Name: Zastosowanie obrazowania ex vivo całego narządu i ilościowej histologii tkanek w celu określenia biodystrybucji cząsteczek znakowanych fluorescencyjnie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Poznaj metodę obrazowania ex vivo całych narządów do szybkiej oceny biodystrybucji fluorescencyjnie znakowanych związków w zwierzętach. Technika ta umożliwia niskokosztowe i precyzyjne porównania różnych leków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Częściowe wsparcie wynagrodzeń dla GLB jest zapewnione przez R01HL121527 grantu NIH. JWDM jest wspierany przez Currier Fellowship in Neurology.

UWAGA: Wszystkie zastosowania zwierząt w tym protokole zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Centrum Medycznego Uniwersytetu Mississippi.
1. Leczenie zwierząt i tkanek
<ol>
	<li>Administracja i poświęcenie
	<ol>
		<li>Znieczulij zwierzęta za pomocą 3% izofluranu przez 5 minut i sprawdź głębokość znieczulenia, obserwując brak odruchu szczypania palców u stóp. Nałóż maść weterynaryjną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.</li>
		<li>Zważyć zwierzę i odpipetować dawkę 50 mg/kg ELP, SynB1-ELP lub Tat-ELP znakowaną rodaminą do probówki o pojemności 1,5 ml. Zaoszczędź 100 μl podanych znakowanych związków do sformułowania krzywych wzorcowych w późniejszych krokach. 
		Uwaga: Ważne jest, aby wzorce były sporządzane z tej samej partii znakowanego białka podawanego zwierzętom, aby uniknąć różnic wynikających ze zmienności skuteczności znakowania fluorescencyjnego. W celu prawidłowego usunięcia fluorescencji tła z późniejszych pomiarów fluorescencji, zwierzę niepoddane działaniu środka musi zostać uśmiercone przy użyciu tych samych metod/odczynników, co zwierzęta poddane działaniu środka.</li>
		<li>Podać wstrzyknięcie dożylne, jak opisanowcześniej 1, używając żyły ogonowej lub żyły udowej (do której dostęp prowadzi przez 1-centymetrowe nacięcie w pachwinie). W przypadku analgezji, w przypadku nacięcia pachwiny, należy podać karprofen podskórnie w dawce 5 mg/kg mc., a przed zamknięciem naciąć w miejsce nacięcia nałożyć sensorkainę za pomocą klipsa do rany. Aby podać je drogą donosową (IN), należy ułożyć zwierzę w pozycji leżącej.</li>
		<li>Za pomocą pipety o pojemności 2 μl pobrać kroplę 1 μl znakowanego związku. Na krótko zsuń głowę zwierzęcia z obroży anestezjologicznej, aby umożliwić dostęp do nozdrzy.</li>
		<li>Przyłożyć końcówkę pipety do otworu pojedynczego węzła i powoli wciskać tłok, pozwalając, aby kropla spłynęła po otworze do jamy nosowej. Powtarzać co 1 minutę, naprzemiennie co kroplę, aż do podania pełnej dawki. 
		Uwaga: Maksymalna objętość podawana przez IN nie powinna przekraczać 10 - 15 μL dla myszy.</li>
		<li>Pozostawić zwierzęta w pozycji leżącej pod narkozą na 10 minut po ostatnim podaniu przed przeniesieniem każdego z nich do osobnej klatki. 
		Uwaga: Nie pozostawiaj zwierząt bez opieki, dopóki nie odzyskają wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą na mostku.</li>
		<li>1 godzinę po podaniu należy ponownie znieczulić zwierzęta jak poprzednio i uśmiercić je poprzez perfuzję przezsercową przy użyciu PBS (210,0 mg/L KH2PO4, 9 000,0 mg/L NaCl, 726 mg/L Na2HPO4,7H 2O) w dawce 10 ml/min, co daje łącznie 20 ml. 
		Uwaga: perfuzja zwierząt podczas uśmiercania w celu usunięcia całej krwi z tkanek jest wymagana w celu określenia pozanaczyniowych stężeń znakowanych związków. Odczynniki perfuzyjne mogą powodować zmiany fluorescencji tła i powinny być spójne. Metoda składania ofiar powinna być spójna w grupach. Różne metody składania ofiar mogą powodować różne poziomy krwi w naczyniach krwionośnych, zmieniając fluorescencję tła tkanek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobieranie tkanek
	<ol>
		<li>Przygotować PBS zgodnie z powyższym opisem do płukania usuniętych tkanek. 
		Uwaga: Jeśli jako płyn perfuzyjny użyto innego buforu, wypłucz tkanki w tym samym buforze.</li>
		<li>Usuń serce, płuca, żołądek, wątrobę, śledzionę i nerki przez prostą sekcję. Krótko spłucz w PBS przed użyciem chusteczek laboratoryjnych do osuszenia lub odprowadzenia nadmiaru wilgoci i umieszczenia tkanek na macie do obrazowania.</li>
		<li>Odetnij głowę myszy i usuń górną część czaszki za pomocą noży do kości lub rongeurs. Za pomocą kleszczy ostrożnie usuń mózg, utrzymując nienaruszone opuszki węchowe. Opłucz, osusz i umieść na dostarczonej macie do obrazowania.</li>
		<li>Aby usunąć rdzeń kręgowy przez szybki wyrzut7, napełnij strzykawkę o pojemności 10 ml PBS i przymocuj stępioną igłę o rozmiarze 18. 
		Uwaga: rozmiar 18 pasuje do kanału kręgowego dorosłego wielu linii myszy. Wymagana średnica będzie się różnić w zależności od wielkości zwierzęcia.</li>
		<li>Ułóż zwierzę w pozycji leżącej, upewniając się, że otwór kanału kręgowego w miejscu dekapitacji jest czysto przecięty i wolny od krwi.</li>
		<li>Usuń skórę z okolic kręgosłupa. Za pomocą ostrych noży do kości lub nożyczek przeciąć kręgosłup w odcinku lędźwiowym bezpośrednio rostralnie do bioder.</li>
		<li>Krótko spłucz go PBS, aby uwidocznić kanał kręgowy. Delikatnie wprowadzić igłę do kanału kręgowego. 
		Uwaga: Igła powinna być dobrze dopasowana i może wymagać powolnego toczenia się w przód iw tył podczas wprowadzania. Jeśli igła wydaje się luźna, można wykonać bardziej rostralne cięcie lub może być potrzebna igła o większej średnicy.</li>
		<li>Za pomocą kciuka i palca wskazującego uciskaj kręgosłup wokół wkłutej igły. Wcisnąć tłok z umiarkowanym i stałym naciskiem. Rdzeń kręgowy wysunie się nienaruszony z otworu rostralnego w kręgosłupie. 
		Uwaga: Całkowite usunięcie, płukanie i suszenie wszystkich głównych narządów można zakończyć w ciągu 5 - 7 minut. Ten krótki czas zapobiega konieczności przedłużonego przechowywania w PBS, co mogłoby skutkować nadmierną ekspozycją na światło i wypłukiwaniem znakowanych białek z tkanki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Obrazowanie fluorescencyjne ex vivo całego narządu
<ol>
	<li>Parametry obrazowania
	<ol>
		<li>Uruchom oprogramowanie do akwizycji obrazów. W prawym dolnym rogu panelu sterowania pobierania kliknij "zainicjuj".</li>
		<li>W sekcji "tryb obrazowania" zaznacz pole wyboru "fluorescencyjne". W sekcji "czas ekspozycji" wybierz "AUTO".</li>
		<li>W sekcji "binning" wybierz "mały" i ustaw przysłonę F/Stop na 2.</li>
		<li>Wybierz filtry wzbudzenia 535 nm i emisji 580 nm. 
		Uwaga: Będzie się to różnić w zależności od użytej etykiety.</li>
		<li>Wybierz "Pole widzenia B" i ustaw wysokość docelową na 0,3 cm. 
		Uwaga: Będzie się to różnić w zależności od tkanek, które mają być obrazowane.</li>
		<li>Gdy wskaźnik temperatury zmieni kolor na zielony (co oznacza, że maszyna jest w pełni zainicjowana), umieść chusteczki na dostarczonym czarnym tle, upewniając się, że tkanki są całkowicie oddzielone od siebie. Umieść matę w imagerze, upewniając się, że wszystkie tkanki znajdują się w siatce wybranego obszaru. Większe i niejednorodne tkanki, takie jak cała wątroba, powinny być ułożone tak, aby zmniejszyć nakładanie się płatów. 
		Uwaga: Tkanki mogą być ułożone razem w jedną grupę, dzięki czemu jeden obraz może pomieścić pojedyncze zwierzę lub wszystkie tkanki podobnego typu. Ułatwia to późniejszą analizę i organizację. Jeśli między różnymi tkankami występują duże różnice w intensywności fluorescencji, najlepiej jest obrazować je pojedynczo lub jako grupy tego samego typu tkanki, ponieważ pojedynczy czas ekspozycji może nie być idealny dla wszystkich intensywności tkanek.</li>
		<li>Kliknij "Acquire" (Nabywaj).</li>
		<li>Po zobrazowaniu należy natychmiast usunąć tkanki i przechowywać je lub zamrażać w celu ilościowej histologii, jak opisano w kroku 4.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Standardy i przetwarzanie obrazu
<ol>
	<li>Standardów
	<ol>
		<li>W PBS należy utworzyć dwukrotne seryjne rozcieńczenia każdego białka stosowanego w leczeniu zwierząt, zaczynając od pierwotnego stężenia, w sumie 15 rozcieńczeń. 
		Uwaga: Zakres stężeń powinien mieć na celu uwzględnienie oczekiwanych stężeń w tkankach i może wymagać dodatkowych rozcieńczeń pierwotnej próbki, w zależności od stężenia wyjściowego.</li>
		<li>Odpipetować 100 μl każdego wzorca do każdego dołka czarnej 96-dołkowej płytki. Dołącz jedną studzienkę czystego PBS, aby uzyskać miarę fluorescencji tła.</li>
		<li>Zobrazuj wzorce z tymi samymi parametrami, które są używane do obrazowania tkanek.</li>
		<li>W oprogramowaniu do akwizycji obrazów "Paleta narzędzi" w sekcji "Narzędzia ROI" wybierz okrąg "Obszar zainteresowania (ROI)" i narysuj ROI wokół jednego dołka. Skopiuj ten zwrot z inwestycji do wszystkich innych wypełnionych studzienek i kliknij "zmierz zwrot z inwestycji".</li>
		<li>Odjąć wartość średniej wydajności promieniowania czystego PBS od wartości innych wzorców, usuwając w ten sposób fluorescencję tła. Wykreśl wartości w stosunku do znanego stężenia na wykresie punktowym. 
		Uwaga: Wynikowe równanie liniowej linii trendu można następnie wykorzystać do obliczenia względnej wartości fluorescencji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przetwarzanie obrazu
	<ol>
		<li>W oprogramowaniu do akwizycji obrazu wybierz narzędzie ROI o dowolnym kształcie i narysuj ROI wokół każdej z poszczególnych tkanek. Kliknij "zmierz".</li>
		<li>Na podstawie otrzymanych średnich pomiarów wydajności promieniowania odejmij wartości zmierzone od nieleczonego zwierzęcia dla każdego typu tkanki i wykreśl te wartości na wcześniej utworzonej krzywej standardowej. 
		Uwaga: Uzyskane względne wartości fluorescencji zapewniają szybki i dokładny obraz biodystrybucji znakowanego związku.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Ilościowa histologia tkanek
<ol>
	<li>Przygotowanie i zamrażanie tkanek do krojenia
	<ol>
		<li>Stwórz lub kup pojemniki o odpowiedniej wielkości, aby zamrozić wybrane tkanki i kriostat, które mają być użyte. Dobrze sprawdza się owijanie folią aluminiową wokół przedmiotu o odpowiedniej wielkości i kształcie.</li>
		<li>Przygotować mieszaninę izopropanolu i suchego lodu, wypełniając połowę zlewki o pojemności 500 ml suchym lodem i dodając ~ 350 ml izopropanolu tak, aby nad suchym lodem znajdowała się wystarczająca ilość płynu, aby częściowo zanurzyć pojemnik do zamrażania. 
		Uwaga: Ciekły azot często powoduje pękanie związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) oraz osadzonych tkanek i należy go unikać.</li>
		<li>Napełnij pojemnik do zamrażania częściowo OCT, upewniając się, że nie ma pęcherzyków. Jeśli są bąbelki, usuń bąbelki z roztworu za pomocą kleszczy lub podobnego narzędzia.</li>
		<li>Wyjmij chusteczkę z PBS i dokładnie ją wysusz, delikatnie wklepując ją chusteczką laboratoryjną lub dotykając krawędzi delikatnych chusteczek chusteczką laboratoryjną i pozwalając płynowi odpłynąć.</li>
		<li>Delikatnie umieść chusteczkę w OCT wewnątrz pojemnika do zamrażania, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków pod tkankę. Gdy tkanka znajdzie się na miejscu, dodawaj OCT, aż tkanka zostanie całkowicie pokryta.</li>
		<li>Zanurzyć pojemnik do zamrażania tak bardzo, jak to możliwe, nie dopuszczając do kontaktu izopropanolu z odsłoniętym OCT wewnątrz pojemnika. Odczekaj 30 - 90 s (lub potencjalnie więcej w przypadku większych tkanek), aby OCT i tkanka całkowicie zamroziły się przed przechowywaniem w temperaturze -80 °C tak długo, jak to konieczne.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie wzorców do krojenia.
	<ol>
		<li>Przygotować i odpowiednio oznaczyć strzykawki jednorazowego użytku o pojemności 1 ml, zdejmując koniec cylindra tak, aby cała długość strzykawki miała jedną średnicę. Umożliwi to późniejsze wypchnięcie zamrożonego cylindra.</li>
		<li>Za pomocą OCT utwórz 15-etapowe, dwukrotne seryjne rozcieńczanie podawanych związków, tak jak to miało miejsce wcześniej w przypadku PBS, ale z końcową uzyskaną objętością 1 ml. Dołączyć jedną próbkę czystego OCT w celu usunięcia wartości fluorescencji tła.</li>
		<li>Lepkość OCT utrudnia odpowiednie mieszanie. Odwróć rurki i pozwól OCT całkowicie się osiąść przed ponownym odwróceniem. Powtórz to 10 - 20 razy, aby zapewnić jednolitą mieszankę. Podczas mieszania roztwory wzorcowe należy przechowywać w temperaturze 4 °C, z dala od światła.</li>
		<li>Po wymieszaniu ponownie przygotuj mieszaninę izopropanolu i suchego lodu, jak poprzednio. 
		Uwaga: Ciekły azot może być również stosowany zamiast mieszaniny izopropanolu i suchego lodu, pod warunkiem, że strzykawki zostaną szybko wyjęte po zamrożeniu ciała stałego.</li>
		<li>Pobrać wzorzec OCT do strzykawki, uważając, aby wprowadzić jak najmniej pęcherzyków. Po pobraniu roztworu OCT należy natychmiast zanurzyć strzykawkę bezpośrednio w izopropanolu i pozostawić roztwór do całkowitego zamrożenia wewnątrz strzykawki na 10 - 20 s. Przechowywać strzykawki w temperaturze -80 °C tak długo, jak jest to konieczne.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cięcie tkanek i wzorców
	<ol>
		<li>Umieścić zarówno tkanki, jak i wzorce w temperaturze -20 °C i odczekać wystarczająco dużo czasu, aby wszystkie próbki osiągnęły temperaturę. 
		Uwaga: Idealna temperatura skrawania zazwyczaj mieści się w zakresie -10 °C dla większości tkanek, ale ostatecznie zależy od wielkości tkanki i zawartości tłuszczu i musi zostać doprecyzowana empirycznie.</li>
		<li>Za pomocą kriostatu pokrój chusteczki na plastry o grubości 20 μm i zamontuj je na szkiełkach, jak opisano wcześniej8. Przechowuj szkiełka w temperaturze -20 °C i trzymaj je z dala od światła tak bardzo, jak to możliwe podczas cięcia i do momentu skanowania. 
		Uwaga: Ważne jest tutaj, aby mierzone odcinki były odpowiednio rozmieszczone na całej grubości tkanki.</li>
		<li>Aby zamontować wzorce na uchwycie kriostatu, wyjmij strzykawkę z zamrażarki i ogrzewaj ją na zewnątrz przez 3 - 5 sekund, trzymając ją w ręku. Naciskać tłok do momentu, gdy krótki odcinek (~ 1 cm) cylindra OCT znajdzie się poza strzykawką.
		<ol>
			<li>Za pomocą żyletki przetnij cylinder i umieść powstałą część cylindra prostopadle na uchwycie, używając OCT, aby utrzymać go na miejscu. Taka konfiguracja powinna skutkować wycinaniem dobrze zdefiniowanych okręgów.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Podzielić cylindry na plastry z prędkością 20 μm, umieszczając po jednym wykroju z każdego rozcieńczenia na jednym szkiełku, tak aby jeden szkiełko odpowiadało całej krzywej wzorcowej. Przechowuj szkiełka w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będą gotowe do skanowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Skanowanie i ocena ilościowa
	<ol>
		<li>Uruchom oprogramowanie macierzy skanowania i kliknij "543 laser", aby rozpocząć procedurę uruchamiania lasera. Odczekaj 15 minut, aż laser się przygotuje.</li>
		<li>Gdy laser będzie gotowy, wyjmij szkiełka z temperatury -20 °C i przenieś je do dużego, chronionego przed światłem pojemnika, aby osiągnęły temperaturę i wyschły przez 3 minuty. Zapobiegnie to gromadzeniu się wilgoci w skanerze slajdów.</li>
		<li>Załaduj szkiełko do gniazda na suwak w skanerze do slajdów. Kliknij "skanuj" i wybierz "uruchom łatwe skanowanie".</li>
		<li>Ustaw rozdzielczość skanowania na 50 μm.</li>
		<li>Zaznacz pierwsze pole wyboru "Użyj" w sekcji "Fluorofor" i wybierz "TRITC". Ustaw wzmocnienie PMT na 80%. 
		Uwaga: Ustawienia te będą się różnić w zależności od fluoroforu i stężenia znakowanych cząsteczek.</li>
		<li>Po lewej stronie upewnij się, że obszar skanowania obejmuje cały slajd. Kliknij "Start".</li>
		<li>Po zeskanowaniu wybierz "plik" i "zapisz jako", a następnie zapisz obraz jako .tif. 
		Uwaga: Preparaty z tkankami i wzorcami powinny być skanowane przy tych samych ustawieniach.</li>
		<li>Załaduj wynikowe obrazy do ImageJ i wybierz ROI wokół tkanek i standardów. W zakładce "analizuj" wybierz "ustaw pomiary" i wybierz "średnia wartość szarości". Kliknij "zmierz" 
		Uwaga: Podobnie jak w przypadku poprzedniej techniki, fluorescencja tła musi zostać odjęta od wszystkich zmierzonych wartości.</li>
		<li>Wykreślić średnią wartość szarości z wzorców w stosunku do znanego stężenia, aby utworzyć krzywą wzorcową. 
		Uwaga: Wynikowe pomiary z tkanek powinny być uśrednione w każdej tkance i wykreślone na tej krzywej wzorcowej w celu określenia stężenia w tkance.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>George, E. M., Liu, H., Robinson, G. G., Bidwell, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Polypeptide+Drug+Carrier+for+Maternal+Delivery+and+Prevention+of+Fetal+Exposure%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Drug+Target%22%5BJournal%5D)">A Polypeptide Drug Carrier for Maternal Delivery and Prevention of Fetal Exposure.</a> J. Drug Target. 22 (9), 1133-1145 (2014).</li>
<li>George, E. M., Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factor+purification+and+delivery+systems+%28PADS%29+for+therapeutic+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Vasc.+Cell%22%5BJournal%5D)">Growth factor purification and delivery systems (PADS) for therapeutic angiogenesis.</a> Vasc. Cell. 7 (1), 1-11 (2015).</li>
<li>Bidwell, G. L., Perkins, E., Hughes, J., Khan, M., James, J. R., Raucher &amp, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermally+Targeted+Delivery+of+a+c-Myc+Inhibitory+Polypeptide+Inhibits+Tumor+Progression+and+Extends+Survival+in+a+Rat+Glioma+Model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Thermally Targeted Delivery of a c-Myc Inhibitory Polypeptide Inhibits Tumor Progression and Extends Survival in a Rat Glioma Model.</a> PLoS One. 8 (1), (2013).</li>
<li>Liu, H., Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+improved+blood%E2%80%93brain+barrier+permeability+of+endomorphin-1+using+the+cell-penetrating+peptide+synB3+with+three+different+linkages%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Pharm%22%5BJournal%5D)">The improved blood–brain barrier permeability of endomorphin-1 using the cell-penetrating peptide synB3 with three different linkages.</a> Int. J. Pharm. 476 (1-2), 1-8 (2014).</li>
<li>Flessner, M. F., Fenstermacher, J. D., Blasberg, R. G., Dedrick, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peritoneal+absorption+of+macromolecules+studied+by+quantitative+autoradiography%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Peritoneal absorption of macromolecules studied by quantitative autoradiography.</a> Am. J. Physiol. 248, 26-32 (1985).</li>
<li>Flessner, M. F., Choi, J., He, Z., Credit, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+characterization+of+human+ovarian+cancer+cells+in+a+rat+model+of+intraperitoneal+antineoplastic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Physiological characterization of human ovarian cancer cells in a rat model of intraperitoneal antineoplastic therapy.</a> J Appl Physiol. 97, 1518-1526 (2004).</li>
<li>Kennedy, H. S., Jones, C., Caplazi, P., Iii, C. J., Caplazi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+standard+laminectomy+with+an+optimized+ejection+method+for+the+removal+of+spinal+cords+from+rats+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histotechnol%22%5BJournal%5D)">Comparison of standard laminectomy with an optimized ejection method for the removal of spinal cords from rats and mice.</a> J. Histotechnol. 36 (3), 86-91 (2013).</li>
<li>Currle, D. S., Monuki, E. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flash+Freezing+and+Cryosectioning+E12.5+Mouse+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp.+JoVE%22%5BJournal%5D)">Flash Freezing and Cryosectioning E12.5 Mouse Brain.</a> J. Vis. Exp. JoVE. (4), e198(2007).</li>
<li>Walker, L., Perkins, E., Kratz, F., Raucher &amp, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+penetrating+peptides+fused+to+a+thermally+targeted+biopolymer+drug+carrier+improve+the+delivery+and+antitumor+efficacy+of+an+acid-sensitive+doxorubicin+derivative%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Cell penetrating peptides fused to a thermally targeted biopolymer drug carrier improve the delivery and antitumor efficacy of an acid-sensitive doxorubicin derivative.</a> Int. J. Pharm. 436 (1-2), 825-832 (2012).</li>
<li>Frangioni, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+near-infrared+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo near-infrared fluorescence imaging.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 7 (5), 626-634 (2003).</li>
<li>Vugmeyster, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacokinetics+and+toxicology+of+therapeutic+proteins%3A+Advances+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22World+J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Pharmacokinetics and toxicology of therapeutic proteins: Advances and challenges.</a> World J. Biol. Chem. 3 (4), 73(2012).</li>
<li>Stumpf, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+and+microscopic+autoradiography+to+determine+tissue+distribution+of+biopharmaceuticals+-+Target+discoveries+with+receptor+micro-autoradiography+engendered+new+concepts+and+therapies+for+vitamin+D%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Whole-body and microscopic autoradiography to determine tissue distribution of biopharmaceuticals - Target discoveries with receptor micro-autoradiography engendered new concepts and therapies for vitamin D.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 65 (8), 1086-1097 (2013).</li>
</ol>

GLB jest właścicielem Leflore Technologies, LLC, prywatnej firmy pracującej nad rozwojem technologii dostarczania leków opartej na ELP. Firma Leflore Technologies nie udzieliła żadnego wsparcia w związku z publikacją tego artykułu ani generowaniem w nim danych.

Chociaż obrazowanie ex vivo całych narządów jest na ogół proste, przestrzeganie niektórych podstawowych koncepcji i technik może poprawić dokładność pomiarów biodystrybucji. Krótkie fale światła doświadczają wysokiego stopnia rozproszenia i absorpcji w większości tkanek, co znacząco wpływa na użyteczność fluoroforów o krótkich falach. Te fluorofory mają ograniczone zastosowanie w badaniach tkanek głębokich, ale są skutecznie wykorzystywane w eksperymentach dotyczących tkanek powierzchniowych lub do oka. I odwrot...

Etykietowanie fluorescencyjne jest łatwą w użyciu i skuteczną metodą określania biodystrybucji związków, przy użyciu szeregu urządzeń, które są wspólne dla wielu laboratoriów. Fluorofory są powszechnie dostępne, stosunkowo niedrogie i występują w różnych długościach fal, dzięki czemu wiele znakowanych cząsteczek może być używanych jednocześnie bez zakłóceń. Większość fluoroforów ma szereg chemii do koniugacji z różnymi grupami reaktywnymi na związkach docelowych, a proces koniugacji jest na ogół prosty dla większości typów miejsc reaktywnych. Ponadto sprzęt wymagany do pomiarów związków znakowanych fluorescencyjnie jest powszechny w wielu laboratoriach. Mikroskopy fluorescencyjne, imagery i skanery preparatów mogą być używane w różnych okolicznościach, dzięki czemu korzystanie z etykietowania fluorescencyjnego jest bardzo dostępne. Znaczniki fluorescencyjne są często używane do określania biodystrybucji i kinetyki związków zarówno in vivo, jak i ex vivo za pomocą urządzeń do obrazowania na żywo, takich jak IVIS Spectrum Imager, oraz za pomocą ilościowej histologii tkanek2,3.
Wykorzystanie obrazowania ex vivo całego narządu za pomocą urządzeń do obrazowania na żywo zwiększyło się z czasem ze względu na ich łatwość użycia i możliwość szybkiego tworzenia dokładnego porównania względnych stężeń znakowanych związków bez konieczności dalszego przetwarzania tkanek4. Jednakże, chociaż obrazowanie ex vivo całego narządu może pozwolić na łatwą analizę i porównanie, nie generuje ilościowej miary bezwzględnych stężeń związków w tkance. Wynika to z efektów rozpraszania światła w nienaruszonych narządach. Ponieważ rozpraszanie światła (i, w mniejszym stopniu, absorbancja) różni się w zależności od wielkości i gęstości tkanki, obrazowanie całego narządu może zaniżać poziomy tkanek w dużych lub gęstych narządach. Sformułowanie odpowiednich wzorców do pomiarów stężenia bezwzględnego jest również trudne, ponieważ należy naśladować grubość i gęstość każdego pojedynczego narządu. Z drugiej strony, obrazowanie całego narządu jest szybką metodą uzyskiwania względnych poziomów tkankowych czynnika i idealnie nadaje się do porównywania względnej biodystrybucji wielu powiązanych cząsteczek (np. w badaniach ukierunkowanych na leki). Alternatywną strategią jest wykorzystanie ilościowej histologii fluorescencyjnej, techniki wywodzącej się z metody ilościowej autoradiografii, w celu uzyskania bezwzględnych poziomów badanego czynnika w tkankach5,6. Zamiast umieszczać całe zwierzę lub narząd w urządzeniu do wyobrażania sobie, ilościowa histologia tkanek wymaga, aby każda tkanka została pokrojona, zamontowana na szkiełkach, zeskanowana i przeanalizowana indywidualnie. Wzorce badanego czynnika są przygotowywane i krojone w plastry o tej samej grubości co próbki narządów. Poprzez przycięcie wszystkich narządów i wzorców do tej samej grubości, zmienność spowodowana rozpraszaniem światła lub absorbancją jest eliminowana, a intensywność fluorescencji tkanek można dopasować do krzywej standardowej w celu określenia stężenia bezwzględnego. Chociaż ta metoda, jeśli jest wykonywana prawidłowo, jest ilościowa, jest również pracochłonna i łatwo ją źle obsłużyć. Biorąc pod uwagę bardziej złożony charakter histologii ilościowej i znacznie wyższe koszty pracy w porównaniu z obrazowaniem całego narządu, warto zbadać, gdzie każdy proces jest najbardziej praktyczny do zastosowania podczas badania biodystrybucji związków znakowanych fluorescencyjnie. Protokół ten zawiera szczegółowy opis tego, w jaki sposób te metody mogą być stosowane razem w celu skutecznego porównania biodystrybucji polipeptydu elastynopodobnego znakowanego rodaminą (ELP), z dodatkiem lub bez dodatku peptydów penetrujących komórki SynB1 lub Tat, poprzez drogę podawania donosowego (IN) i dożylnego (IV).

<table><tbody><tr><td>Odczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorofory pochodne maleimidu (np. , 5-maleimid, AlexaFluor 633-C5-maleimid)</td><td>Thermo Fisher</td><td>T6027, A20342</td><td>Tiolowe reaktywne barwniki fluorescencyjne do znakowania białek</td></tr><tr><td>Fosforanowa sól fizjologiczna</td><td>Sigma</td><td>1002243569</td><td>PBS Bufor do płukania</td></tr><tr><td>Optymalne cięcie Związek temperaturowy</td><td>Tissue-Tek</td><td>4585</td><td>Używany do zamrażania i montażu</td></tr><tr><td>Sprzęt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IVIS Spectrum</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>Do obrazowania całego narządu ex vivo</td></tr><tr><td>Cryomicrotome</td><td>Thermo</td><td></td><td>Do kriosekcji</td></tr><tr><td>Skaner fluorescencyjny</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>Do slajdów Skanowanie</td></tr></tbody></table>

zastosowanie obrazowania ex vivo całego narządu i ilościowej histologii tkanek w celu określenia biodystrybucji cząsteczek znakowanych fluorescencyjnie

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Znakowanie fluorescencyjne to sprawdzony proces badania losu znakowanych cząsteczek w różnych warunkach eksperymentalnych, zarówno in vitro, jak i in vivo. Sondy fluorescencyjne są szczególnie przydatne w określaniu biodystrybucji podawanych dużych cząsteczek, gdzie dodanie małocząsteczkowego znacznika fluorescencyjnego prawdopodobnie nie wpłynie na kinetykę lub biodystrybucję związku. Istnieje wiele metod badania biodystrybucji, które różnią się znacznie pod względem wymaganego wysiłku i tego, czy wynikowe pomiary są w pełni ilościowe, ale użycie wielu metod w połączeniu może zapewnić szybki i skuteczny system analizy biodystrybucji.
Obrazowanie całego narządu ex vivo to metoda, która może być użyta do szybkiego porównania względnych stężeń cząsteczek fluorescencyjnych w tkankach i między wieloma typami tkanek lub grupami leczenia. Korzystając z platformy obrazowania przeznaczonej do obrazowania żywych zwierząt lub całych narządów, fluorescencję w nienaruszonych tkankach można określić bez dalszego przetwarzania, oszczędzając czas i pracę, zapewniając jednocześnie dokładny obraz ogólnej biodystrybucji. Proces ten jest idealny w eksperymentach mających na celu określenie specyficzności tkankowej związku lub do porównania wielu różnych związków. Z drugiej strony ilościowa histologia tkanek wymaga intensywnego dalszego przetwarzania tkanek w celu stworzenia ilościowej miary znakowanych związków. Aby dokładnie ocenić biodystrybucję, wszystkie tkanki będące przedmiotem zainteresowania muszą zostać pokrojone, zeskanowane i przeanalizowane w stosunku do krzywych standardowych w celu dokonania porównań między tkankami lub grupami. Ilościowa histologia tkanek jest złotym standardem w określaniu bezwzględnych stężeń związków w tkankach.
Tutaj opisujemy, jak obie metody mogą być skutecznie używane razem do oceny zdolności różnych metod podawania i modyfikacji związków do celowania i dostarczania fluorescencyjnie znakowanych cząsteczek do ośrodkowego układu nerwowego1.

Poniższe dane opisują dostarczanie trzech związków: wektora do dostarczania leków znanego jako ELP oraz dwóch wersji ELP zmodyfikowanych peptydami penetrującymi komórki (SynB1-ELP oraz Tat-ELP)9. Wszystkie trzy związki zostały oznakowane tetrametylorodaminą-5-maleimidem i podano dwiema drogami administracji (IN oraz IV). Celem tych eksperymentów było ustalenie, który związek i która droga administracji zapewnią najlepszą penetrację do ośrodkowego układu nerwowego (OUN)3.
...

Obrazowanie ex vivo całego narządu to szybka metoda określania względnych stężeń związków znakowanych fluorescencyjnie w obrębie i pomiędzy tkankami lub grupami leczenia. I odwrotnie, ilościowa histologia fluorescencji, choć bardziej pracochłonna, pozwala na ilościowe określenie bezwzględnych poziomów tkanek znakowanych cząsteczek.

Zastosowanie obrazowania ex vivo całego narządu i ilościowej histologii tkanek w celu określenia biodystrybucji cząsteczek znakowanych fluorescencyjnie

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro ...

Ogólnym celem tej procedury jest szybkie scharakteryzowanie biodystrybucji związków znakowanych fluorescencyjnie u całych zwierząt. Metoda ta może być wykorzystana do zdefiniowania biodystrybucji terapii opartych na białkach oraz do określenia wpływu cząsteczek docelowych na dystrybucję wdychaną. Do zalet tej techniki należy ogólnie niski koszt wymaganych odczynników oraz szybkość, z jaką można dokonać dokładnych porównań między różnymi związkami.Biorąc pod uwagę szybki postęp w rozwoju leków biologicznych, techniki te zapewniają wygodny i dokładny sposób określania biodystrybucji związków w różnych modelach zwierzęcych. W przypadku obrazowania ex vivo całych narządów należy najpierw otworzyć oprogramowanie do akwizycji obrazu i kliknąć przycisk Zainicjuj. W obszarze Tryb obrazowania zaznacz pole wyboru Fluorescencyjny.W obszarze Czas naświetlania wybierz opcję auto. W obszarze Binning wybierz opcję mały i ustaw wartość F/Stop na dwa. Wybierz odpowiednie filtry wzbudzenia i emisji dla etykiet użytych w eksperymencie.Następnie wybierz pole widzenia B i ustaw docelową wysokość na odpowiednią głębokość zgodnie z oglądaną tkanką. Gdy wskaźnik temperatury zmieni kolor na zielony, umieść

the-use-ex-vivo-whole-organ-imaging-quantitative-tissue-histology-to

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Nanocząstki wirusowe pochodzenia roślinnego (VNPs) stanowią obiecujące platformy do zastosowań w biomedycynie. W niniejszym materiale opisujemy procedury propagacji, oczyszczania, charakteryzacji oraz biokoniugacji roślinnych VNP. Na koniec przedstawiamy zastosowanie VNP w celowanym dostarczaniu do guzów oraz obrazowaniu z wykorzystaniem modelu ksenoprzeszczepu u myszy i obrazowania fluorescencyjnego.

Nanocząsteczki wirusowe do obrazowania guzów in vivo

W tym artykule przedstawiamy metodę analizy mikronaczyń guza in vivo za pomocą dynamicznej wideomikroskopii fluorescencyjnej wzmocnionej kontrastem. Uzyskano dwa parametry ilościowe: funkcjonalną gęstość naczyń włosowatych odzwierciedlającą unaczynienie guza oraz nieszczelność wskaźnika odzwierciedlającą nieszczelność ściany śródbłonka.

In vivo (in vivo) Obrazowanie angiogenezy guza za pomocą fluorescencyjnej wideomikroskopii konfokalnej

Złożone masy tkankowe, od organów po guzy, składają się z różnych elementów komórkowych. Wyjaśniliśmy udział fenotypów komórkowych w tkance przy użyciu wieloznakowanych fluorescencyjnych myszy transgenicznych w połączeniu z wieloparametrowym barwieniem immunofluorescencyjnym, a następnie rozmieszaniem widmowym w celu rozszyfrowania pochodzenia komórek, a także cech komórek na podstawie ekspresji białka.

Ilościowa analiza wielospektralna po przeszczepie tkanki fluorescencyjnej w celu wizualizacji pochodzenia, typów i interakcji komórek

Kombinatoryczne oznaczanie 5 fluorescencyjnych białek hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych pozwala na śledzenie klonów in vivo za pomocą mikroskopii konfokalnej i dwufotonowej, dostarczając wglądu w architekturę hematopoetyczną szpiku kostnego podczas regeneracji. Metoda ta umożliwia nieinwazyjne mapowanie losów kodowanych spektralnie komórek pochodzących z HSPC w nienaruszonych tkankach przez długi czas po przeszczepie.<br...

In vivo (in vivo) Klonalne śledzenie hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych oznaczonych pięcioma białkami fluorescencyjnymi przy użyciu mikroskopii konfokalnej i wielofotonowej

Opisujemy stosunkowo prostą metodę obrazowania na żywo ex vivo interakcji komórka nowotworowa - zrąb w obrębie przerzutów do płuc, wykorzystując fluorescencyjne reportery u myszy. Wykorzystując mikroskopię konfokalną z wirującym dyskiem, technika ta umożliwia wizualizację żywych komórek przez co najmniej 4 godziny i może być dostosowana do badania innych stanów zapalnych płuc.

Ex vivo Obrazowanie na żywo przerzutów do płuc i ich mikrośrodowiska

Sondy specyficzne dla celu stanowią innowacyjne narzędzie do analizy mechanizmów molekularnych, takich jak ekspresja białek w różnych typach chorób (np. zapaleniu, infekcji i nowotworzenia). W tym badaniu opisano ilościową trójwymiarową ocenę tomograficzną infiltracji makrofagów jelitowych w mysim modelu zapalenia jelita grubego przy użyciu tomografii fluorescencyjnej specyficznej dla F4 / 80.

Tomografia fluorescencyjna do wykrywania i ilościowego oznaczania mysiego zapalenia jelit związanego z makrofagami

Ten protokół opisuje technikę obrazowania różnych populacji komórek w drenujących węzłach chłonnych bez zmian w strukturze narządu.

Wizualizacja struktury węzłów chłonnych i lokalizacji komórkowej za pomocą mikroskopii konfokalnej ex-vivo

Opisane podejście łączy eksperymentalne testy przerzutów do żył ogonowych z obrazowaniem żywych zwierząt in vivo, aby umożliwić monitorowanie w czasie rzeczywistym powstawania i wzrostu przerzutów raka piersi, a także ilościowe określenie liczby i wielkości przerzutów w płucach.

Łączne wykorzystanie testów przerzutów do żył ogonowych i obrazowania in vivo w czasie rzeczywistym w celu ilościowego określenia kolonizacji przerzutowej raka piersi i obciążenia płuc

Opisujemy protokoły oceny stopnia transdukcji przez peptydy penetrujące komórki, wykorzystując systemy obrazowania ex vivo, a następnie zatapianie parafiny, cięcie i konfokalną mikroskopię fluorescencyjną na przykładzie peptydu celującego w serce. W naszym protokole pojedyncze zwierzę może być wykorzystane do uzyskania obu rodzajów oceny obrazowej tych samych narządów, zmniejszając w ten sposób liczbę zwierząt potrzebnych do badań o połowę.

Obrazowanie in vivo skuteczności transdukcji peptydu ukierunkowanego na serce

Celem tego protokołu jest synteza liposomów znakowanych fluorescencyjnie i wykorzystanie cytometrii przepływowej do identyfikacji lokalizacji liposomów in vivo na poziomie komórkowym.

Przygotowanie, podawanie i ocena specyficznego tkankowo wychwytu komórkowego in vivo liposomów znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym

Spektralne iteracyjne wybielanie rozszerza multipleksencję (IBEX) opiera się na podstawowej technice IBEX, dodając blokowanie heparyny w celu minimalizacji wiązania niespecyficznego oraz wykorzystując detekcję spektralną z obliczeniowym rozmieszaniem w celu tłumienia autofluorescencji. Takie podejście przyspiesza akwizycję obrazu, jednocześnie ograniczając źródła tła, umożliwiając solidne wielorundowe, wysokoparametryczne analizy przestrzenne proteomiczne.

Obrazowanie wysoko-plexowe z użyciem spektralnej mikroskopii konfokalnej w celu minimalizacji niespecyficznej fluorescencji tkanek

Poznaj metodę obrazowania ex vivo całych narządów do szybkiej oceny biodystrybucji fluorescencyjnie znakowanych związków w zwierzętach. Technika ta umożliwia niskokosztowe i precyzyjne porównania różnych leków.

Zastosowanie obrazowania ex vivo całego narządu i ilościowej histologii tkanek w celu określenia biodystrybucji cząsteczek znakowanych fluorescencyjnie (Wideo) | JoVE Journal

Zastosowanie obrazowania ex vivo całego narządu i ilościowej histologii tkanek w celu określenia biodystrybucji cząsteczek znakowanych fluorescencyjnie

Przeglądaj więcej filmów