Indukowanie uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego w skórze ucha myszy w celu przyżyciowego obrazowania wielofotonowego odpowiedzi immunologicznych

Ogólnym celem tego eksperymentu jest zrozumienie, w jaki sposób komórki odpornościowe reagują na reperfuzję niedokrwienną poprzez przyżyciowe obrazowanie wielofotonowe skóry ucha myszy. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na niektóre z bardzo ważnych pytań w dziedzinie immunologii i dermatologii, aby zrozumieć dynamiczne zachowanie komórek odpornościowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia solidny model obrazowania do badania aktywności komórkowej w skórze w stanie zapalnym lub spoczynku.

Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w niedokrwienne urazy reperfuzyjne, można ją również zastosować do innych układów, takich jak reakcje nadwrażliwości, a także infekcje. Aby rozpocząć tę procedurę, umieść mysz na poduszce grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała na poziomie 37 stopni Celsjusza przez cały czas trwania procedury przygotowania. Potwierdź głębokość znieczulenia poprzez brak odruchu szczypania palców u stóp.

Następnie nałóż lubrykant okulistyczny na oczy zwierzęcia, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia. Następnie ostrożnie nałóż krem do depilacji na górne dwie trzecie ucha grzbietowego i odczekaj od dwóch do trzech minut. Następnie usuń krem za pomocą mokrych aplikatorów z bawełnianą końcówką w dokładny, ale delikatny sposób.

Teraz wywołaj niedokrwienie skóry ucha myszy za pomocą magnesów neodymowych. Aby to zrobić, najpierw wsuń magnesy w ich indywidualne plastikowe prowadnice. Ustaw jeden magnes tak, aby tylko krawędź stykała się z drugim magnesem brzusznym, który powinien być umieszczony poniżej brzusznej strony ucha, tak aby ucho leżało płasko na magnesie.

Gdy będziesz gotowy, ostrożnie pozwól, aby magnesy się połączyły. Po 1,5 godziny niedokrwienia usuń magnesy, odkręcając je od siebie za pomocą plastikowych prowadnic, umożliwiając przeprowadzenie reperfuzji. Natychmiast po usunięciu magnesu należy podać dożylnie Evans Blue lub inny wybrany środek do znakowania naczyń krwionośnych.

W tym kroku wytnij dwa kawałki taśmy maskującej. Pozwól, aby strony kleju skleiły się ze sobą, pozostawiając około jednego milimetra kleju na całej jego szerokości. Następnie przetnij taśmę maskującą na dwie części, aby dostosować się do jej umieszczenia w szczelinie na platformie ucha.

Włóż tę taśmę maskującą mniej więcej w połowie szczeliny, tak aby strona samoprzylepna była skierowana do góry. Następnie umieść mysz na poduszce grzewczej tak, aby ucho, które ma być obrazowane, znajdowało się obok paska taśmy maskującej. Używając dwóch aplikatorów z bawełnianą końcówką zwilżoną PBS, delikatnie dociśnij ucho do paska samoprzylepnego.

Używając paska jako prowadnicy, przełóż ucho myszy przez szczelinę, jednocześnie dostosowując mysz bliżej sceny. Ponieważ skóra ucha jest bardzo delikatna, krok ten należy wykonać bardzo ostrożnie, aby uniknąć urazów spowodowanych przygotowaniem. Aby usunąć taśmę klejącą, najpierw dodaj kroplę PBS, aby zmniejszyć przyczepność taśmy.

Następnie oddziel ucho myszy od taśmy maskującej tak delikatnie, jak to możliwe, za pomocą drobnego pędzla. Przyłóż ucho do platformy usznej, delikatnie przesuwając po uchu aplikator z wilgotną bawełnianą końcówką. Następnie umieść kroplę PBS pod szkiełkiem nakrywkowym i delikatnie umieść ją na uchu.

Następnie włóż sondę temperatury doodbytnicy i podłącz przewody do instalacji grzewczej zgodnie z instrukcjami producenta. Aby uzyskać obrazy, umieść zwierzę pod mikroskopem wielofotonowym. Zacznij od obszaru obrazowania, który znajduje się w bliskiej odległości od krawędzi niedokrwienia, charakteryzującego się masywnym wyciekiem niebieskiego Evansa.

Schemat ideowy tutaj pokazuje położenie magnesów. Te dwa zdjęcia pokazują ucho przed niedokrwieniem i po niedokrwieniu po zaciśnięciu magnesu. Na tym schemacie ucho wskazuje obszar obrazowany w odniesieniu do miejsca, w którym został umieszczony magnes.

Ta sekwencja poklatkowa maksymalnej projekcji pokazuje naciek neutrofili w odpowiedzi na reperfuzję w skórze ucha myszy albinosa LysM-eGFPM po 1,5 godziny niedokrwienia. We wcześniejszych punktach czasowych brak niebieskiego sygnału Evansa wskazuje na tymczasowe zamknięcie naczynia po niedokrwieniu. Po opanowaniu, przygotowanie niedokrwiennego ucha reperfuzyjnego do obrazowania można wykonać w mniej niż 30 minut, jeśli zostanie wykonane prawidłowo.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby stale sprawdzać głębokość znieczulenia i temperaturę myszy. Zgodnie z tą procedurą można wykonać inną metodę, taką jak barwienie skóry ucha myszy na całej myszy, aby uzyskać globalny widok lokalizacji komórkowych. Po opracowaniu tego protokołu utorował on drogę naukowcom w dziedzinie immunologii i dermatologii do zbadania odporności wrodzonej w skórze uszu myszy.

Po obejrzeniu tych filmów powinieneś dobrze zrozumieć, jak ustalić model obrazowania skóry ucha myszy w celu zbadania niedokrwiennego uszkodzenia reperfuzyjnego. Nie zapominaj, że praca z mikroskopem wielofotograficznym może być niebezpieczna. Należy podjąć środki ostrożności, takie jak szkolenie w zakresie bezpieczeństwa lasera.