Fluorescencja rentgenowska (XRF)

1. Przygotowanie okien z azotku krzemu

1. Użyj odwróconej pęsety, aby podnieść okienko (okienka z azotku krzemu pękną, jeśli zostaną upuszczone).
2. Umieść okno na szklanym szkiełku, płaską stroną do góry.
3. Przyklej małe kawałki taśmy klejącej do boków okna i użyj ich do przyklejenia okien do dna naczynia hodowlanego.
4. Sterylizuj okna w naczyniach hodowlanych promieniowaniem UV. Można to osiągnąć za pomocą ustawienia automatycznego sieciowania w szafie sieciującej UV, a następnie dalszego naświetlania UV pod lampą UV w okapie z przepływem laminarnym przez około 1 godzinę.

2. Posiewanie komórek na wysterylizowanych oknach z azotku krzemu

1. Trzymaj naczynie przechylone pod kątem około 45°.
2. Dodaj pożywkę, pipetując w kierunku boku naczynia i powoli zmniejszaj kąt nachylenia, aby pokryć okienko nośnikiem.
3. Dodaj komórki do naczynia hodowlanego w ten sam sposób i inkubuj.
4. Od czasu do czasu obserwuj komórki za pomocą mikroskopu świetlnego, aby określić, kiedy są gotowe do użycia.

3. Utrwalanie i suszenie komórek

1. W okapie z przepływem laminarnym wyjmij pożywkę przez delikatne zasysanie, przechylając naczynie zgodnie z powyższym opisem.
2. Dodaj PBS, pipetując w kierunku boku naczynia, trzymając je pod kątem. Powoli zmniejsz kąt nachylenia, aby pokryć okno PBS.
3. Usunąć PBS z delikatnym zasysaniem.
4. Pipetując w kierunku boku naczynia i trzymając je pod kątem, dodaj 4% PFA/PBS, pH 7, aby pokryć komórki. Przechowywać w tym roztworze przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
5. Usuń mieszaninę PFA/PBS i zutylizuj jako materiał niebezpieczny.
6. Dodać PBS, pipetując zgodnie z powyższym opisem.
7. Powtórz kroki 3.5 i 3.6 dwukrotnie.
8. Usunąć PBS przez delikatne aspiracje.
9. Dodać 20 mM RURY, 200 mM sacharozy, pH 7.
10. Usunąć RURY/sacharozę przez delikatne zasysanie.
11. Powtórz kroki 2.8 i 2.9 dwukrotnie.
12. Szybko osusz krawędzie i tylne wgłębienie okna za pomocą Kimwipe, a następnie ustaw okno na czystej powierzchni, takiej jak gumowa mata kratkowa, do wyschnięcia.

4. Obrazowanie fluorescencyjne komórek za pomocą promieni rentgenowskich

1. Po wyschnięciu próbki sprawdź obecność komórek na oknach za pomocą mikroskopu świetlnego.
2. Użyj lakieru do paznokci, aby przymocować okna do aluminiowego uchwytu dostarczonego przez linię badawczą.
3. Włóż aluminiowy uchwyt do uchwytu kinematycznego, a następnie umieść go w miejscu ogniskowym optyki w mikroskopie rentgenowskim i pod kątem około 45° do padającej wiązki promieniowania rentgenowskiego, zamontowanej na stopniach nanopozycjonowania próbki.
4. Wyjdź z obszaru instrumentów mikroskopu rentgenowskiego (zwykle jest to klatka wykonana z ołowianych ścianek) i otwórz migawkę. Pozostałe kroki wykonaj zdalnie.
5. Używając płytki strefowej lub luster Kirkpatricka-Baeza, skoncentruj monochromatyczną wiązkę promieniowania rentgenowskiego (zwykle o energii 10 keV) do rozmiaru plamki submikronowej.
6. Korzystając ze stolików nanopozycjonowania próbki i wyświetlając położenie wiązki promieniowania rentgenowskiego na próbce za pomocą wstępnie skalibrowanej kamery scyntylacyjnej znajdującej się za próbką, określ odpowiednią szerokość i wysokość skanu rastrowego w celu przechwycenia danych próbki.
7. Za pomocą krzemowego detektora dryfu z dyspersją długości fali pod kątem 90° do wiązki padającej i w odległości około 3 mm lub mniej od próbki, zbierz widmo testowe o czasie przebywania 1-2 sek.
8. Przeglądając widmo testowe, wybierz odpowiedni czas przebywania dla skanowania, aby zapewnić wystarczającą ilość sygnału do szumu dla interesujących elementów.
9. Wybierz odpowiednią rozdzielczość skanu, taką, która nie jest znacznie mniejsza niż rozmiar plamki wiązki na próbce ani większa niż cechy będące przedmiotem zainteresowania w próbce.
10. Zaprogramuj skanowanie w oprogramowaniu do skanowania i zbierz obraz.