Name: Kolokalizacja markerów linii komórkowej i sygnału pomidora (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Poznaj technikę śledzenia linii komórkowej z immunofluorescencją u myszy Rosa26 tdtomato/Cre. Metoda pozwala badać transformację chondrocytów w komórki kostne podczas endochondrogenesis in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

To badanie było wspierane przez grant NIH DE025014 dla JQF.

Wszystkie protokoły zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) w Texas A&M University College of Dentistry.
1. Hodowla zwierząt
<ol>
	<li>W tym badaniu wykorzystano trzy modele zwierzęce. Aby zbadać los zarodkowych chondrocytów w tworzeniu kłykci, najpierw użyj myszy Col10a1-Cre15 i skrzyżuj je z Rosa26tdTomato (B6; 129S6-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze/J) myszy w celu uzyskania myszy Col10a1-Cre i Rosa26tdTomato. Następnie skrzyżuj te myszy z myszami 2.3Col1a1-GFP 16. Użyj Col10a1-Cre; Rosa26tdPomidor; 2.3Col1a1-GFP myszy do przeprowadzenia eksperymentów śledzenia linii komórkowych (Figura 1B).</li>
	<li>Aby zbadać los chondrocytów po urodzeniu, postępuj zgodnie z tą samą procedurą, co w kroku 1.1, ale użyj linii Aggrecan-creERT2 (Agg-CreERT2)17,18 i zachowaj Agg-CreERT2; Rosa26tdPomidor; 2.3Col1a1-GFP myszy do przeprowadzenia eksperymentów śledzenia linii komórkowych (Figura 1C). Wstrzyknąć tamoksyfen w 14. dniu po urodzeniu.</li>
	<li>Aby połączyć technikę śledzenia linii komórkowych z immunofluorescencją, skrzyżuj myszy Agg-CreERT2 i myszy Rosa26tdTomato. W eksperymencie należy użyć myszy, które są nosicielami obu genów i wstrzyknąć tamoksyfen w 3. dniu po urodzeniu (ryc. 1D).</li>
</ol>
2. Przygotowanie materiału
<ol>
	<li>Rozpuścić tamoksyfen w proszku w 10% etanolu i 90% oleju kukurydzianym o stężeniu 10 mg/ml. Dawka do wstrzykiwań wynosi 75 mg/kg.</li>
	<li>Rozpuścić proszek paraformaldehydu (PFA) w PBS do stężenia 4%, używając 2 M hydratu sodu, aby dostosować wartość pH do 7,4. Użyj 4% roztworu PFA, aby utrwalić tkankę (używa się tutaj kłykcia żuchwy i tylnej nogi) po uśmierceniu. Ze względu na jego toksyczność, z PFA w kapturze należy obchodzić się w rękawiczkach i masce na twarz.</li>
	<li>Rozpuścić proszek EDTA w wodzie destylowanej do stężenia 10%, używając 2 M hydratu sodu, aby dostosować wartość pH do 7,4. Użyj 10% EDTA, aby odwapnić kłykieć żuchwy i tylną nogę.</li>
	<li>Rozpuść sacharozę w proszku w PBS w stężeniach 15% i 30%. Użyj roztworu sacharozy, aby odwodnić tkankę po odwapnieniu.</li>
	<li>Rozpuścić hialuronidazę w proszku w PBS w stężeniu 2 mg/ml, pH 5,0. To rozwiązanie służy do pobierania antygenu immunofluorescencyjnego.</li>
	<li>Użyj probówki o pojemności 1,5 ml, aby przygotować roztwór blokujący, który zawiera 3% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 20% surowicy koziej w PBS do barwienia immunofluorescencyjnego Runx2 lub DMP1.</li>
	<li>Użyj probówki o pojemności 1,5 ml do przygotowania pierwszorzędowego roztworu przeciwciała, który zawiera 2% koziej surowicy w PBS do barwienia immunofluorescencyjnego Runx2 lub DMP1. Stężenie przeciwciała pierwszorzędowego wynosi 1:400 dla Runx2 i 1:100 dla DMP1.</li>
	<li>Użyj probówki o pojemności 1,5 ml do przygotowania roztworu IgG królika jako kontroli barwienia immunofluorescencyjnego, aby uniknąć wyników fałszywie dodatnich. Roztwór zawiera 2% surowicy koziej w PBS. Stężenie króliczej IgG do kontroli Runx2 wynosi 1:400; dla DMP1, 1:100. Wykonaj eksperyment i kontroluj barwienie jednocześnie.</li>
	<li>Użyj probówki o pojemności 1,5 ml do przygotowania wtórnego roztworu przeciwciała, który zawiera 2% koziej surowicy w PBS do barwienia immunofluorescencyjnego Runx2 lub DMP1. Przeciwciało drugorzędowe należy stosować w rozcieńczeniu 1:500.</li>
</ol>
3. Przygotowanie preparatu do mikroskopii konfokalnej (tylko śledzenie linii komórkowych, bez kombinacji z immunofluorescencją)
<ol>
	<li>Wstrzyknąć tamoksyfen myszom Agg-creERT2 w korzystnym punkcie czasowym.
	<ol>
		<li>Najpierw wyjmij mysz z klatki. Następnie użyj lewego kciuka i palca wskazującego, aby chwycić skórę z tyłu myszy i odwrócić ją, odsłaniając brzuch. Prawą ręką trzymać strzykawkę. Optymalnym punktem wejścia do wstrzykiwań jest lewa lub prawa strona podbrzusza, omijając wątrobę i pęcherz moczowy.</li>
		<li>Trzymać strzykawkę równolegle do tylnych nóg myszy i wstrzykiwać dootrzewnowo. Dawka do wstrzykiwań wynosi 75 mg/kg. Waga myszy w wieku 2 tygodni, 3 tygodni i 4 tygodni wynosi odpowiednio około 7 - 9 g, 11 - 13 g i 16 - 18 g.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Znieczulij myszy kombinacją ksylazyny/ketasetu.
	<ol>
		<li>Aby przygotować roztwór roboczy, należy najpierw rozcieńczyć ksylazynę i Ketaset wodą destylowaną do stężenia odpowiednio 1 mg/ml i 5 mg/ml. Następnie wymieszaj ksylazynę i Ketaset w stosunku 1:2. Dawka do wstrzykiwań wynosi 30 μl/g.</li>
		<li>Wstrzyknąć jak w kroku 3.1. Potwierdź znieczulenie, szczypiąc kostkę myszy. Mysz jest nieprzytomna, jeśli nie ma reakcji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Perfuzję myszy z 4% PFA po znieczuleniu.
	<ol>
		<li>Po tym, jak mysz straci przytomność, przymocuj cztery nogi myszy na desce, aby całkowicie odsłonić brzuch.</li>
		<li>Nasycić brzuch 70% etanolem i dokonać wycięcia od dolnej części brzucha do szyi wzdłuż środkowej linii. Ściśnij i jednocześnie pociągnij skórę na boczne strony, aby odsłonić błonę otrzewną. Użyj nożyczek do preparowania, aby wykonać podłużne wycięcie.</li>
		<li>Odetnij i usuń przednie żebra, aby odsłonić serce. Nakłuć serce z lewej komory strzykawką 22 G, przytrzymać strzykawkę i jednocześnie wyciąć szczelinę w prawej małżowinie usznej.</li>
		<li>Powoli wstrzyknij 4% PFA, który jest perfundowany wzdłuż układu sercowo-naczyniowego, podczas gdy krew wypłukuje się z nacięcia z prawej małżowiny usznej. Objętość PFA do perfuzji wynosi 1 ml/gram. Wykonaj ten krok w szafie bezpieczeństwa biologicznego klasy I, która jest przymocowana na stałe do układu wydechowego budynku. </li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oderwij skórę myszy i umieść całe ciało w 50-mililitrowej probówce wirówkowej z polipropylenu, która zawiera 40 ml 4% PFA do utrwalenia przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Użyj nożyczek preparacyjnych i kleszczy # 3 i # 5, aby ostrożnie usunąć żuchwę i tylną nogę z ciała oraz usunąć mięśnie i ścięgna na powierzchni. Wykonaj ten krok w szafie bezpieczeństwa biologicznego klasy I, która jest przymocowana na stałe do układu wydechowego budynku.</li>
	<li>Przetnij żuchwę na dwie części w dystalnej okolicy trzeciego zęba trzonowego. Podobnie przetnij kość udową i piszczelową w środkowej części trzonu, aby odsłonić jamę szpiku kostnego w celu przyspieszenia odwapnienia. Umieścić część, która obejmuje kłykieć i wyrostek kłykciowy wraz z tylną nogą, do 40 ml 10% EDTA w celu odwapnienia w temperaturze 4 °C przez 2 - 4 dni w probówce wirówkowej z polipropylenu o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Użyć 50 ml 15% sacharozy do odwodnienia kłykcia i tylnej nogi przez noc w temperaturze 4 °C w probówce wirówkowej z polipropylenu o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Użyj 30% sacharozy do odwodnienia kłykcia i tylnej nogi przez noc w temperaturze 4 °C w 50-mililitrowej probówce wirówkowej z polipropylenu.</li>
	<li>Wzdłuż płaszczyzny strzałkowej osadź próbkę z OCT na płycie tnącej w maszynie do kriosekcji.
	<ol>
		<li>Poziomo ułóż kłykieć lub tylną nogę w formie montażowej. Zanurz tkankę w OCT i pozostaw ją w maszynie do kriosekcji, aż OCT zamarznie.</li>
		<li>Zamontuj blok OCT na płycie tnącej. Odczekaj około 15 minut przed cięciem, aby upewnić się, że OCT jest całkowicie zamrożony.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pokrój kłykieć i tylną nogę na odcinki 10 μm. Zebrać skrawki na szkiełkach i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Inkubować szkiełko w komorze o temperaturze 37 °C, aby usunąć wodę przed barwieniem.</li>
	<li>Umyj szkiełka dwukrotnie wodą destylowaną przez 5 minut.</li>
	<li>Zetrzyj wodę wokół każdej sekcji. Użyj hydrofobowego pisaka barierowego, aby zakreślić sekcje i wrzuć DAPI lub niefluorescencyjny roztwór montażowy zapobiegający blaknięciu do okręgu. Ostrożnie połóż szkiełko nakrywkowe.</li>
</ol>
4. Barwienie immunohistochemiczne dla Runx2 i DMP1
UWAGA: Kontrola IgG jest niezbędna do barwienia immunohistochemicznego, aby uniknąć fałszywie pozytywnych sygnałów. Barwienie dla grupy eksperymentalnej i kontrolnej musi być wykonywane jednocześnie.
<ol>
	<li>Inkubować szkiełka w komorze o temperaturze 37 °C, aby usunąć wodę przed barwieniem.</li>
	<li>Umyj szkiełka dwukrotnie wodą destylowaną.</li>
	<li>Użyj hydrofobowego pisaka barierowego, aby zakreślić wszystkie sekcje na szkiełku. Na tym etapie dodaj cały przygotowany roztwór do koła, aby całkowicie pokryć sekcje.</li>
	<li>Skrawki należy traktować hialuronidazą w wilgotnej komorze w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Objętość roztworu (w krokach 4.5 - 4.8) zależy od wielkości przekroju. Użyć 50 μl roztworu na kłykieć i 100 μl na kość długą. Umyj PBST (PBS zawierający 0,1% Tween 20) trzy razy.</li>
	<li>Przygotuj i nałóż roztwór blokujący na każdą sekcję i inkubuj je w wilgotnej komorze przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Inkubować skrawki z roztworem przeciwciała pierwszorzędowego (króliczy anty-mysi Runx2 lub króliczy anty-mysi DMP1) w temperaturze 4 °C przez noc. Umyj trzykrotnie PBS.</li>
	<li>Inkubować skrawki z wtórnym roztworem przeciwciał (kozi anty-królik, Alexa Fluor 488) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Umyj trzykrotnie PBS.</li>
	<li>Wytrzyj wodę wokół sekcji i upuść DAPI w okrąg, aby zakryć sekcję na zjeżdżalni. Ostrożnie połóż szkiełko nakrywkowe.</li>
</ol>
5. Mikroskopia konfokalna
<ol>
	<li>Rejestruj obrazy komórek fluorescencyjnych za pomocą mikroskopu konfokalnego o długości fali od 488 μm (zielony) do 561 μm (czerwony). Rób wiele zdjęć warstwowych z częstotliwością odświeżania 200 Hz (wymiary 1 024 × 1 024)19 przy użyciu obiektywów 10-, 20- i 63-krotnych.</li>
</ol>

<ol><li>Gibson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+role+of+chondrocyte+apoptosis+in+endochondral+ossification%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Active role of chondrocyte apoptosis in endochondral ossification.</a> Microsc Res Tech. 43 (2), 191-204 (1998).</li>
<li>Kronenberg, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+regulation+of+the+growth+plate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Developmental regulation of the growth plate.</a> Nature. 423 (6937), 332-336 (2003).</li>
<li>Shapiro, I. M., Adams, C. S., Freeman, T., Srinivas, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+of+the+hypertrophic+chondrocyte%3A+microenvironmental+perspectives+on+apoptosis+and+survival+in+the+epiphyseal+growth+plate%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Res+C+Embryo+Today%22%5BJournal%5D)">Fate of the hypertrophic chondrocyte: microenvironmental perspectives on apoptosis and survival in the epiphyseal growth plate.</a> Birth Defects Res C Embryo Today. 75 (4), 330-339 (2005).</li>
<li>Kahn, A. J., Simmons, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrocyte-to-osteocyte+transformation+in+grafts+of+perichondrium-free+epiphyseal+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Orthop+Relat+Res%22%5BJournal%5D)">Chondrocyte-to-osteocyte transformation in grafts of perichondrium-free epiphyseal cartilage.</a> Clin Orthop Relat Res. (129), 299-304 (1977).</li>
<li>Roach, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-differentiation+of+hypertrophic+chondrocytes+into+cells+capable+of+producing+a+mineralized+bone+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Miner%22%5BJournal%5D)">Trans-differentiation of hypertrophic chondrocytes into cells capable of producing a mineralized bone matrix.</a> Bone Miner. 19 (1), 1-20 (1992).</li>
<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+pathways+to+endochondral+osteoblasts%3A+a+novel+chondrocyte-derived+osteoprogenitor+cell+identified+in+hypertrophic+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Open%22%5BJournal%5D)">Dual pathways to endochondral osteoblasts: a novel chondrocyte-derived osteoprogenitor cell identified in hypertrophic cartilage.</a> Biol Open. 4 (5), 608-621 (2015).</li>
<li>Kretzschmar, K., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Lineage tracing.</a> Cell. 148 (1-2), 33-35 (2012).</li>
<li>Humphreys, B. D., DiRocco, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage-tracing+methods+and+the+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Lineage-tracing methods and the kidney.</a> Kidney Int. 86 (3), 481-488 (2014).</li>
<li>Romagnani, P., Rinkevich, Y., Dekel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+lineage+tracing+to+study+kidney+injury+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Nephrol%22%5BJournal%5D)">The use of lineage tracing to study kidney injury and regeneration.</a> Nat Rev Nephrol. 11 (7), 420-431 (2015).</li>
<li>Yang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenic+fate+of+hypertrophic+chondrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Osteogenic fate of hypertrophic chondrocytes.</a> Cell Res. 24 (10), 1266-1269 (2014).</li>
<li>Yang, L., Tsang, K. Y., Tang, H. C., Chan, D., Cheah, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypertrophic+chondrocytes+can+become+osteoblasts+and+osteocytes+in+endochondral+bone+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hypertrophic chondrocytes can become osteoblasts and osteocytes in endochondral bone formation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (33), 12097-12102 (2014).</li>
<li>Jing, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrocytes+Directly+Transform+into+Bone+Cells+in+Mandibular+Condyle+Growth%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dent+Res%22%5BJournal%5D)">Chondrocytes Directly Transform into Bone Cells in Mandibular Condyle Growth.</a> J Dent Res. 94 (12), 1668-1675 (2015).</li>
<li>Zhou, X., von der Mark, K., Henry, S., Norton, W., Adams, H., de Crombrugghe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrocytes+transdifferentiate+into+osteoblasts+in+endochondral+bone+during+development%2C+postnatal+growth+and+fracture+healing+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Chondrocytes transdifferentiate into osteoblasts in endochondral bone during development, postnatal growth and fracture healing in mice.</a> PLoS Genet. 10 (12), (2014).</li>
<li>Purcell, P., Trainor, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mighty+Chondrocyte%3A+No+Bones+about+It%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dent+Res%22%5BJournal%5D)">The Mighty Chondrocyte: No Bones about It.</a> J Dent Res. 94 (12), 1625-1627 (2015).</li>
<li>Gebhard, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+expression+of+Cre+recombinase+in+hypertrophic+cartilage+under+the+control+of+a+BAC-Col10a1+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biol%22%5BJournal%5D)">Specific expression of Cre recombinase in hypertrophic cartilage under the control of a BAC-Col10a1 promoter.</a> Matrix Biol. 27 (8), 693-699 (2008).</li>
<li>Kalajzic, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directing+the+expression+of+a+green+fluorescent+protein+transgene+in+differentiated+osteoblasts%3A+comparison+between+rat+type+I+collagen+and+rat+osteocalcin+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Directing the expression of a green fluorescent protein transgene in differentiated osteoblasts: comparison between rat type I collagen and rat osteocalcin promoters.</a> Bone. 31 (6), 654-660 (2002).</li>
<li>Akiyama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteo-chondroprogenitor+cells+are+derived+from+Sox9+expressing+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Osteo-chondroprogenitor cells are derived from Sox9 expressing precursors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (41), 14665-14670 (2005).</li>
<li>Henry, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+aggrecan-CreERT2+knockin+mice+for+inducible+Cre+activity+in+adult+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Generation of aggrecan-CreERT2 knockin mice for inducible Cre activity in adult cartilage.</a> Genesis. 47 (12), 805-814 (2009).</li>
<li>Ren, Y., Lin, S., Jing, Y., Dechow, P. C., Feng, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+way+to+statistically+analyze+morphologic+changes+in+Dmp1-null+osteocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Connect+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">A novel way to statistically analyze morphologic changes in Dmp1-null osteocytes.</a> Connect Tissue Res. 55, 129-133 (2014).</li>
<li>Pest, M. A., Beier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+biology%3A+Is+there+such+a+thing+as+a+cartilage-specific+knockout+mouse%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Developmental biology: Is there such a thing as a cartilage-specific knockout mouse?</a> Nat Rev Rheumatol. 10 (12), 702-704 (2014).</li>
<li>Tsang, K. Y., Chan, D., Cheah, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+of+growth+plate+hypertrophic+chondrocytes%3A+death+or+lineage+extension%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Fate of growth plate hypertrophic chondrocytes: death or lineage extension?</a> Dev Growth Differ. 57 (2), 179-192 (2015).</li>
<li>Sugimoto, Y., Takimoto, A., Hiraki, Y., Shukunami, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+characterization+of+ScxCre+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Generation and characterization of ScxCre transgenic mice.</a> Genesis. 51 (4), 275-283 (2013).</li>
<li>Feng, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+conditional+null+allele+for+Dmp1+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Generation of a conditional null allele for Dmp1 in mouse.</a> Genesis. 46 (2), 87-91 (2008).</li>
<li>Lu, Y., Xie, Y., Zhang, S., Dusevich, V., Bonewald, L. F., Feng, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DMP1-targeted+Cre+expression+in+odontoblasts+and+osteocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dent+Res%22%5BJournal%5D)">DMP1-targeted Cre expression in odontoblasts and osteocytes.</a> J Dent Res. 86 (4), 320-325 (2007).</li>
<li>Rios, A. C., Fu, N. Y., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+identification+of+bipotent+stem+cells+in+the+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In situ identification of bipotent stem cells in the mammary gland.</a> Nature. 506 (7488), 322-327 (2014).</li>
<li>Blanpain, C., Simons, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unravelling+stem+cell+dynamics+by+lineage+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Unravelling stem cell dynamics by lineage tracing.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 489-502 (2013).</li>
<li>Huh, W. J., Khurana, S. S., Geahlen, J. H., Kohli, K., Waller, R. A., Mills, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tamoxifen+induces+rapid%2C+reversible+atrophy%2C+and+metaplasia+in+mouse+stomach%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Tamoxifen induces rapid, reversible atrophy, and metaplasia in mouse stomach.</a> Gastroenterology. 142 (1), 21-24 (2012).</li>
<li>Lee, M. H., Kim, J. W., Kim, J. H., Kang, K. S., Kong, G., Lee, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+of+murine+hepatic+steatosis+induced+by+tamoxifen%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Lett%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling of murine hepatic steatosis induced by tamoxifen.</a> Toxicol Lett. 199 (3), 416-424 (2010).</li>
<li>Nakamura, E., Nguyen, M. T., Mackem, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+tamoxifen-regulated+Cre+activity+in+mice+using+a+cartilage-specific+CreER%28T%29+to+assay+temporal+activity+windows+along+the+proximodistal+limb+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Kinetics of tamoxifen-regulated Cre activity in mice using a cartilage-specific CreER(T) to assay temporal activity windows along the proximodistal limb skeleton.</a> Dev Dyn. 235 (9), 2603-2612 (2006).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych ani innych konfliktów interesów.

Ze względu na ograniczenia technologiczne zawsze trudno jest zbadać zachowanie komórek in vivo. Jednak technika śledzenia linii komórkowych okazuje się być potężnym narzędziem do badania biologii komórki7-9. W tym badaniu jeszcze bardziej ulepszamy ten protokół, łącząc go z immunofluorescencją. W ten sposób los komórki może być definiowany przez wiele powiązanych markerów, co rozszerza zastosowanie śledzenia linii. Co więcej, ta kolokalizacja immunofluorescencji i sygnału pomidora jednocześnie wyświet...

Podczas rozwoju, tworzenie kości śródchrzęstnej stanowi ponad 80% objętości szkieletu. Powszechnie uważa się, że zaczyna się od apoptozy przerostowych chondrocytów. Następnie komórki z leżącego poniżej szpiku kostnego atakują i inicjują angiogenezę, po której następuje nowe odkładanie kości przez komórki pochodzące ze szpiku kostnego i okostnej1,2. Los komórek przerostowych chondrocytów (HC) jest jednak przedmiotem debaty od dziesięcioleci3. Początkowo uważano, że HC są końcem szlaku różnicowania chondrocytów, a apoptoza była ogólnie uważana za ostateczny los HC. Teraz niektórzy badacze sugerują, że przynajmniej niektóre HC mogą przetrwać i przyczyniać się do tworzenia kości śródchrzęstnej. Chociaż zasugerowali, że chondrocyty na płytce wzrostu mają zdolność do transróżnicowania się w osteoblasty na podstawie ultrastruktury, barwienia immunohistochemicznego i badań in vitro 46, żadna z tych metod nie była ostateczna w wykazywaniu wkładu chondrocytów w linię osteoblastów.
Technika śledzenia linii komórkowych zapewnia bardziej rygorystyczny sposób badania losu komórek. Krótko mówiąc, enzym rekombinazy, który ulega ekspresji tylko w określonym typie komórki, stymuluje ekspresję genu reporterowego. W ten sposób ten typ komórek i ich potomkowie są na stałe oznaczeni jako7. System Cre-loxP jest powszechnie stosowany w śledzeniu linii. Cre (enzym rekombinazy) wytnie sekwencję STOP między dwoma miejscami loxP i aktywuje reporter w określonej linii komórkowej (figura 1A). W niektórych przypadkach badacz może wybrać korzystny punkt czasowy do aktywacji Cre za pomocą leku, takiego jak tamoksyfen, powodując fuzję Cre ze zmodyfikowaną formą receptora estrogenowego (CreERT2)8. Reportery fluorescencyjne stały się standardem w eksperymentach śledzenia linii, ponieważ radykalnie zmniejszają złożoność oraz poprawiają dokładność i wydajność śledzenia losów komórek8,9. tdTomato staje się najlepszym wyborem wśród reporterów fluorescencyjnych, ponieważ ma najjaśniejsze białko fluorescencyjne i najsilniejszą epifluorescencję, dzięki czemu jest łatwe do wizualizacji7 (Figura 1A).
Korzystając z systemu śledzenia linii Rosa26tdTomato, nasza grupa i inni badacze wykazali, że HCs mogą zmienić swój fenotyp w komórki kostne podczas rozwoju10-14. Aby to osiągnąć, opracowaliśmy dwa zestawy kombinacji śledzenia z myszamiRosa26 tdtomato (wszechobecna ekspresja we wszystkich komórkach) / Cre (specyficzna dla chondrocytów): 2,3Col1a1-GFP (specyficzna dla osteoblastów) i immunofluorescencja (specyficzna dla komórek kostnych). Dane pokazują, że obie metody są realnymi sposobami badania losu komórek in vivo.

<table><tbody><tr><td>Tamoksyfen&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T5648</td><td>aktywuj wydarzenie Cre&nbsp;</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P6148</td><td>utrwalić próbkę</td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy</td><td>Alfa Aesar</td><td>A10713</td><td>odwapnić tkankę twardą</td></tr><tr><td>Sacharoza&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td>odwadnianie tkanki</td></tr><tr><td>Hialuronidaza z jąder bydlęcych&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H4272</td><td>odzyskaj antygen do barwienia immunochemicznego</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma&nbsp;</td>Rozwiązanie blokujące <td>A3059</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>pierwszorzędowe przeciwciało przeciwko Runx2&nbsp;</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe</td> <td>Cell Signal</td><td>D1L7F</td> do barwienia immunochemicznego</tr> przeciwciało <tr><td>pierwszorzędowe dla DMP1</td><td>dostarczone przez dr Chunlin Qin</td><td></td><td>przeciwciało pierwotne do barwienia immunochemicznego</td></tr><tr><td>anty-królicze IgG</td><td>Sigma</td><td>18140</td><td>kontrola dla barwienia immunochemicznego</td></tr><tr><td>przeciwciała wtórnego&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>drugie przeciwciało do barwienia immunochemicznego</td></tr><tr><td>OCT</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td>osadź próbkę do zamrożonego odcinka</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337</td><td>PBST</td></tr><tr><td>niefluorescencyjny mocowanie przeciwblaknięcia</td><td>Technologie</td><td>życia Prowadnice montażowe</td><td>P36934</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Life technologies</td><td>P36931</td><td>barwienie jądrowe</td></tr><tr><td>Hydrofobowy długopis</td><td>barierowy Vector Laboratories</td><td></td><td>zakreśla sekcję na szkiełku do barwienia immunochemicznego&nbsp;</td></tr><tr><td>Znieczulenie</td> <td>Xylazine</td><td>AnaSed</td><td></td>&nbsp;</tr><tr><td>Ketaset&nbsp;</td><td>Znieczulenie</td> <td>Zoetis</td><td></td>&nbsp;</tr><tr><td>maszyna do kriosekcji</td><td>Leica</td><td>CM1860</td> Mikroskop konfokalny UV <td></td></tr><tr><td></td><td>Leica</td><td>DM6000 CFS&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

kolokalizacja markerów linii komórkowej i sygnału pomidora

Co-localization of Cell Lineage Markers and the Tomato Signal

System śledzenia linii komórkowych był używany głównie w badaniach biologii rozwojowej. Zastosowanie rekombinazy Cre pozwala na aktywację reportera w określonej linii komórkowej i całym potomstwie. W tym przypadku zastosowaliśmy technikę śledzenia linii komórkowych, aby wykazać, że chondrocyty bezpośrednio przekształcają się w osteoblasty i osteocyty podczas rozwoju kości długich i kłykci żuchwy przy użyciu dwóch rodzajów Cre, Col10a1-Cre i Aggrecan-CreERT2 (Agg-CreERT2), skrzyżowanych z Rosa26tdTomato. Zarówno Col10, jak i agrekan są dobrze rozpoznanymi markerami chondrocytów.
Na tej podstawie opracowaliśmy nową metodę - śledzenie linii komórkowych w połączeniu z immunohistochemią fluorescencyjną - do definiowania losu komórki poprzez analizę ekspresji określonych markerów komórkowych. Runx2 (marker komórek osteogennych we wczesnym stadium) i białko macierzy zębiny1 (DMP1; marker komórek osteogennych w późnym stadium) wykorzystano do identyfikacji komórek kostnych pochodzących z chondrocytów i ich statusu różnicowania. Ta kombinacja nie tylko rozszerza zastosowanie śledzenia linii komórkowych, ale także upraszcza tworzenie myszy złożonych. Co ważniejsze, liczba, lokalizacja i statusy różnicowania potomstwa komórek rodzicielskich są wyświetlane jednocześnie, dostarczając więcej informacji niż samo śledzenie linii komórkowych. Podsumowując, jednoczesne zastosowanie technik śledzenia linii komórkowych i immunofluorescencji jest potężnym narzędziem do badania biologii komórki in vivo.

Chondrocyty bezpośrednio przekształcają się w komórki kostne (osteoblasty i osteocyty) w wyrostku stawowym żuchwy i kościach długich.
Aggrecan, kluczowy gen dla chondrogenezy, jest wyrażany głównie w wczesnych i dojrzałych chondrocytach18. W rezultacie wstrzyknięcie tamoksyfenu w 2. tygodniu życia myszy Agg-CreERT2; Rosa26tdTomato aktywowało czerwony re...

Opracowaliśmy dwa zestawy kombinacji śledzenia u myszy Rosa26tdtomato (wszechobecne w wszystkich komórkach)/Cre (specyficznie wyrażane w chondrocytach): jeden z 2.3Col1a1-GFP (specyficzny dla osteoblastów) i jeden z immunofluorescencją (specyficzny dla komórek kostnych). Dane wskazują na bezpośrednią transformację chondrocytów w komórki kostne.

Kolokalizacja markerów linii komórkowej i sygnału pomidora

The cell lineage tracing system has been used predominantly in developmental biology studies. The use of Cre recombinase allows for the activation of the ...

Ogólnym celem tej techniki śledzenia linii komórkowych i późniejszej immunofluorescencji jest badanie biologii komórki oraz losów komórek in vivo. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii komórki i rozwoju tkanek dotyczące pochodzenia komórek tworzących kość podczas endochondrogenezy. Główną zaletą tej techniki jest możliwość jednoczesnego wykazania liczby, lokalizacji i stanu różnicowania potomstwa komórki macierzystej, co rozszerza zastosowanie śledzenia linii komórkowych.Choć metoda ta pozwala zrozumieć proces przekształcania się chondrocytów w komórki osteogenne podczas prawidłowego rozwoju, może być ona również zastosowana do innych tkanek i modeli chorobowych, takich jak transformacja komórek w guzie. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ przygotowywanie skrawków mrożonych jest wymagające, a sekcje mogą łatwo odkleić się podczas barwienia. Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy chcieliśmy wykazać stan różnicowania komórek osteogennych przekształconych z chondrocytów w kości beleczkowatej.Aby prześledzić linię komórkową hipertroficznych chondrocytów u myszy, najpierw przeprowadź hodowlę zwierząt zgodnie z

co-localization-of-cell-lineage-markers-and-the-tomato-signal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opisany tutaj protokół hybrydyzacji in situ umożliwia bezpośrednią lokalizację ekspresji mRNA i małych RNA na poziomie komórkowym z wysoką czułością i swoistością. Procedura została zoptymalizowana dla przekrojów tkanek roślinnych zatopionych w parafinie, ma zastosowanie do szerokiego zakresu roślin i tkanek oraz może zostać ukończona w ciągu dziesięciu dni.

Hybrydyzacja in situ w celu precyzyjnej lokalizacji transkrypty w roślinach

Metoda otrzymywania protoplastów z liści Arabidopsis kompatybilna z fluorescencyjnym sortowaniem komórek (FACS), umożliwiająca badania specyficznych populacji komórkowych. Metoda ta jest zgodna z każdą linią Arabidopsis wykazującą ekspresję GFP w podzbiorze komórek.

Analiza specyficzna dla komórek liści Arabidopsis z wykorzystaniem sortowania komórek aktywowanego fluorescencją

Opisujemy tutaj transgeniczny model myszy reporterowej do wizualizacji komórek wytwarzających IL-22 wewnątrz różnych tkanek myszy. Ta metoda może być wykorzystana do śledzenia lokalizacji innych cytokin lub białek wydzielniczych u myszy.

Wizualizacja limfocytów z ekspresją IL-22 przy użyciu myszy reporterowych

Tutaj prezentujemy protokół techniki etykietowania mozaiki, który pozwala na wizualizację neuronów pochodzących ze wspólnej komórki progenitorowej w dwóch różnych kolorach. Ułatwia to analizę linii neuronalnej z możliwością datowania pojedynczych neuronów na narodziny i badania funkcji genów w tych samych neuronach różnych osób.

Analizy linii komórkowych i badania funkcji genów z wykorzystaniem MARCM w bliźniaczej plamce

Połączenia międzykomórkowe roślin, plazmodesmaty (Pd), odgrywają kluczową rolę w fizjologii roślin i interakcjach między roślinami a wirusami. Kluczowe znaczenie dla transportu Pd mają sygnały sortujące, które kierują białka do Pd. Jednak nasza wiedza na temat tych sekwencji jest wciąż w powijakach. Opisujemy strategię identyfikacji sygnałów lokalizacji Pd w białkach docelowych Pd.

Identyfikacja sekwencji lokalizacji plazmodesmalnej w białkach w Planta

Ten protokół pokazuje, jak na żywo obrazować i analizować merystemy wierzchołkowe pędów z różnych gatunków roślin za pomocą laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej.

Konfokalne obrazowanie na żywo merystemów wierzchołkowych pędów różnych gatunków roślin

Zmiany morfologiczne występują w komórkach fibroblastów reagujących immunologicznie po aktywacji i sprzyjają zmianom w rekrutacji komórek. Wykorzystanie obrazowania 2-fotonowego w połączeniu z genetycznie modyfikowanym białkiem 1 specyficznym dla fibroblastów (FSP1)-cre; Linia myszy tdTomato floxed-stop-floxed (TB / TB) i zielony fluorescencyjnie oznaczony lipopolisacharyd-FITC, możemy zilustrować wysoce specyficzny wychwyt lipopolisacharydu w fibroblastach skóry i zmiany morfologiczne in vivo.

Dwukolorowe obrazowanie 2-fotonowe in vivo genetycznie znakowanych komórek reporterowych w skórze

W tym manuskrypcie przedstawiono protokół do wykonywania pomiarów aktywności transkrypcyjnej BK-poliomawirusa opartego na FACS przy użyciu komórek HEK293T transfekowanych dwukierunkowym plazmidem reporterowym wykazującym ekspresję tdTomato i eGFP. Metoda ta pozwala ponadto na ilościowe określenie wpływu nowych związków na transkrypcję wirusa.

Pomiar aktywności transkrypcyjnej sterowanej przez niekodujący region kontrolny BK-poliomawirusa za pomocą cytometrii przepływowej

Przedstawiono protokół do śledzenia linii i funkcjonalnej analizy genetycznej genów kandydujących na poziomie pojedynczej komórki za pomocą analizy mozaikowej z podwójnymi markerami (MADM). Analiza klonalna MADM zapewnia ilościowe ramy do pomiaru zachowania proliferacyjnego, produkcji komórkowej i pokrewieństwa liniowego poszczególnych komórek progenitorowych i ich komórek potomnych.

Śledzenie linii i analiza klonalna w rozwoju kory mózgowej za pomocą analizy mozaiki z podwójnymi markerami (MADM)

Możliwość trwałego oznaczania komórek macierzystych i ich potomstwa za pomocą fluoroforu za pomocą indukowalnej linii myszy śledzącej transgeniczną linię genealogiczną pozwala na przestrzenną i czasową analizę aktywacji, proliferacji, migracji i/lub różnicowania in vivo. Śledzenie linii może ujawnić nowe informacje na temat zaangażowania w linię, odpowiedzi na interwencję (interwencje) i multipotencji.

Śledzenie linii indukowalnych fluorescencyjnie znakowanych komórek macierzystych w mózgu dorosłej myszy

Ten protokół opisuje wybór optymalnych markerów plazmodesmalnych do analiz opartych na mikroskopii konfokalnej białek ukierunkowanych na plazmodesmat podczas interakcji wirus-plazmodesmata lub transportu plazmodesmalnego.

Mikroskopia konfokalna Analiza sortowania białek do plazmodesmatów u Nicotiana benthamiana

Poznaj technikę śledzenia linii komórkowej z immunofluorescencją u myszy Rosa26 tdtomato/Cre. Metoda pozwala badać transformację chondrocytów w komórki kostne podczas endochondrogenesis in vivo.

Kolokalizacja markerów linii komórkowej i sygnału pomidora

Przeglądaj więcej filmów