Peptydowa metoda transportu genów i białek przez bariery komórkowe i organellarne w roślinach
16 grudnia 2016
Istniejące metody modyfikacji roślin mają ograniczone zastosowanie. Zaproponowana tu nowatorska technologia oparta na peptydach obiecuje zarówno prostotę, jak i skuteczność we wprowadzaniu egzogennych białek lub genów do pożądanych przedziałów wewnątrzkomórkowych nienaruszonych roślin.
Ogólnym celem tej metody opartej na peptydach jest transport genów i białek przez bariery komórkowe i organellowe w roślinach. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania badawcze poprzez modyfikację roślin za pomocą racjonalnie zaprojektowanych koniugatów peptydowych, które dostarczają różne geny i białka w celu pośredniczenia w ekspresji specyficznych genów. Bezpośrednią zaletą tej techniki jest zastosowanie prostej procedury transfekcji liści roślin przy użyciu strzykawki, opartej na peptydach zdolnych do przekraczania granic komórkowych i organellowych.
Opracowaliśmy tę prostą, skuteczną i nowatorską metodę transformacji roślin, ponieważ konwencjonalne metody są kosztowne, nieprzydatne dla niektórych typów roślin i niepozwalają na celowanie w organelle wewnątrzkomórkowe. Jo-Ann Church zaprezentuje procedurę wraz z Yoko Horii, technikiem z mojego laboratorium. Przygotuj formulację plazmidowego DNA z peptydami zgodnie z opisem w protokole tekstowym.
Po dodaniu peptydu do plazmowego DNA utworzy się mętny roztwór. Mieszanina staje się klarowna po rozcieńczeniu wodą ultrapure do objętości końcowej określonej w protokole tekstowym. Przenieś 800 µL rozcieńczonego roztworu do kuwety do analizy dynamicznego rozpraszania światła.
Wyznaczyć średnicę hydrodynamiczną oraz indeks polidyspersyjności utworzonych kompleksów za pomocą analizatora zetanano. Pomiarów należy dokonać przy użyciu lasera helowo-neonowego o długości fali 633 nm w temperaturze 25 °C, przy kącie detekcji rozproszonego światła wstecznego wynoszącym 173 stopnie. Po dokonaniu pomiarów wielkości, przenieść roztwór do składanej kuwety kapilarnej w celu pomiaru potencjału zeta, stosując domyślne parametry stałej dielektrycznej, współczynnika załamania światła oraz lepkości wody w temperaturze 25 °C.
Aby zaobserwować roztwór kompleksów za pomocą mikroskopii sił atomowych, nanieś 10 µL na świeżo odsłoniętą, rozłupaną powierzchnię płytki mikowej i pozostaw mikę do wyschnięcia na powietrzu przez noc w przykrytej plastikowej szalce Petriego. Uzyskaj obraz kompleksów w powietrzu w temperaturze 25 °C, wykorzystując krzemową dźwignię o stałej sprężystości 1,3 N/m w trybie stukowym. Wykorzystaj trzytygodniowe rośliny Arabidopsis thaliana hodowane w cyklu 16 godzin światła i 8 godzin ciemności w temperaturze 22 °C.
Wybierz co najmniej trzy liście do transfekcji, aby umożliwić wykonanie pomiarów w trzech powtórzeniach dla kwantyfikacji ekspresji genów. Napełnij jednofilarową plastikową strzykawkę bez igły 100 µL roztworu kompleksu do transfekcji jednego liścia. Następnie ustaw końcówkę strzykawki na powierzchni abaksjalnej liścia.
Lekko dociśnij końcówkę strzykawki do liścia, a następnie powoli wciśnij tłok strzykawki, wywierając jednocześnie przeciwciśnienie palcem wskazującym ręki w lateksowej rękawiczce z przeciwnej strony. Prawidłową infiltrację można rozpoznać po rozprzestrzenianiu się obszaru nasiąkniętego wodą w liściu. Oznakuj infiltrowane liście w celu łatwej identyfikacji.
Inkubować roślinę z transfekcją DNA plazmidowego z peptydem przez 12 godzin w komorze wzrostowej. Aby ocenić wydajność transfekcji, najpierw wyciąć cały transfekowany liść. W przypadku eksperymentów z transfekcją z wykorzystaniem wektora reporterowego Renilla Luciferase, określić ilościowo wydajność transfekcji, korzystając z zestawu do analizy Renilla Luciferase.
Najpierw umieść każdy wycięty liść w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1.5 millileter. Do każdej probówki dodaj 100 microliters buforu do lizy 1X. W ten sam sposób przygotuj lizaty liści kontrolnych, nietransfekowanych, w trzech powtórzeniach.
Rozetrzeć liść za pomocą tłuczka do homogenizacji i inkubować otrzymany lizat w temperaturze 25 °C przez od 6 do 10 godzin. Po inkubacji odwirować lizat w mikrocentryfużce z prędkością 12 470 ×g przez jedną minutę. Przenieść 20 µL klarownego lizatu do dołka w mikropłytce 96-dołkowej.
Pozostałą objętość wykorzystać do oznaczania całkowitego stężenia białka za pomocą zestawu do analizy białek BCA zgodnie z protokołem producenta. Następnie do dołka dodać 100 µL jednego stężenia substratu do analizy Renilla Luciferase i wymieszać poprzez powolne pipetowanie. Umieścić mikropłytkę w wielofunkcyjnym czytniku mikropłytek i rozpocząć pomiar.
W przypadku eksperymentów z transfekcją z użyciem wektora reporterowego z zielonym białkiem fluorescencyjnym, należy obserwować fluorescencję przy użyciu konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego. Najpierw należy przyciąć brzegi całego liścia, aby ułatwić usunięcie pęcherzyków powietrza. Następnie należy wyjąć tłok z strzykawki o pojemności 10 milileter i umieścić każdy wycięty liść lub fragment liścia w strzykawce.
Włóż tłok i delikatnie dociśnij go do dna strzykawki, uważając, aby nie zmiażdżyć liścia. Nabierz do strzykawki wodę, aż będzie wypełniona mniej więcej do połowy. Skieruj strzykawkę pionowo w górę i naciśnij tłok, aby usunąć powietrze ze strzykawki przez jej końcówkę.
Następnie zakryj końcówkę strzykawki i powoli pociągnij tłok w dół, aby usunąć powietrze z liścia. Powtórz ten proces kilka razy, aż liść stanie się półprzezroczysty. Następnie pokryj powierzchnię szkiełka przedmiotowego taśmą klejącą.
Za pomocą ostrza wytnij w taśmie kwadratowy obszar wystarczająco duży, aby pomieścić próbkę liścia, a następnie pęsetą odklej kwadratowy fragment taśmy, tworząc komorę na preparat. Taśma będzie pełnić funkcję dystansera między szkiełkiem podstawowym a nakryweksem. Umieść liść w komorze stroną abaksjalną skierowaną do góry i wypełnij pozostałą przestrzeń komory wodą.
Uszczelnij liść w komorze za pomocą szkiełka nakrywki i zabezpiecz krawędzie szkiełka taśmą klejącą. Przebadaj próbkę liścia przy użyciu konfokalnego mikroskopu skaningowego z wykorzystaniem obiektywu 40x lub obiektywu imersyjnego wodnego 63x. Fluorescencję GFP można wizualizować przy długości fali wzbudzenia 488 nanometrów.
Optymalne przygotowanie formulacji peptydowo-plazmowego DNA przy stosunku peptyd do DNA wynoszącym 0,5 powinno mieć średnicę średnią około 290 nanometrów oraz niski indeks polidyspersyjności wynoszący około 0,3, co wskazuje na jednorodny rozkład wielkości. Ponadto kompleksy powinny wykazywać potencjał zeta na poziomie około 30 miliwoltów. Tutaj przedstawiono reprezentatywny obraz kompleksów peptydowo-plazmowego DNA uzyskany za pomocą mikroskopu sił atomowych.
Zaobserwowano jednorodne kompleksy globularne. Wykorzystując formulację peptydowo-plazmidową, w Arabidopsis thaliana można osiągnąć dostarczanie i ekspresję plazmidowego DNA skierowane do jądra komórkowego, przy szacowanej wartości Renilla Luciferase na miligram wynoszącej około 100 000. Obserwacje mikroskopowe przeprowadzono na liściach traktowanych kompleksami przygotowanymi z plazmidowego DNA kodującego reporter GFP w celu oceny ekspresji genu.
Obrazy ujawniły, że w komórkach transfekowanych kompleksami plazmidowego DNA z nieukierunkowanym peptydem wyraźnie obserwowano rozproszoną zieloną fluorescencję odpowiadającą ekspresji GFP, która lokalizowała się w cytosolu. Po opracowaniu technika ta otworzyła badaczom z dziedziny biotechnologii roślin drogę do dostarczania różnych ładunków opartych na białkach i kwasach nukleinowych do żywych roślin. Po obejrzeniu tego filmu i przeczytaniu protokołu tekstowego powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak przygotowywać, charakteryzować i stosować różne zoptymalizowane formulacje dla każdego rodzaju ładunku, do których należą plazmidowe DNA, dwuniciowe DNA lub RNA oraz białka.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia nowatorską metodę opartą na peptydach, służącą do transportu genów i białek przez bariery komórkowe roślin. Technika ta oferuje prosty i wydajny sposób modyfikacji roślin, rozwiązując ograniczenia istniejących metod.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biotechnologia roślin
- Inżynieria genetyczna
- Biologia komórki
Wstęp
- Konwencjonalne metody modyfikacji roślin są często kosztowne i mają ograniczone zastosowanie.
- Istniejące techniki mają trudności z celowaniem w konkretne organelle wewnątrzkomórkowe.
- Koniugaty peptydowe mogą ułatwić dostarczanie genów i białek do komórek roślinnych.
- Niniejsze badanie ma na celu zwiększenie wydajności procesów transformacji roślin.
Cel badania
- Opracowanie prostej metody wprowadzania egzogennych białek lub genów do komórek roślinnych.
- Wykazanie skuteczności technologii opartej na peptydach w transformacji roślin.
- Ocena wydajności transfekcji proponowanej metody.
Zastosowane metody
- Przygotowanie formulacji peptydowo-plazmidowego DNA do transfekcji.
- Transfekcja liści roślin przy użyciu strzykawki.
- Pomiary dynamicznego rozpraszania światła i potencjału zeta kompleksów.
- Ocena wydajności transfekcji z wykorzystaniem wektorów reporterowych lucyferazy Renilla oraz GFP.
Główne wyniki
- Sformułowanie peptydowo-plazmowe z DNA wykazywało średnicę średnią wynoszącą około 290 nanometrów.
- Kompleksy charakteryzowały się niskim indeksem polidyspersyjności, co wskazuje na jednorodny rozkład wielkości.
- Pomiary potencjału zeta wykazały ładunek sprzyjający pobraniu komórkowemu.
- Skuteczną transfekcję wykazano u Arabidopsis thaliana, uzyskując mierzalne wyniki.
Wnioski
- Nowatorska metoda oparta na peptydach stanowi obiecującą alternatywę dla modyfikacji genetycznych roślin.
- Technika ta upraszcza proces i zwiększa możliwości precyzyjnego celowania.
- Przyszłe zastosowania mogą rozszerzyć zakres gatunków roślin, które można modyfikować w sposób efektywny.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ta metoda dostarczania oparta na peptydach rozwiązuje kluczowy problem w biotechnologii roślin: potrzebę stworzenia prostego, kosztowo efektywnego i szeroko stosowalnego systemu transportu genów i białek przez bariery komórkowe i organellowe. Dzięki umożliwieniu ukierunkowanego dostarczania w systemach modelowych, takich jak Arabidopsis thaliana, podejście to wspiera wczesną walidację celów oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego w roślinnych biofabrykach i procesach opracowywania cech. Konstrukcja oparta na peptydach oferuje zalety w zakresie biodegradowalności, możliwości dostrojenia oraz skalowalności, co jest zgodne z priorytetami przemysłowymi dotyczącymi powtarzalnych i przekładalnych narzędzi w procesach badawczych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie funkcji genów poprzez wydajne dostarczanie ładunków kwasów nukleinowych w celu modulacji ekspresji in planta.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje procedurę infiltracji za pomocą strzykawki, która wymaga minimalnego wyposażenia i pozwala na szybkie prototypowanie konstruktów genetycznych.
- Pewność prognostyczna: Ułatwia analizę ekspresji zależnej od dawki za pomocą mierzalnych reporterów, takich jak lucyferaza Renilla, co wspiera priorytetyzację celów.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Pozwala na wytwarzanie jednorodnych kompleksów kwasów nukleinowych z peptydami o określonej wielkości (~290 nm) i ładunku powierzchniowym (~30 mV potencjału zeta), co umożliwia powtarzalne warunki transfekcji.
- Wartość operacyjna: Charakteryzowane za pomocą dynamicznego rozpraszania światła oraz pomiarów potencjału zeta, co zapewnia wyniki zgodne z kontrolą jakości (QC) w zakresie spójności formulacji.
- Gotowość do analizy: Kompatybilne z późniejszymi odczytami opartymi na fluorescencji i luminescencji, co wspiera wysokoprzepustowe badania (high-content screening) wyników ekspresji genów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Wykazano dostarczanie zarówno plazmidowego DNA, jak i białek, co umożliwia wielomodalne testy ładunków w systemach roślinnych.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Umożliwia prowadzenie badań nad lokalizacją subkomórkową (np. celowanie cytozolowe w porównaniu z jądrowym) w celu wyjaśnienia mechanizmu działania dostarczonych transgenów.
- Adaptacyjność gatunkowa: Chociaż metoda została zademonstrowana na Arabidopsis, zasady projektowania peptydów sugerują możliwość rozszerzenia jej na inne chassis roślinne wykorzystywane w bioprodukcji.
Integracja rurociągów i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w wczesny etap procesu odkrywania, wspierając testowanie hipotez w walidacji celów oraz umożliwiając skalowalny rozwój testów do badań funkcji genów i białek w systemach roślinnych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera wyjaśnianie szlaków sygnałowych i potwierdzanie celów poprzez kontrolowane dostarczanie siRNA, mRNA lub komponentów CRISPR.
- Przesiewanie: Umożliwia standaryzowane przygotowanie kompleksów transfekcyjnych o mierzalnych właściwościach biofizycznych w celu spójnej oceny związków lub konstruktów.
- Analityka: Zapewnia wyniki ilościowe za pomocą testów lucyferazowych i fluorescencyjnych, co pozwala na porównanie wydajności transfekcji w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Wspiera dopasowanie biomarkerów poprzez umożliwienie ekspresji białek z etykietą do badań lokalizacji i analiz funkcjonalnych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Nośniki peptydowe mogą być modyfikowane dla różnych ładunków, co pozycjonuje platformę jako zasób wielokrotnego użytku w wielu projektach.
Wpływ operacyjny i korporacyjny
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad funkcją genów poprzez umożliwienie precyzyjnej dostawy i kontroli ekspresji.
- Wartość operacyjna: Eliminuje potrzebę stosowania specjalistycznego sprzętu, takiego jak armatki genowe lub szczepy Agrobacterium, obniżając bariery techniczne.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu prac (go/no-go) w walidacji celów poprzez dostarczenie wiarygodnych, ilościowych danych o transfekcji.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o wyniki funkcjonalne w żywym systemie roślinnym.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie formułowania i charakterystyki kompleksów kwasów nukleinowych z peptydami.
- Metoda zależy od dostępu do systemów dynamicznego rozpraszania światła, pomiaru potencjału zeta oraz detekcji fluorescencyjnej/luminescencyjnej.
- W celu uzyskania powtarzalnych wyników konieczna jest standaryzacja ciśnienia infiltracji oraz przygotowania liści.
- Adaptacja do różnych gatunków roślin może wymagać optymalizacji sekwencji peptydowej oraz stosunku ładunku.
- Metoda jest ograniczona koniecznością stosowania świeżej tkanki roślinnej i kontrolowanych warunków wzrostu, co może wpływać na wydajność procesu.
