Name: Indukowanie uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego w skórze ucha myszy w celu przyżyciowego obrazowania wielofotonowego odpowiedzi immunologicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: Poznaj metodę indukcji uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego w skórze ucha myszy z wykorzystaniem obrazowania wielofotonowego do badania odpowiedzi immunologicznych in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Thomasowi Grafowi za dostarczenie nam myszy LysM-eGFP.

Wszystkie eksperymenty dotyczące żywych zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie ze wszystkimi odpowiednimi wytycznymi i przepisami dotyczącymi użytkowania i pielęgnacji zwierząt.
1. Wybór fluorescencyjnych myszy reporterowych
<ol>
	<li>Użyj myszy LysM-eGFP11 w wieku od 6 do 12 tygodni (bez preferencji dla samców lub samic). 
	Uwaga: Zastosowanie różnych specyficznych dla komórek fluorescencyjnych myszy reporterowych umożliwia wizualizację różnych komórek odpornościowych in vivo. W tym szczepie można uwidocznić krążące neutrofile (komórkiGFP hi), krążące monocyty (komórki GFPlo) i makrofagi skórne (komórki GFPlo). Przy zastosowanych parametrach obrazowania wykrywane będą tylko jasne sygnały od neutrofili GFP-dodatnich. 
	Uwaga: Listę specyficznych dla komórek odpornościowych fluorescencyjnych szczepów myszy reporterowych odpowiednich do tego typu badań obrazowania skóry można znaleźć w Odnośniku 8. 
	Uwaga: Zdecydowanie zaleca się używanie myszy albinosów do obrazowania, ponieważ myszy pigmentowane są bardziej podatne na fotouszkodzenia. Dzieje się tak, ponieważ pigmentowana skóra ucha jest znacznie bardziej wrażliwa na plamki wywołane laserem (wskazujące na spalanie tkanek). W rezultacie rekrutację i akumulację neutrofili można zaobserwować nawet w stanie stacjonarnym8,12.</li>
	<li>Utrzymuj myszy w określonych warunkach wolnych od patogenów (SPF) z 12-godzinnymi cyklami światło-ciemność.</li>
</ol>
2. Znieczulenie myszy
<ol>
	<li>Znieczulić mysz wstrzyknięciem dootrzewnowym ketaminy-ksylazyny (8 μl g-1 masy ciała), składającej się z mieszaniny 15 mg mL-1 ketaminy i 1 mg mL-1 ksylazyny rozpuszczonej w sterylnej wodzie.</li>
	<li>Umieść mysz na poduszce grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała na poziomie 37 °C przez cały czas trwania procedury przygotowania. Sprawdź, czy znieczulenie jest wystarczające, obserwując brak odruchu szczypania palców u stóp. 
	Uwaga: Po pierwszej godzinie kolejne ćwiartki znieczulenia będą musiały być podawane podskórnie i będą trwać około 0,5 godziny każda. Drganie wąsów lub ogona może również wskazywać, że znieczulenie słabnie i że wymagane jest uzupełnienie.</li>
	<li>Użyj lubrykantu okulistycznego na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.</li>
</ol>
3. Depilacja
<ol>
	<li>Ostrożnie nałóż krem do depilacji na górne dwie trzecie grzbietowego ucha myszy za pomocą aplikatorów z bawełnianą końcówką.</li>
	<li>Odczekaj 2 - 3 minuty przed usunięciem kremu za pomocą mokrych aplikatorów z bawełnianą końcówką w dokładny, ale delikatny sposób. 
	Uwaga: Nie pozwól, aby krem do depilacji pozostawał zbyt długo na uchu myszy, ponieważ może wywołać stan zapalny13,14.</li>
</ol>
4. Indukcja niedokrwienia i uszkodzenia reperfuzyjnego
<ol>
	<li>Użyj pozłacanych magnesów neodymowych klasy N42 o średnicy 12 mm x grubości 2 mm i wskaźniku Gaussa około 3,000, aby wywołać niedokrwienie skóry ucha myszy. 
	Uwaga: W tym przypadku wgłębiona powierzchnia magnesu oznacza jego biegun północny.</li>
	<li>Umieść magnesy w ich indywidualnych prowadnicach z tworzywa sztucznego. 
	Uwaga: Plastikowa prowadnica ułatwia umieszczanie i rozdzielanie magnesów o dużej wytrzymałości. Ze względu na ich dużą siłę magnetyczną, a jednocześnie niską odporność na pękanie, nie należy umieszczać pojedynczych magnesów w bliskiej odległości od siebie lub od innych metali. Pęknięcie i odpryski mogą wystąpić, jeśli przyciągną się do siebie.</li>
	<li>Ustawić pierwszy magnes (grzbietowy) w taki sposób, aby tylko krawędź stykała się z drugim magnesem (brzusznym) (Rysunek 3a) 
	Uwaga: Zapobiega to zatrzaskiwaniu się magnesów przed ich prawidłowym ustawieniem.</li>
	<li>Umieść oba magnesy tak, aby magnes brzuszny leżał płasko na uchu (Rysunek 3a). 
	Uwaga: Przed wywołaniem niedokrwienia należy upewnić się, że mysz jest utrzymywana w temperaturze 37 °C i że utrzymywane jest wystarczające znieczulenie (patrz krok 2.2).</li>
	<li>Gdy będą gotowe, ostrożnie pozwól, aby magnesy się połączyły (Rysunek 3a). 
	Uwaga: Do celów obrazowania zaciśnij tylko połowę ucha, aby można było zaobserwować obszar w podczerwieni i bez podczerwieni.</li>
	<li>Po 1,5 h niedokrwienia usuń magnesy, odkręcając magnesy od siebie za pomocą plastikowych prowadnic, umożliwiając reperfuzję. 
	Uwaga: Należy uważać, aby uszy nie marszczyły się po umieszczeniu magnesów. Niepełne niedokrwienie jest widoczne, jeśli makroskopowo widoczne główne naczynia krwionośne ulegają reperfuzji natychmiast (tj. krew wypełnia naczynia natychmiast) po usunięciu magnesów. Chociaż reperfuzja nie następuje natychmiast po usunięciu magnesów, niedrożność naczyń krwionośnych jest tylko przejściowa. W związku z tym konieczne jest jak najszybsze przygotowanie ucha myszy do obrazowania.</li>
</ol>
5. Wstrzykiwanie środków do znakowania naczyń krwionośnych
<ol>
	<li>Natychmiast po usunięciu magnesu podać dożylnie (poprzez wstrzyknięcie do żyły zaoczodołowej lub ogonowej) błękit Evansa (10 mg mL-1 w PBS lub soli fizjologicznej; 1 μl g-1 masy ciała) lub inny wybrany środek znakujący naczynia krwionośne. 
	Uwaga: Przed wstrzyknięciem należy upewnić się, że nadal utrzymuje się wystarczające znieczulenie, wykonując delikatne szczypanie palca u nogi.</li>
</ol>
6. Umieszczenie ucha na platformie obrazowania
<ol>
	<li>Wytnij 2 kawałki taśmy maskującej o długości 1,5 cm i szerokości 1,8 cm.</li>
	<li>Pozwól, aby strony kleju skleiły się ze sobą, pozostawiając około 1 mm kleju na całej jego szerokości.</li>
	<li>Przetnij taśmę maskującą na dwie części wzdłuż, aby dostosować się do jej umieszczenia w szczelinie na platformie ucha.</li>
	<li>Włóż tę taśmę maskującą mniej więcej w połowie szczeliny, tak aby strona samoprzylepna była skierowana do góry.</li>
	<li>Umieść mysz na poduszce grzewczej w taki sposób, aby ucho, które ma być obrazowane, znajdowało się obok paska taśmy maskującej.</li>
	<li>Używając dwóch aplikatorów z bawełnianą końcówką zwilżoną PBS, delikatnie dociśnij ucho do paska samoprzylepnego.</li>
	<li>Używając paska jako prowadnicy, przełóż ucho myszy przez szczelinę, jednocześnie dostosowując mysz bliżej sceny.</li>
	<li>Aby usunąć taśmę klejącą, najpierw dodaj kroplę PBS, aby zmniejszyć przyczepność taśmy.</li>
	<li>Oddziel ucho myszy od taśmy maskującej tak delikatnie, jak to możliwe, za pomocą cienkiego pędzla.</li>
	<li>Przyłóż ucho do platformy usznej, delikatnie przesuwając po uchu wilgotny aplikator z bawełnianą końcówką.</li>
	<li>Umieść kroplę PBS pod szkiełkiem nakrywkowym (które jest utrzymywane na miejscu na uchwycie szkiełka nakrywkowego za pomocą smaru; Rysunek 2) i delikatnie umieść go na uchu. W razie potrzeby uzupełnij większą ilością PBS. 
	Uwaga: Uchwyt szkiełka nakrywkowego zwiększa stabilność podczas obrazowania.</li>
	<li>Włóż sondę temperatury doodbytniczej i podłącz przewody do instalacji grzewczej zgodnie z instrukcjami producenta. 
	Uwaga: Ustaw temperaturę poduszki grzewczej do ciała na 37 °C, a ucha stage platforma na 35 °C.</li>
</ol>
7. Konfiguracja mikroskopu wielofotonowego i parametry obrazowania
Uwaga: Ten protokół wykorzystuje jednowiązkowy, wielofotonowy mikroskop z przestrajalnym (680 - 1,080 nm) laserem Ti:Sa (3,3 W przy 800 nm; długość impulsu 140 fs; częstotliwość powtarzania 80 MHz) z 20-krotnym obiektywem wodnym (NA = 1,0) do badań obrazowania przyżyciowego.
<ol>
	<li>Otwórz oprogramowanie do obrazowania.</li>
	<li>Ustaw laser zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Dostosuj długość fali wzbudzenia na 950 nm. 
	Uwaga: GFP i niebieski Evansa mogą być jednocześnie wzbudzone przy 950 nm.</li>
	<li>Aby wyświetlić podgląd, użyj następujących ustawień: pole skanowania 500μm2, rozdzielczość 505 x 505 pikseli i częstotliwość skanowania 800 Hz w jednym zeszycie. Kliknij "Podgląd".</li>
	<li>Przełącz moc tłumika (lasera). Upewnij się, że wszystkie niezbędne sygnały są odbierane bez narażania pola obrazowania na nadmierne ilości mocy lasera, które mogą wywołać uszkodzenie cieplne. 
	Uwaga: Zacznij od niskiej mocy tłumika i zwiększaj, jeśli sygnał jest przyciemniony. Ponieważ neutrofile będą nieobecne w śródmiąższu we wczesnych punktach czasowych po reperfuzji, makrofagi mogą być używane jako miernik do określenia minimalnej wymaganej mocy, ponieważ te pierwsze są ciemniejsze niż neutrofile. 
	Uwaga: Jeśli ten krok ma być wykonany po raz pierwszy, dostosuj ustawienia w strefie nieniedokrwiennej, w której oczekiwana jest nienaruszona integralność naczyniowa i ułatwi ustawienie mocy tłumika. W kolejnych eksperymentach ustawienia te nie wymagają wielu modyfikacji, chyba że moc lasera jest niestabilna.</li>
	<li>Dostosuj ustawienia PMT. 
	Uwaga: Skontaktuj się z producentem, aby uzyskać maksymalne optymalne napięcie wzmocnienia dla PMT. Ustawienie napięcia PMT powyżej zalecanego progu spowoduje wyższy stosunek sygnału do szumu. Ogólnym zaleceniem jest ustawienie napięcia wzmocnienia PMT na zalecany próg i zwiększenie mocy tłumika w razie potrzeby, jeśli sygnał jest zbyt słaby.</li>
	<li>Wybierz obszar obrazowania, który znajduje się w bliskiej odległości od krawędzi niedokrwienia, charakteryzujący się masywnym niebieskim wyciekiem Evansa.</li>
	<li>Zbieraj niebieskie sygnały GFP i Evansa za pomocą filtrów pasmowoprzepustowych 525/50 (BP) i 655/40 BP. W przypadku sygnałów generacji drugiej harmonicznej (SHG) włókien kolagenowych w przedziale skórnym należy użyć filtra 475/42 BP.</li>
	<li>Utwórz folder, w którym zostaną zapisane obrazy w formacie zgodnym z dostępnym oprogramowaniem do analizy obrazów.</li>
	<li>Aby uzyskać dostęp, użyj następujących ustawień: pole skanowania 500μm2, rozdzielczość 505 x 505 pikseli i częstotliwość skanowania 400 Hz w skanowaniu jednowierszowym.</li>
	<li>Stos z o wielkości 100 μm i kroku 4 μm może być rejestrowany wielokrotnie w czasie, w odstępach 1-minutowych, w celu monitorowania infiltracji neutrofili. 
	Uwaga: Szczególnie w przypadku leukocytów (np. neutrofili) o większej prędkości migracji, przerwa dłuższa niż 1 minuta może powodować trudności podczas analizy śledzenia komórek. W takim przypadku użytkownik może albo zmniejszyć grubość stosu akwizycji, albo zwiększyć częstotliwość skanowania. 
	Uwaga: Podczas gdy wymagany stos akwizycji strefy niedokrwiennej może wydawać się mniejszy w wyniku kompresji (alternatywnie charakteryzuje się wyższą intensywnością SHG), późniejsza reperfuzja spowoduje masywny stan zapalny, który powoduje obrzęk ucha. Spodziewane są znaczne dryfy w kierunku Z. W związku z tym konieczne jest nabycie dużego stosu z, aby dostosować się do dryfu.</li>
	<li>Przez cały czas obrazowania należy regularnie uzupełniać PBS i wodę, aby ucho było wilgotne, a soczewka obiektywu zanurzona w wodzie. 
	Uwaga: Typowy eksperyment trwa zwykle od 2 do 4 godzin. W zależności od projektu eksperymentalnego i w połączeniu z dobrze kontrolowanym reżimem znieczulenia, możliwe jest wydłużenie czasu trwania obrazowania.</li>
</ol>
8. Zakończenie eksperymentu
<ol>
	<li>Poddaj mysz eutanazji przez uduszenie dwutlenkiem węgla zgodnie z procedurami Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania (IACUC). 
	Uwaga: Zawsze poddawaj mysz eutanazji zatwierdzonymi metodami, zgodnie z zasadami, przepisami i wytycznymi instytucji. Jeśli konieczne jest powtórzenie obrazowania, trzymaj mysz na poduszce grzewczej, aż znieczulenie ustąpi. Gdy mysz odzyska wystarczającą przytomność i będzie ruchoma, wróć do klatki.</li>
</ol>
9. Analiza obrazu
Uwaga: Dane wygenerowane z eksperymentu obrazowania mogą być wizualizowane przez różne pakiety oprogramowania.
<ol>
	<li>Otwórz oprogramowanie do analizy obrazowania.</li>
	<li>W trybie Surpass zaimportuj plik (Otwórz → wybierz dowolny plik w żądanym folderze → kliknij "otwórz").</li>
	<li>Edytuj pseudokolory, jeśli kolory domyślne nie mają zastosowania (Edytuj → Dopasowanie wyświetlania → Na karcie kanału wybierz żądany kolor z palety kolorów).</li>
	<li>Dostosuj jasność, kontrast i tło (Edytuj → Dopasowanie wyświetlania → Przełącz wartości Max i Min).</li>
	<li>Upewnij się, że wymiary pliku są poprawne (Edytuj → Właściwości obrazu → Na karcie geometrii sprawdź rozmiar wokseli. W tym protokole X = 0,99, Y = 0,99 i Z = 4). 
	Uwaga: Wyznacz X i Y, dzieląc wymiar pola skanowania przez rozdzielczość w pikselach. Z to grubość między każdym plasterkiem. 
	Uwaga: Dane wyjściowe tych zestawów danych można przedstawić jako filmy projekcyjne o maksymalnej wysokości. 
	Uwaga: Analiza śledzenia jest wymagana, aby w pełni scharakteryzować aktywność i interakcje komórkowe w celu zrozumienia ich funkcji in vivo. Szczegółowe instrukcje śledzenia komórek za pomocą funkcji spot dostępnej w oprogramowaniu można znaleźć w protokole w sygnaturze 15. 
	Uwaga: Istnieje wiele sposobów ilościowego określania migracji leukocytów, których szczegóły można znaleźć w artykule przeglądowym w Bibliografii 16.</li>
</ol>

<ol><li>Black, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((National+Pressure+Ulcer+Advisory+Panel%27s+updated+pressure+ulcer+staging+system%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Skin+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">National Pressure Ulcer Advisory Panel's updated pressure ulcer staging system.</a> Adv Skin Wound Care. 20, 269-274 (2007).</li>
<li>Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+ischemia%2Freperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell biology of ischemia/reperfusion injury.</a> Int Rev Cell Mol Biol. 298, 229-317 (2012).</li>
<li>Huebener, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HMGB1%2FRAGE+axis+triggers+neutrophil-mediated+injury+amplification+following+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">The HMGB1/RAGE axis triggers neutrophil-mediated injury amplification following necrosis.</a> J Clin Invest. 125, 539-550 (2015).</li>
<li>Wassermann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chronic+pressure+ulcer+model+in+the+nude+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+Regen%22%5BJournal%5D)">A chronic pressure ulcer model in the nude mouse.</a> Wound Repair Regen. 17, 480-484 (2009).</li>
<li>Stadler, I., Zhang, R. Y., Oskoui, P., Whittaker, M. S., Lanzafame, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+simple%2C+noninvasive%2C+clinically+relevant+model+of+pressure+ulcers+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Surg%22%5BJournal%5D)">Development of a simple, noninvasive, clinically relevant model of pressure ulcers in the mouse.</a> J Invest Surg. 17, 221-227 (2004).</li>
<li>Tsuji, S., Ichioka, S., Sekiya, N., Nakatsuka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+ischemia-reperfusion+injury+in+a+microcirculatory+model+of+pressure+ulcers%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+Regen%22%5BJournal%5D)">Analysis of ischemia-reperfusion injury in a microcirculatory model of pressure ulcers.</a> Wound Repair Regen. 13, 209-215 (2005).</li>
<li>Ng, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+neutrophil+response+to+sterile+tissue+injury+in+mouse+dermis+reveals+a+three-phase+cascade+of+events%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events.</a> J Invest Dermatol. 131, 2058-2068 (2011).</li>
<li>Li, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+multiphoton+imaging+of+immune+responses+in+the+mouse+ear+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Intravital multiphoton imaging of immune responses in the mouse ear skin.</a> Nat Protoc. 7, 221-234 (2012).</li>
<li>Tong, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+skin+immune+atlas%3A+three-dimensional+analysis+of+cutaneous+leukocyte+subsets+by+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">The skin immune atlas: three-dimensional analysis of cutaneous leukocyte subsets by multiphoton microscopy.</a> J Invest Dermatol. 135, 84-93 (2015).</li>
<li>Saito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+loss+of+MCP-1+attenuates+cutaneous+ischemia-reperfusion+injury+in+a+mouse+model+of+pressure+ulcer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">The loss of MCP-1 attenuates cutaneous ischemia-reperfusion injury in a mouse model of pressure ulcer.</a> J Invest Dermatol. 128, 1838-1851 (2008).</li>
<li>Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertion+of+enhanced+green+fluorescent+protein+into+the+lysozyme+gene+creates+mice+with+green+fluorescent+granulocytes+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages.</a> Blood. 96, 719-726 (2000).</li>
<li>Roediger, B., Ng, L. G., Smith, A. L., Fazekasde de St Groth, B., Weninger, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+dendritic+cell+migration+within+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Visualizing dendritic cell migration within the skin.</a> Histochem Cell Biol. 130, 1131-1146 (2008).</li>
<li>Kikushima, K., Kita, S., Higuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-invasive+imaging+for+the+in+vivo+tracking+of+high-speed+vesicle+transport+in+mouse+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A non-invasive imaging for the in vivo tracking of high-speed vesicle transport in mouse neutrophils.</a> Sci Rep. 3, 1913(2013).</li>
<li>Ng, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migratory+dermal+dendritic+cells+act+as+rapid+sensors+of+protozoan+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Migratory dermal dendritic cells act as rapid sensors of protozoan parasites.</a> PLoS Pathog. 4, e1000222(2008).</li>
<li>Soohoo, A. L., Bowersox, S. L., Puthenveedu, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+clathrin-mediated+endocytosis+of+G+protein-coupled+receptors+at+single-event+resolution+via+TIRF+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualizing clathrin-mediated endocytosis of G protein-coupled receptors at single-event resolution via TIRF microscopy.</a> J Vis Exp. , e51805(2014).</li>
<li>Beltman, J. B., Maree, A. F., de Boer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysing+immune+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Analysing immune cell migration.</a> Nat Rev Immunol. 9, 789-798 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Znaczenie
IR jest jedną z głównych przyczyn odleżyn skóry. Wczesne stadia (I i II) odleżyn opisują stan ludzkiej skóry (w porównaniu z leżącymi poniżej tkankami podskórnymi i mięśniami). Jednak nadal brakuje zrozumienia etiologii immunologicznej. Tutaj przedstawiamy prosty i solidny model IR na skórze uszu myszy, aby wypełnić tę lukę. Symulujemy niedokrwienie, zaciskając ucho myszy między dwoma magnesami, a następnie badamy dalsze reakcje immunologiczne po usunięciu magnesu (reperfuzji). Używając...

Uszkodzenie niedokrwienno-reperfuzyjne (IRI) występuje, gdy występuje przejściowe niedotlenienie spowodowane przeszkodą w przepływie krwi (niedokrwienie), po którym następuje ponowne dotlenienie tkanek (reperfuzja). Uważa się, że w skórze niedokrwienie-reperfuzja (IR) jest jednym z czynników przyczyniających się do patofizjologii odleżyn, w których długotrwałe leżenie w łóżku predysponuje długotrwałych pacjentów szpitalnych do urazów. U tych pacjentów zarówno skóra, jak i leżące pod nią mięśnie są stale narażone na nacisk wywierany na obszary wypukłości kostnej, co prowadzi do miejscowych urazów, które nieleczone mogą stać się martwicze1.
Szkody związane z IRI są dwojakie. Podczas niedokrwienia niedrożność naczyń krwionośnych prowadzi do drastycznego spadku dostarczania tlenu do tkanek. Powoduje to spadek ATP i pH, co powoduje dezaktywację ATPaz biorących udział w metabolizmie komórkowym. Z kolei poziom wapnia w komórkach gwałtownie wzrasta, a zestresowane lub uszkodzone komórki ulegają apoptozie lub martwicy2. Uwalnianie zawartości wewnątrzkomórkowej lub związane z uszkodzeniem wzorców molekularnych (DAMP), takich jak HMGB1, przyczynia się do odpowiedzi zapalnej3. Druga zniewaga pojawia się podczas reperfuzji. Chociaż poziom tlenu i pH jest przywracany podczas reperfuzji, powoduje to wytwarzanie reaktywnych form tlenu (ROS), co prowadzi do utleniania wewnątrzkomórkowych lipidów, DNA i białek. W konsekwencji aktywowane są mediatory prozapalne, co uruchamia wtórną reakcję zapalną, która obejmuje rekrutację komórek odpornościowych do miejsca zapalnego2. Podczas gdy kaskada zdarzeń biochemicznych prowadzących do odpowiedzi zapalnej została dobrze opisana, przestrzenna i czasowa regulacja aktywności komórek odpornościowych nie jest dobrze poznana.
Tutaj opisujemy solidny model IR na skórze uszu myszy za pomocą prostego zaciskania magnesem. W połączeniu z wielofotonowym obrazowaniem przyżyciowym (MP-IVM) stworzyliśmy model do badania reakcji zapalnych in vivo, które występują po reperfuzji. Uzasadnieniem rozwoju i zastosowania tej techniki jest próba zrozumienia, w jaki sposób zarówno komórki śródmiąższowe, jak i naciekające reagują na podczerwień w czasie rzeczywistym.
Istniejące modele IR wykorzystujące technikę zaciskania na boku skóry są wysoce inwazyjne, ponieważ wymagają chirurgicznego wszczepienia stalowych płytek w bok skóry, co czyni je mniej niż idealnymi do badań immunologicznych4. Podobna nieinwazyjna technika zaciskania została opisana w boku skóry myszy5,6. Jednak ze względu na włączenie do tej metody komponentu obrazowania przyżyciowego, zamiast tego wybraliśmy skórę ucha jako docelowe miejsce IR, ponieważ omija ona ruchy spowodowane oddychaniem i zapewnia stabilność podczas obrazowania7,8. Co więcej, podzbiory leukocytów, które obejmują śródmiąższ, są identyczne między skórą ucha a bokiem skóry, chociaż liczby i proporcje mogą się nieznacznie różnić9. W ten sposób skóra ucha stanowi idealne miejsce do obrazowania.
Ponadto, większość danych pobieranych z tych modeli IRI ogranicza się do makroskopowych ocen (stopniowanie wrzodów) i mikroskopowych analiz końcowych wskaźników stanu zapalnego10. Korzystając z tego modelu, możliwa jest wizualizacja w czasie rzeczywistym odpowiedzi komórkowej neutrofili po reperfuzji w skórze fluorescencyjnej myszy reporterowej. Wykorzystano wcześniej opublikowany model obrazowania ucha przyżyciowego8 z dodatkowymi modyfikacjami (ryc. 1, 2).

<table><tbody><tr><td colspan="4"><silne>Myszy szczepy</td></tr><tr><td>Lysozyme-GFP C57BL/6</td><td>Thomas Graf, Center for Genomic</td><td></td><td></td>Regulation</tr><tr><td>C57BL/6-C2J</td><td>Jackson Laboratories</td><td>000058</td><td>Do skrzyżowania z Lysozyme-GFP w celu wygenerowania albinosa Lysozyme-GFP do obrazowania</td></tr><tr> skóry<td colspan="4">Reodczynniki</td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Viaflex 0,9% (wt/vol) sól fizjologiczna</td><td>Baxter Healthcare</td><td>F8B1323</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina (100 mg ml&minus; 1 chlorowodorek ketaminy</td><td>Parnell</td><td></td><td>Ketamina jest lekiem kontrolowanym i należy przestrzegać wszystkich odpowiednich przepisów lokalnych</td></tr><tr><td>Ilium Xylazil-20 (20&nbsp; mg&nbsp; mL&minus; 1 chlorowodorek ksylazyny)</td><td>Troy Laboratories</td><td></td><td>Xylazil-20 jest lekiem kontrolowanym i należy przestrzegać wszystkich odpowiednich przepisów lokalnych.</td></tr><tr><td>Evans niebieski (10&nbsp; mg&nbsp; mL&minus; 1 w PBS lub soli fizjologicznej)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46160</td><td></td></tr><tr><td>Ultraoczyszczona woda</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Strzykawka insulinowa z igłą</td><td>BD</td><td>328838</td><td></td></tr><tr><td>Pipety transferowe</td><td>Biologix Research Company</td><td>30-0135</td><td></td></tr><tr><td>Taśma maskująca papierowa 3 M</td><td>3M</td><td>2214</td><td></td></tr><tr><td>Szkło nakrywkowe mikroskopu Deckglaser (22 mm i razy 32 mm)</td><td>Paul Marienfeld</td><td>101112</td><td></td></tr><tr><td>Zakrzywione kleszczyki do odłamków</td><td>Aesculap, B. Braun Melsungen</td><td>BD312R</td><td></td></tr><tr><td>Krem do depilacji Veet</td><td>Reckitt Benckiser</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aplikatory medyczne z bawełnianą końcówką</td><td>Puritan Medical Products Company</td><td>806-WC</td><td></td></tr><tr><td>Ręczniki składane w kształcie litery C</td><td>Kimberly-Clark</td><td>20311</td><td></td></tr><tr><td>Chusteczki Kimwipes do delikatnych zadań</td><td>Kimtech Science</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Pozłacane magnesy neodymowe klasy N42 o średnicy 12 mm i grubości 2 mm&nbsp;</td><td>first4magnets</td><td>F656S Prowadnica</td><td></td></tr><tr><td>z tworzywa sztucznego, 10 cm na 1,5 cm (materiał z polichlorku winylu)</td><td></td><td></td> <td>złożyć wzdłuż na pół, związać taśmą maskującą i magnesem szczelinowym w</td></tr><tr><td>smarze wysokopróżniowym</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">mikroskop</td></tr><tr><td>TriM Scope II jednowiązkowy mikroskop dwufotonowy</td><td>LaVision BioTec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przestrajany (680&ndash; 1,080 nm) Coherent Chameleon Ultra II One Box Ti:laser szafirowy (&ge; 3,3 W przy 800 nm; długość impulsu 140 fs, częstotliwość powtarzania 80 MHz)</td><td>Spójne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>obiektywy zanurzające w wodzie (20&times;, NA = 1.0)</td><td>Olympus</td><td>XLUMPLFLN20xW</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Zestawy filtrów i luster miscroskopowych (do obrazowania GFP, SHG, Evans Blue)</td></tr><tr><td>495 długoprzepustowe</td><td>Chroma</td><td>T495LPXR</td><td></td></tr><tr><td>560 lomg-pass</td><td>Chroma</td><td>T560LPXR</td><td></td></tr><tr><td>475/42 pasmowo-przepustowy</td><td>Semrock</td><td>FF01-475/42-25</td><td></td></tr><tr><td>525/50 pasmowo-przepustowy</td><td>Chroma</td><td>ET525/50m</td><td></td></tr><tr><td>655/40 pasmowo-przepustowy</td><td>Chroma</td><td>NC028647</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Platforma sceniczna do obrazowania skóry (patrz schemat montażu)</td></tr><tr><td>A metalowa płyta podstawy (126 mm & 126 mm & 1 mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mosiężna platforma do ucha (79 mm & razy; 19 mm; grubość 1 mm z boku, grubość 0,5 mm pośrodku; <mocny>Rysunek 1</mocny>) ze szczeliną (1,7 mm & razy 1 mm; 1,5 mm od długiej krawędzi)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dwa plastikowe klocki (10 mm wysokości)&mdash; do izolacji</td><td></td><td></td><td></td>cieplnej</tr><tr><td>Zakrzywiony uchwyt, do umieszczenia termistora sterującego na platformie</td><td></td><td></td><td></td>usznej</tr><tr><td>interfejsu CC-28 ze złączem DIN i termistorami, jeden do kontroli temperatury, a drugi do monitora temperatury</td> <td>(Warner Instruments (Harvard Apparatus)</td><td>640106</td><td>podłączyć interfejsu do obu rezystancyjnych bloków grzejnych ustawionych na 35 &; C</td></tr><tr><td>Rezystancyjne bloki grzejne RH-2</td> <td>(Warner Instruments (Harvard Apparatus)</td><td>640274</td><td>Rezystancyjne bloki grzejne mogą podgrzewać mosiężną platformę douszną do ponad 100 stopni C w ciągu kilku minut. Upewnij się, że termistor sterujący został prawidłowo zamocowany w uchwycie, aby uniknąć przegrzania.</td></tr><tr><td>Regulator temperatury TC-344B do platformy dousznej</td> <td>(Warner Instruments (Harvard Apparatus)</td><td>640101</td><td></td></tr><tr><td>Regulator temperatury TR-200 do poduszki grzewczej myszy</td><td>Fine Science Tools</td><td>21052-00</td><td>Jednostka nie jest już w sprzedaży. Zapytaj producenta o alternatywy</td></tr><tr><td>Zasilacz do jednostki TR-200</td><td>Fine Science Tools</td><td>21051-00</td><td>nie jest już w sprzedaży. Zapytaj producenta o alternatywy</td></tr><tr><td>Poduszka grzewcza</td><td>Fine Science Tools</td><td>21060-00</td><td>Jednostka nie jest już w sprzedaży. Zapytaj producenta o alternatywy.&nbsp;</td></tr><tr><td>Sonda doodbytnicza dla zwierząt&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>21060-01</td><td>Unit nie jest już w sprzedaży. Zapytaj producenta o alternatywy. Po podłączeniu sondy doodbytniczej i poduszki grzewczej do regulatora temperatury TR-200 należy ustawić temperaturę na 37 &deg; C</td></tr><tr><td colspan="4"><mocny>uchwyt na szkiełko nakrywkowe</td></tr>2 <tr><td>plastikowe pręty o średnicy 1 cm, długości</td><td></td><td></td><td></td>10 cm</tr><tr><td>1 plastikowy adapter z wywierconymi otworami do mocowania prętów (patrz schemat)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3 plastikowe mocujące do utrzymywania plastikowych prętów na miejscu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 metalowa płytka o wymiarach 6 cm x 2,5 cm z kwadratowym nacięciem 2 cm na 1 końcu, 2 mm krawędzi od krótkiej krawędzi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 para nakrętek i do mocowania metalowej płytki do plastikowego pręta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 akrylowa podstawa (4 cm x 5 cm x 1,5 cm) z magnesem do przytrzymywania uchwytu na szkiełko nakrywkowe na platformie do obrazowania skóry. 1 pręt jest na stałe przymocowany do podstawy.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Oprogramowanie do analizy obrazowania</td></tr><tr><td>Imaris v8.1.2</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

indukowanie uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego w skórze ucha myszy w celu przyżyciowego obrazowania wielofotonowego odpowiedzi immunologicznych

Inducing Ischemia-reperfusion Injury in the Mouse Ear Skin for Intravital Multiphoton Imaging of Immune Responses

Uszkodzenie niedokrwienno-reperfuzyjne (IRI) występuje, gdy występuje przejściowe niedotlenienie spowodowane przeszkodą w przepływie krwi (niedokrwienie), po którym następuje ponowne dotlenienie tkanek (reperfuzja). W skórze niedokrwienie-reperfuzja (IR) jest głównym czynnikiem przyczyniającym się do patofizjologii odleżyn. Podczas gdy kaskada zdarzeń prowadzących do odpowiedzi zapalnej została dobrze zbadana, przestrzenne i czasowe reakcje różnych podzbiorów komórek odpornościowych na uraz IR nie są dobrze poznane. Istniejące modele IR wykorzystujące technikę zaciskania na boku skóry są wysoce inwazyjne i nieodpowiednie do badania odpowiedzi immunologicznych na uraz, podczas gdy podobne nieinwazyjne badania zaciskania magnesu w boku skóry są mniej niż idealne do badań obrazowania przyżyciowego. W tym protokole opisujemy solidny model nieinwazyjnego podczerwieni opracowany na skórze ucha myszy, w którym naszym celem jest wizualizacja w czasie rzeczywistym odpowiedzi komórkowej komórek odpornościowych po reperfuzji za pomocą wielofotonowego obrazowania przyżyciowego (MP-IVM).

W niniejszym protokole wykorzystano autorską platformę do obrazowania skóry ucha, przedstawioną na Rysunku 1. Kilka funkcji tej platformy zostało zaprojektowanych specjalnie w celu ułatwienia obrazowania przy jednoczesnym zachowaniu parametrów fizjologicznych. Umieszczenie ucha na podgrzewanej mosiężnej platformie nie tylko pozwala na utrzymanie ucha w fizjologicznej temperaturze 35 °C, ale także izoluje je od nieuniknionych ruchów związanych z oddychaniem. Dodanie metalo...

Ten protokół opisuje indukcję modelu niedokrwienia-reperfuzji (IR) na skórze ucha myszy za pomocą zaciskania magnesem. Korzystając z niestandardowego modelu obrazowania przyżyciowego, badamy in vivo reakcje zapalne po reperfuzji. Uzasadnieniem dla opracowania tej techniki jest poszerzenie wiedzy na temat tego, w jaki sposób leukocyty reagują na uszkodzenia skóry w podczerwieni.

Indukowanie uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego w skórze ucha myszy w celu przyżyciowego obrazowania wielofotonowego odpowiedzi immunologicznych

Ischemia-reperfusion injury (IRI) occurs when there is transient hypoxia due to the obstruction of blood flow (ischemia) followed by a subsequent ...

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest zrozumienie reakcji komórek odpornościowych na niedokrwienie i reperfuzję za pomocą intravitalnego obrazowania wielofotonowego skóry ucha myszy. Metoda ta może pomóc w rozwiązaniu kluczowych kwestii w dziedzinie immunologii i dermatologii w celu zrozumienia dynamicznego zachowania komórek odpornościowych. Główną zaletą tej techniki jest zapewnienie wiarygodnego modelu obrazowania do badania aktywności komórkowej w skórze w stanie zapalnym lub spoczynkowym.Choć metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat uszkodzeń reperfuzyjnych w niedokrwieniu, można ją zastosować również w innych układach, takich jak reakcje nadwrażliwości, a także infekcje. Aby rozpocząć tę procedurę, umieść mysz na podkładce grzewczej, aby utrzymać temperaturę jej ciała na poziomie 37 °C przez cały czas trwania przygotowań. Głębokość znieczulenia potwierdź poprzez brak odruchu wycofywania łapy po uciśnięciu palca.Następnie nałóż smar okulistyczny do oczu zwierzęcia, aby zapobiec ich wysychaniu podczas znieczulenia. Po tym czasie ostrożnie nałóż krem depilacyjny na górne dwie trzecie grzbietowej strony małżowiny usznej i odczekaj od dwóch do trzech minut. Następnie usuń k

inducing-ischemia-reperfusion-injury-mouse-ear-skin-for-intravital

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ten film demonstruje technikę mikroskopii fluorescencyjnej w celu zbadania powstawania skrzepliny w modelu mysim. Myszowi wstrzykuje się polisacharyd znakowany fluoroforem w celu monitorowania krążenia krwi. Po oświetleniu światłem o dużym natężeniu, fototoksyczna indukcja urazu w mikrokrążeniu ucha prowadzi do powstania skrzepliny, co potwierdza się poprzez wizualizację przeszkody w przepływie krwi.

Przyżyteczna mikroskopia fluorescencyjna do badania tworzenia się skrzeplin mikronaczyniowych

Macierz zewnątrzkomórkowa ulega znacznej przebudowie podczas gojenia się ran, stanów zapalnych i nowotworzenia. Przedstawiamy nowatorskie podejście do mikroskopii immunofluorescencyjnej przyżyciowej do wizualizacji dynamiki fibrylarnych, a także siatkowych składników matrycy z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową przy użyciu mikroskopii epifluorescencyjnej lub dwufotonowej.

Długoterminowe przyżyciowe obrazowanie immunofluorescencyjne składników macierzy tkankowej z mikroskopią epifluorescencyjną i dwufotonową

Mechanizmy rządzące ruchliwością śródmiąższową komórek T efektorowych CD4 w miejscach zapalenia są stosunkowo nieznane. Przedstawiamy nieinwazyjne podejście do wizualizacji i manipulacji limfocytami T CD4 przygotowanymi in vitro w zapalnej skórze właściwej ucha, co pozwala na badanie dynamicznego zachowania tych komórek in situ.

Obrazowanie migracji śródmiąższowej komórek T CD4 w stanie zapalnym skóry właściwej

Ten obecny protokół wykorzystuje fluorescencyjne reportery, znakowanie in vivo i techniki obrazowania przyżyciowego, aby umożliwić monitorowanie dynamicznego procesu pobudzania neutrofili u żywych zwierząt.

Przyżyciowe obrazowanie torowania neutrofili przy użyciu myszy reporterowych DsRed napędzanych promotorem IL-1β

Model ucha bezwłosej myszy SKH1-Hrhr umożliwia przyżyciowe mikroskopowanie fluorescencyjne mikrokrążenia i fototoksyczną indukcję skrzepliny bez wcześniejszego przygotowania chirurgicznego w badanym łożysku mikronaczyniowym. Dlatego ucho bezwłosej myszy jest doskonałym modelem in vivo do badania złożonych interakcji podczas tworzenia skrzeplin mikronaczyniowych, ewolucji skrzepliny i trombolizy.

Mikroskopia przyżyciowa i indukcja skrzepliny w płatku ucha myszy bezwłosej

Ustaliliśmy nowatorski protokół chirurgiczny do obrazowania dwufotonowego żywej wątroby myszy z minimalną inwazją. Dzięki tej technice zidentyfikowaliśmy szczegółową strukturę wątroby podczas endotoksemii wywołanej lipopolisacharydem. Przewidujemy, że metoda ta może być wykorzystana do określenia skuteczności różnych odczynników do migracji leukocytów wątrobowych.

Dwufotonowe obrazowanie przyżyciowe leukocytów podczas odpowiedzi immunologicznej w wątrobie myszy leczonej lipopolisacharydem

Obrazowanie in vivo jest potężnym narzędziem do badania biologii w zdrowiu i chorobie. Protokół ten opisuje obrazowanie przezźrenicowe siatkówki myszy za pomocą standardowego mikroskopu dwufotonowego. Zademonstrowano również różne metody obrazowania in vivo, które umożliwiają fluorescencyjne znakowanie wielu kohort komórkowych siatkówki.

Przezźrenicowe dwufotonowe obrazowanie in vivo siatkówki myszy

Rekrutacja leukocytów i płytek krwi stanowi niezbędny składnik niezbędny do efektywnego wzrostu tętnic pobocznych podczas arteriogenezy. Mikroskopia wielofotonowa jest skutecznym narzędziem do śledzenia dynamiki komórek z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną in vivo i mniejszą fototoksycznością do badania rekrutacji i wynaczynienia leukocytów podczas arteriogenezy.

Wielofotonowe obrazowanie przyżyciowe do monitorowania rekrutacji leukocytów podczas arterogenezy w mysim modelu kończyn tylnych

Migracja neutrofili polega na szybkiej i ciągłej przebudowie błony plazmatycznej w odpowiedzi na chemoatraktant i jego interakcje z mikrośrodowiskiem zewnątrzkomórkowym. Opisana w niniejszym dokumencie jest procedura oparta na przyżyciowej mikroskopii subkomórkowej w celu zbadania dynamiki przebudowy błony w neutrofilach wstrzykniętych do ucha znieczulonych myszy.

Obrazowanie migracji neutrofili w skórze myszy w celu zbadania przebudowy błony subkomórkowej w warunkach fizjologicznych

Protokół przedstawia nowe narzędzie do uproszczenia obrazowania przyżyciowego za pomocą odwróconej mikroskopii konfokalnej.

Uproszczone podejście do obrazowania przyżyciowego do długoterminowego monitorowania dynamiki tkanki nabłonkowej pod odwróconym mikroskopem konfokalnym

Badanie to przedstawia podejście in vivo do obrazowania dwufotonowego do wizualizacji struktur niskoprogowych zakończeń aksonów mechanoreceptorów (LTMR) w skórze przedniej łapy myszy. Wykorzystując powtarzalne, wysokorozdzielcze obrazowanie poszczególnych aksonów, metoda ta stanowi nową platformę do badania struktury i funkcji skórnego obwodu czuciowego podczas rozwoju oraz u dorosłych.

Dwufotonowe obrazowanie wewnątrzżyciowe morfologii aksonów dotykowych u skóry myszy

Poznaj metodę indukcji uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego w skórze ucha myszy z wykorzystaniem obrazowania wielofotonowego do badania odpowiedzi immunologicznych in vivo.

Indukowanie uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego w skórze ucha myszy w celu przyżyciowego obrazowania wielofotonowego odpowiedzi immunologicznych (Wideo) | JoVE Journal

Indukowanie uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego w skórze ucha myszy w celu przyżyciowego obrazowania wielofotonowego odpowiedzi immunologicznych

Przeglądaj więcej filmów