Analiza aberracji chromosomowych wywołanych przez pył zawieszony w otoczeniu przy użyciu systemu in vitro

Ogólnym celem tego eksperymentu jest wykrycie uszkodzeń chromosomów wywołanych ekspozycją komórek na cząstki stałe, wyekstrahowane z otaczającego powietrza. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na jedno kluczowe pytanie w dziedzinie pyłu zawieszonego, a mianowicie, czy narażenie na cząstki stałe powoduje uszkodzenie chromosomów? Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na bezpośrednią wizualizację uszkodzeń indukowanych w materiale genetycznym.

Po zebraniu i przeanalizowaniu cząstek zgodnie z protokołem tekstowym, należy przeprowadzić ekspozycję na cząstki, podgrzewając kompletną pożywkę wzrostową, 0,25% trypsyny i PBS w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza, przez co najmniej 30 minut przed rozpoczęciem hodowli. Po umyciu surowych komórek 264,7 dodaj jeden mililitr ciepłego roztworu trypsyny do naczynia i usuń komórki z dna naczynia do hodowli tkankowej przez zeskrobanie. Następnie zebrać komórki i sporządzić zawiesinę jednokomórkową przez wielokrotne pipetowanie.

Za pomocą błękitu trypanowego policz liczbę komórek, a następnie użyj wstępnie podgrzanej kompletnej pożywki, aby pokryć je gęstością 8000 na centymetr kwadratowy w 100-milimetrowym naczyniu do hodowli tkankowej. Następnie użyj kompletnej pożywki, aby dostosować objętość do 10 mililitrów, aby uzyskać końcowe stężenie 50 000 komórek na mililitr. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 przez 24 godziny, aby umożliwić im przyczepienie się.

W komorze bezpieczeństwa biologicznego użyj sterylnego PBS do rozcieńczenia przefiltrowanych cząstek w stężeniu 0,5 miligrama na mililitr, w przypadku dawki 5 mikrogramów na mililitr i w skalicie 5 miligramów na mililitr, w przypadku dawki terapeutycznej 50 mikrogramów na mililitr. Aby poddać je działaniu cząstek stałych, należy sprawdzić hodowane komórki pod mikroskopem z 10-krotnym powiększeniem pod kątem wzrostu komórek, morfologii komórek, stanu hodowli i zanieczyszczenia. Na tym etapie komórki powinny być zlewane w co najmniej 30%.

Za pomocą sterylnej pipety asepcie zassać pożywkę w asepcie i użyć dwóch mililitrów PBS o temperaturze 37 stopni Celsjusza do dwukrotnego umycia naczynia hodowlanego. Dodać wcześniej ustaloną dawkę pyłu zawieszonego ze świeżą pożywką i inkubować kultury w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2, aby zrównać ekspozycję stosowaną do jednoczesnej analizy genotoksycznej i epigenotoksycznej. Aby zatrzymać komórki w metafazie, po umyciu komórek dodaj do kultury dwa mililitry wstępnie podgrzanej pożywki z pięcioma mikrolitrami na mililitr roztworu colcemidu i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 przez dwie godziny.

Po inkubacji całkowicie usuń pożywkę i użyj ciepłego PBS do dwukrotnego umycia komórek. Następnie dodaj roztwór trypsyny i inkubuj kultury w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną minutę. Za pomocą skrobaka do komórek odłącz komórki i dodaj 10 mililitrów PBS, aby dezaktywować trypsynę.

Następnie pipetuj komórki w górę iw dół co najmniej dziesięć razy, aby utworzyć zawiesinę jednokomórkową, i przenieś komórki do 15-mililitrowej, stożkowej probówki wirówkowej. Umieść probówki w wirówce odchylanej i wiruj zawiesinę komórek pod ciśnieniem 400 razy g i w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Aby przeprowadzić leczenie hipotoniczne, należy usunąć supernatant z probówek bez naruszania osadu komórkowego i pozostawić około 0,5 mililitra PBS.

Delikatnie rozbij osad komórek i użyj pipety P200, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki. Następnie dodaj kroplami cztery mililitry podgrzanego roztworu chlorku potasu, delikatnie wstrząsając. Zawiesinę komórkową inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut.

Po zabiegu hipotonicznym utrwalić komórki, dodając równą objętość utrwalacza do probówki i delikatnie wymieszać, odwracając probówkę. Odwirować probówki w temperaturze pokojowej 400 razy g przez pięć minut i usunąć supernatant. Na tym etapie granulka komórkowa zwiększy swój rozmiar i stanie się biaława i bardziej widoczna.

Usunąć supernatant. Dodaj cztery mililitry świeżego utrwalacza i inkubuj probówki w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie odwirować probówki, usunąć supernatant i użyć czterech mililitrów utrwalacza, aby przemyć komórki jeszcze dwa razy.

Zanurz całkowicie szkiełka w 10% płynnym detergencie na 30 minut. Następnie dokładnie opłucz szkiełka w zimnej bieżącej wodzie z kranu przez 30 minut. Użyj wody destylowanej do trzykrotnego spłukania szkiełek, aby całkowicie usunąć detergent.

Następnie zanurz je w wodzie destylowanej i przechowuj szkiełka w lodówce na noc. Upuść dziesięć mikrolitrów zawiesiny komórkowej na schłodzone mokre szkiełko i pozostaw do wyschnięcia na noc w temperaturze pokojowej. Aby wybarwić i połączyć próbki, przygotuj 50 mililitrów roztworu barwiącego giemsa, mieszając jedną część roztworu barwienia giemsa z jedną częścią PBS i wlej do słoika z kopeliną.

Zanurz szkiełka w roztworze barwiącym na 20 minut, następnie spłucz szkiełka w wodzie destylowanej, aby usunąć nadmiar plam i natychmiast użyj suszarki do włosów, aby wysuszyć szkiełka. Pozostaw szkiełka w temperaturze pokojowej na noc. Następnego ranka nałóż pojedynczą kroplę podłoża mocującego na szkiełko.

Delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe na górze i pozwól, aby medium montażowe powoli rozprowadzało się po szkiełku. Następnie użyj ręcznika papierowego, aby usunąć nadmiar podłoża. Na koniec użyj mikroskopu jasnego pola przy 100-krotnym powiększeniu, aby zbadać strukturalne aberracje chromosomowe w rozprzestrzenianiu się metafazy.

Ten obraz pokazuje, że normalny rozprzestrzenianie się metafazy myszy będzie miał 40 acentrycznych chromosomów. Leczenie cząstkami stałymi wywołuje różne aberracje chromosomowe, takie jak pęknięcie chromatydy, fragment acentryczny, chromosom pierścieniowy, chromosom dicentryczny, podwójne minuty, translokacja Robertsona i endoreduplikacja. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że należy używać tylko komórek proliferujących.

Zgodnie z tą procedurą, inne metody, takie jak M-FISH i SKY, mogą być użyte do udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania. Na przykład, czy występują międzychromosomowe, stabilne aberracje. Nie zapomnij o środkach ostrożności i czynnikach rakotwórczych, a środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek, należy zawsze podejmować podczas wykonywania tej procedury.