Name: Wgląd w interakcje aminokwasów i peptydów z materiałami nieorganicznymi za pomocą spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 44 s
Description: Poznaj spektroskopię sił pojedynczych cząsteczek do badania oddziaływań aminokwasów i peptydów z powierzchniami nieorganicznymi przy użyciu mikroskopii sił atomowych. Ta metoda umożliwia precyzyjne pomiary sił adhezji na poziomie molekularnym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Międzynarodowy Grant Reintegracyjny Marie Curie (EP7). P. D. dziękuje za wsparcie Izraelskiej Rady ds. Szkolnictwa Wyższego.

1. Modyfikacja końcówki
<ol>
	<li>Zakup wsporników AFM z azotku krzemu (Si3N4) z silikonowymi końcówkami (nominalny promień wspornika ~2 nm).</li>
	<li>Wyczyść każdy wspornik AFM, zanurzając go w bezwodnym etanolu na 20 minut. Wysuszyć w temperaturze pokojowej. Następnie potraktuj wsporniki, wystawiając je na działanie plazmyO2 przez 5 minut.</li>
	<li>Zawiesić czyste końcówki powyżej (3 cm) roztworu zawierającego metylotrietoksysilan i 3-(aminopropylo)trietoksysilan w stosunku 15:1 (v/v) w eksykatorze w atmosferze obojętnej (azot lub argon) i podłączyć eksykator do pompy próżniowej. Odkurzaj przez 2 godziny, aby utworzyć monowarstwę tych dwóch rodzajów mieszanych związków silanu.</li>
	<li>Użyj metalowego uchwytu na końcówki (wyprodukowanego do tego procesu), aby umieścić końcówki na gorącej płycie. Następnie suszyć końcówki przez 10 minut w temperaturze 70 °C w warunkach atmosferycznych. Przed użyciem wyczyść płytę grzejną, metalowy uchwyt i pęsetę za pomocą etanolu.</li>
	<li>Schłodzić końcówki w temperaturze pokojowej, a następnie zanurzyć końcówki w roztworze fluorenylometylokoksykarbonylo-PEG-N-hydroksysukcynimidu (Fmoc-PEG-NHS, MW 5 000 Da) o stężeniu 5 mM w chloroformie zawierającej 0,5% (v/v) trietyloaminy przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zanurz końcówki w chloroformie na 5 minut, a następnie zanurz je w dimetyloformamidzie (DMF) na dodatkowe 5 minut. W celu odbezpieczenia grupy Fmoc przyłączonych cząsteczek PEG, zanurz końcówki w 20% piperydynie (v/v) w DMF na 30 min. Zanurz końcówki w DMF na 4 minuty, a następnie w N-metylo-2-pirolidonie (NMP) na dodatkowe 4 minuty. Powtórz sekwencyjne zanurzanie trzy razy.</li>
	<li>W celu sprzężenia aminokwasów zanurzyć końcówki w roztworze zawierającym N-terminal chroniony aminokwas (AA) / diizopropyloetyloaminę (DIPEA) / 2-(1H-benzotriazol-1-ylo)-1,1,3,3-tetrametylofluofosforan (HBTU), w stosunku molowym 1:1:1 przy całkowitym stężeniu 30 mM w 5 ml NMP przez 1,5 godziny.</li>
	<li>W celu sprzężenia peptydów zanurz końcówki w 5 ml roztworu zawierającego 40 mg chronionego peptydu (N-końcowe i boczne łańcuchy, na przykład Fmoc-Gln(Trt)-Pro-Ala-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Arg(pbf)-Tyr(tBu)-COOH.), 15 mg heksafluorofosforanu 2-(1H-benzotriazol-1-ylo)-1,1,3,3-tetrametylofluorofosforanu (HBTU) i 5 ml DIPEA w NMP przez 2 godziny.</li>
	<li>Zanurz końcówki w NMP na 4 minuty. Następnie, w celu ochrony rozwiercanego/nieprzereagowanego NH2 przez grupę acetylową, zanurz końcówki na 30 minut w mieszaninie bezwodnika octowego/DIPEA w stosunku molowym 4:1 i całkowitym stężeniu 0,65 M w NMP.</li>
	<li>W przypadku sprzężenia peptydów wykonaj dwa dodatkowe kroki.
	<ol>
		<li>W celu odochrony łańcuchów bocznych peptydu należy zanurzyć końcówki w roztworze zawierającym 95% TFA, 2,5% triizopropylosilianu i 2,5% wody na 1 godzinę, a następnie przemyć chloroformem i DMF.</li>
		<li>W celu usunięcia grupy Fmoc peptydu należy zanurzyć końcówki w 20% piperydynie (v/v) w DMF na 30 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kolejno zanurzaj końcówki funkcjonalizowane peptydami/aminokwasami na cztery minuty każda w DMF (dla peptydów) lub NMP (dla aminokwasów), chloroformie, 50% etanolu i wodzie. Na koniec wysusz końcówkę na powietrzu.</li>
</ol>
2. Przygotowanie powierzchni
<ol>
	<li>Przygotuj mikę. Rozłup podłoża (o średnicy 9,9 mm) przed każdym użyciem za pomocą taśmy klejącej. Następnie umyj powierzchnie wodą potrójnie destylowaną (TDW).</li>
	<li>Przygotuj silikon pokryty TiO2.
	<ol>
		<li>Pokrój wafel silikonowy (100) na kwadraty o średnicy 2 cm za pomocą pisaka diamentowego.</li>
		<li>Umieść substrat w probówce o pojemności 15 ml wypełnionej acetonem i poddaj go sonikacji przez pięć minut w łaźni ultradźwiękowej. Następnie umieść tę powierzchnię w 15 ml probówce wypełnionej izopropanolem i poddaj ją sonikacji przez 5 minut. Wysuszyć podłoże za pomocą azotu.</li>
		<li>Rozpuść środek powierzchniowo czynny (np. Byk-348) w etanolu, aby przygotować 5% (wagowo-objętościowo) roztwór. Następnie dodaj 0,02 ml roztworu środka powierzchniowo czynnego do 2 ml 30% dyspersji TiO2.</li>
		<li>Z otrzymanego roztworu odlewać kroplowo 0,2 ml na czystym podłożu Si.</li>
		<li>Wyżarzać te powierzchnie odlewane kroplowo w temperaturze 250 °C przez 2 godziny w powietrzu. 41</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Pomiary spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek
<ol>
	<li>Przymocuj żądaną powierzchnię do metalowego uchwytu AFM za pomocą dostępnego w handlu kleju dwuskładnikowego. Umieść metalowy uchwyt w szklanym uchwycie AFM, który ma kształt małej szalki Petriego. Napełnij ten uchwyt buforem Tris (50 mM pH = 7,4) lub dowolnym żądanym podłożem. Następnie umieść uchwyt na stoliku AFM poniżej uchwytu końcówki.</li>
	<li>Skalibruj wsporniki AFM ze stałymi sprężystości w zakresie od 10 do 30 pN/nm przy użyciu metody fluktuacji termicznej26 (zawartej w oprogramowaniu AFM) z bezwzględną niepewnością około 10%.</li>
	<li>Zmierz siłę oddziaływania, zbliżając końcówkę funkcjonalizowaną aminokwasem lub peptydem do podłoża, aż zetknie się z substratem z siłą ściskającą ~200 pN, a następnie natychmiast wycofaj końcówkę z różnymi prędkościami, od 0,1 do 0,8 μm/s, na odległość ~200 nm.</li>
</ol>
4. Analiza danych
<ol>
	<li>Przelicz wartości ugięcia (V) na siłę, mnożąc czułość fotodiody (V/m) i używając eksperymentalnie wyznaczonej stałej sprężystości. 42 Odbywa się to automatycznie przez oprogramowanie AFM.
	<ol>
		<li>Aby uzyskać krzywe F-D z pojedynczymi zdarzeniami cząsteczkowymi, zapisz kilkaset krzywych (800-1,500). Uzyskaj dwa piki na krzywej pojedynczej cząsteczki: pierwszy pik wskazuje na niespecyficzne oddziaływania między końcówką a powierzchnią, a drugi pik odpowiada specyficznemu oddziaływaniu cząsteczki z powierzchnią. Gdy krzywa F-D zawiera więcej niż te dwa szczyty, odrzuć je z obliczeń najbardziej prawdopodobnej siły. 
		UWAGA: Pod uwagę brane są tylko pojedyncze zdarzenia przyczepności (od 10 do 30% krzywych). 43</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby obliczyć pozorną szybkość obciążenia, dopasuj co najmniej 50 krzywych siły do odległości za pomocą modelu łańcucha ślimakowego (WLC) 44 tuż przed zerwaniem, aby uzyskać zestaw współczynników obciążenia, które są następnie wykorzystywane do przygotowania histogramów pozornych szybkości obciążenia. Wyprowadź siły rozwiązywania między peptydami/aminokwasami a powierzchnią ze skoku siły po oddzieleniu wspornika od podłoża.</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Kroki 1.3, 1.4 i 1.7 w protokole powinny być wykonywane z dużą ostrożnością i w bardzo delikatny sposób. W kroku 1.3 końcówka nie powinna stykać się z mieszaniną silanów, a proces silanizacji powinien odbywać się w atmosferze obojętnej (bez wilgoci). 45 Ma to na celu zapobieżenie tworzeniu się wielu warstw oraz dlatego, że cząsteczki silanu łatwo ulegają hydrolizie w obecności wilgoci. Rozdział 45
W kroku 1.4 temperatura i czas powinny być odpowi...

Interakcja między białkami a minerałami nieorganicznymi prowadzi do budowy materiałów kompozytowych o charakterystycznych właściwościach. Należą do nich materiały o wysokiej wytrzymałości mechanicznej lub unikalnych właściwościach optycznych. 1,2 Na przykład, połączenie kolagenu białkowego z minerałem hydroksyapatytem tworzy miękkie lub twarde kości o różnych funkcjach. 3 Krótkie peptydy mogą również wiązać materiały nieorganiczne o wysokiej specyficzności. 4,5,6 Specyfika tych peptydów została wykorzystana do projektowania nowych materiałów magnetycznych i elektronicznych,7,8,9 wytwarzanie materiałów nanostrukturalnych, hodowla kryształów, 10 i synteza nanocząstek. 11Zrozumienie mechanizmu leżącego u podstaw interakcji między peptydami lub białkami a materiałami nieorganicznymi pozwoli nam zatem zaprojektować nowe materiały kompozytowe o ulepszonych właściwościach adsorpcyjnych. Ponadto, ponieważ interfaza implantów z odpowiedzią immunologiczną odbywa się za pośrednictwem białek, lepsze zrozumienie interakcji białek z materiałami nieorganicznymi poprawi naszą zdolność do projektowania implantów. Innym ważnym obszarem, w którym białka wchodzą w interakcje z powierzchniami nieorganicznymi, jest wytwarzanie materiałów przeciwporostowych. 12,13,14,15 Biofouling to niepożądany proces, w którym organizmy przyczepiają się do powierzchni. Ma to wiele szkodliwych konsekwencji dla naszego życia. Na przykład biofouling bakterii na wyrobach medycznych prowadzi do zakażeń szpitalnych. Biofouling organizmów morskich na łodziach i dużych statkach zwiększa zużycie paliwa. 12,16,17,18
Spektroskopia siły pojedynczej cząsteczki (SMFS), wykorzystująca AFM, może bezpośrednio mierzyć interakcje między aminokwasem lub peptydem a substratem. 19,20,21,22,23,24,25,26 Inne metody, takie jak wyświetlanie fagów,27,28 mikrowaga kwarcowa (QCM)29lub powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR)29,30,31,32,33 mierzą interakcje peptydów i białek z powierzchniami nieorganicznymi luzem. 34,35,36 Oznacza to, że wyniki uzyskane tymi metodami odnoszą się do zespołów cząsteczek lub agregatów. W SMFS jedna lub bardzo niewiele cząsteczek jest mocowanych do końcówki AFM i mierzone są ich interakcje z pożądanym substratem. Podejście to można rozszerzyć o badanie fałdowania białek poprzez wyciąganie białka z powierzchni. Ponadto może być stosowany do pomiaru interakcji między komórkami i białkami oraz wiązania przeciwciał z ich ligandami. 37,38,39,40 Ten artykuł opisuje szczegółowo, jak dołączyć peptydy lub aminokwasy do końcówki AFM za pomocą chemii silanolowej. Ponadto w artykule wyjaśniono, jak wykonywać pomiary siły i jak analizować wyniki.

<table><tbody><tr><td>Azotek krzemu (Si3N4) Wsporniki AFM z silikonowymi końcówkami</td><td>Bruker (Camarilo, CA, USA)</td><td></td><td>MSNL10, nominalny promień wsporników ~2 nm&nbsp;</td></tr><tr><td>Metylotrietoksysilan&nbsp;</td><td>Acros Organics (New Jersey, USA)</td><td></td><td>Do silaylacji końcówki AFM&nbsp;</td></tr><tr><td>3-(Aminopropylo)trietoksysilan</td><td>Sigma-Aldrich (Jerozolima, Izrael)</td><td></td><td>Do silaylacji końcówki AFM</td></tr><tr><td>Triizopropylosilan</td><td>Sigma-Aldrich (Jerozolima, Izrael)</td><td></td><td>Używany do deprotekcji peptydów</td></tr><tr><td>N-etylodiizopropyloamina</td><td>Alfa-Aesar (Lancashire, Wielka Brytania)</td><td></td><td>Używany do modyfikacji końcówki</td></tr><tr><td>Triethylamine</td><td>Alfa-Aesar (Lancashire, Wielka Brytania)</td><td></td><td>Używany do końcówki modyfikacja</td></tr><tr><td>Piperidine</td><td>Alfa-Aesar (Lancashire, Wielka Brytania)</td><td></td><td>Używana do deprotekcji końcówki Fmoc</td></tr><tr><td>Fluorenylmethyloxycarbonyl-PEG-N-hydroxysuccinimiide&nbsp; (Fmoc-PEG-NHS)</td><td>Iris Biotech GmbH (Deutschland, Niemcy)</td><td></td><td>Stosowany jako kowalencyjny elastyczny łącznik&nbsp; (MW = 5 000 Da)</td></tr><tr><td>2-(1H-benzotriazol-1-ylo)-1,1,3,3,-tetrametylofluorofosforan heksafluorofosforanu (HBTU)</td><td>Alfa Aser (Heysham, Anglia)</td><td></td><td>Stosowany jako odczynnik sprzęgający.&nbsp;</td></tr><tr><td>N-metylo-2-pirolidon (NMP)</td><td>Acros Organics (New Jersey, USA)</td><td></td><td>Stosowany jako rozpuszczalnik w procedurze modyfikacji końcówki</td></tr><tr><td>DMF (dimetyloformamid)</td><td>Merck (Darmstadt, Niemcy)</td><td></td><td>Stosowany jako rozpuszczalnik w procedurze modyfikacji końcówki</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Bio-Lab (Jerozolima, Izrael)</td><td></td><td>Używany jako rozpuszczalnik w procedurze modyfikacji końcówki</td></tr><tr><td>Etanol (bezwodny)</td><td>Gadot (Netanya, Izrael)</td><td></td><td>Stosowany jako rozpuszczalnik w procedurze modyfikacji końcówki</td></tr><tr><td>Kwas trifluorooctowy (TFA)</td> <td>Merck (Darmstadt, Niemcy)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Bezwodnik octowy</td><td>Merck (Darmstadt, Niemcy)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Peptydy</td><td>GL Biochem (Szanghaj, Chiny).</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fenyloalanina i tyrozyna&nbsp;</td><td>Biochem (Darmstadt, Niemcy)&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>30% dyspersji TiO2 w mieszaninie rozpuszczalnika 2-(2-metoksyetoksy)etanolu (DEGME) i 3-etoksypropionianu etylu (EEP)</td><td>Applied Vision Laboratories (Jerozolima, Izrael)</td><td></td> <td>(30%) w mieszaninie rozpuszczalnika 2-(2 Methoxyethoxy) etanolu (DEGME) i 3-etoksypropionianu etylu (EEP). Służy do przygotowania podłoża TiO2</td></tr><tr><td>Podłoża mikowe</td><td>TED PELLA, INC. (Redding, Kalifornia, USA)</td><td></td><td>Średnica 9,9 mm</td></tr></tbody></table>

wgląd w interakcje aminokwasów i peptydów z materiałami nieorganicznymi za pomocą spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

Interakcje między białkami lub peptydami a materiałami nieorganicznymi prowadzą do kilku interesujących procesów. Na przykład połączenie białek z minerałami prowadzi do powstania materiałów kompozytowych o unikalnych właściwościach. Ponadto niepożądany proces biofoulingu jest inicjowany przez adsorpcję biomolekuł, głównie białek, na powierzchniach. Ta warstwa organiczna jest warstwą adhezyjną dla bakterii i umożliwia im interakcję z powierzchnią. Zrozumienie podstawowych sił, które rządzą interakcjami na granicy faz organiczno-nieorganicznych, jest zatem ważne dla wielu dziedzin badań i może doprowadzić do zaprojektowania nowych materiałów do zastosowań optycznych, mechanicznych i biomedycznych. W artykule przedstawiono technikę spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek, która wykorzystuje AFM do pomiaru siły adhezji między peptydami lub aminokwasami a dobrze zdefiniowanymi powierzchniami nieorganicznymi. Technika ta obejmuje protokół dołączania biomolekuły do końcówki AFM za pomocą kowalencyjnego elastycznego łącznika i pomiary spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek za pomocą mikroskopu sił atomowych. Ponadto dołączona jest analiza tych pomiarów.

Rysunek 1 przedstawia procedurę modyfikacji końcówki. W pierwszym kroku obróbka plazmowa zmienia powierzchnię końcówki z azotku krzemu. Końcówka wykazuje obecność grup OH. Grupy te będą następnie reagować z silanami. Po zakończeniu tego etapu powierzchnia końcówki zostanie pokryta wolnymi grupami -NH2. Wolne aminy te będą następnie reagować z Fmoc-PEG-NHS, który jest łącznikiem kowalencyjnym. Grupa Fmoc łącznika PEG jest usuwana przez piperydynę, która pełni ro...

Tutaj prezentujemy protokół do pomiaru siły oddziaływań między dobrze zdefiniowaną powierzchnią nieorganiczną a peptydami lub aminokwasami za pomocą pomiarów spektroskopii sił pojedynczej cząsteczki za pomocą mikroskopu sił atomowych (AFM). Informacje uzyskane z pomiaru są ważne dla lepszego zrozumienia interakcji peptyd-materiał nieorganiczny.

Wgląd w interakcje aminokwasów i peptydów z materiałami nieorganicznymi za pomocą spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...

Ogólnym celem techniki spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek jest określenie siły adhezji i charakteru oddziaływań między aminokwasami lub peptydami o różnych powierzchniach. Zagadnienie to może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu chemii powierzchni i zostać wykorzystane do opracowania nowych kompozytów i strunowców. Główną zaletą tej techniki jest to, że dostarcza ona informacji na temat interakcji między pożądaną cząsteczką a powierzchniami na poziomie pojedynczej cząsteczki.Na początek kup wsporniki AFM z azotku krzemu wyposażone w silikonowe końcówki o nominalnym promieniu wspornika wynoszącym dwa nanometry. Zamontuj końcówkę na uchwycie. Wyczyść każdy ze wsporników AFM, zanurzając je w etanolu na 20 minut, a następnie wysusz w temperaturze pokojowej.Następnie umieść końcówki w komorze plazmowej i potraktuj wsporniki, wystawiając je na działanie plazmy tlenowej przez pięć minut. Przygotować roztwór zawierający 15 części metylotrietoksysilanu i jedną część trzy aminopropylotrietoksysilan i zawiesić kantylanse trzy centymetry nad roztworem w atmosferze obojętnej. Ważne jest, aby końcówki i uchwyt nie dotykały mieszaniny silanów.Ponadto silan jest bardzo wrażliwy na wilgoć, dlatego końcówki te muszą być wykonywane w atmosferze obojętnej. Po uszczelnieniu podłączyć eksykator do pompy próżniowej i stosować próżnię przez dwie godziny, aby utworzyć monowarstwę dwóch rodzajów mieszanych związków silanu na powierzchni wsporników. Ostrożnie zdejmij końcówki i umieść je na płycie grzejnej nagrzanej do 70 stopni Celsjusza.Pozostaw końcówki do wyschnięcia na 10 minut. Schłodzić końcówki w temperaturze pokojowej przed zanurzeniem ich w roztworze Fmoc-PEG-NHS na godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie zanurz końcówki w chloroformie na pięć minut, a następnie w DMF na dodatkowe pięć minut.Po inkubacji w DMF należy odbezpieczyć grupy Fmoc przyłączonych cząsteczek PEG, zanurzając końcówki w 20% roztworze piperydyny w DMF na 30 minut. Ponownie zanurz końcówki w DMF na cztery minuty, a następnie w N-metylo-2-pirolidonie na dodatkowe cztery minuty. Aby połączyć aminokwasy z końcówkami, zanurz je na półtorej godziny w roztworze sprzęgającym aminokwasy o łącznym stężeniu 30 milimolów i pięciu mililitrach N-metylo-2-pirolidonu.Aby chronić pozostałe wolne lub niereagujące reszty PEG przez grupę acetylową, zanurz końcówki na 30 minut w 0,65 molowej mieszaninie czterech części bezwodnika octowego i jednej części diizopropyloetyloaminy i N-metylo-2-pirolidonu. Następnie kolejno zanurz końcówki funkcjonalizowane aminokwasami peptydowymi na cztery minuty w NMP, chloroformie, 50% etanolu i wodzie, zanim ostatecznie wysuszysz końcówkę na powietrzu. Przymocuj żądaną powierzchnię testową do metalowego uchwytu AFM za pomocą dostępnej w handlu żywicy epoksydowej.Następnie umieść metalowy uchwyt w szklanym uchwycie AFM, który ma kształt małej szalki Petriego. Napełnij uchwyt szklanki buforem TRIS. A następnie umieść metalowy uchwyt na stoliku AFM poniżej uchwytu końcówki.Następnie zamontuj końcówkę AFM na szkle optycznym AFM. Umieść szklany blok optyczny w głowicy AFM. I połóż głowę AFM na scenie.Następnie skalibruj wsporniki AFM ze stałymi sprężystości w zakresie od 10 do 30 pikonewtonów na nanometr. Typowy pomiar siły daje w wyniku krzywą odległości siły, taką jak pokazana tutaj. Pierwszy rzut oka wskazuje na niespecyficzne interakcje między końcówką a powierzchnią, a drugi rzut oka odnosi się do określonego zdarzenia przyczepności.Na podstawie kilkuset krzywych odległości siły można skonstruować histogram, wykreślając liczbę zdarzeń adhezji w funkcji siły. Zastosowanie dopasowania Gaussa na tych histogramach określi najbardziej prawdopodobną siłę. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak chemicznie modyfikować końcówki AFM za pomocą aminokwasów lub peptydów oraz jak wykonywać spektroskopię sił pojedynczych cząsteczek za pomocą AFM.

insights-into-interactions-amino-acids-peptides-with-inorganic

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

W niniejszym artykule opisujemy zastosowanie pęset magnetycznych do badania wpływu siły na proteolizę enzymatyczną na poziomie pojedynczej cząsteczki w sposób wysoce równoległy.

Multipleksowe pomiary proteolizy pojedynczych cząsteczek siłowych przy użyciu pęset magnetycznych

Celulosomy to kompleksy wieloenzymatyczne przeznaczone do trawienia celulozy. SMFS oparty na AFM wykorzystano do zbadania właściwości mechanicznych i konfiguracji fałdowania zespołów białkowych związanych z celulozonami. Przedstawiamy kompletny przepływ pracy do immobilizacji białek, pozyskiwania i analizy danych w celu zbadania interakcji poszczególnych kompleksów receptor-ligand zaangażowanych w składanie celulasomów.

Badanie układów receptor-ligand celulosomu za pomocą spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek opartej na AFM

Przedstawiono protokół kowalencyjnego łączenia dużej różnorodności pojedynczych cząsteczek na końcówce AFM. Podano procedury i przykłady określające siłę adhezji i energię swobodną tych cząsteczek na stałych nośnikach i biointerfejsach.

Badanie adhezji pojedynczych cząsteczek za pomocą spektroskopii sił atomowych

Opisujemy szczegółowe procedury i strategie pomiaru właściwości mechanicznych i szlaków mechanicznego rozwijania pojedynczych cząsteczek białka za pomocą mikroskopu sił atomowych. Pokazujemy również reprezentatywne wyniki jako odniesienie do selekcji i uzasadnienia dobrych zapisów pojedynczych cząsteczek białka.

Spektroskopia sił pojedynczych cząsteczek białka przy użyciu mikroskopu sił atomowych

Ten protokół opisuje kowalencyjną immobilizację białek za pomocą heterobifunkcyjnego czynnika sprzęgającego silan z powierzchniami tlenku krzemu, przeznaczoną do spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek opartej na mikroskopii sił atomowych, której przykładem jest oddziaływanie RrgA (adhezyna końcówki pilus-1 S. pneumoniae) z fibronektyną.

Kowalencyjna immobilizacja białek do spektroskopii sił pojedynczej cząsteczki

Opisujemy zastosowanie nanospektroskopii w podczerwieni i mikroskopii sił atomowych o wysokiej rozdzielczości do wizualizacji procesu samoorganizacji białek w agregaty oligomeryczne i fibryle amyloidowe, co jest ściśle związane z powstawaniem i rozwojem szerokiego zakresu ludzkich zaburzeń neurodegeneracyjnych.

Charakterystyka poszczególnych agregatów białkowych za pomocą nanospektroskopii w podczerwieni i mikroskopii sił atomowych

Tutaj prezentujemy protokół koniugacji monomeru białkowego za pomocą enzymów tworzących polimer białkowy o kontrolowanej sekwencji i unieruchamiania go na powierzchni w celu badań spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek.

Synteza enzymatyczna i immobilizacja spolimeryzowanego białka za pośrednictwem OaAEP1 do spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek

Kowalencyjne dołączanie cząsteczek sondy do końcówek wsporników mikroskopii sił atomowych (AFM) jest niezbędną techniką do badania ich właściwości fizycznych. Dzięki temu możemy określić siłę rozciągania, siłę desorpcji i długość polimerów za pomocą spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek opartej na AFM o wysokiej odtwarzalności.

Kowalencyjne przyłączanie pojedynczych cząsteczek do spektroskopii sił opartej na AFM

Zespołowa spektroskopia sił (EFS) to solidna technika mechanicznego rozkładania i wykrywania w czasie rzeczywistym zestawu struktur biomolekularnych w polach biofizycznych i biosensorycznych.

Spektroskopia sił zespołowych za pomocą sił ścinających

Plazmoniczne pęsety wykorzystują zlokalizowany powierzchniowy rezonans plazmonów w nanostrukturach złota, aby uwięzić pojedyncze nanocząsteczki, w tym białka, w polu optycznym o skali nanometrowej. Zmiany w rozproszonym sygnale ujawniają obecność białka i dynamikę konformacyjną, umożliwiając monitorowanie bez modyfikacji fluoroforu lub wiązania powierzchni.

Monitorowanie dynamiki konformacyjnej pojedynczych niemodyfikowanych białek za pomocą plazmonicznej pęsety

Poznaj spektroskopię sił pojedynczych cząsteczek do badania oddziaływań aminokwasów i peptydów z powierzchniami nieorganicznymi przy użyciu mikroskopii sił atomowych. Ta metoda umożliwia precyzyjne pomiary sił adhezji na poziomie molekularnym.

Wgląd w interakcje aminokwasów i peptydów z materiałami nieorganicznymi za pomocą spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek

Przeglądaj więcej filmów