane procedury mikrochirurgiczne dla powtarzalnego podawania związków do ucha wewnętrznego.
- Standaryzuje parametry podawania, wspierając powtarzalność testów i porównywalność między badaniami.
- Umożliwia ilościowy pomiar progów słyszenia w zastosowaniach przesiewowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Dostosowuje przedkliniczne metody podawania leków do klinicznych procedur wewnątrz bębenkowych, zwiększając ciągłość translacyjną.
- Umożliwia analizę biomarkerów poprzez qRT-PCR markerów stanu zapalnego w tkance ślimaka.
- Zmniejsza ryzyko biologiczne, wykazując minimalny wpływ na cytoarchitekturę i funkcję ślimaka.
Integracja potoku i przepływu pracy
Te techniki mikrosurgicalne plasują lokalne dostarczanie leków w kontinuum od etapu odkrywania do badań przedklinicznych, stanowiąc pomost między wczesnymi badaniami nad mechanizmami a badaniami translacyjnymi w obszarze terapii słuchu.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez dotyczących działania leków w kontrolowanym systemie odpowiadającym stanom chorobowym.
- Screening: Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki ABR oraz dane histologiczne do oceny związków.
- Analityka: Wspiera statystyczne porównywanie metod dostarczania leków oraz wyników funkcjonalnych.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość z procedurami klinicznymi i wspiera dostosowanie biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w organizacji: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do badań nad lokalnym dostarczaniem leków w ramach portfeli badawczych w dziedzinie słuchu.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną strategii miejscowego dostarczania leków i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje protokoły mikrochirurgiczne w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności w różnych badaniach.
- Wartość strategiczna: Dostarcza informacji dla decyzji go/no-go w zakresie metod dostarczania i zwiększa efektywność kapitałową.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację kandydatów na leki słuchowe i technologii dostarczania z uwzględnieniem ryzyka.
Kwestie związane z wdrożeniem
- Wymaga specjalistycznej wiedzy z zakresu mikrochirurgii oraz znajomości anatomii struktur ucha gryzoni.
- Wymaga dostępu do systemów rejestracji elektrofizjologicznej oraz infrastruktury do analizy histologicznej.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów chirurgicznych i analitycznych pomiędzy zespołami w celu zapewnienia powtarzalności.
- Adaptacja do innych gatunków lub modeli chorobowych może wymagać optymalizacji protokołu.
- W kontekście przełożenia wyników na zastosowania kliniczne należy wziąć pod uwagę ograniczenia dotyczące objętości oraz precyzji podania.
