Peptydowa metoda transportu genów i białek przez bariery komórkowe i organellarne w roślinach

Ogólnym celem tej metody opartej na peptydach jest transport genów i białek przez bariery komórkowe i organellowe w roślinach. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania badawcze poprzez modyfikację roślin za pomocą racjonalnie zaprojektowanych koniugatów peptydowych, które dostarczają różne geny i białka w celu pośredniczenia w ekspresji specyficznych genów. Bezpośrednią zaletą tej techniki jest zastosowanie prostej procedury transfekcji liści roślin przy użyciu strzykawki, opartej na peptydach zdolnych do przekraczania granic komórkowych i organellowych.

Opracowaliśmy tę prostą, skuteczną i nowatorską metodę transformacji roślin, ponieważ konwencjonalne metody są kosztowne, nieprzydatne dla niektórych typów roślin i niepozwalają na celowanie w organelle wewnątrzkomórkowe. Jo-Ann Church zaprezentuje procedurę wraz z Yoko Horii, technikiem z mojego laboratorium. Przygotuj formulację plazmidowego DNA z peptydami zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Po dodaniu peptydu do plazmowego DNA utworzy się mętny roztwór. Mieszanina staje się klarowna po rozcieńczeniu wodą ultrapure do objętości końcowej określonej w protokole tekstowym. Przenieś 800 µL rozcieńczonego roztworu do kuwety do analizy dynamicznego rozpraszania światła.

Wyznaczyć średnicę hydrodynamiczną oraz indeks polidyspersyjności utworzonych kompleksów za pomocą analizatora zetanano. Pomiarów należy dokonać przy użyciu lasera helowo-neonowego o długości fali 633 nm w temperaturze 25 °C, przy kącie detekcji rozproszonego światła wstecznego wynoszącym 173 stopnie. Po dokonaniu pomiarów wielkości, przenieść roztwór do składanej kuwety kapilarnej w celu pomiaru potencjału zeta, stosując domyślne parametry stałej dielektrycznej, współczynnika załamania światła oraz lepkości wody w temperaturze 25 °C.

Aby zaobserwować roztwór kompleksów za pomocą mikroskopii sił atomowych, nanieś 10 µL na świeżo odsłoniętą, rozłupaną powierzchnię płytki mikowej i pozostaw mikę do wyschnięcia na powietrzu przez noc w przykrytej plastikowej szalce Petriego. Uzyskaj obraz kompleksów w powietrzu w temperaturze 25 °C, wykorzystując krzemową dźwignię o stałej sprężystości 1,3 N/m w trybie stukowym. Wykorzystaj trzytygodniowe rośliny Arabidopsis thaliana hodowane w cyklu 16 godzin światła i 8 godzin ciemności w temperaturze 22 °C.

Wybierz co najmniej trzy liście do transfekcji, aby umożliwić wykonanie pomiarów w trzech powtórzeniach dla kwantyfikacji ekspresji genów. Napełnij jednofilarową plastikową strzykawkę bez igły 100 µL roztworu kompleksu do transfekcji jednego liścia. Następnie ustaw końcówkę strzykawki na powierzchni abaksjalnej liścia.

Lekko dociśnij końcówkę strzykawki do liścia, a następnie powoli wciśnij tłok strzykawki, wywierając jednocześnie przeciwciśnienie palcem wskazującym ręki w lateksowej rękawiczce z przeciwnej strony. Prawidłową infiltrację można rozpoznać po rozprzestrzenianiu się obszaru nasiąkniętego wodą w liściu. Oznakuj infiltrowane liście w celu łatwej identyfikacji.

Inkubować roślinę z transfekcją DNA plazmidowego z peptydem przez 12 godzin w komorze wzrostowej. Aby ocenić wydajność transfekcji, najpierw wyciąć cały transfekowany liść. W przypadku eksperymentów z transfekcją z wykorzystaniem wektora reporterowego Renilla Luciferase, określić ilościowo wydajność transfekcji, korzystając z zestawu do analizy Renilla Luciferase.

Najpierw umieść każdy wycięty liść w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1.5 millileter. Do każdej probówki dodaj 100 microliters buforu do lizy 1X. W ten sam sposób przygotuj lizaty liści kontrolnych, nietransfekowanych, w trzech powtórzeniach.

Rozetrzeć liść za pomocą tłuczka do homogenizacji i inkubować otrzymany lizat w temperaturze 25 °C przez od 6 do 10 godzin. Po inkubacji odwirować lizat w mikrocentryfużce z prędkością 12 470 ×g przez jedną minutę. Przenieść 20 µL klarownego lizatu do dołka w mikropłytce 96-dołkowej.

Pozostałą objętość wykorzystać do oznaczania całkowitego stężenia białka za pomocą zestawu do analizy białek BCA zgodnie z protokołem producenta. Następnie do dołka dodać 100 µL jednego stężenia substratu do analizy Renilla Luciferase i wymieszać poprzez powolne pipetowanie. Umieścić mikropłytkę w wielofunkcyjnym czytniku mikropłytek i rozpocząć pomiar.

W przypadku eksperymentów z transfekcją z użyciem wektora reporterowego z zielonym białkiem fluorescencyjnym, należy obserwować fluorescencję przy użyciu konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego. Najpierw należy przyciąć brzegi całego liścia, aby ułatwić usunięcie pęcherzyków powietrza. Następnie należy wyjąć tłok z strzykawki o pojemności 10 milileter i umieścić każdy wycięty liść lub fragment liścia w strzykawce.

Włóż tłok i delikatnie dociśnij go do dna strzykawki, uważając, aby nie zmiażdżyć liścia. Nabierz do strzykawki wodę, aż będzie wypełniona mniej więcej do połowy. Skieruj strzykawkę pionowo w górę i naciśnij tłok, aby usunąć powietrze ze strzykawki przez jej końcówkę.

Następnie zakryj końcówkę strzykawki i powoli pociągnij tłok w dół, aby usunąć powietrze z liścia. Powtórz ten proces kilka razy, aż liść stanie się półprzezroczysty. Następnie pokryj powierzchnię szkiełka przedmiotowego taśmą klejącą.

Za pomocą ostrza wytnij w taśmie kwadratowy obszar wystarczająco duży, aby pomieścić próbkę liścia, a następnie pęsetą odklej kwadratowy fragment taśmy, tworząc komorę na preparat. Taśma będzie pełnić funkcję dystansera między szkiełkiem podstawowym a nakryweksem. Umieść liść w komorze stroną abaksjalną skierowaną do góry i wypełnij pozostałą przestrzeń komory wodą.

Uszczelnij liść w komorze za pomocą szkiełka nakrywki i zabezpiecz krawędzie szkiełka taśmą klejącą. Przebadaj próbkę liścia przy użyciu konfokalnego mikroskopu skaningowego z wykorzystaniem obiektywu 40x lub obiektywu imersyjnego wodnego 63x. Fluorescencję GFP można wizualizować przy długości fali wzbudzenia 488 nanometrów.

Optymalne przygotowanie formulacji peptydowo-plazmowego DNA przy stosunku peptyd do DNA wynoszącym 0,5 powinno mieć średnicę średnią około 290 nanometrów oraz niski indeks polidyspersyjności wynoszący około 0,3, co wskazuje na jednorodny rozkład wielkości. Ponadto kompleksy powinny wykazywać potencjał zeta na poziomie około 30 miliwoltów. Tutaj przedstawiono reprezentatywny obraz kompleksów peptydowo-plazmowego DNA uzyskany za pomocą mikroskopu sił atomowych.

Zaobserwowano jednorodne kompleksy globularne. Wykorzystując formulację peptydowo-plazmidową, w Arabidopsis thaliana można osiągnąć dostarczanie i ekspresję plazmidowego DNA skierowane do jądra komórkowego, przy szacowanej wartości Renilla Luciferase na miligram wynoszącej około 100 000. Obserwacje mikroskopowe przeprowadzono na liściach traktowanych kompleksami przygotowanymi z plazmidowego DNA kodującego reporter GFP w celu oceny ekspresji genu.

Obrazy ujawniły, że w komórkach transfekowanych kompleksami plazmidowego DNA z nieukierunkowanym peptydem wyraźnie obserwowano rozproszoną zieloną fluorescencję odpowiadającą ekspresji GFP, która lokalizowała się w cytosolu. Po opracowaniu technika ta otworzyła badaczom z dziedziny biotechnologii roślin drogę do dostarczania różnych ładunków opartych na białkach i kwasach nukleinowych do żywych roślin. Po obejrzeniu tego filmu i przeczytaniu protokołu tekstowego powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak przygotowywać, charakteryzować i stosować różne zoptymalizowane formulacje dla każdego rodzaju ładunku, do których należą plazmidowe DNA, dwuniciowe DNA lub RNA oraz białka.