Name: Wytwarzanie ludzkich komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów z krwi pełnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Poznaj technikę izolacji monocytów z krwi pełnej przy użyciu magnetycznych kulek CD14 i ich różnicowanie w komórki dendrytyczne. Ta metoda zapewnia czystość populacji 98-99% i wspiera badania immunologiczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować naszej technice Karolin Thurnes, Wydziałowi Higieny i Mikrobiologii Medycznej, oraz dr Annelies Mühlbacher i dr Paulowi Hörtnaglowi z Centralnego Instytutu Transfuzji Krwi i Oddziału Immunologicznego, za ich cenną pomoc i wsparcie dotyczące tego manuskryptu. Dziękujemy Austriackiemu Funduszowi Naukowemu za wsparcie tych prac (P24598 do DW, P25389 do WP).

Oświadczenie etyczne: Pisemna świadoma zgoda została uzyskana od wszystkich uczestniczących dawców krwi przez Centralny Instytut Transfuzji Krwi i Oddziału Immunologicznego w Innsbrucku w Austrii. Wykorzystanie zanonimizowanych resztek próbek do celów naukowych zostało zatwierdzone przez Komisję Etyki Uniwersytetu Medycznego w Innsbrucku.
1. Wzbogacanie komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMCs)
<ol>
	<li>Zatężanie PBMC przez odwirowanie.
	<ol>
		<li>Otwórz opakowanie z krwią i podziel krew na sterylne probówki wirówkowe o pojemności 50 ml w zależności od ilości otrzymanej krwi.</li>
		<li>W razie potrzeby dostosować objętość do 50 ml dla każdej probówki ze sterylną solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (D-PBS) firmy Dulbecco.</li>
		<li>Umieść probówki w wirówce i wiruj je z prędkością 400 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej (RT) bez hamulca.</li>
		<li>Pobrać górną warstwę zawierającą osocze i płytki krwi za pomocą sterylnej pipety serologicznej o pojemności 10 ml, pozostawiając warstwę graniczną nienaruszoną. 
		UWAGA: Jeśli do uzupełnienia pożywki hodowlanej stosuje się osocze autologiczne zamiast FCS, osocze musi zostać pobrane i inaktywowane termicznie na tym etapie.</li>
		<li>Zebrać komórki jednojądrzaste (warstwy graniczne) z dwóch probówek wirówkowych o pojemności 50 ml i przenieść je do jednej sterylnej probówki o pojemności 50 ml za pomocą sterylnej pipety serologicznej o pojemności 10 ml.</li>
		<li>Dostosować objętość do 50 ml dla każdej probówki za pomocą sterylnego D-PBS.</li>
		<li>Umieścić probówki w wirówce i wirować je z prędkością 400 x g przez 15 minut przy RT bez hamulca.</li>
		<li>Za pomocą sterylnej pipety serologicznej o pojemności 10 ml pobrać górną warstwę zawierającą osocze i płytki krwi, pozostawiając warstwę graniczną nienaruszoną.</li>
		<li>Zebrać komórki jednojądrzaste (warstwy graniczne) z probówek wirówkowych o pojemności 50 ml i przenieść je do dwóch sterylnych probówek zbiorczych o pojemności 50 ml za pomocą sterylnej pipety serologicznej o pojemności 10 ml.</li>
		<li>Dostosować objętość do 50 ml dla każdej probówki ze sterylnym D-PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozdzielanie PBMC przez wirowanie w gradicynie gęstości (rysunek 1).
	<ol>
		<li>Przygotować cztery probówki o pojemności 50 ml i do każdej probówki odpipetować 15 ml pożywki o gradientowym natężeniu gęstości.</li>
		<li>Pobrać 25 ml zebranych komórek/krwi z probówki zbiorczej (krok 1.1.10) i ostrożnie nałożyć na nią podłoże o gradifikacji gęstości.</li>
		<li>Umieść probówki w wirówce i wiruj je z prędkością 700 x g przez 30 minut przy RT bez hamulca.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbieranie i oczyszczanie PBMC.
	<ol>
		<li>Pobrać górną warstwę zawierającą osocze i płytki krwi za pomocą sterylnej pipety serologicznej o pojemności 10 ml, pozostawiając warstwę PBMC nienaruszoną.</li>
		<li>Zebrać interfazę PBMC ze wszystkich probówek i połączyć komórki w dwóch sterylnych probówkach o pojemności 50 ml za pomocą sterylnej pipety serologicznej o pojemności 25 ml.</li>
		<li>Dostosować objętość do 50 ml dla każdej probówki ze sterylnym D-PBS. Umieścić probówki w wirówce i wirować je z prędkością 400 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C z hamulcem.</li>
		<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w sterylnym D-PBS. Połączyć komórki z obu probówek i dostosować objętość do 50 ml za pomocą sterylnego D-PBS.</li>
		<li>Umieścić probówki w wirówce i obracać je w temperaturze 400 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C z hamulcem.</li>
		<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w sterylnym D-PBS. Dostosować objętość do 50 ml za pomocą sterylnego D-PBS i odpipetować 50 μl do probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 450 μl D-PBS.</li>
		<li>Energicznie wymieszać probówkę o pojemności 1,5 ml i policzyć komórki w komorze Neubauera lub innym przyrządzie do liczenia komórek.</li>
		<li>Umieścić probówki o pojemności 50 ml w wirówce i obracać je w temperaturze 400 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C z hamulcem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Izolacja monocytów przez anty-ludzkie cząstki magnetyczne CD14
<ol>
	<li>Znakowanie PBMC cząstkami magnetycznymi.
	<ol>
		<li>Dostosuj stężenie PBMC do 8 x 107 komórek/ml za pomocą buforu izolacyjnego.</li>
		<li>Dokładnie wymieszaj anty-ludzkie cząstki magnetyczne CD14 i dodaj 50 μl cząstek na każdy 1 x10 7 PBMC.</li>
		<li>Zawiesinę cząstek komórkowych dokładnie wymieszać i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oddzielenie frakcji dodatniej i ujemnej.
	<ol>
		<li>Dostosować objętość do 12 ml za pomocą buforu izolacyjnego.</li>
		<li>Przygotować sześć sterylnych probówek okrągłodennych i do każdej probówki odpipetować 2 ml zawiesiny cząstek komórek.</li>
		<li>Natychmiast umieść rurki na magnesie. Inkubuj je przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Trzymaj rurki na magnesie i ostrożnie odciągnij supernatant. Supernatant zawiera frakcję ujemną.</li>
		<li>Wyjmij probówkę z magnesu i dodaj 2 ml buforu izolacyjnego.</li>
		<li>Delikatnie zawiesić ogniwa, pipetując w górę i w dół.</li>
		<li>Umieść rurki z powrotem na magnesie. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Trzymaj rurki na magnesie i ostrożnie odciągnij supernatant. Supernatant zawiera frakcję ujemną.</li>
		<li>Wyjmij probówki z magnesu i dodaj 2 ml buforu izolacyjnego do każdej probówki. Delikatnie zawiesić ogniwa, pipetując w górę i w dół.</li>
		<li>Przenieść frakcję dodatnią do sterylnej probówki o pojemności 50 ml i dostosować objętość do 50 ml za pomocą sterylnego D-PBS.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Stymulacja izolowanych monocytów za pomocą IL-4 i GM-CSF
<ol>
	<li>Umieścić probówkę w wirówce i wirować ją z prędkością 400 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C z hamulcem.</li>
	<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 50 ml D-PBS.</li>
	<li>Odpipetować 50 μl do probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 450 μl D-PBS. Energicznie przemieszać probówkę o pojemności 1,5 ml i policzyć komórki w komorze Neubauera lub innym przyrządzie do liczenia komórek.</li>
	<li>Umieścić probówkę o pojemności 50 ml w wirówce i obracać ją w temperaturze 400 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C z hamulcem. 
	UWAGA: Jeśli wymagana jest również frakcja ujemna, zawierająca limfocyty krwi obwodowej (PBL), należy wykonać kroki mycia i liczenia podobne do tych dla frakcji dodatniej (kroki 3.1-3.5).</li>
	<li>Dostosuj stężenie komórek do 1 x 106/ml za pomocą wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej (pożywka RPMI 1640 uzupełniona 10% inaktywowanym termicznie FBS i 1% roztworem L-glutaminy) i pipetować 3 ml/dołek do płytek 6-dołkowych. 
	UWAGA: W przypadku korzystania z inaktywowanego termicznie osocza autologicznego zastąp 10% FCS 1-5% osoczem autologicznym, zgodnie z konfiguracją eksperymentalną.</li>
	<li>Stymulować monocyty rekombinowaną ludzką IL-4 (250 U/ml) i rekombinowaną ludzką GM-CSF (1,000 U/ml) poprzez pipetowanie cytokin bezpośrednio do pożywki hodowlanej. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Ponownie stymuluj komórki za pomocą IL-4 (250 U/ml) i GM-CSF (1000 U/ml) po 48 godzinach, pipetując cytokiny bezpośrednio do pożywki hodowlanej. 
	UWAGA: Jeśli w pożywce widoczne są jakiekolwiek oznaki zakwaszenia widoczne przez wskaźnik pH, zastąp połowę pożywki wstępnie podgrzaną pożywką hodowlaną.</li>
	<li>Niedojrzałe komórki dendrytyczne należy pobrać w dniu 5 do dalszych eksperymentów, pipetując wyhodowane komórki z płytki 6-dołkowej do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml po kilkukrotnym pipetowaniu pożywki hodowlanej w górę iw dół.</li>
	<li>Policz komórki i wybarwić próbkę izolowanych monocytów przeciwciałami anty-ludzkimi przeciwko CD11b, CD11c i DC-SIGN/CD209, wraz z barwnikiem żywotności komórek. Aby uniknąć niespecyficznego wiązania przeciwciał podczas barwienia powierzchniowego, zdecydowanie zaleca się stosowanie odczynników blokujących receptor Fc lub albuminy surowicy bydlęcej (BSA).</li>
	<li>Przeanalizować próbkę przy użyciu barwnika żywotności komórek, zgodnie z protokołem producenta, wykonując cytometrię przepływową w celu oceny czystości i żywotności wygenerowanych iDC.</li>
</ol>

<ol><li>Banchereau, J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+and+the+control+of+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells and the control of immunity.</a> Nature. 392, 245-252 (1998).</li>
<li>Steinman, R. M., Hemmi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells%3A+translating+innate+to+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Microbiol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells: translating innate to adaptive immunity.</a> Curr Top Microbiol Immunol. 311, 17-58 (2006).</li>
<li>Steinman, R. M., Inaba, K., Turley, S., Pierre, P., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+capture%2C+processing%2C+and+presentation+by+dendritic+cells%3A+recent+cell+biological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antigen capture, processing, and presentation by dendritic cells: recent cell biological studies.</a> Hum Immunol. 60, 562-567 (1999).</li>
<li>Schwarz, J., Sixt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Analysis+of+Dendritic+Cell+Haptotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Quantitative Analysis of Dendritic Cell Haptotaxis.</a> Methods Enzymol. 570, 567-581 (2016).</li>
<li>Weber, M., Sixt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+of+chemotactic+dendritic+cell+migration+in+explanted+mouse+ear+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging of chemotactic dendritic cell migration in explanted mouse ear preparations.</a> Methods Mol Biol. 1013, 215-226 (2013).</li>
<li>Sixt, M., Lammermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+analysis+of+chemotactic+leukocyte+migration+in+3D+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro analysis of chemotactic leukocyte migration in 3D environments.</a> Methods Mol Biol. 769, 149-165 (2011).</li>
<li>Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic-cell+trafficking+to+lymph+nodes+through+lymphatic+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels.</a> Nat Rev Immunol. 5, 617-628 (2005).</li>
<li>Wilflingseder, D., Banki, Z., Dierich, M. P., Stoiber, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+promoting+dendritic+cell-mediated+transmission+of+HIV%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms promoting dendritic cell-mediated transmission of HIV.</a> Mol Immunol. 42, 229-237 (2005).</li>
<li>Pope, M., Gezelter, S., Gallo, N., Hoffman, L., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+levels+of+HIV-1+infection+in+cutaneous+dendritic+cells+promote+extensive+viral+replication+upon+binding+to+memory+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Low levels of HIV-1 infection in cutaneous dendritic cells promote extensive viral replication upon binding to memory CD4+ T cells.</a> J Exp Med. 182, 2045-2056 (1995).</li>
<li>McDonald, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+HIV+and+its+receptors+to+dendritic+cell-T+cell+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Recruitment of HIV and its receptors to dendritic cell-T cell junctions.</a> Science. 300, 1295-1297 (2003).</li>
<li>Pruenster, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-type+lectin-independent+interaction+of+complement+opsonized+HIV+with+monocyte-derived+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">C-type lectin-independent interaction of complement opsonized HIV with monocyte-derived dendritic cells.</a> Eur J Immunol. 35, 2691-2698 (2005).</li>
<li>Wilflingseder, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IgG+opsonization+of+HIV+impedes+provirus+formation+in+and+infection+of+dendritic+cells+and+subsequent+long-term+transfer+to+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">IgG opsonization of HIV impedes provirus formation in and infection of dendritic cells and subsequent long-term transfer to T cells.</a> J Immunol. 178, 7840-7848 (2007).</li>
<li>Kapsenberg, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic-cell+control+of+pathogen-driven+T-cell+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dendritic-cell control of pathogen-driven T-cell polarization.</a> Nat Rev Immunol. 3, 984-993 (2003).</li>
<li>Mills, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR-dependent+T+cell+activation+in+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">TLR-dependent T cell activation in autoimmunity.</a> Nat Rev Immunol. 11, 807-822 (2011).</li>
<li>Banki, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+as+an+endogenous+adjuvant+for+dendritic+cell-mediated+induction+of+retrovirus-specific+CTLs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Complement as an endogenous adjuvant for dendritic cell-mediated induction of retrovirus-specific CTLs.</a> PLoS Pathog. 6, e1000891(2010).</li>
<li>Posch, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+attenuate+the+capacity+of+dendritic+cells+to+stimulate+HIV-specific+cytotoxic+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antibodies attenuate the capacity of dendritic cells to stimulate HIV-specific cytotoxic T lymphocytes.</a> J Allergy Clin Immunol. 130, e1362 1368-1374 (2012).</li>
<li>Posch, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement-Opsonized+HIV-1+Overcomes+Restriction+in+Dendritic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Complement-Opsonized HIV-1 Overcomes Restriction in Dendritic Cells.</a> PLoS Pathog. 11, e1005005(2015).</li>
<li>Wilflingseder, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immediate+T-Helper+17+Polarization+Upon+Triggering+CD11b%2Fc+on+HIV-Exposed+Dendritic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Immediate T-Helper 17 Polarization Upon Triggering CD11b/c on HIV-Exposed Dendritic Cells.</a> J Infect Dis. 212, 44-56 (2015).</li>
<li>Grassi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte-derived+dendritic+cells+have+a+phenotype+comparable+to+that+of+dermal+dendritic+cells+and+display+ultrastructural+granules+distinct+from+Birbeck+granules%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Monocyte-derived dendritic cells have a phenotype comparable to that of dermal dendritic cells and display ultrastructural granules distinct from Birbeck granules.</a> J Leukoc Biol. 64, 484-493 (1998).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten opisuje wytwarzanie komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów (MDDC) poprzez izolację ludzkich monocytów z antykoagulowanej krwi przy użyciu testu magnetycznego opartego na nanocząstkach. W tym protokole etapy wirowania są przeprowadzane przed procedurą izolacji komórek, co prowadzi do wzbogacenia frakcji PBMC. Chociaż komórki są tracone podczas wirowania, nałożenie zawartości pakietu krwi pełnej na podłoże o gradiencie gęstości wymagałoby 200-300 ml pożywki o gradiencie gęstości i dlatego nie można go...

Komórki dendrytyczne (DC) są najważniejszymi wyspecjalizowanymi komórkami naszego układu odpornościowego prezentującymi antygeny. Niedojrzałe DC (iDC) znajdują się w skórze lub w tkankach błony śluzowej i dlatego są jednymi z pierwszych komórek odpornościowych, które wchodzą w interakcje z atakującymi patogenami. DC stanowią pomost między wrodzonym a adaptacyjnym układem odpornościowym1, ponieważ mogą aktywować odpowiedzi limfocytów T i B po wykryciu patogenu. Ponadto przyczyniają się do prozapalnej odpowiedzi immunologicznej ze względu na wydzielanie dużych ilości cytokin, takich jak IL-1β, IL-6 i IL-12. DC aktywują również komórki NK i przyciągają inne komórki odpornościowe do miejsca infekcji przez chemotaksję.
DC można podzielić na niedojrzałe komórki dendrytyczne (iDCs) i dojrzałe komórki dendrytyczne (mDCs)2 na podstawie ich morfologii i funkcji. Po rozpoznaniu obcych antygenów przez jeden z wielu receptorów rozpoznawania wzorców (np. receptorów toll-podobnych, lektyny typu C lub receptory dopełniacza) obficie wyrażających się na powierzchni komórki, iDC ulegają poważnym zmianom i zaczynają dojrzewać. Podczas tego procesu dojrzewania receptory do wychwytywania antygenu są regulowane w dół, podczas gdy cząsteczki niezbędne do prezentacji antygenu są regulowane w górę3. Dojrzałe DC regulują w górę główne kompleksy zgodności tkankowej I i II (MHC I i II), cząsteczki kostymulujące, takie jak CD80 i CD86, które są niezbędne do prezentacji antygenu i aktywacji limfocytów T. Dodatkowo indukowana jest ekspresja receptora chemokiny CCR7 na powierzchni komórki, co umożliwia migrację DC z tkanek obwodowych do węzłów chłonnych. Migracja jest ułatwiona przez "toczenie" DC wzdłuż gradientu ligandu chemokiny 19 (CCL19/MIP-3b) i ligandu chemokiny 21 (CCL21/SLC) do węzłów chłonnych4-6.
Po migracji, mDC prezentują przetworzony antygen naiwnym limfocytom T CD4+ i CD8+, inicjując w ten sposób adaptacyjną odpowiedź immunologiczną przeciwko atakującemu patogenowi7. Ta interakcja z limfocytami T w węzłach chłonnych jest również związana z rozprzestrzenianiem się wirusa8. Inne badania in vitro wykazały, że DC skutecznie wychwytują i przenoszą wirusa HIV do limfocytów T, a ta transmisja prowadzi do energicznej infekcji9-12. Eksperymenty te podkreślają, że in vivo HIV wykorzystuje DC jako transportery z peryferii do węzłów chłonnych. Podczas prezentacji antygenu DC wydzielają kluczowe interleukiny, które kształtują różnicowanie efektorowych komórek pomocniczych T, a zatem wynik całej odpowiedzi immunologicznej przeciwko drobnoustrojowi jest określany właśnie w tej interakcji. Oprócz efektorowych limfocytów T typu 1 (Th1) i typu 2 (Th2) opisano inne podzbiory komórek pomocniczych T CD4 + (np. Limfocyty T typu 17 (Th17) i typu 22 (Th22)), a ich indukcja i funkcja zostały dokładnie zbadane. DC są ponadto zaangażowane w wytwarzanie regulatorowych limfocytów T (Treg)13,14. Komórki te są immunosupresyjne i mogą zatrzymywać lub zmniejszać indukcję lub proliferację efektorowych limfocytów T, a zatem mają kluczowe znaczenie dla rozwoju odporności i tolerancji.
Ludzkie konwencjonalne DC (cDCs) składają się z kilku podzbiorów komórek o pochodzeniu szpikowym (np. Komórki Langerhansa (LCs) oraz dermalne i śródmiąższowe DCs) lub limfoidalne (np. plazmocytoidalne DC (pDCs)). W przypadku eksperymentów in vitro lub strategii szczepień DC, DC pochodzące z monocytów są rutynowo stosowane jako model dla skórnych DC. Komórki te wykazują podobieństwa w fizjologii, morfologii i funkcji do konwencjonalnych szpikowych komórek dendrytycznych. Są one generowane przez dodanie interleukiny 4 (IL-4) i czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF) do monocytów wyizolowanych od zdrowych dawców12,15-18. Komórki dendrytyczne mogą być również bezpośrednio izolowane z biopsji skóry lub błony śluzowej, a nawet mogą być wytwarzane z hematopoetycznych komórek progenitorowych CD34+ wyizolowanych z próbek krwi pępowinowej pobranych ex utero. Tutaj pokazujemy, w jaki sposób monocyty są izolowane i stymulowane z antykoagulowanej krwi ludzkiej po wzbogaceniu komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) przez wirowanie w gradiacji gęstości. Po inkubacji przez 5 dni ludzkie monocyty w określonych warunkach różnicują się w iDC i są gotowe do procedur eksperymentalnych w warunkach nieklinicznych.

<table><tbody><tr><td>Mysz APC Anti-Human CD19 Klon HIB19</td><td>BD Biosciences</td><td>555415</td><td></td></tr><tr><td>Mysz APC Anti-Human CD83 Klon HB15e</td><td>BD Biosciences</td><td>551073</td><td></td></tr><tr><td>BD Imag Anty-ludzkie cząstki magnetyczne CD14</td><td>BD Biosciences</td><td>557769</td><td></td></tr><tr><td>BD Imagnet</td><td>BD Biosciences</td><td>552311</td><td></td></tr><tr><td>BSA (Frakcja albuminy V)</td><td>Carl Roth</td><td>EG-Nr 2923225</td><td></td></tr><tr><td>Costar 6 Well Clear Płytki wielodołkowe poddane działaniu TC</td><td>Costar</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Gradient gęstości podłoża: Ficoll-Paque Premium</td><td>GE Healthcare Bio-Sciences</td><td>17-5442-03</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (D-PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 10&nbsp; ml Pipeta serologiczna</td><td>Corning</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 25&nbsp; ml Pipeta serologiczna</td><td>Corning</td><td>357525</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50&nbsp; ml Probówka wirówkowa PP o wysokiej przejrzystości</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Okrągłe probówki Falcon</td><td>Corning</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>FITC Mysz anty-ludzka CD3 Klon HIT3a</td><td>BD Biosciences</td><td>555339</td><td></td></tr><tr><td>Ghost Dye Violet 510 (odczynnik żywotności komórek)</td><td>Tonbo biosciences</td><td>13-0870</td><td></td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-093-862</td><td></td></tr><tr><td>Inaktywowana termicznie FBS (płodowa surowica bydlęca), zatwierdzone przez UE pochodzenie (Ameryka Południowa)</td><td>Gibco</td><td>10500-064</td><td></td></tr><tr><td>Hettich Rotanta 460R</td><td>Hettich</td><td>---</td><td></td></tr><tr><td>IL-4 CC</td><td>PromoKine</td><td>C-61401</td><td></td></tr><tr><td>Bufor izolacyjny: BD IMag Buffer (10x)</td><td>BD Biosciences</td><td>552362</td><td></td></tr><tr><td>roztwór L-glutaminy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek, 1,5 ml, SuperSpin</td><td>VWR</td><td>211-0015</td><td></td></tr><tr><td>PE Mysz Anti-Human CD14 Klon M5E2</td><td>BD Biosciences</td><td>555398</td><td></td></tr><tr><td>PE Mysz Anti-Human CD209 Klon DCN46</td><td>BD Biosciences</td><td>551265</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td> średni <td>Sigma-Aldrich</td><td>R0883</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td></td></tr></tbody></table>

wytwarzanie ludzkich komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów z krwi pełnej

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Komórki dendrytyczne (DC) rozpoznają obce struktury różnych patogenów, takich jak wirusy, bakterie i grzyby, poprzez różne receptory rozpoznawania wzorców (PRR) wyrażane na powierzchni ich komórek i w ten sposób aktywują i regulują odporność. 
Główną funkcją DC jest indukcja odporności adaptacyjnej w węzłach chłonnych poprzez prezentowanie antygenów przez cząsteczki MHC I i MHC II do naiwnych limfocytów T. W związku z tym DC muszą migrować z peryferii do węzłów chłonnych po rozpoznaniu patogenów w miejscach infekcji. W przypadku eksperymentów in vitro lub strategii szczepień DC rutynowo stosuje się DC pochodzące z monocytów. Komórki te wykazują podobieństwa w fizjologii, morfologii i funkcji do konwencjonalnych szpikowych komórek dendrytycznych. Są one generowane przez stymulację interleukiny 4 (IL-4) i czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF) monocytów wyizolowanych od zdrowych dawców. Tutaj pokazujemy, w jaki sposób monocyty są izolowane i stymulowane z antykoagulowanej krwi ludzkiej po wzbogaceniu komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) przez wirowanie w gradiacji gęstości. Ludzkie monocyty różnicują się w niedojrzałe DC i są gotowe do procedur eksperymentalnych w warunkach nieklinicznych po 5 dniach inkubacji.

Po wirowaniu krwi przeciwkrzepliwej z wykorzystaniem poduszki sacharozowej, mononuklearne komórki krwi obwodowej (PBMCs) ulegają wzbogaceniu w interfazie nad medium do gradientu gęstości (Rysunek 1). Po pobraniu PBMCs przeprowadzana jest analiza FACS w celu charakterystyki różnych populacji komórkowych w ramach PBMCs z wykorzystaniem markerów linii (np. CD3 dla limfocytów T, CD14 dla monocytów i CD19 dla limfocytów B). Rysunek 2A przedstawia wyni...

Tutaj pokazujemy, jak monocyty są izolowane przez magnetyczne oddzielanie kulek od komórek jednojądrzastych krwi obwodowej po odwirowaniu w gradionym gradifikacji gęstości ludzkiej krwi antykoagulowanej. Po inkubacji przez 5 dni ludzkie monocyty różnicują się w niedojrzałe komórki dendrytyczne i są gotowe do procedur eksperymentalnych w warunkach nieklinicznych.

Wytwarzanie ludzkich komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów z krwi pełnej

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Ogólnym celem tej techniki separacji kulek magnetycznych CD14 jest wyizolowanie monocytów z krwi w celu ich dalszego różnicowania w komórki dendrytyczne lub makrofagi in vitro. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu immunologii dotyczące rozpoznawania, przetwarzania i prezentacji patogenów lub antygenów przez komórki dendrytyczne. Główną zaletą tej procedury izolacji jest to, że można uzyskać populację monocytów o czystości od 98 do 99%.Procedurę zademonstruje Karolin Thurnes, technik z naszej grupy roboczej. Zacznij od podzielenia objętości opakowania krwi na sterylne 50-mililitrowe probówki wirówkowe w zależności od ilości otrzymanej krwi. W razie potrzeby dostosować końcową objętość w każdej probówce do 50 mililitrów za pomocą sterylnego PBS firmy Dulbecco i odwirować próbki.Za pomocą sterylnej pipety serologicznej o pojemności jednego mililitra podłączonej do laboratoryjnej pompy próżniowej usuń warstwy plazmy i płytek krwi, pozostawiając warstwy graniczne nienaruszone. Następnie użyj nowej pipety o pojemności 25 mililitrów, aby połączyć warstwy graniczne komórek jednojądrzastych z dwóch probówek w nowej sterylnej stożkowej probówce o pojemności 50 mili

generation-of-human-monocyte-derived-dendritic-cells-from-whole-blood

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Prezentacja antygenu w wtórnych narządach limfatycznych przez komórki dendrytyczne jest kluczowa dla inicjacji adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej pośredniczonej przez limfocyty T. W niniejszej pracy demonstrujemy hodowlę mysich komórek dendrytycznych pochodzących z szpiku kostnego, ich aktywację oraz znakowanie do obrazowania dwufotonowego.

Generowanie mysich komórek dendrytycznych pochodzących z szpiku kostnego do zastosowań w obrazowaniu dwufotonowym

Ten film opisuje protokół generowania komórek dendrytycznych - kluczowych komórek prezentujących antygen, które aktywują limfocyty T - ze szpiku kostnego dorosłej myszy.

Generowanie komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego: metoda generowania komórek dendrytycznych ze szpiku kostnego myszy

Ten film pokazuje wytwarzanie niedojrzałych, dojrzałych i tolerogennych komórek dendrytycznych (DC) z ludzkich monocytów. Inkubacja monocytów z czynnikami wzrostu i cytokinami prowadzi do produkcji niedojrzałych DC. W odpowiedzi na cząsteczki regulatora immunologicznego niedojrzałe DC różnicują się w tolerogenne i dojrzałe DC.

Wytwarzanie niedojrzałych, dojrzałych i tolerogennych komórek dendrytycznych z monocytów

Tutaj prezentujemy protokół, który generuje duże ilości mysich monocytów z heterogenicznego szpiku kostnego do zastosowań translacyjnych. W porównaniu z innymi, ta nowa metoda pomaga zmniejszyć liczbę uśmierconych zwierząt i obniżyć koszty, unikając kosztownych metod, takich jak magnetyczna separacja komórek o wysokim gradimencie (MACS).

Izolacja i wstrzyknięcie dożylne monocytów pochodzących ze szpiku kostnego myszy

Niedojrzałe komórki dendrytyczne mogą być selektywnie różnicowane w tolerogenne lub dojrzałe komórki dendrytyczne, aby regulować równowagę między odpornością a tolerancją. W pracy przedstawiono sposób generowania z niedojrzałych komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów (moDC), tolerogennych in vitro i dojrzałych moDC, które różnią się fenotypami metabolicznymi.

Wytwarzanie niedojrzałych, dojrzałych i tolerogennych komórek dendrytycznych o różnych fenotypach metabolicznych

To badanie porównuje dwie różne metody izolacji ludzkich monocytów w celu uzyskania in vitro komórek dendrytycznych (DC). Monocyty są selekcjonowane przez przyleganie lub ujemnie wzbogacane przez separację magnetyczną. Wydajność i żywotność monocytów wraz z żywotnością, proliferacją MDDC i ekspresją markera powierzchniowego CD11c/CD14 zostaną porównane między obiema metodami.

Charakterystyka ludzkich komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów za pomocą obrazowania cytometrii przepływowej: porównanie dwóch protokołów izolacji monocytów

Tutaj udostępniamy metodę identyfikacji i izolowania dużej liczby komórek szpikowych sterowanych przez GM-CSF za pomocą szybkiego sortowania komórek. Na podstawie ekspresji Ly6C i CD115 można zidentyfikować pięć odrębnych populacji (pospolite przodki szpiku, progenitorzy granulocytów/makrofagów, monocyty, makrofagi pochodzące z monocytów i DC pochodzące z monocytów).

Generowanie dużej liczby progenitorów szpiku i prekursorów komórek dendrytycznych z mysiego szpiku kostnego przy użyciu nowej strategii sortowania komórek

Urządzenie lub płytka do transimmunizacji (TI) i związane z nim protokoły zostały opracowane w celu odtworzenia kluczowych cech pozaustrojowej fotochemoterapii (ECP), w warunkach eksperymentalnych, pozwalając na produkcję fizjologicznie aktywowanych, przestrajalnych komórek dendrytycznych (DC) do immunoterapii raka.

Nowy protokół generowania fizjologicznych immunogennych komórek dendrytycznych

Metodologia opisuje wytwarzanie komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów bydlęcych (MoDC) i ich zastosowanie do oceny in vitro kandydatów na antygeny podczas opracowywania potencjalnych szczepionek weterynaryjnych u bydła.

Oznaczanie immunogenności szczepionki przy użyciu komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów bydlęcych

Przedstawiono unikalny, kompleksowy protokół generowania de-sialylowanych ludzkich komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów (mo-DCs) z izolowanych komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMCs) za pomocą leczenia sialidazą. Ponadto opisano metody oceny charakterystyki fenotypowej i funkcjonalnej mo-DC oraz oceny, w jaki sposób leczenie sialidazą poprawia poziom dojrzewania mo-DC.

Generowanie komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów o różnych fenotypach sjalowanych

Opisujemy procedurę oceny zdolności środków farmakologicznych do generowania tolerogennych komórek dendrytycznych z naiwnych komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów in vitro i walidacji ich siły poprzez autologiczne generowanie regulatorowych limfocytów T.

Prosta i skuteczna metoda testowania środków immunomodulujących do wytwarzania tolerogennych komórek dendrytycznych z ludzkich monocytów CD14+

Poznaj technikę izolacji monocytów z krwi pełnej przy użyciu magnetycznych kulek CD14 i ich różnicowanie w komórki dendrytyczne. Ta metoda zapewnia czystość populacji 98-99% i wspiera badania immunologiczne.

Wytwarzanie ludzkich komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów z krwi pełnej

Przeglądaj więcej filmów