Name: Analiza aberracji chromosomowych wywołanych przez pył zawieszony w otoczeniu przy użyciu systemu in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Poznaj metodę analizy aberracji chromosomowych wywołanych przez pył zawieszony w otoczeniu przy użyciu makrofagów RAW264.7. Technika umożliwia bezpośrednią wizualizację uszkodzeń materiału genetycznego in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Praca była częściowo wspierana przez National Institute of Health Center of Biological Research Excellence [numer grantu 1P20GM109005], Arkansas Space Grant Consortium poprzez National Aeronautics and Space Administration [numer grantu NNX15AK32A] oraz National Institute for Occupational Safety and Health (NIOSH) [numer grantu 2T420H008436]. Autorzy pragną podziękować Christopherowi Fettesowi za korektę i redakcję tego rękopisu.

1. Zbieranie i przygotowanie cząstek
<ol>
	<li>Kalibracja próbnika cząstek zawieszonych o dużej objętości
	<ol>
		<li>Odłączyć silnik próbnika od regulatora przepływu masowego i podłączyć silnik do stabilnego źródła zasilania prądem przemiennym (Rysunek 1). 
		UWAGA: Podczas tej procedury nie jest używany filtr.</li>
		<li>Zamontuj kryzę kalibratora i płytkę adaptera ładowanego od góry do próbnika. Mocno dokręć nakrętki dociskowe adaptera ładowanego od góry, aby upewnić się, że nie ma wycieków powietrza. Poczekaj, aż silnik próbnika rozgrzeje się do normalnej temperatury roboczej (około 10-15 minut).</li>
		<li>Przeprowadź próbę szczelności, zakrywając otwory w górnej części kryzy i docisnąć kran do kryzy rękami. Posłuchaj wysokiego, piskliwego dźwięku wydawanego przez uciekające powietrze. Jeśli usłyszysz ten dźwięk, ponownie dokręć nakrętki dociskowe adaptera ładowanego od góry, ponieważ występuje wyciek. Jeśli dźwięk jest niższy, wyciek występuje w pobliżu jednej z pozostałych uszczelek w systemie.</li>
		<li>Podłącz jedną stronę manometru wodnego do zaworu ciśnieniowego z boku kryzy za pomocą gumowej rurki próżniowej. Pozostaw przeciwną stronę manometru otwartą na atmosferę. Trzymaj manometr pionowo, aby zapewnić dokładne odczyty. Stuknięcie w tylną część rejestratora ciągłego przepływu pomoże wyśrodkować pióro i zapewni dokładne odczyty.</li>
		<li>Powtórz krok 1.1.2, używając pięciu natężeń przepływu reprezentujących robocze natężenia przepływu od 30 do 60 stóp/min (w przybliżeniu co 5-6 stóp3/min). Ustaw pokrętło na zmiennej kryzie w pięciu różnych pozycjach i wykonaj pięć różnych odczytów.</li>
		<li>Na karcie kalibracji należy zapisać temperaturę powietrza otoczenia, ciśnienie atmosferyczne otoczenia, numer seryjny próbnika, numer seryjny kryzy, nachylenie kryzy i punkt przecięcia z datą ostatniego poświadczenia zasilania, datą, lokalizacją miejsca i inicjałami operatora.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobieranie próbek całkowitych zawieszonych cząstek i analiza grawimetryczna
	<ol>
		<li>Owiń filtr z włókna kwarcowego o wymiarach 8 "x 10" dwiema warstwami folii aluminiowej. Umieść owinięty filtr w piecu i ustaw temperaturę na 550 °C. Piecz filtr przez co najmniej 4 godziny. Poczekaj, aż piec ostygnie i wyjmij filtr. Umieścić filtr w eksykatorze z CaCO3.</li>
		<li>Zważyć filtr na mikrowadze z dokładnością do 10 μg. Powtórzyć pomiar trzy razy w ciągu dnia. Poszczególne pomiary powinny mieścić się w granicach 25 μg. Jeśli to nie zostanie osiągnięte, należy zwrócić owinięty filtr z powrotem do eksykatora i powtórzyć proces następnego dnia.</li>
		<li>Otwórz pokrywę schronu (Rysunek 2). Zdejmij ramę uchwytu filtra, poluzowując cztery nakrętki motylkowe, pozwalając mosiężnym i podkładkom odchylić się w dół. Rozłóż filtr z folii aluminiowej i za pomocą oczyszczonych kleszczyków ostrożnie wyśrodkuj go, szorstką stroną do góry, na ekranie nośnym. Prawidłowo wyrównaj filtr na ekranie.</li>
		<li>Umieść ramę na ekranie i zabezpiecz ją mosiężnymi i podkładkami, wywierając wystarczający nacisk, aby uniknąć wycieku powietrza na krawędziach. Wytrzyj nagromadzony kurz z okolic uchwytu filtra czystą szmatką. Ostrożnie zamknij pokrywę schronienia i zabezpiecz ją.</li>
		<li>Upewnij się, że wszystkie przewody są podłączone do odpowiednich gniazdek, a przewód między zaworem ciśnieniowym silnika dmuchawy a rejestratorem przepływu ciągłego jest podłączony.</li>
		<li>Przygotuj rejestrator przepływu. Wciśnij podnośnik ramienia pióra, aby podnieść punkt pióra i wstawić nowy wykres. Dopasuj zakładkę wykresu do piasty napędu rejestratora i naciśnij kciukiem, aby opuścić środek wykresu na koncentratorze. Ustaw czas, obracając piastę napędu zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aż właściwy czas na wykresie zostanie wyrównany ze wskaźnikiem indeksu czasu.</li>
		<li>Ręcznie włącz sampler i rozpocznij kolekcję. Monitoruj rejestrator, aby upewnić się, że jest prawidłowo odręczny, oraz wskaźnik czasu, który upłynął, aby upewnić się, że działa prawidłowo.</li>
		<li>Pod koniec okresu pobierania próbek wyłączyć próbnik, zapisać czas, który upłynął, i pobrać wykres. Zdejmij ramkę, aby odsłonić filtr. Wyjmij odsłonięty filtr z ekranu nośnego, delikatnie przytrzymując go za końce kleszczami. Złóż filtr wzdłuż tak, aby próbka dwukrotnie dotykała próbki i zawiń ją w oryginalną folię aluminiową.</li>
		<li>Przechowuj filtr w eksykatorze z CaCO3 przez co najmniej 24 godziny przed ważeniem. Powtórzyć krok 1.2.2 w celu zmierzenia masy filtrów po pobraniu próbki. Umieść filtr w plastikowej torbie z zamkiem błyskawicznym i przechowuj go w temperaturze -80 °C do czasu analizy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza pobranej próbki całkowitych cząstek zawieszonych
	<ol>
		<li>Wyjmij przechowywany filtr, rozłóż folię aluminiową i przenieś filtr na czystą powierzchnię teflonową. Za pomocą kleszczy i skalpela odetnij zewnętrzną (białą) część filtra i wyrzuć.
		<ol>
			<li>Następnie pokrój filtr na kawałki o wymiarach 0,5" x 0,5" i umieść kawałki w kolbie o pojemności 100 ml. Dodać 50 ml ultraczystej wody. Umieścić kolbę w łaźni ultradźwiękowej i poddać soniku przez 60 minut przy 33±3 kHz.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przefiltrować ekstrakt przez polipropylenowy filtr strzykawkowy o wielkości 0,45 μm do kolby okrągłodennej o pojemności 100 ml. Odparować wodę za pomocą przyrządu rotavap pod ciśnieniem 50 °C do momentu, gdy w kolbie pozostanie około 5 ml ekstraktu.
		<ol>
			<li>Odparować pozostałą wodę w kolbie o pojemności 15 ml w kształcie gruszki o znanej masie. Zważyć kolbę z suchym ekstraktem i zanotować masę suchego ekstraktu.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Rozpuścić suchą próbkę w 400 μlD2O przez sonikację przez 15 minut i przenieść do standardowej probówki NMR o średnicy 5 mm. Wirować przez 5 minut w temperaturze pokojowej 12 000 x g w celu usunięcia nierozpuszczonej substancji.</li>
		<li>Powtórzyć z 300 μl D2O. Dodać 10 μl NaN3 1,4% (końcowe stężenie: 0,02% w/v) do probówki NMR. Dodać 10 μl (32 μg) całkowitych zawieszonych cząstek (TSP)-d4 (3,2 mg/ml) do D2O (stężenie końcowe 0,258 mM) w probówce NMR.</li>
		<li>Uzyskaj widma 1H NMR za pomocą spektrometru NMR działającego na częstotliwości 600,17 MHz.
		<ol>
			<li>Włóż rurkę NMR do kriosondy rezonansowej z potrójnym rezonansem. Skalibruj przyrząd w następującej kolejności: blokada, strojenie, podkładka, kalibracja długości impulsu 90° i regulacja wzmocnienia odbiornika.</li>
			<li>Pomiar widm w temperaturze 25 °C za pomocą sekwencji rzeźbienia wzbudzenia 1 D przy użyciu 180 impulsów selektywnych dla wody w trybie detekcji Digital Quad, 8 192 skany, 4 skany fikcyjne, szerokość przemiatania 8012,57 Hz, przesunięcie częstotliwości dla tłumienia sygnału wodnego ustawione na 4,70 ppm, czas akwizycji 1,70 s, 32 768 punktów danych w dziedzinie czasu (TD), gradient czasu trwania 1 ms (p16), Opóźnienie powrotu 100 μs po nachyleniu (d16).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przetwarzaj widma 1H NMR, stosując poszerzenie linii o 1 Hz i wypełnienie zerem o współczynnik 2 (65 536 punktów danych). Ręcznie skoryguj fazę i linię bazową i zintegruj. Ustaw szczyt TSP-d4 na 0,0 ppm.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Ekspozycja na cząstki
<ol>
	<li>Struktura kultury
	<ol>
		<li>Ciepła, kompletna pożywka wzrostowa zawierająca 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i roztwór penicyliny-streptomycyny (100 j./ml), 0,25% roztwór trypsyny i sól fizjologiczną z buforu bezwapniowo-magnezowo-fosforanowego (PBS) w łaźni wodnej (w temperaturze 37 °C) przez co najmniej 30 minut przed rozpoczęciem hodowli.</li>
		<li>Wyjąć kolbę T75 z inkubatora 5% CO2 zawierającego hodowane komórki RAW264.7 i przemyć komórki 2 ml wstępnie podgrzanego PBS dwa razy.</li>
		<li>Usunąć przylegające komórki RAW264.7 z dna naczynia do hodowli tkankowej za pomocą 1 ml wstępnie podgrzanego roztworu trypsyny, a następnie zeskrobać.</li>
		<li>Pobrać komórki z naczynia do hodowli tkankowej i sporządzić zawiesinę pojedynczej komórki przez wielokrotne pipetowanie. Policz liczbę komórek za pomocą błękitu trypanowego i płytki o gęstości 8 000/cm2 (łącznie 500 000 komórek) w naczyniu do hodowli tkankowej o średnicy 100 mm ze wstępnie podgrzaną kompletną pożywką. Dostosuj objętość podłoża do 10 ml, aby uzyskać końcowe stężenie 50 000 komórek na ml. 
		UWAGA: Podwój liczbę płytek, jeśli wykonywana jest również analiza metylacji DNA.</li>
		<li>Umieścić nowo platerowane komórki RAW264.7 z powrotem w inkubatorze 5% CO2 w temperaturze 37 °C i pozostawić do przyłączenia na 24 godziny.</li>
		<li>Również w komorze bezpieczeństwa biologicznego należy ponownie zawiesić przefiltrowane cząstki. Na przykład rozcieńczyć cząstki w stężeniu 0,5 mg/ml w sterylnym PBS dla dawki leczniczej 5 μg/ml i w stężeniu 5 mg/ml dla dawki leczniczej 50 μg/ml. Rozcieńczenia można przygotowywać z miesięcznym wyprzedzeniem i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Leczenie cząstkami stałymi
	<ol>
		<li>Wyjmij komórki z inkubatora 5% CO2 i sprawdź pod 10-krotnym powiększeniem za pomocą odwróconego mikroskopu wzrost komórek, morfologię komórek, stan hodowli i zanieczyszczenie. Na tym etapie należy spodziewać się co najmniej 30% zlewających się komórek.</li>
		<li>W aseptyce odessać pożywkę za pomocą wysterylizowanej pipety i dwukrotnie umyć naczynie hodowlane 2 ml PBS o temperaturze 37 °C, aby całkowicie usunąć pożywkę oraz pływające lub martwe komórki.</li>
		<li>Dodać wcześniej ustaloną dawkę cząstek stałych ze świeżymi pożywkami do naczyń hodowlanych i inkubować przez żądany czas w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 . W tym badaniu należy traktować komórki RAW264.7 PM przez 72 godziny, aby zrównać ekspozycję stosowaną do jednoczesnej analizy genotoksycznej i epigenotoksycznej. 
		UWAGA: Cytotoksyczność może negatywnie wpływać na jakość analizy cytogenetycznej. Dlatego na leczonych komórkach zwykle wykonuje się dodatkowe testy, takie jak cytotoksyczność, metylacja DNA, Western blot lub analiza ekspresji genów. Wystaw komórki zgodnie z opisem i postępuj zgodnie z żądanym testem. Niedoświadczeni użytkownicy mogą również chcieć włączyć kontrolę pozytywną, taką jak metanosulfonian metylu, aby przetestować ich zdolność do wykrywania CA.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Test cytogenetyczny
<ol>
	<li>Leczenie mające na celu zatrzymanie komórek w metafazie
	<ol>
		<li>Podgrzewać roztwór colcemidu (10 μg/ml) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 30 minut. Przetrzeć pokrywkę 70% alkoholem pod szafką bezpieczeństwa biologicznego, aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia</li>
		<li>Całkowicie usunąć pożywkę w aseptyki i umyć naczynia hodowlane 2 ml wstępnie podgrzanego PBS dwa razy.</li>
		<li>Dodać wstępnie podgrzaną świeżą pożywkę (2 ml pożywki/106 komórek) zawierającą roztwór colcemidu (5 μl/ml) do naczynia hodowlanego i inkubować przez 2 godziny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobieranie komórek
	<ol>
		<li>Ciepły roztwór trypsyny i PBS w łaźni wodnej utrzymywanej w temperaturze 37 °C przez 30 min. Od tego kroku nie ma potrzeby utrzymywania stanu aseptyki.</li>
		<li>Całkowicie usunąć pożywkę, umyć naczynia hodowlane 2 ml PBS o temperaturze 37 °C przez dwa razy, dodać wymaganą objętość wstępnie podgrzanego roztworu trypsyny (zwykle 2 ml dla szalki hodowlanej 60 mm lub kolby T25 i 4 ml dla szalki 100 mm lub kolby T75) i umieścić naczynie hodowlane z powrotem w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C na 1 minutę.</li>
		<li>Wyjmij naczynie hodowlane, odłącz komórki za pomocą skrobaka i dodaj 10 ml PBS, aby zatrzymać działanie trypsyny.</li>
		<li>Pipetować w górę i w dół co najmniej dziesięć razy, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek i przenieść je do stożkowej dolnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Odwirować zawiesinę komórek przy 400 x g przez 5 minut w wirówce odchylanej w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Usunąć supernatant, rozbić osad komórkowy przez delikatne stukanie, dodać 10 ml PBS i ponownie wirować przez pięć minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Leczenie hipotoniczne i fiksacja
	<ol>
		<li>Podgrzać 0,075 M roztwór chlorku potasu w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez co najmniej 30 minut.</li>
		<li>Usunąć supernatant bez naruszania osadu komórkowego i pozostawić około 0,5 ml PBS.</li>
		<li>Delikatnie rozbij osad komórek i przygotuj zawiesinę pojedynczych komórek za pomocą pipety P200.</li>
		<li>Dodawać 4 ml podgrzanego roztworu chlorku potasu kropla po kropli, delikatnie wstrząsając.</li>
		<li>Inkubować komórki w hipotonicznym roztworze chlorku potasu w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 20 minut.</li>
		<li>Przygotuj świeży roztwór acetometanolu, dodając 3 części metanolu z 1 częścią lodowatego kwasu octowego. Świeżo przygotowany utrwalacz należy przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Po leczeniu hipotonicznym dodać równą objętość (4 ml) utrwalacza do probówki i delikatnie wymieszać roztwór, odwracając probówkę.</li>
		<li>Wirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant. Na tym etapie rozmiar osadu komórkowego zwiększa się, staje się białawy i bardziej widoczny.</li>
		<li>Usunąć supernatant, dodać 4 ml świeżego utrwalacza i przechowywać w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
		<li>Wirować przy 400 x g przez 5 minut, usunąć supernatant i przeprowadzić jeszcze dwa płukania 4 ml utrwalacza.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Czyszczenie szkiełek i przygotowanie do rozprzestrzeniania się metafazy
	<ol>
		<li>Całkowicie zanurz szkiełka w 10% płynnym detergencie na 30 minut.</li>
		<li>Dokładnie opłucz szkiełka w zimnej bieżącej wodzie z kranu przez 30 minut.</li>
		<li>Trzykrotnie spłucz szkiełka wodą destylowaną, aby całkowicie usunąć detergent, zanurz w wodzie destylowanej i przechowuj w lodówce do wykorzystania w przyszłości. 
		UWAGA: Czyszczenie szkiełek przed użyciem ułatwia równomierne rozprowadzanie i zwiększa jakość metafazy.</li>
		<li>Upuść 10 μl zawiesiny komórek na schłodzone mokre szkiełko i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez noc w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie i montaż
	<ol>
		<li>Przygotuj 50 ml roztworu barwiącego Giemsa, mieszając jedną część roztworu do barwienia Giemsa z jedną częścią PBS i wlej do słoika Coplin.</li>
		<li>Zanurz szkiełka w roztworze barwiącym na 20 minut.</li>
		<li>Opłucz szkiełka w wodzie destylowanej, aby usunąć nadmiar plam i natychmiast wysusz szkiełka za pomocą suszarki do włosów.</li>
		<li>Pozostaw szkiełka w temperaturze pokojowej na noc.</li>
		<li>Nałóż pojedynczą kroplę podłoża montażowego na szkiełko, delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe na podłożu montażowym, pozwól medium powoli rozprowadzić się po szkiełku i usuń nadmiar podłoża ręcznikiem papierowym. Pozostaw zamontowane szkiełko do wyschnięcia na co najmniej 1 godzinę przed przeniesieniem lub obejrzeniem pod mikroskopem, aby uniknąć przesuwania się szkiełka nakrywkowego. 
		Uwaga: Ważne jest, aby na tym etapie ostrożnie umieścić szkiełko nakrywkowe, nie tworząc żadnych pęcherzyków. Nie zaleca się używania nadmiernego ciepła do usuwania pęcherzyków.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obserwacja mikroskopowa i typy aberracji
	<ol>
		<li>Zbadaj strukturalne CA w rozrzutach metafaz przy 100-krotnym powiększeniu za pomocą dobrej jakości mikroskopu jasnego pola.</li>
		<li>Oceń co najmniej 50 do 100 rozpiętości metafaz dla każdej grupy leczonej w przypadku zabiegów, które indukują dużą liczbę CA. W przypadku mniejszych rozmiarów efektu zaleca się analizę do 300 spreadów metafazowych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Lim, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+risk+assessment+of+burden+of+disease+and+injury+attributable+to+67+risk+factors+and+risk+factor+clusters+in+21+regions%2C+1990-2010%3A+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2010%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">A comparative risk assessment of burden of disease and injury attributable to 67 risk factors and risk factor clusters in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010.</a> Lancet. 380, 2224-2260 (2012).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22IARC%3A+Outdoor+air+pollution+a+leading+environmental+cause+of+cancer+deaths%22">IARC: Outdoor air pollution a leading environmental cause of cancer deaths</a>. , IARC. Press Release 10-17-2013 (2013).</li>
<li>Putaud, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+European+aerosol+phenomenology-2%3A+chemical+characteristics+of+particulate+matter+at+kerbside%2C+urban%2C+rural+and+background+sites+in+Europe%5BTitle%5D)+AND+%22Atmos.+Environ%22%5BJournal%5D)">A European aerosol phenomenology-2: chemical characteristics of particulate matter at kerbside, urban, rural and background sites in Europe.</a> Atmos. Environ. 38 (16), 2579-2595 (2004).</li>
<li>Hand, J., Schichtel, B., Pitchford, M., Malm, W., Frank, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seasonal+composition+of+remote+and+urban+fine+particulate+matter+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22J+Geophys+Res-Atmos%22%5BJournal%5D)">Seasonal composition of remote and urban fine particulate matter in the United States.</a> J Geophys Res-Atmos. 117 (5), (2012).</li>
<li>Schauer, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Source+apportionment+of+airborne+particulate+matter+using+organic+compounds+as+tracers%5BTitle%5D)+AND+%22Atmos.+Environ%22%5BJournal%5D)">Source apportionment of airborne particulate matter using organic compounds as tracers.</a> Atmos. Environ. 30 (22), 3837-3855 (1996).</li>
<li>Simoneit, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+biomarker+compounds+as+source+indicators+and+tracers+for+air+pollution%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Pollut.+Res%22%5BJournal%5D)">A review of biomarker compounds as source indicators and tracers for air pollution.</a> Environ. Sci. Pollut. Res. 6 (3), 159-169 (1999).</li>
<li>Kavouras, I. G., Stephanou, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+size+distribution+of+organic+primary+and+secondary+aerosol+constituents+in+urban%2C+background+marine%2C+and+forest+atmosphere%5BTitle%5D)+AND+%22J+Geophys+Res-Atmos%22%5BJournal%5D)">Particle size distribution of organic primary and secondary aerosol constituents in urban, background marine, and forest atmosphere.</a> J Geophys Res-Atmos. 107 (8), (2002).</li>
<li>Graber, E., Rudich, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atmospheric+HULIS%3A+How+humic-like+are+they%3F+A+comprehensive+and+critical+review%5BTitle%5D)+AND+%22Atmos.+Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">Atmospheric HULIS: How humic-like are they? A comprehensive and critical review.</a> Atmos. Chem. Phys. 6 (3), 729-753 (2006).</li>
<li>Pöschl, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atmospheric+aerosols%3A+composition%2C+transformation%2C+climate+and+health+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int%22%5BJournal%5D)">Atmospheric aerosols: composition, transformation, climate and health effects.</a> Angew. Chem. Int. 44 (46), 7520-7540 (2005).</li>
<li>Hou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+methylation+in+tandem+repeat+element+and+elemental+component+levels+in+inhalable+air+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Mol.+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Altered methylation in tandem repeat element and elemental component levels in inhalable air particles.</a> Environ. Mol. Mutagen. 55 (3), 256-265 (2014).</li>
<li>Miousse, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+alterations+induced+by+ambient+particulate+matter+in+mouse+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Mol.+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Epigenetic alterations induced by ambient particulate matter in mouse macrophages.</a> Environ. Mol. Mutagen. 55 (5), 428-435 (2014).</li>
<li>Miousse, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Toxicity+and+Epigenotoxicity+of+Different+Types+of+Ambient+Particulate+Matter%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Sci%22%5BJournal%5D)">In Vitro Toxicity and Epigenotoxicity of Different Types of Ambient Particulate Matter.</a> Toxicol. Sci. 148 (2), 473-487 (2015).</li>
<li>Ehrlich, M. Genomic instability in cancer development. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEhrlich%2C+M+%22Genome+Instability+in+Cancer+Development%22">Genome Instability in Cancer Development</a>. , Springer. 363-392 (2005).</li>
<li>Michael, S., Montag, M., Dott, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-inflammatory+effects+and+oxidative+stress+in+lung+macrophages+and+epithelial+cells+induced+by+ambient+particulate+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Pollut%22%5BJournal%5D)">Pro-inflammatory effects and oxidative stress in lung macrophages and epithelial cells induced by ambient particulate matter.</a> Environ Pollut. 183, 19-29 (2013).</li>
<li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+heme+oxygenase-1+expression+in+macrophages+by+diesel+exhaust+particle+chemicals+and+quinones+via+the+antioxidant-responsive+element%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction of heme oxygenase-1 expression in macrophages by diesel exhaust particle chemicals and quinones via the antioxidant-responsive element.</a> J Immunol. 165 (6), 3393-3401 (2000).</li>
<li>Pathak, R., Ramakumar, A., Subramanian, U., Prasanna, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+radio-sensitivities+of+human+chromosomes+1+and+2+in+one+donor+in+interphase-+and+metaphase-spreads+after+60Co+gamma-irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med.+Phys%22%5BJournal%5D)">Differential radio-sensitivities of human chromosomes 1 and 2 in one donor in interphase- and metaphase-spreads after 60Co gamma-irradiation.</a> BMC Med. Phys. 9, 6649(2009).</li>
<li>Pathak, R., Dey, S. K., Sarma, A., Khuda-Bukhsh, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotoxic+effects+in+M5+cells+and+Chinese+hamster+V79+cells+after+exposure+to+7+Li-beam+%28LET%3D+60keV%2F%C2%B5m%29+and+correlation+of+their+survival+dynamics+to+nuclear+damages+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res.+Genet.+Toxicol.+Environ.+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Genotoxic effects in M5 cells and Chinese hamster V79 cells after exposure to 7 Li-beam (LET= 60keV/µm) and correlation of their survival dynamics to nuclear damages and cell death.</a> Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 628 (1), 56-66 (2007).</li>
<li>Pathak, R., Dey, S. K., Sarma, A., Khuda-Bukhsh, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+killing%2C+nuclear+damage+and+apoptosis+in+Chinese+hamster+V79+cells+after+irradiation+with+heavy-ion+beams+of+16+O%2C+12+C+and+7+Li%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res.+Genet.+Toxicol.+Environ.+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Cell killing, nuclear damage and apoptosis in Chinese hamster V79 cells after irradiation with heavy-ion beams of 16 O, 12 C and 7 Li.</a> Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 632 (1), 58-68 (2007).</li>
<li>Chalbot, M. C., Kavouras, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+magnetic+resonance+spectroscopy+for+determining+the+functional+content+of+organic+aerosols%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Pollut%22%5BJournal%5D)">Nuclear magnetic resonance spectroscopy for determining the functional content of organic aerosols: a review.</a> Environ. Pollut. 191, 232-249 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Badania cytogenetyczne lub analiza mikroskopowa liczby lub struktur chromosomów, przede wszystkim w rozprzestrzenianiu się metafazy, dostarczają informacji kluczowych dla rokowania, oceny ryzyka i leczenia różnych chorób. Obecnie powszechnie wiadomo, że nieprawidłowości cytogenetyczne są związane z progresją i rozwojem wielu chorób, w tym raka. Do tej pory CA znaleziono we wszystkich głównych typach nowotworów. CA mogą powstawać spontanicznie lub przez bodźce zewnętrzne lub wewnętrzne, takie jak promieniowanie jonizujące...

Szacuje się, że narażenie na pył zawieszony (PM) powoduje ponad 3 miliony nadmiarowych zgonów rocznie, głównie z powodu chorób krążeniowo-oddechowych i raka płuc1. Rzeczywiście, PM został uznany za rakotwórczy dla ludzi przez Międzynarodową Agencję Badań nad Rakiem (Grupa 1), ponieważ wykazano zwiększone ryzyko raka płuc wraz ze wzrostem poziomu narażenia na PM2. Co ciekawe, prawie wszystkie komórki rakowe mają numeryczne i/lub strukturalne nieprawidłowości chromosomowe. Węgiel organiczny w postaci cząstek stałych jest różnorodną, złożoną i niejednorodną mieszaniną, której skład i rozkład wielkości zależy od emisji oraz przemian fizycznych i chemicznych. Odpowiada za 35-55% masy PM2,5 w miastach (PM 2,5 μm i mniej) oraz ponad 60% masy PM2,5 w tle wiejskim i kontynentalnym3, 4. Frakcja rozpuszczalna w wodzie stanowi 30-90% aerozolu organicznego. Zidentyfikowano dużą liczbę związków organicznych, w tym węglowodory alifatyczne, wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne oraz ich utlenione i nitrowane pochodne, aldehydy alifatyczne i alkohole, wolne kwasy tłuszczowe i ich sole, kwasy dikarboksylowe, związki wielofunkcyjne, białka i makrocząsteczki humopodobne (HULIS) przy użyciu metod chromatograficznych sprzężonych z technikami spektrometrii mas5-8. Związki te stanowią mniej niż 10-20% węgla organicznego w cząstkach stałych, dlatego większość węgla organicznego jest nieznana9.
Eksperymentalne dowody sugerują, że cytotoksyczność, stres oksydacyjny i stan zapalny są zaangażowane w rozwój stanów patologicznych związanych z PM. Ostatnio wykazano jednak, że narażenie na PM powoduje również szereg zmian epigenetycznych, w tym zmiany w metylacji DNA powtarzających się elementów, zarówno w eksperymentalnych systemach in vitro, jak i u ludziw wieku 10-12 lat. Szczególnie interesujący jest wpływ PM na DNA satelitów – głównych i mniejszych satelitów – które znajdują się w regionie heterochromatycznym wokół centromeru chromosomów. Wykazano, że efekty te mogą być z natury trwałe, ponieważ można je wykryć przez co najmniej 72 godziny po ekspozycji12. Zmiany w metylacji DNA, szczególnie wokół centromerów, mogą prowadzić do akumulacji satelitarnych transkryptów DNA mRNA, naruszać integralność chromosomów podczas podziału komórki, a w konsekwencji prowadzić do rozwoju różnych stanów patologicznych13.
Adaptacja podejścia cytogenetycznego do analizy CA jako punktu końcowego zmian epigenetycznych spowodowanych przez PM, ma zatem duże znaczenie. W tym miejscu przedstawiamy podejście do zbierania i przygotowania cząstek stałych w otoczeniu, ekspozycji in vitro i analizy CA przy użyciu systemu modelowego mysich makrofagów RAW264.7. Makrofagi stanowią pierwszą linię obrony przed wdychanymi ciałami obcymi i dlatego ta linia komórkowa służy jako uznany i najczęściej stosowany model w toksykologii cząstek11, 12, 14, 15.

<table><tbody><tr><td>Próbnik cząstek zawieszonych</td><td>Tisch Environmental</td><td>TE-5170</td><td></td></tr><tr><td>Spektrometr NMR Bruker Avance III&nbsp;</td><td>Oprogramowanie Bruker</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>TopSpin 3.5/pl2</td><td>Procesor Bruker</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>ACD/NMR Academic Edition</td><td>ACD/Labs</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>RAW264.7 mysie makrofagi</td><td>ATCC</td><td>ATCC TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>Wysoka glukoza DMEM GlutaMAX Media</td><td>ThermoFisher</td><td>10569010</td><td>Ciepły w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>ThermoFisher</td><td>16000044</td><td>Ciepła w 37 &stopni; C kąpiel wodna przed użyciem</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)</td><td>ThermoFisher</td><td>15140163</td><td>Warm w temperaturze 37 & stopni; C kąpiel wodna przed użyciem</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,25%)</td><td>ThermoFisher</td><td>25200056</td><td>Ciepły w temperaturze 37 stopni; C kąpiel wodna przed użyciem</td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>ThermoFisher</td><td>10010049</td><td>Ciepły w temperaturze 37 & stopni; C kąpiel wodna przed użyciem</td></tr><tr><td>KaryoMAX Colcemid Solution w PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>15212012</td><td>Warm w temperaturze 37 stopni; C kąpiel wodna przed użyciem</td></tr><tr><td>KaryoMAX Roztwór chlorku potasu</td><td>ThermoFisher</td><td>10575090</td><td>Ciepły w temperaturze 37 stopni C kąpiel wodna przed użyciem</td></tr><tr><td>Metanol (HPLC)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452N1-19</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy, lodowaty</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1185-500</td><td></td></tr><tr><td>Decon Contrad 70 Płynny detergent</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-1</td><td></td></tr><tr><td>Roztwory plam Wright i Wright-Giemsa</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-200733</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże</td> <td>montażowe PermountFisher Scientific</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>Axio Imager 2</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza aberracji chromosomowych wywołanych przez pył zawieszony w otoczeniu przy użyciu systemu in vitro

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Narażenie na pył zawieszony (PM) jest głównym problemem zdrowotnym na świecie, który może uszkodzić różne składniki komórkowe, w tym jądrowy materiał genetyczny. Aby ocenić wpływ PM na jądrową integralność genetyczną, w rozprzestrzenianiu się metafaz mysich komórek makrofagowych RAW264.7 ocenia się strukturalne aberracje chromosomowe. Cząstki stałe są zbierane z powietrza otoczenia za pomocą próbnika cząstek zawieszonych o dużej objętości. Zebrany materiał jest rozpuszczany i filtrowany w celu zachowania rozpuszczalnej w wodzie, drobnej porcji. Cząstki są charakteryzowane pod względem składu chemicznego za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR). Różne stężenia zawiesiny cząstek dodaje się do hodowli in vitro mysich makrofagów RAW264.7 na łączny czas ekspozycji wynoszący 72 godziny, wraz z nietraktowanymi komórkami kontrolnymi. Pod koniec ekspozycji hodowla jest traktowana colcemidem w celu zatrzymania komórek w metafazie. Komórki są następnie zbierane, traktowane roztworem hipotonicznym, utrwalane w acetometanolu, umieszczane na szkiełkach i na koniec barwione roztworem Giemsy. Szkiełka są badane w celu oceny strukturalnych aberracji chromosomowych (CA) w rozprzestrzenianiu się metafazy przy powiększeniu 1,000x przy użyciu mikroskopu jasnego pola. Dla każdej grupy leczonej ocenia się od 50 do 100 rozpiętości metafaz. Technika ta jest przystosowana do wykrywania strukturalnych aberracji chromosomowych (CA), takich jak pęknięcia typu chromatyd, wymiany typu chromatyd, fragmenty acentryczne, chromosomy dicentryczne i pierścieniowe, podwójne minuty, endoreduplikacja i translokacje Robertsona in vitro po ekspozycji na PM. Jest to potężna metoda powiązania dobrze ustalonego cytogenetycznego punktu końcowego ze zmianami epigenetycznymi.

Należy zachować szczególną ostrożność przy wyborze lokalizacji próbownika TSP, jak również czasu w roku, w którym przeprowadzane jest pobieranie próbek. Skład chemiczny, a także wielkość cząstek mogą mieć istotny wpływ na wyniki. Zebrany materiał powinien być widoczny na białym filtrze. Normalna preparat metafazy mysiej będzie zawierać 40 chromosomów acentrycznych. Celem techniki jest wykazanie zmiany (lub jej braku) w proporcji chromosomów anormalnych w komórkach traktowanych w porównani...

Ten protokół opisuje techniki kwantyfikacji i charakterystyki aberracji chromosomowych in vitro w makrofagach myszy RAW264.7 po leczeniu cząstkami powietrza atmosferycznego.

Analiza aberracji chromosomowych wywołanych przez pył zawieszony w otoczeniu przy użyciu systemu in vitro

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. ...

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest wykrycie uszkodzeń chromosomowych wywołanych ekspozycją komórek na pył zawieszony wyekstrahowany z powietrza otoczenia. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na jedno z kluczowych pytań w dziedzinie badań nad pyłem zawieszonym: czy ekspozycja na pył zawieszony indukuje uszkodzenia chromosomowe? Główną zaletą tej techniki jest możliwość bezpośredniej wizualizacji uszkodzeń powstałych w materiale genetycznym.Po zebraniu i przeanalizowaniu cząstek zgodnie z protokołem tekstowym, przeprowadź ekspozycję cząstek, podgrzewając kompletną pożywkę wzrostową, 0,25% trypsynę oraz PBS w kąpieli wodnej w temperaturze 37 °C przez co najmniej 30 minut przed rozpoczęciem hodowli. Po przemyciu surowych komórek 264.7, dodaj jeden mililitr ciepłego roztworu trypsyny do naczynia i odczep komórki od dna naczynia do hodowli tkankowej poprzez skrobanie. Następnie zbierz komórki i przygotuj zawiesinę pojedynczych komórek poprzez wielokrotne pipetowanie.Przy użyciu błękitu trypanu oblicz liczbę komórek, a następnie użyj uprzednio ogrzanej pożywki kompletnej, aby wysiać je w 100 milimetrowej naczyniu do hodowli tkanek z gęstością 8000 na centymetr kwadratowy. Następnie

analysis-ambient-particulate-matter-induced-chromosomal-aberrations

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Kariotypowanie jest prostą i użyteczną techniką powszechnie stosowaną do wykrywania zmian genetycznych. W niniejszym opracowaniu opisujemy szczegółowy protokół przygotowania preparatów rozprzestrzeniających chromosomy z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w celu monitorowania stanu chromosomowego tych komórek utrzymywanych w hodowli.

Przygotowanie rozprzestrzenionego preparatu chromosomów ludzkich embrionalnych komórek macierzystych do analizy kariotypu

Xenopus ekstrakt z jaj jest przydatnym systemem modelowym do badania punktu kontrolnego uszkodzeń DNA. Niniejszy protokół dotyczy przygotowania ekstraktów z jaj Xenopus oraz odczynników indukujących punkt kontrolny uszkodzeń DNA. Techniki te można zaadaptować do różnych metod wywołania uszkodzeń DNA w badaniach nad sygnałowaniem punktu kontrolnego uszkodzeń DNA.

Badanie punktu kontrolnego uszkodzeń DNA z wykorzystaniem ekstraktów z jaj Xenopus

Ten film demonstruje bardzo czuły test oparty na immunofluorescencji do wykrywania uszkodzeń oksydacyjnych wywołanych PM2.5 w sercach zarodków danio pręgowanego poprzez pomiar poziomów 8-OHdG i γH2AX, które wskazują odpowiednio na uszkodzenie DNA i pęknięcia dwuniciowego DNA.

Test immunofluorescencyjny do wykrywania uszkodzeń DNA za pośrednictwem PM2,5 w zarodkach ryb

Chromosomy mogą być izolowane z żywych komórek, takich jak limfocyty czy fibroblasty skóry, oraz z organizmów, w tym ludzi i myszy. Te preparaty chromosomowe mogą być dalej wykorzystywane do rutynowych prążków G i procedur cytogenetyki molekularnej, takich jak fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH), porównawcza hybrydyzacja genomowa (CGH) i kariotypowanie spektralne (SKY).

Przygotowanie chromosomów z hodowanych komórek

Szlaki naprawy DNA są niezbędne do utrzymania integralności genomu oraz zapobiegania mutacjom i nowotworom. Celem tego protokołu jest ilościowe określenie niestabilności genomu poprzez bezpośrednią obserwację aberracji chromosomowych w rozprzestrzenianiu się metafazy z mysich komórek B przy użyciu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) dla powtórzeń telomerowego DNA.

Szybka analiza aberracji chromosomowych w mysich limfocytach B przez PNA-FISH

Opisujemy szczegółowe etapy wysokoprzepustowego testu chemicznego u nicieni Caenorhabditis elegans używanych do oceny toksyczności linii zarodkowej. W tym teście zaburzenie funkcji linii zarodkowej po narażeniu na działanie substancji chemicznych jest monitorowane za pomocą fluorescencyjnego reportera specyficznego dla zarodków aneuploidalnych.

Kompleksowa ocena toksyczności chemicznej linii rozrodczej z wykorzystaniem nicienia Caenorhabditis elegans

Przedstawiono protokół oceny zmian w poziomach uszkodzeń DNA i zdolności do naprawy DNA, które mogą być wywołane przez przewlekłe napromienianie in vivo niskimi dawkami limfocytów śledziony myszy, poprzez pomiar fosforylowanego histonu H2AX, markera pęknięć dwuniciowych DNA, za pomocą cytometrii przepływowej.

Pomiar uszkodzeń i naprawy DNA w splenocytach myszy po przewlekłej ekspozycji in vivo na bardzo niskie dawki promieniowania beta i gamma

Niniejszy protokół opisuje przydatność wielokrotnej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (mFISH) i kariotypowania spektralnego (SKY) w identyfikacji stabilnych międzychromosomowych aberracji w komórkach szpiku kostnego myszy po ekspozycji na promieniowanie całego ciała.

Wykrywanie stabilnych aberracji międzychromosomowych za pomocą wielokrotnej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (mFISH) i kariotypowania spektralnego (SKY) u napromieniowanych myszy

Opisujemy tutaj metody czułego i dokładnego oznaczania zmian 8-okso-7,8-dihydro-2'-deoksyguanozyny (8-oxodGuo), 1,N 6-etheno-2'-deoksyadenozyny (1,N 6-dAdo) i 1,N 2-etheno-2'-deoksyguanozyny (1,N 2-dGuo) w DNA. Metody te zastosowano do oceny wpływu drobnego pyłu zawieszonego (PM2,5) w tkankach (płuca, wątroba i nerki) narażonych myszy A/J.

Kwantyfikacja trzech zmian DNA za pomocą spektrometrii mas i ocena ich poziomów w tkankach myszy narażonych na działanie drobnego pyłu zawieszonego w otoczeniu

Ta procedura została ustanowiona do wykorzystania do rozwoju zaawansowanych hodowli wątroby 3D in vitro, które mogą dostarczyć bardziej fizjologicznie istotną ocenę zagrożeń genotoksycznych związanych z ekspozycją na nanomateriały zarówno w ostrym, jak i długotrwałym, powtarzanym dawce.

Zaawansowane modele 3D wątroby do badań genotoksyczności in vitro po długotrwałym narażeniu na nanomateriały

Opracowaliśmy zmodyfikowaną metodę QuEChERS-HPLC do oceny wewnętrznych poziomów 16 WWA w zarodkach danio pręgowanego.

Zmodyfikowana metoda QuEChERS-HPLC do wykrywania wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych w zarodkach danio pręgowanego narażonych na działanie drobnych cząstek stałych

Poznaj metodę analizy aberracji chromosomowych wywołanych przez pył zawieszony w otoczeniu przy użyciu makrofagów RAW264.7. Technika umożliwia bezpośrednią wizualizację uszkodzeń materiału genetycznego in vitro.

Analiza aberracji chromosomowych wywołanych przez pył zawieszony w otoczeniu przy użyciu systemu in vitro

Przeglądaj więcej filmów